JPH0519654B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の利用分野） 本発明は微小なイオン感応部をワンチツプ上に
少なくとも２種有し部分的に酵素活性を有するバ
イオセンサの製造方法に関する。

（従来技術） １チツプ上に２種のイオン感応部を有し一方の
みに酵素活性を有するものとしては先に本発明者
は以下のような提案をしている。ここでは、イオ
ン感受性電界効果型トランジスタ（ISFFT）の
ウエハなどの全面にあらかじめ形成された酵素固
定膜に一対の電極の一方のみを酵素活性を有する
様にするため、石英製フオトマスクでおおつて酵
素活性を持たせる部分のみを光が当らないように
してから光を照射し、残部、とりわけもう一方の
イオン感受部の酵素活性を失活させる事で作動電
極を作成する方法であつた。

この方法の場合酵素膜に光照射をするのみで一
対のイオン感応部の一方を酵素活性測定用、他方
を比較用に出来るため簡単に作動型バイオセンサ
を提供する事が出来る。反面、使用した酵素薬剤
の殆んどは失活するため薬剤使用量が多いこと
と、基本的に２種類以上の基質を同時に測定する
マルチバイオセンサの製作が不可能である欠点を
有していた。

又、１つのチツプ上に２種以上の酵素を固定化
した例については現在まで報告はない。

（発明の目的） 本発明はワンチツプに２つ以上のイオン感応部
を有する素子を用いたマルチバイオセンサの効果
的かつ経済的な製造方法を提供するものである。

（発明の構成） 本発明は、チツプ上に複数のイオン感応部を形
成し、少なくとも１種の酵素を固定化するバイオ
センサの製造方法において、イオン感応部以外の
部分をあらかじめ疎水性樹脂で被覆せしめた後、
前記イオン感応部に酵素含有液を保持せしめるこ
とによつて固定化酵素膜を形成することを特徴と
するバイオセンサの製造方法。

（構成の詳細な説明） 本発明によれば通常では固定化酵素を形成させ
るのが困難な非常に微細なイオン感応部への酵素
の固定化が可能となる。電極上へ酵素を固定化す
る方法のうち良く知られているのは酵素を可溶性
タンパクと混合しグルタール・アルデヒドなどで
架橋する方法である。可溶性タンパクとしてアル
ブミンを使つた例がM.マツシーニとG.G.ギルボ
ー（M.Mascini and G.G. Guil−baut）によつ
てアナリテイカル・ケミストリー第49巻、６号、
1977年５月（Analytical Chemistry，Vol.49、
No.６）に述べられている。ここでは、ウレアーゼ
を固定化して尿素測定用電極を得ている。文献中
でマツシーニらは、酵素をアルブミンと混合した
ものを電極へ塗付する寸前にグルタールアルデヒ
ドと混合、素早く電極表面へ塗付する様に指示し
ている。本法によると架橋は大気中で速やかに反
応するため粘性がすぐに大きくなる。マツシーニ
らはアンモニアガスセンサーを用いて酵素反応の
結果生成するアンモニアで尿素を定量している。
この場合比較的広い面積に塗付するためまだしも
操作は簡単である。

発明者らが、イオン感応部として使用している
もので最も小さいものはゲート部の大きさが、
50μｍ×400μｍ位のものが、250μｍ間隔で２つ並
んでいる、全体で巾が0.6mmのデユアル型ISFET
である。この構造を第２図に示す。第２図で１１
はサフアイア基板、１２はリード線取り出し部、
１３はドレイン領域、１４はゲート部、１５はソ
ース領域である。

この一方のみに固定化酵素を保持させるのは従
来困難とされていた。例えば先に示したマツシー
ニらの方法では固定化酵素用混合物の粘りが強く
細い針状センサの一方のみに酵素をつける事はわ
けても困難である。

本発明者らは実用性の低い酵素固定化法を解決
するためマツシーニらの方法を改良、先に酵素と
アルブミンの混合液を一方のゲート上へ保持、続
いてグルタールアルデヒドをその上へつける事で
架橋させる方法を見出した。しかしながらこの場
合アルブミンと酵素の混合液の半導体表面への塗
れ漏れ非常に良いため付着させるのは容易である
がセンサ全域に酵素膜が流れることが判明した。

本発明者らはかかる微小領域で選択的に酵素を
固定化する方法について検討した結果、酵素を固
定化する部分以外をあらかじめ疎水性ポリマーで
被覆することで前記酵素アルブミン混合物をマス
クロシリンダによつてゲート上へピペツテイング
する方法を見出した。すなわち通常集積回路のパ
ターニングに使用されるネガ型レジスト材によつ
てゲート部以外が被覆された前記ISFETを有す
るウエハと同じくゲート部以外がフツ素樹脂によ
つて被覆されたウエハを準備し、一対の電極の一
方のみに酵素とアルブミンを含有した溶液をマイ
クロシリンジで保持した。第１図ａに示すのが、
ウエハゲート部における断面図であり基板１上の
イオン感応部２以外の疎水性樹脂３によつて被覆
されている様子を示す。第１図ｂに示すのが一方
のゲート部にシリンジによつてアルブミンと酵素
を含有する酵素含有溶液４を形成せしめた時の断
面であるが、ここに示すようにゲートの横に形成
された樹脂層の疎水性のためはじかれ、ゲート上
にうまく保持されている。なお樹脂については２
種を比較したが、フツ化樹脂の方がすぐれている
事が判明した。これはネガ型レジスト材の材料で
ある環化ゴムよりもフツ素樹脂の方が疎水性が大
きいためであると思われる。

第１図ｂに示した酵素とアルブミン混合液は水
分を失ない、数分で第１図ｃのような酵素含有膜
５が形成される。ひき続きこの上に架橋剤６とし
例えばグルタールアルデヒドを供給すると、やは
り樹脂層にはじかれ先のタンパク膜上に保持され
る（第１図ｄ）。これを数分放置するとタンパク
の架橋は順調に進展し、固定化酵素膜７が形成さ
れる（第１図ｅ）。あとはマツシーニの論文にあ
るように一定時間放置し、水洗、グリシン処理後
バツフアー中で保管した。

この様に本発明を採用する事によつてわずかな
酵素で微小センサー上にうまく酵素を固定化する
ことが可能となつた。

ここで単一の酵素を固定化する差動型バイオセ
ンサについて述べたが、同様の操作を別種の酵素
によつてくり返す事によりワンチツプで同時に多
種の基質を測定するマルチバイオセンサが容易に
提供出来る。

（実施例） ワンチツプ上に３つのゲートを有するISFET
を用いて２つのゲートを各々ウレアーゼ・グルコ
ースオキシダーゼを固定化し、１つをPH電極とす
る事で差動型マルチバイオセンサーを１チツプ化
した。参照電極は本発明者らが「1984年国際素子
材料コンフアレンス（1984 International
Conference on Solid State Devices and
Materials）」に於て「アン インテグレーテツ
ドSOS／FETバイオセンサ」と題して発表した
内容の様に裏面に金電極を擬似参照電極として有
している。

素子の平面図とＡ−A′部分の断面をそれぞれ
第３図ａ，ｂに示す。素子のゲート部以外はフツ
素樹脂であらかじめ被覆してある。酵素を固定化
した時の断面を第４図に示す。

酵素の固定化は前記マツシーニらの方法を基本
的に踏襲した。

すなわち0.2M PH8.5 トリスバツフアーに溶
解した15％のアルブミン液80μに５mgのウレア
ーゼ（ベーリンガーマンハイム社製Lot.No.
1513339、111mg／5000U）を溶解したものに蒸留
水450μを入れたウレアーゼストツク液、同じ
く15％のアルブミン液50μに２mgのグルコース
オキシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製
Lot.No.1273334、90mg／25000U）を溶解蒸留水
450μを入れたグルコースオキシダーゼストツ
ク2.5％グルタールアルデヒド水溶液を固定化酵
素用に準備した。素子表面上へのフツ素樹脂被覆
は以下の手法によつて容易に実現出来た。すなわ
ち、素子の３つのゲート部２２のみをポジ型レジ
スト材によつてあらかじめ被覆した後、全面にフ
ツ素樹脂を塗布した。フツ樹脂の厚みは約5μｍ
程度であつた。

ひき続きアセトンをハク離剤とする事でノボラ
ツク樹脂より成るレジスト材を溶解、同時にゲー
ト上のフツ素樹脂がとり去られた。この様にして
容易にゲート部のみが表面Si₃N₄（窒化シリコン）
層をむき出しにされ、残りはリード線取り出し部
を除外してフツ素樹脂で覆われた素子を得た。

第３図に示す３つのゲート２２のうち左端のゲ
ートにマイクロシリンジで先に述べたウレアーゼ
ストツクを約0.05μを導いた。結果は第１図ｂ
に示す様にうまく保持された。

ひき続きグルコースオキシダーゼストツクを右
端のゲート表面へ導いたが、結果は同じく第１図
ｂに示す様にうまく保持された。上記２つの操作
に要した時間は約１分である。両ストツク液をゲ
ート上へ保持してから５分経過後第１図ｃに示す
様に両方のゲート上には酵素とアルブミンの膜が
形成され続いて同様マイクロシリンジで2.5％グ
ルタールアルデヒド水溶液を第１図ｄの様に酵素
とアルブミンで出来た膜の上へ導いた。

このまま15分放置して第１図ｅに示す酵素固定
化膜を得た。この素子を用いて測定した結果を第
５図第６図に示す。測定値は差動であり第３図左
端と中央のゲート電圧の差が尿素センサ出力で右
端と中央のゲート電圧の差がグルコースセンサ出
力である。測定結果は良好でこのマルチセンサの
優秀性を示している。なお尿素に対するグルコー
スセンサ、グルコースに対する尿素センサの応答
はゼロ近辺であつた。

（発明の効果） 今まで述べてきた様に本発明は酵素の消費量を
少なくし、かつ簡単にマルチバイオセンサを得る
事の出来る画期的発明である。ゲート部以外に疎
水性を持たせるにはここで示した様にフツ素樹脂
などの疎水性の強い樹脂を表面に形成させる方法
が最も効果的であり、又更にセンサの保護にも役
立つ。

しかしながらこれらにとどまらず例えばゲート
部以外にワツクスなどを塗付する事によつてもこ
れと同等の効果をもたらすことも明白である。

【図面の簡単な説明】

第１図ａ〜ｅは本発明の方法を説明する概略
図、第２図はイオン感受性のFETの概略図であ
る。第３図ａ，ｂは、３つのイオン感応部を持ち
共通ドレインを持つイオン感受性FETの概略図。
第４図は、マルチバイオセンサのゲート部断面図
である。第５図はFETのゲート電圧の差出力と
尿素濃度の相関図、第６図はFETのゲート電圧
の差出力とグルコース濃度の相関図を示す。 図中、１は基板、２はイオン感応部、３は疎水
性樹脂、４は酵素含有溶液、５は酵素含有膜、６
は架橋剤、７は固定化酵素膜、１２はリード線取
り出し部、１３，２３はドレイン領域、１４，２
２はゲート部、１５，２１はソース領域、３０は
ウレアーゼ固定化膜、３１はグルコースオキシダ
ーゼ固定化膜。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ １チツプ上に複数のイオン感応部を形成し、
   少なくとも１種の酵素を固定化するバイオセンサ
   の製造方法において、イオン感応部以外の部分を
   あらかじめ疎水性樹脂で被覆せしめた後、前記イ
   オン感応部に酵素含有液を保持せしめることによ
   つて固定化酵素膜を形成することを特徴とするバ
   イオセンサの製造方法。 ２ 酵素含有液が少なくとも酵素を含有する第１
   の液と、該第１の液に含有される酵素またはこの
   酵素とそれ以外の物質を架橋せしめる第２の液と
   からなる特許請求の範囲第１項記載のバイオセン
   サの製造方法。 ３ 第１の液をまずイオン感応部に塗付し、その
   あと第２の液を含浸せしめる特許請求の範囲第２
   項記載のバイオセンサの製造方法。 ４ 第１の液が酵素と可溶性タンパクを緩衡液に
   溶解した液で、第２の液が分子の両側に反応基を
   有する化合物を含む液である特許請求の範囲第２
   項又は第３項記載のバイオセンサの製造方法。 ５ 可溶性タンパクがアルブミンである特許請求
   の範囲第４項記載のバイオセンサの製造方法。 ６ 分子の両側に反応基を有する化合物がグルタ
   ール・アルデヒドである特許請求の範囲第４項記
   載のバイオセンサの製造方法。