JPH05240855A - タンパク質の同定または測定方法、およびそれの適用 - Google Patents
タンパク質の同定または測定方法、およびそれの適用Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、タンパク質の同定または測定方
法、およびその方法の適用を提供することを目的とす
る。 【構成】 本発明は、必要であれば免疫原性にされたペ
プチドを用いて抗体を生産せしめ、次いで得られた抗体
を用いて着目のタンパク質を測定し、それらを含有しそ
して前記ペプチドを遊離させるために処理した試料を使
って出発することを含んで成り、前記ペプチドが前記タ
ンパク質の既知のアミノ酸配列と一致するように選択さ
れ、そして酵素処理によって前記タンパク質から遊離さ
せることができるタンパク質断片として使用され、その
後それが合成されることを特徴とする方法によって構成
される。
法、およびその方法の適用を提供することを目的とす
る。 【構成】 本発明は、必要であれば免疫原性にされたペ
プチドを用いて抗体を生産せしめ、次いで得られた抗体
を用いて着目のタンパク質を測定し、それらを含有しそ
して前記ペプチドを遊離させるために処理した試料を使
って出発することを含んで成り、前記ペプチドが前記タ
ンパク質の既知のアミノ酸配列と一致するように選択さ
れ、そして酵素処理によって前記タンパク質から遊離さ
せることができるタンパク質断片として使用され、その
後それが合成されることを特徴とする方法によって構成
される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質の同定また
は測定方法、およびこの方法の適用に関する。
は測定方法、およびこの方法の適用に関する。
【０００２】
【従来の技術】タンパク質の精密な免疫学的測定は、一
般に遭遇するような少量においてそれらのタンパク質を
検出することを可能にする程それらのタンパク質に対し
て十分に高い親和性を有する抗体を必要とする。更に、
それらの抗体は、測定を行う媒体中の他の成分による干
渉を除外するほど十分に特異的でなければならない。し
かしながら、十分に多量で且つ適当に純粋な問題の抗原
源を得ることが困難であるため、そのような抗体はしば
しば入手不可能である。
般に遭遇するような少量においてそれらのタンパク質を
検出することを可能にする程それらのタンパク質に対し
て十分に高い親和性を有する抗体を必要とする。更に、
それらの抗体は、測定を行う媒体中の他の成分による干
渉を除外するほど十分に特異的でなければならない。し
かしながら、十分に多量で且つ適当に純粋な問題の抗原
源を得ることが困難であるため、そのような抗体はしば
しば入手不可能である。
【０００３】しかしながら、免疫原として合成ペプチド
を使用することにより、稀である抗原、アミノ酸配列の
みが既知である抗原、およびタンパク質分子中に存在す
る或る種の弱免疫原性エピトープ、に対する抗体を得る
ことが可能になった。しかし、ほとんどの場合、そのよ
うな合成ペプチドに対して得られた抗体は、抗体に基礎
を置くのに必要とされる感度を有するイムノアッセイを
可能にする程十分な結合力で完全タンパク質を認識しな
い。
を使用することにより、稀である抗原、アミノ酸配列の
みが既知である抗原、およびタンパク質分子中に存在す
る或る種の弱免疫原性エピトープ、に対する抗体を得る
ことが可能になった。しかし、ほとんどの場合、そのよ
うな合成ペプチドに対して得られた抗体は、抗体に基礎
を置くのに必要とされる感度を有するイムノアッセイを
可能にする程十分な結合力で完全タンパク質を認識しな
い。
【０００４】タンパク質イムノアッセイを行う媒体中の
他の成分による干渉を除去するために多くの試みがなさ
れている。ヨーロッパ特許出願第51,985号に記載された
それらの方法の１つにおいては、試料をタンパク質分解
剤で処理した後で測定を行っている。この方法は、測定
しようとするタンパク質上のエピトープをそのまま維持
した状態で汚染タンパク質上のエピトープの選択的破壊
を可能にし、また特異的エピトープを担持しておりそし
てタンパク質分解開裂により得られるタンパク質断片の
測定を可能にすることが記載されている。これは、前記
タンパク質を開裂させることにより得られた精製断片で
動物を免疫処置することによって得られた抗体を用いて
達成することができる。
他の成分による干渉を除去するために多くの試みがなさ
れている。ヨーロッパ特許出願第51,985号に記載された
それらの方法の１つにおいては、試料をタンパク質分解
剤で処理した後で測定を行っている。この方法は、測定
しようとするタンパク質上のエピトープをそのまま維持
した状態で汚染タンパク質上のエピトープの選択的破壊
を可能にし、また特異的エピトープを担持しておりそし
てタンパク質分解開裂により得られるタンパク質断片の
測定を可能にすることが記載されている。これは、前記
タンパク質を開裂させることにより得られた精製断片で
動物を免疫処置することによって得られた抗体を用いて
達成することができる。
【０００５】しかしながら、上記の刊行物において提案
された方法は２つとも幾つかの欠点を有する。上記に略
述した第一の方法では、ａ）測定に関与する抗体により
認識されるエピトープの位置とｂ）汚染タンパク質の性
質の両方が正確に既知である場合、またはタンパク質分
解による断片化の種々の技術の広範な実験を行う場合に
のみ、干渉タンパク質分子上のエピトープの選択的破壊
を達成することができる。
された方法は２つとも幾つかの欠点を有する。上記に略
述した第一の方法では、ａ）測定に関与する抗体により
認識されるエピトープの位置とｂ）汚染タンパク質の性
質の両方が正確に既知である場合、またはタンパク質分
解による断片化の種々の技術の広範な実験を行う場合に
のみ、干渉タンパク質分子上のエピトープの選択的破壊
を達成することができる。
【０００６】上記に略述した第二の方法では、精製断片
での免疫処置によって得られた抗体を用いたタンパク質
分解生成断片の測定は、非常に純粋な多量の生来のタン
パク質を必要とする。更に、特異的抗体の検出は、免疫
原として使用する前にタンパク質分解により得られた精
製断片の特徴づけを必要とし、または異なるペプチドで
の免疫処置後に得られた抗体の特異性の徹底的な調査を
必要とする。
での免疫処置によって得られた抗体を用いたタンパク質
分解生成断片の測定は、非常に純粋な多量の生来のタン
パク質を必要とする。更に、特異的抗体の検出は、免疫
原として使用する前にタンパク質分解により得られた精
製断片の特徴づけを必要とし、または異なるペプチドで
の免疫処置後に得られた抗体の特異性の徹底的な調査を
必要とする。
【０００７】バソプレッシンそれ自体に対する抗体を用
いたバソプレッシン前駆体の測定方法も記載されてい
る。この方法では、測定前に抗原決定基が酵素的または
化学的処理により再構成される〔A. Cupo, G. Rougon-R
apuzziおよびM. Delaage, "Immunochemical detection
of vasopressin precursors : artical processing and
quantitation along the hypothalamo-hypophyseal ax
is", Eur. J. Biochem., 115 ,169-174 (1981) を参照
のこと〕。
いたバソプレッシン前駆体の測定方法も記載されてい
る。この方法では、測定前に抗原決定基が酵素的または
化学的処理により再構成される〔A. Cupo, G. Rougon-R
apuzziおよびM. Delaage, "Immunochemical detection
of vasopressin precursors : artical processing and
quantitation along the hypothalamo-hypophyseal ax
is", Eur. J. Biochem., 115 ,169-174 (1981) を参照
のこと〕。
【０００８】met-エンケファリン前駆体の天然断片に対
して惹起された抗体を使用することによりmet-エンケフ
ァリンを測定する類似方法が好結果に用いられている。
この測定は、まず天然断片を除去するために試料をトリ
クロロ酢酸で処理し、次いでトリプシンで処理した後に
行われる〔A. Cupo, P.A. Pontarotti, T. Jarryおよび
M.A. Delaage, "A new immunological approach to the
detection and quantitation of met-enkephalin prec
ursors in the rat brain", Neuropeptides ,4 ,375-38
7 (1984) を参照のこと〕。
して惹起された抗体を使用することによりmet-エンケフ
ァリンを測定する類似方法が好結果に用いられている。
この測定は、まず天然断片を除去するために試料をトリ
クロロ酢酸で処理し、次いでトリプシンで処理した後に
行われる〔A. Cupo, P.A. Pontarotti, T. Jarryおよび
M.A. Delaage, "A new immunological approach to the
detection and quantitation of met-enkephalin prec
ursors in the rat brain", Neuropeptides ,4 ,375-38
7 (1984) を参照のこと〕。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の方法は、従来
技術の欠点の幾つか、例えば他のタンパク質による干渉
を削除する。実際に、従来技術の方法は、この点で有効
な解決策を全く提供せず、そして干渉タンパク質を除去
する酵素的および／または化学的開裂を見つけるために
多大な予備実験を行わなければならない。
技術の欠点の幾つか、例えば他のタンパク質による干渉
を削除する。実際に、従来技術の方法は、この点で有効
な解決策を全く提供せず、そして干渉タンパク質を除去
する酵素的および／または化学的開裂を見つけるために
多大な予備実験を行わなければならない。
【００１０】本発明によれば、測定しようとするタンパ
ク質の一次構造の研究によって、前処理または後の修飾
を行うことなく、タンパク質分解で得られた特異的断片
の簡単な直接測定を可能にする。この方法は、次の３つ
の本質的な点で上述の従来方法と異なっている。 １）免疫処置用ペプチドが人工的な断片であること、 ２）天然の断片を除去するための抽出を行わないこと、
および ３）試料に化学的修飾を行う必要がないこと。
ク質の一次構造の研究によって、前処理または後の修飾
を行うことなく、タンパク質分解で得られた特異的断片
の簡単な直接測定を可能にする。この方法は、次の３つ
の本質的な点で上述の従来方法と異なっている。 １）免疫処置用ペプチドが人工的な断片であること、 ２）天然の断片を除去するための抽出を行わないこと、
および ３）試料に化学的修飾を行う必要がないこと。
【００１１】
【課題を解決するための手段】従って、本発明の目的
は、タンパク質の同定または測定方法であって、必要で
あれば免疫原性にされたペプチドを用いて抗体を生産せ
しめ、次いで得られた抗体を使って着目のタンパク質を
測定し、そしてこのタンパク質を含有しており且つ前記
ペプチドを遊離させるために処理された試料を用いて開
始することを含んで成り、前記ペプチドが、前記タンパ
ク質の既知の配列から選択されそして酵素処理によって
遊離され得るタンパク質の断片（または断片の部分）と
して使用され、その後合成されることを特徴とする方法
を提供することである。
は、タンパク質の同定または測定方法であって、必要で
あれば免疫原性にされたペプチドを用いて抗体を生産せ
しめ、次いで得られた抗体を使って着目のタンパク質を
測定し、そしてこのタンパク質を含有しており且つ前記
ペプチドを遊離させるために処理された試料を用いて開
始することを含んで成り、前記ペプチドが、前記タンパ
ク質の既知の配列から選択されそして酵素処理によって
遊離され得るタンパク質の断片（または断片の部分）と
して使用され、その後合成されることを特徴とする方法
を提供することである。
【００１２】
【作用】そのような方法は、合成ペプチドタイプの免疫
原の使用が、着目のエピトープの容易な調製および選択
を提供するという利点を有する。それは、生来のタンパ
ク質のイムノアッセイにおいて起こる親和性の低下によ
り生じる問題を回避することを可能にする。これは免疫
原が測定しようとする抗原と完全に一致するために可能
であり、例えばそれと完全に同一であることができる。
更に、タンパク質の一次構造において同定することが容
易である特異的部位における結合の切断を保証するタン
パク質分解酵素を用いてタンパク質の開裂を行うための
当業者に利用可能な技術が多数存在しており、そしてこ
の技術領域は使用されるペプチド断片の広範な選択を提
供する。
原の使用が、着目のエピトープの容易な調製および選択
を提供するという利点を有する。それは、生来のタンパ
ク質のイムノアッセイにおいて起こる親和性の低下によ
り生じる問題を回避することを可能にする。これは免疫
原が測定しようとする抗原と完全に一致するために可能
であり、例えばそれと完全に同一であることができる。
更に、タンパク質の一次構造において同定することが容
易である特異的部位における結合の切断を保証するタン
パク質分解酵素を用いてタンパク質の開裂を行うための
当業者に利用可能な技術が多数存在しており、そしてこ
の技術領域は使用されるペプチド断片の広範な選択を提
供する。
【００１３】ペプチドを用いた抗体の調製は、従来技術
から周知である。ペプチドが免疫原性でないかまたは十
分に免疫原性でないならば、例えばそれらを巨大分子、
特にタンパク質由来のもの、に結合することによって、
それらを免疫原性にすることができる。
から周知である。ペプチドが免疫原性でないかまたは十
分に免疫原性でないならば、例えばそれらを巨大分子、
特にタンパク質由来のもの、に結合することによって、
それらを免疫原性にすることができる。
【００１４】ペプチドは、既知のアミノ酸配列から選択
することができ、または対応する遺伝子中の核酸配列か
ら推定することができる。ペプチドは、タンパク質、例
えばホルモンまたはウイルスタンパク質の断片と一致す
るように選択される。選択されるペプチドは、実際は、
それらが酵素処理により得ることができるタンパク質断
片と一致するように選択される。それらの例は、問題の
タンパク質をトリプシンで処理することによって得られ
る「トリプシン断片」である。
することができ、または対応する遺伝子中の核酸配列か
ら推定することができる。ペプチドは、タンパク質、例
えばホルモンまたはウイルスタンパク質の断片と一致す
るように選択される。選択されるペプチドは、実際は、
それらが酵素処理により得ることができるタンパク質断
片と一致するように選択される。それらの例は、問題の
タンパク質をトリプシンで処理することによって得られ
る「トリプシン断片」である。
【００１５】上記で言及した「断片の部分」なる用語
は、タンパク質断片のＣ−末端、Ｎ−末端または非末端
部分である。以下の記載において、「断片」なる用語
は、断片と断片の部分の両方を意味するために用いられ
る。
は、タンパク質断片のＣ−末端、Ｎ−末端または非末端
部分である。以下の記載において、「断片」なる用語
は、断片と断片の部分の両方を意味するために用いられ
る。
【００１６】もちろん、別の単一酵素または複数の酵素
の組合せ、例えばトリプシン−キモトリプシン−プロリ
ンエンドペプチダーゼの組合せ、を用いて出発タンパク
質を処理することも可能である。
の組合せ、例えばトリプシン−キモトリプシン−プロリ
ンエンドペプチダーゼの組合せ、を用いて出発タンパク
質を処理することも可能である。
【００１７】ペプチドは、それらのサイズに従ってそし
てそれらが単一タンパク質のまたはタンパク質のグルー
プもしくは「ファミリー」のどんな代表物であるかに従
って選択される。本発明の方法の実際の適用において、
１または複数（例えば２，３または４つ）のペプチドを
用いることができる。
てそれらが単一タンパク質のまたはタンパク質のグルー
プもしくは「ファミリー」のどんな代表物であるかに従
って選択される。本発明の方法の実際の適用において、
１または複数（例えば２，３または４つ）のペプチドを
用いることができる。
【００１８】本発明の好ましい態様において、タンパク
質の既知の配列と一致するように且つ適当な処理によっ
てタンパク質から遊離され得るタンパク質断片として働
くように選択されるペプチドは、６〜３０、好ましくは
６〜２０のアミノ酸残基を含む。
質の既知の配列と一致するように且つ適当な処理によっ
てタンパク質から遊離され得るタンパク質断片として働
くように選択されるペプチドは、６〜３０、好ましくは
６〜２０のアミノ酸残基を含む。
【００１９】選択されたペプチドは、それらが上記の必
要条件を満たすならばそのまま使用することができる
が、或る場合にはそれらを変更することが有利である。
これは例えば置換によって行うことができる。
要条件を満たすならばそのまま使用することができる
が、或る場合にはそれらを変更することが有利である。
これは例えば置換によって行うことができる。
【００２０】アミノ酸残基の数を同数に保ちながら、選
択したペプチド中に存在する１または複数のアミノ酸を
１または複数のアミノ酸により置換することが可能であ
る。しかし、この置換は好ましくは４個未満のアミノ
酸、特に１，２または３個のアミノ酸に作用するだろ
う。こうして導入された新たな１または複数のアミノ酸
は、好ましくは幾つかの遊離基、例えば -NH2, -COOHま
たは-SH 基を有するだろう。
択したペプチド中に存在する１または複数のアミノ酸を
１または複数のアミノ酸により置換することが可能であ
る。しかし、この置換は好ましくは４個未満のアミノ
酸、特に１，２または３個のアミノ酸に作用するだろ
う。こうして導入された新たな１または複数のアミノ酸
は、好ましくは幾つかの遊離基、例えば -NH2, -COOHま
たは-SH 基を有するだろう。
【００２１】選択したペプチドに単一または複数導入す
ることができるアミノ酸の中で、チロシン、および着目
の担体タンパク質、酵素または他のいずれかの分子との
標的指向性カップリングを可能にするアミノ酸を挙げる
ことができる。選択したペプチドに１または複数のアミ
ノ酸を付加することも有用であるだろう。付加される新
たな１または複数のアミノ酸は、有利には置換と同じア
ミノ酸の中から選択されるだろう。
ることができるアミノ酸の中で、チロシン、および着目
の担体タンパク質、酵素または他のいずれかの分子との
標的指向性カップリングを可能にするアミノ酸を挙げる
ことができる。選択したペプチドに１または複数のアミ
ノ酸を付加することも有用であるだろう。付加される新
たな１または複数のアミノ酸は、有利には置換と同じア
ミノ酸の中から選択されるだろう。
【００２２】１または複数のアミノ酸を削除することに
よって前記断片を変更することも有利であろうが、これ
は好ましくは存在するアミノ酸の半分未満に限定すべき
である。本発明に従ったタンパク質の同定または測定に
おける干渉を防ぐために、ペプチドはタンパク質のアミ
ノ酸配列中に重複を有するがタンパク質断片として天然
に存在しないように選択することができる。上述したよ
うに、ペプチドは与えられたタンパク質またはタンパク
質のグループもしくはファミリー全体に対して特異的で
あるように選択することができる。
よって前記断片を変更することも有利であろうが、これ
は好ましくは存在するアミノ酸の半分未満に限定すべき
である。本発明に従ったタンパク質の同定または測定に
おける干渉を防ぐために、ペプチドはタンパク質のアミ
ノ酸配列中に重複を有するがタンパク質断片として天然
に存在しないように選択することができる。上述したよ
うに、ペプチドは与えられたタンパク質またはタンパク
質のグループもしくはファミリー全体に対して特異的で
あるように選択することができる。
【００２３】上記方法の態様において、選択したペプチ
ドは重合形において存在することができる。これは例え
ば適当な処理によってタンパク質から遊離させることが
できる２つのタンパク質断片に対応することができ、問
題の断片は生来のシステイン残基にある１または複数の
ジスルフィド結合によって結合している。
ドは重合形において存在することができる。これは例え
ば適当な処理によってタンパク質から遊離させることが
できる２つのタンパク質断片に対応することができ、問
題の断片は生来のシステイン残基にある１または複数の
ジスルフィド結合によって結合している。
【００２４】重合は、１または複数のペプチドの免疫原
性を変更するためにも使用することができる。ポリマー
は同一のまたは異なるモノマーから成ることができる。
種々の基（例えばアミノ、カルボキシルまたはスルフヒ
ドリル基）によりモノマーを一緒に結合することがで
き、そして特に１または複数の分子を介してそれらのモ
ノマーを一緒に連結することができる。
性を変更するためにも使用することができる。ポリマー
は同一のまたは異なるモノマーから成ることができる。
種々の基（例えばアミノ、カルボキシルまたはスルフヒ
ドリル基）によりモノマーを一緒に結合することがで
き、そして特に１または複数の分子を介してそれらのモ
ノマーを一緒に連結することができる。
【００２５】上記に記載の方法は多数の利点を有する。
物質的存在としてタンパク質を所有することはもはや必
要でない。実際、測定しようとする１または複数のタン
パク質のアミノ酸配列またはアミノ酸配列の部分を文献
から知ることで十分である。１または複数の酵素による
酵素的開裂方法に詳しい技術者は、どのペプチドが適当
な処理によりタンパク質から遊離させることができる断
片に対応するだろうかを予想することができる。
物質的存在としてタンパク質を所有することはもはや必
要でない。実際、測定しようとする１または複数のタン
パク質のアミノ酸配列またはアミノ酸配列の部分を文献
から知ることで十分である。１または複数の酵素による
酵素的開裂方法に詳しい技術者は、どのペプチドが適当
な処理によりタンパク質から遊離させることができる断
片に対応するだろうかを予想することができる。
【００２６】問題のタンパク質がペプチドを含む唯一の
ものであるためか、または実際は次のような逆の理由：
それを構成しているアミノ酸配列がタンパク質のグルー
プまたはファミリー全体に共通であるためにペプチドを
選択してもよい。後者のねらいはタンパク質のグループ
全体を一緒に測定することである。
ものであるためか、または実際は次のような逆の理由：
それを構成しているアミノ酸配列がタンパク質のグルー
プまたはファミリー全体に共通であるためにペプチドを
選択してもよい。後者のねらいはタンパク質のグループ
全体を一緒に測定することである。
【００２７】幾つかの特別な必要条件、例えば適当なサ
イズを有するペプチドを提供すること、を満たすアミノ
酸配列を選択することも可能である。
イズを有するペプチドを提供すること、を満たすアミノ
酸配列を選択することも可能である。
【００２８】選択したペプチド断片は、例えば次のこと
を可能にするために変更することができる： ａ）ペプチド断片の与えられた部分に対する抗原−抗体
反応を標的するための担体タンパク質との結合； ｂ）着目の分子、例えば酵素との結合；または ｃ）ヨウ素-125での標識を可能にするための、アミノ酸
例えばチロシンの導入。
を可能にするために変更することができる： ａ）ペプチド断片の与えられた部分に対する抗原−抗体
反応を標的するための担体タンパク質との結合； ｂ）着目の分子、例えば酵素との結合；または ｃ）ヨウ素-125での標識を可能にするための、アミノ酸
例えばチロシンの導入。
【００２９】本発明の方法は、従来技術の欠点の幾つ
か、例えば他のタンパク質による干渉を削除する。実際
に、従来技術の方法は、この点で有効な解決策を全く提
供せず、そして干渉タンパク質を除去する酵素的および
／または化学的開裂を見つけるために多大な予備実験を
行わなければならない。
か、例えば他のタンパク質による干渉を削除する。実際
に、従来技術の方法は、この点で有効な解決策を全く提
供せず、そして干渉タンパク質を除去する酵素的および
／または化学的開裂を見つけるために多大な予備実験を
行わなければならない。
【００３０】当業者は周知の方法、例えばMerrifieldの
固相ペプチド合成によって、選択したペプチドを合成す
ることができるであろう。
固相ペプチド合成によって、選択したペプチドを合成す
ることができるであろう。
【００３１】本発明の方法は、精製が困難でありそして
しばしば構造的相同性を示す多数のタンパク質タイプの
ホルモンのイムノアッセイに特に適当である。それはま
た、他の方法では次のような問題点により妨害され得る
ウイルスタンパク質のイムノアッセイにも適当である： １）使用する動物を免疫処置するのに十分に多量で且つ
高純度で抗原を得ることが困難である； ２）同一ウイルスの異なる株に対応する抗原が株によっ
て大きな多様性を示す； ３）感染された個体の血清中に存在するウイルスタンパ
ク質に対する抗体が分析を干渉し、この干渉が、測定に
関与する抗体により認識されるエピトープの全部また部
分を遮蔽し得る。
しばしば構造的相同性を示す多数のタンパク質タイプの
ホルモンのイムノアッセイに特に適当である。それはま
た、他の方法では次のような問題点により妨害され得る
ウイルスタンパク質のイムノアッセイにも適当である： １）使用する動物を免疫処置するのに十分に多量で且つ
高純度で抗原を得ることが困難である； ２）同一ウイルスの異なる株に対応する抗原が株によっ
て大きな多様性を示す； ３）感染された個体の血清中に存在するウイルスタンパ
ク質に対する抗体が分析を干渉し、この干渉が、測定に
関与する抗体により認識されるエピトープの全部また部
分を遮蔽し得る。
【００３２】タンパク質分解による生成断片の測定は、
上記の３つの問題点も解決する。第一に、タンパク質分
解断片に対応する合成ペプチドは、非常に純粋で且つ多
量に入手できる免疫原である。第二に、アミノ酸配列の
正確な選択は、同一ウイルスの異なる株に共通であるか
または反対に１つの与えられた株に特異的である断片を
選択することを可能にする。第三に、天然には存在しな
い測定に関与する抗体のエピトープは、もちろん血清抗
体によって遮蔽されない。本発明の方法を以下の実施例
によりさらに説明するが、これは本発明の範囲を限定す
るものではない。
上記の３つの問題点も解決する。第一に、タンパク質分
解断片に対応する合成ペプチドは、非常に純粋で且つ多
量に入手できる免疫原である。第二に、アミノ酸配列の
正確な選択は、同一ウイルスの異なる株に共通であるか
または反対に１つの与えられた株に特異的である断片を
選択することを可能にする。第三に、天然には存在しな
い測定に関与する抗体のエピトープは、もちろん血清抗
体によって遮蔽されない。本発明の方法を以下の実施例
によりさらに説明するが、これは本発明の範囲を限定す
るものではない。
【００３３】
【実施例】実施例１：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＰ２５タ
ンパク質の測定 １．ペプチド断片の選択 効果的で、安価で、単純で且つ特異的であるため、タン
パク質のトリプシン誘導断片化を使用し、アルギニンお
よびリジン単位の後ろで分子を開裂させた。比較標準株
HIV-1 BRUの P25タンパク質をトリプシンで消化するこ
とにより得られた断片を、GENPROデータベースおよびBI
SANCE(CITI 2) ソフトウエアを使って、アミノ酸配列に
基づいてマッピングした。
ンパク質の測定 １．ペプチド断片の選択 効果的で、安価で、単純で且つ特異的であるため、タン
パク質のトリプシン誘導断片化を使用し、アルギニンお
よびリジン単位の後ろで分子を開裂させた。比較標準株
HIV-1 BRUの P25タンパク質をトリプシンで消化するこ
とにより得られた断片を、GENPROデータベースおよびBI
SANCE(CITI 2) ソフトウエアを使って、アミノ酸配列に
基づいてマッピングした。
【００３４】６以上のアミノ酸を含むトリプシン生成断
片のみを考慮に入れた。次にそれらの断片を、NBRFおよ
びGENPROデータベースに列挙されたHIV-1 およびHIV-2
ウイルスの他の株のP25 タンパク質のアミノ酸配列と比
較した。
片のみを考慮に入れた。次にそれらの断片を、NBRFおよ
びGENPROデータベースに列挙されたHIV-1 およびHIV-2
ウイルスの他の株のP25 タンパク質のアミノ酸配列と比
較した。
【００３５】それらのアミノ酸配列がHIV-1 およびHIV-
2 ウイルスの他の株領域に渡り80％を越える相同性を示
したならば、トリプシン生成断片自体（または６以上の
アミノ酸を含み且つそのような断片のCOOH末端またはNH
2 末端に対応するペプチド）を保持した。次いでそれら
のペプチドをNBRFおよびGENPROデータベースに記憶され
たあらゆるタンパク質のアミノ酸配列と比較した。しか
し、HIV およびSIV ウイルスの P25タンパク質以外のタ
ンパク質のアミノ酸配列とは有意な相同性が認められな
かった。これに基づいて４つのペプチド（T7K, G11C, N
17K およびT18K) を選択しそして合成した。それらのペ
プチドを下記に記載する。
2 ウイルスの他の株領域に渡り80％を越える相同性を示
したならば、トリプシン生成断片自体（または６以上の
アミノ酸を含み且つそのような断片のCOOH末端またはNH
2 末端に対応するペプチド）を保持した。次いでそれら
のペプチドをNBRFおよびGENPROデータベースに記憶され
たあらゆるタンパク質のアミノ酸配列と比較した。しか
し、HIV およびSIV ウイルスの P25タンパク質以外のタ
ンパク質のアミノ酸配列とは有意な相同性が認められな
かった。これに基づいて４つのペプチド（T7K, G11C, N
17K およびT18K) を選択しそして合成した。それらのペ
プチドを下記に記載する。
【００３６】１ａ．ペプチドT7K : Thr-Leu-Asn-Ala-Tr
p-Val-Lys の正体 このペプチドは、トリプシン処理により得られた完全な
断片であり、そして比較標準ウイルスHIV-1 BRU の P25
タンパク質中の19位から25位までのアミノ酸の配列に対
応する。この配列は、今までにアミノ酸配列が決定され
ているHIV ウイルスの全ての株に常に存在する。
p-Val-Lys の正体 このペプチドは、トリプシン処理により得られた完全な
断片であり、そして比較標準ウイルスHIV-1 BRU の P25
タンパク質中の19位から25位までのアミノ酸の配列に対
応する。この配列は、今までにアミノ酸配列が決定され
ているHIV ウイルスの全ての株に常に存在する。
【００３７】１ｂ．ペプチドG11C : Gly-Ser-Asp-Ile-A
la-Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Cysの正体 このペプチドは、比較標準ウイルス株、即ちHIV-1 BRU
、のアミノ酸 101からアミノ酸 131までを含んで成る
トリプシン生成断片の NH2末端のアミノ酸 101からアミ
ノ酸 110までに及ぶ配列により構成されるが、SH基を介
した化学結合を可能にするため余分なシステインがその
COOH末端に付加されている。このペプチドも、今までに
アミノ酸配列が決定されているHIV ウイルスの他の株全
てに常に存在する。
la-Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Cysの正体 このペプチドは、比較標準ウイルス株、即ちHIV-1 BRU
、のアミノ酸 101からアミノ酸 131までを含んで成る
トリプシン生成断片の NH2末端のアミノ酸 101からアミ
ノ酸 110までに及ぶ配列により構成されるが、SH基を介
した化学結合を可能にするため余分なシステインがその
COOH末端に付加されている。このペプチドも、今までに
アミノ酸配列が決定されているHIV ウイルスの他の株全
てに常に存在する。
【００３８】１c ．ペプチドN17K : Asn-Trp-Met-Thr-G
lu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys
の正体 このペプチドは、トリプシン処理により得られた完全な
断片であり、そして比較標準HIV-1 BRU 株のP25 タンパ
ク質中のアミノ酸 183からアミノ酸 199までの配列に対
応する。しかしながら、異なるHIV ウイルス株間で次の
ような相違が観察され得る。 ─ 187位のグルタミン酸のグルタミンによる置換(HIV-2
ROD株について) ； ─ 187位のグルタミン酸のグルタミンによる置換、 193
位のアスパラギンのセリンによる置換および 194位のア
ラニンの削除(HIV-2 SBLISY 株について) ； ─ 187位のグルタミン酸のグルタミンによる置換および
191位のバリンのロイシンによる置換(HIV-2 FG 株につ
いて) ；並びに ─ 183位のアスパラギンのグリシンによる置換(HIV-1 Z
2 株について) 。
lu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys
の正体 このペプチドは、トリプシン処理により得られた完全な
断片であり、そして比較標準HIV-1 BRU 株のP25 タンパ
ク質中のアミノ酸 183からアミノ酸 199までの配列に対
応する。しかしながら、異なるHIV ウイルス株間で次の
ような相違が観察され得る。 ─ 187位のグルタミン酸のグルタミンによる置換(HIV-2
ROD株について) ； ─ 187位のグルタミン酸のグルタミンによる置換、 193
位のアスパラギンのセリンによる置換および 194位のア
ラニンの削除(HIV-2 SBLISY 株について) ； ─ 187位のグルタミン酸のグルタミンによる置換および
191位のバリンのロイシンによる置換(HIV-2 FG 株につ
いて) ；並びに ─ 183位のアスパラギンのグリシンによる置換(HIV-1 Z
2 株について) 。
【００３９】１ｄ．ペプチドT18K : Thr-Leu-Glu-Glu-M
et-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-Gly-Pro-Gly-His
-Lysの正体 このペプチドは、HIV-1 BRU のアミノ酸 204からアミノ
酸 227までの区域を含んで成るトリプシン生成断片のCO
OH末端の 210位から 227位までに及ぶアミノ酸配列から
成る。しかしながら、異なるHIV ウイルス株間で次のよ
うな相違が観察され得る。 ─ 215位のメチオニンのロイシンによる置換および 226
位のヒスチジンのグルタミンによる置換(HIV-2 ROD株に
ついて) ； ─ 215位のメチオニンのロイシンによる置換および 220
位のグリシンのイソロイシンによる置換(HIV-2 SEBLISY
株について) ； ─ 215位のメチオニンのロイシンによる置換、217 位の
アラニンのスレオニンによる置換および226 位のヒスチ
ジンのグルタミンによる置換(HIV-2 FG 株について) ；
並びに ─225 位のグリシンのセリンによる置換(HIV-1 ELI, HI
V-1 MAL およびHIV-1Z2株について) 。
et-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-Gly-Pro-Gly-His
-Lysの正体 このペプチドは、HIV-1 BRU のアミノ酸 204からアミノ
酸 227までの区域を含んで成るトリプシン生成断片のCO
OH末端の 210位から 227位までに及ぶアミノ酸配列から
成る。しかしながら、異なるHIV ウイルス株間で次のよ
うな相違が観察され得る。 ─ 215位のメチオニンのロイシンによる置換および 226
位のヒスチジンのグルタミンによる置換(HIV-2 ROD株に
ついて) ； ─ 215位のメチオニンのロイシンによる置換および 220
位のグリシンのイソロイシンによる置換(HIV-2 SEBLISY
株について) ； ─ 215位のメチオニンのロイシンによる置換、217 位の
アラニンのスレオニンによる置換および226 位のヒスチ
ジンのグルタミンによる置換(HIV-2 FG 株について) ；
並びに ─225 位のグリシンのセリンによる置換(HIV-1 ELI, HI
V-1 MAL およびHIV-1Z2株について) 。
【００４０】２．抗体の惹起 前記４つのペプチドを様々な担体タンパク質と結合さ
せ、必要な免疫原を作製した。より詳しくは、ペプチド
中の生来のシステインのSH基と担体タンパク質中のリジ
ン残基のε-NH2基の両方と反応するスクシンイミジル４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート(SMCC)を介して、ペプチドN17Kをウシ血清
アルブミン(BSA) と結合させた。Serva からのウシ血清
アルブミンを0.1Mリン酸塩緩衝液(pH 7)中に5 mg/ml の
濃度に溶解した。PierceからのSMCC試薬をジメチルホル
ムアミド(DMF) 中に25 mg/mlの濃度に溶解し、そして得
られた溶液を1:50のモル比で BSA溶液に添加した。
せ、必要な免疫原を作製した。より詳しくは、ペプチド
中の生来のシステインのSH基と担体タンパク質中のリジ
ン残基のε-NH2基の両方と反応するスクシンイミジル４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート(SMCC)を介して、ペプチドN17Kをウシ血清
アルブミン(BSA) と結合させた。Serva からのウシ血清
アルブミンを0.1Mリン酸塩緩衝液(pH 7)中に5 mg/ml の
濃度に溶解した。PierceからのSMCC試薬をジメチルホル
ムアミド(DMF) 中に25 mg/mlの濃度に溶解し、そして得
られた溶液を1:50のモル比で BSA溶液に添加した。
【００４１】室温で１時間インキュベートした後、予め
0.1Mリン酸塩緩衝液(pH 6)で平衡化されているBio-Rad
からのBiogel P2 カラムの分子篩を通過させることによ
り、種々の試薬を分離した。次いで30:1のモル比におい
てペプチドをBSA-SMCC溶液に導入し、そして反応混合物
を４℃で12時間インキュベートした。
0.1Mリン酸塩緩衝液(pH 6)で平衡化されているBio-Rad
からのBiogel P2 カラムの分子篩を通過させることによ
り、種々の試薬を分離した。次いで30:1のモル比におい
てペプチドをBSA-SMCC溶液に導入し、そして反応混合物
を４℃で12時間インキュベートした。
【００４２】予めリン酸塩緩衝化塩溶液(PBS; pH7.2)で
平衡化されているBio-Rad からのBiogel P4 カラムの分
子篩に反応混合物を通過させることにより、こうして得
られた免疫原を精製した。４匹のBALB/cマウスに、完全
フロイントアジュバントに混和された50μg の免疫原を
一ヵ月おきに接種した。半分は皮下に、そして残りの半
分は腹腔内に注射した。
平衡化されているBio-Rad からのBiogel P4 カラムの分
子篩に反応混合物を通過させることにより、こうして得
られた免疫原を精製した。４匹のBALB/cマウスに、完全
フロイントアジュバントに混和された50μg の免疫原を
一ヵ月おきに接種した。半分は皮下に、そして残りの半
分は腹腔内に注射した。
【００４３】３．抗体の特徴づけ ヨウ素-125で同位体標識されたグリシル−Ｌ−チロシン
(GT)と結合された放射性トレーサー（ここではペプチド
N17K) を結合する能力を使うことにより、得られた抗体
を特徴づけた。
(GT)と結合された放射性トレーサー（ここではペプチド
N17K) を結合する能力を使うことにより、得られた抗体
を特徴づけた。
【００４４】まず、0.1Mリン酸塩緩衝液(pH7.0) 中のグ
リシル−Ｌ−チロシン(GT; Sigmaから) の20ミリモル溶
液を調製し、そしてジメチルホルムアミド(DMF) 中25 m
g/mlのSMCC(Pierce から) 溶液を1:1 のモル比において
前記GT溶液に添加した。得られた反応混合物を20℃で２
時間インキュベートした。
リシル−Ｌ−チロシン(GT; Sigmaから) の20ミリモル溶
液を調製し、そしてジメチルホルムアミド(DMF) 中25 m
g/mlのSMCC(Pierce から) 溶液を1:1 のモル比において
前記GT溶液に添加した。得られた反応混合物を20℃で２
時間インキュベートした。
【００４５】形成したGT-SMCC 接合体を逆相高圧液体ク
ロマトグラフィー(HPLC)により精製し、次いで0.1Mリン
酸塩緩衝液(pH6.0) 中の0.5 ミリモル溶液中のペプチド
N17Kと1:1 のモル比においてカップリングさせた。４℃
で12時間インキュベートした後、生じたN17K-SMCC-GTを
逆相HPLCにより精製した。得られたN17K-SMCC-GTトレー
サー系をクロラミンＴ法によりヨウ素-125で標識し、そ
して再び高圧液体クロマトグラフィーにより精製した。
ロマトグラフィー(HPLC)により精製し、次いで0.1Mリン
酸塩緩衝液(pH6.0) 中の0.5 ミリモル溶液中のペプチド
N17Kと1:1 のモル比においてカップリングさせた。４℃
で12時間インキュベートした後、生じたN17K-SMCC-GTを
逆相HPLCにより精製した。得られたN17K-SMCC-GTトレー
サー系をクロラミンＴ法によりヨウ素-125で標識し、そ
して再び高圧液体クロマトグラフィーにより精製した。
【００４６】図１は、N17K-SMCC-BSA 接合体で免疫処置
されたマウスの抗血清を用いて得られた結果を示す。よ
り詳しくは、この図は次のようにして得られた。マウス
の抗血清 100μl を0.1% BSA-PBS緩衝液混合物(pH 7.2)
で1:1000希釈した。この希釈液に、同じ緩衝液中の同位
体標識N17K-SMCC-GTトレーサー50μl と共に ─第一の場合はペプチドN17K 50μl 、 ─第二の場合はHIV-1 BRU 株の P25タンパク質(Transge
neから) 50μl 、そして ─第三の場合はトリプシン処理された P25タンパク質
50μl（これらの成分は通常ヒト血漿中に様々な濃度で
添加される) を添加した。
されたマウスの抗血清を用いて得られた結果を示す。よ
り詳しくは、この図は次のようにして得られた。マウス
の抗血清 100μl を0.1% BSA-PBS緩衝液混合物(pH 7.2)
で1:1000希釈した。この希釈液に、同じ緩衝液中の同位
体標識N17K-SMCC-GTトレーサー50μl と共に ─第一の場合はペプチドN17K 50μl 、 ─第二の場合はHIV-1 BRU 株の P25タンパク質(Transge
neから) 50μl 、そして ─第三の場合はトリプシン処理された P25タンパク質
50μl（これらの成分は通常ヒト血漿中に様々な濃度で
添加される) を添加した。
【００４７】この混合物を４℃で12時間インキュベート
し、そして生成した抗原−抗体複合体を、6000の平均分
子量を有するポリエチレングリコール(REG 6000)の 20%
水溶液の添加により沈澱させ、次いで遠心分離した。最
後に得られた沈澱の放射能を測定した。図１に示される
ように、抗体はペプチドN17Kとトリプシン処理されたP2
5 タンパク質の両者を認識するが、生来の P25タンパク
質には応答しなかった。
し、そして生成した抗原−抗体複合体を、6000の平均分
子量を有するポリエチレングリコール(REG 6000)の 20%
水溶液の添加により沈澱させ、次いで遠心分離した。最
後に得られた沈澱の放射能を測定した。図１に示される
ように、抗体はペプチドN17Kとトリプシン処理されたP2
5 タンパク質の両者を認識するが、生来の P25タンパク
質には応答しなかった。
【００４８】従って、ペプチドN17Kの定量は明らかにHI
V-1 BRU 株の P25タンパク質の測定を可能にするが、こ
の断片と構造的相同性を示すHIV-1 ウイルスの他の株全
てにおける P25タンパク質の測定も可能にするであろ
う。
V-1 BRU 株の P25タンパク質の測定を可能にするが、こ
の断片と構造的相同性を示すHIV-1 ウイルスの他の株全
てにおける P25タンパク質の測定も可能にするであろ
う。
【００４９】実施例２：脂肪親和性下垂体ホルモン（Ｌ
ＰＨ）の測定 NH2-末端ヘキサペプチド(E6R) Glu-Leu-Thr-Gly-Gln-Ar
g に対して惹起された抗体を用いる脂肪親和性下垂体ホ
ルモンのイムノアッセイ方法を開発した。このペプチド
はトリプシン生成断片に対応するが、NBRFおよびGENPRO
データベース中に記憶されているタンパク質のアミノ酸
配列のいずれとも有意な相同性を示さない。
ＰＨ）の測定 NH2-末端ヘキサペプチド(E6R) Glu-Leu-Thr-Gly-Gln-Ar
g に対して惹起された抗体を用いる脂肪親和性下垂体ホ
ルモンのイムノアッセイ方法を開発した。このペプチド
はトリプシン生成断片に対応するが、NBRFおよびGENPRO
データベース中に記憶されているタンパク質のアミノ酸
配列のいずれとも有意な相同性を示さない。
【００５０】この断片のCOOHおよびNH2 末端に対して特
異的に向けられた抗体を生産するため、システインのSH
基を介してこのペプチドを担体タンパク質に結合させる
ことを可能にするためにもとの断片中に存在していたグ
リシン残基がシステイン残基により置換されたアミノ酸
配列Glu-Leu-Thr-Cys-Gln-Arg を有するペプチドを用い
て、動物を免疫処置した。
異的に向けられた抗体を生産するため、システインのSH
基を介してこのペプチドを担体タンパク質に結合させる
ことを可能にするためにもとの断片中に存在していたグ
リシン残基がシステイン残基により置換されたアミノ酸
配列Glu-Leu-Thr-Cys-Gln-Arg を有するペプチドを用い
て、動物を免疫処置した。
【００５１】スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート(SMCC)
は、ペプチドの生来のまたは付加されたシステイン残基
のSH基と、担体タンパク質中に存在するリジン残基のε
-NH2基の両方と反応するので、SMCCを用いてこのカップ
リングを行った。
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート(SMCC)
は、ペプチドの生来のまたは付加されたシステイン残基
のSH基と、担体タンパク質中に存在するリジン残基のε
-NH2基の両方と反応するので、SMCCを用いてこのカップ
リングを行った。
【００５２】Serva からのウシ血清アルブミン(BSA) を
0.1Mリン酸塩緩衝液(pH 7)中に 5 mg/mlの濃度に溶解し
た。PierceからのSMCC試薬をジメチルホルムアミド(DM
F) 中に25 mg/mlの濃度に溶解し、そしてSMCC溶液を1:5
0のモル比においてBSA 溶液に添加した。
0.1Mリン酸塩緩衝液(pH 7)中に 5 mg/mlの濃度に溶解し
た。PierceからのSMCC試薬をジメチルホルムアミド(DM
F) 中に25 mg/mlの濃度に溶解し、そしてSMCC溶液を1:5
0のモル比においてBSA 溶液に添加した。
【００５３】室温で１時間インキュベートした後、予め
0.1Mリン酸塩緩衝液(pH 6)で平衡化されているBio-Rad
からのBiogel P2 カラムの分子篩を通過させることによ
り、種々の試薬を分離した。次いで30:1のモル比におい
てペプチドをBSA-SMCC溶液に導入し、反応混合物を４℃
で12時間インキュベートした。
0.1Mリン酸塩緩衝液(pH 6)で平衡化されているBio-Rad
からのBiogel P2 カラムの分子篩を通過させることによ
り、種々の試薬を分離した。次いで30:1のモル比におい
てペプチドをBSA-SMCC溶液に導入し、反応混合物を４℃
で12時間インキュベートした。
【００５４】予めリン酸塩緩衝化塩溶液(PBS; pH7.2)で
平衡化されているBio-Rad からのBiogel P4 カラムの分
子篩に反応混合物を通過させることにより、形成された
免疫原を精製した。
平衡化されているBio-Rad からのBiogel P4 カラムの分
子篩に反応混合物を通過させることにより、形成された
免疫原を精製した。
【００５５】８匹のBALB/cマウスに、完全フロイントア
ジュバント中に混和された50および250μg の免疫原を
一ヵ月おきに皮下注射により接種した。それらの動物の
うちの２匹が、脂肪親和性下垂体ホルモンを測定するの
に使用することができる抗体を生産した。
ジュバント中に混和された50および250μg の免疫原を
一ヵ月おきに皮下注射により接種した。それらの動物の
うちの２匹が、脂肪親和性下垂体ホルモンを測定するの
に使用することができる抗体を生産した。
【００５６】血清試料をトリプシンで処理してNH2-末端
ペプチドを遊離させ、そしてこのペプチドと、SMCCを介
してグリシル−Ｌ−チロシン(GT)（ここでGTは放射性ヨ
ウ素-125で標識されている）に結合された同じペプチド
との間の競合に基づいて測定を行った。イムノアッセイ
の結果を図２に示す。
ペプチドを遊離させ、そしてこのペプチドと、SMCCを介
してグリシル−Ｌ−チロシン(GT)（ここでGTは放射性ヨ
ウ素-125で標識されている）に結合された同じペプチド
との間の競合に基づいて測定を行った。イムノアッセイ
の結果を図２に示す。
【００５７】この実施例は、本発明の方法が、免疫処置
のために十分に多量の適当に純粋なタンパク質を得るこ
とが困難である脂肪親和性下垂体ホルモンのイムノアッ
セイに使用できることを示す。
のために十分に多量の適当に純粋なタンパク質を得るこ
とが困難である脂肪親和性下垂体ホルモンのイムノアッ
セイに使用できることを示す。
【図１】図１は、免疫原N17K-SMCC-BSA 接合体で免疫処
置されたマウスの抗血清の、N17K, P25 またはトリプシ
ン処理されたP25 とN17K-SMCC-GT（ここでGTはヨウ素-1
25で標識されている）との間の競合に基づくイムノアッ
セイの結果を示す。
置されたマウスの抗血清の、N17K, P25 またはトリプシ
ン処理されたP25 とN17K-SMCC-GT（ここでGTはヨウ素-1
25で標識されている）との間の競合に基づくイムノアッ
セイの結果を示す。
【図２】図２は、免疫原E6R-SMCC-BSA接合体で免疫処置
されたマウスの抗血清をトリプシンで処理して遊離させ
たNH2-末端ペプチドと、SMCCを介してGT（ここでGTは放
射性ヨウ素-125で標識されている）に結合された同じペ
プチドとの間の競合に基づくイムノアッセイの結果を示
す。
されたマウスの抗血清をトリプシンで処理して遊離させ
たNH2-末端ペプチドと、SMCCを介してGT（ここでGTは放
射性ヨウ素-125で標識されている）に結合された同じペ
プチドとの間の競合に基づくイムノアッセイの結果を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ミッシェル デラジュ フランス国，13001 マルセイユ，リュ アドルフ−ティエ，16
Claims (16)
- 【請求項１】 タンパク質の同定または測定方法であっ
て、必要であれば免疫原性にされたペプチドを用いて抗
体を調製し、次いでこうして得られた抗体を使って着目
のタンパク質を決定し、それらを含有し且つ前記ペプチ
ドを遊離させるために処理した試料を用いて開始するこ
とを含んで成り、前記ペプチドが、酵素処理によって遊
離され得るタンパク質断片またはタンパク質の一部分と
して前記タンパク質の既知の配列から選択され、その後
で合成により調製されることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記ペプチドが６〜３０個のアミノ酸残
基を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記ペプチドが６〜２０個のアミノ酸残
基を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の
方法。 - 【請求項４】 前記ペプチドがＣ−末端、Ｎ−末端また
は非末端の断片に対応することを特徴とする、請求項１
〜３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】 選ばれた前記ペプチドが変更される、請
求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 前記ペプチドが１または複数のアミノ酸
の置換により変更される、請求項１〜５のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項７】 前記ペプチドが１または複数のアミノ酸
の付加により変更される、請求項１〜５のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項８】 前記ペプチドが１または複数のアミノ酸
の削除により変更される、請求項１〜５のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項９】 選ばれた前記ペプチドが、タンパク質の
アミノ酸配列中に重複を有するが断片の形では天然に存
在しないことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一
項に記載の方法。 - 【請求項10】 前記ペプチドが単一のタンパク質に対す
るそれの特異性のために選択されることを特徴とする、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項11】 前記ペプチドがタンパク質ファミリーに
対するそれの特異性のために選択されることを特徴とす
る、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項12】 前記ペプチドが重合形において使用され
ることを特徴とする、請求項１〜11のいずれか一項に記
載の方法。 - 【請求項13】 タンパク質の同定のために使用される、
請求項１〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項14】 タンパク質の測定のために使用される、
請求項１〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項15】 前記タンパク質がＨＩＶウイルスのＰ２
５タンパク質であることを特徴とする、請求項１〜14の
いずれか一項に記載の方法。 - 【請求項16】 前記タンパク質がＬＰＨであることを特
徴とする、請求項１〜14のいずれか一項に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| FR9004774A FR2660757B1 (fr) | 1990-04-06 | 1990-04-06 | Procede d'identification ou de dosage de proteines et applications. |
| FR9004774 | 1990-04-06 |
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| ATE23169T1 (de) * | 1983-07-21 | 1986-11-15 | Scripps Clinic Res | Synthetische polypeptide, die gehirnspezifischen mrnas translatierten proteinoidabschnitten entsprechen, sowie ihre anwendung fuer rezeptoren, methoden und diagnostik. |
| US4798787A (en) * | 1984-09-19 | 1989-01-17 | Cetus Corporation | Peptide antibodies and their use in detecting oncogene products |
| US4658022A (en) * | 1985-08-08 | 1987-04-14 | Molecular Diagnostics, Inc. | Binding of antibody reagents to denatured protein analytes |
| US4795702A (en) * | 1986-02-05 | 1989-01-03 | Immunogon Associates | Diagnostic method for gonorrhea by assay of IgA1 fragments |
| WO1987007957A1 (en) * | 1986-06-20 | 1987-12-30 | The Regents Of The University Of California | Low-level detection of human immunodeficiency virus |
| DE68925923T2 (de) * | 1988-06-10 | 1996-11-14 | Merck & Co Inc | Antigene der einzigen Spaltungsstelle von Fibrinogen durch Elastase |
-
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-
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- 1993-05-17 US US08/061,350 patent/US5449601A/en not_active Expired - Lifetime
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- 1995-12-12 GR GR950403500T patent/GR3018371T3/el unknown
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