JPS63241346A - プレ−ナ型バイオセンサの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は固体の平坦な表面に形成された電気化学センサ
の表面に酵素固定化膜が設けられてなるプレーナ型バイ
オセンサの製造方法に関するものである。

（従来の技術） 従来、溶液中の特定の有機物の濃度を測定する半導体バ
イオセンサの一種に半導体電界効果型イオンセンサ（以
下ｒ　ｌ５ＦＥＴ　Ｊという）の表面に酵素を固定化し
た膜が設けられたものが知られている。

このバイオセンサは、溶液中の特定の有機物が酵素固定
化膜中で酵素の触媒作用により化学反応をした時に生じ
る水素イオン濃度の変化をｌ５ＦＥＴで検出することに
より、特定の有機物の濃度を測定するものである。この
選択性をもつ酵素固定化膜の例として、尿素検出用とし
てウレアーゼ固定化膜、グルコース検出用としてグルコ
ースオキシダーゼ膜などが知られている（センサーズ・
アンド・アクチュエイターズ（Ｓｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ
　Ａｃｔｕａｔｏｒｓ）第７膜１頁〜１０頁（１９８５
））。また、サファイア基板上に設けられた島状シリコ
ンを用いて酵素固定化膜が設けられたｌ５ＦＥＴと失活
した酵素固定化膜が設けられたｌ５ＦＥＴを同一チップ
上に形成し、裏面に参照電極として金電極を設けること
により、ワンチップ化されたバイオセンサをも開発され
ている（第１６回、１９８４　インタナショナル・カン
ファレンス・オン・ソリッド・ステート・デバイシズ・
アンド・マテリアルズ、レイト・ニューズ・アブストラ
クツ（１９８４ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅ
ｒｅｎｃｅ　ｏｎ　５ｏｌｉｄ　５ｔａｔｅ　Ｄｅｖｉ
ｃｅｓ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ。

Ｌａｔｅ　Ｎｅｗｓ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）６６頁〜６
７頁（１９８４））。

また、絶縁基板上に形成された基金属電極上に酵素固定
化膜を設け、酵素反応によって生じた過酸化水素をアン
ペロメトリーによって計測するという原理に基いたバイ
オセンサも、グルコース測定用のものが発表されている
（第４回化学センサー研究発表会予稿集２１〜２２頁（
１９８５））。いずれのタイプのセンサ基板上に微小な
ホストセンサを形成し、この上に酵素固定化膜を設ける
ことによりセンサの微小化を図っている。

以上述べてきたようなｌ５ＦＥＴ型バイオセンサやア°
ンペロメトリックバイオセンサのようなプレーナ型バイ
オセンサを製造するにあたり問題となるのは、酵素固定
化膜の形成法である。従来のバイオセンサ、例えばクラ
ーク型酸素電極をホストセンサにしたグルコースセンサ
では、グルコースオキシダーゼを含有する膜をあらかじ
め作製しておき、これを適当な大きさに裁断して電極表
面に装着するといった方法が採用されているが、このよ
うな方法はホストセンサが微小なプレーナ型センサに適
用できない。プレーナ型センサ用の酵素固定化膜形成方
法としてはりフトオフ法（特願昭５９−２０９１６５）
感光性ポリビニルアルコールを用いる方法（第４回化学
センサー研究発表会予稿集２１〜２２頁（１９８５））
、三酢酸セルロースを担体とした酵素固定化膜をウェハ
全面に形成した後ホストマスクを介して紫外線を照射、
所定のｌ５ＦＥＴ上以外の酵素固定化膜中の酵素を失活
させる方法（第１６回、１９８４インターナシヨナル・
カンファレンス・オン・ソリッド・ステート・デバイシ
ズ・アンド・マテリアルズ・レイト・ニューズ・アブス
トラクツ（１９８４ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎ
ｆｅｒｅｃｎｃｅ　ｏｎ　５ｏｌｉｄ　５ｔａｔｅ　Ｄ
ｅｖｉｃｅｓ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ。

Ｌａｔｅ　Ｎｅｗｓ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）６６〜６７
頁（１９８４））などが知られている。

バイオセンサを実際の測定に供した場合問題となるのは
、測定対象中に存在する被測定物質以外の物質がセンサ
の出力に与える影響である。

ｌ５ＦＥＴをホストセンサとしたプレーナ型バイオセン
サ場合では測定対象のｐＨ、アンペロメトリックセンサ
の場合は測定対象中に存在する酸化還元物質がセンサの
出力に影響を及ぼすものと考えられる。このような影響
を回避するためにとられる手段として、センサの差動出
力を計測することが一般に行なわれている。すなわち、
２つのホストセンサのうち、一方のセンサには酵素固定
化膜を設け（このようなセンサを以後作用センサという
）、他方には何も設けないか酵素活性をもたない膜を設
け（このようなセンサを以後参照センサという）、測定
に際しては作用センサの出力と参照センサの出力との差
、いわゆる差動出力を計測するのである。

この方式に従えば、被測定物質以外の要因からの影響は
消去され、差動出力は被測定物質の濃度のみに依存する
と考えられる。参照センサには酵素活性を除いては作用
センサと同じ性質をもつ膜を形成することが理想である
。参照センサを製造すｉンンブ に酵素固定化膜を形成する方法、酵素を含まない膜を参
照センサ上に設ける方法が広く行なわれてきた。さらに
、参照センサ上に形成された酵素固定化膜に紫外線を照
射し酵素を失活させる方法も提案されている（特願昭５
９−１５６１２３）。

（発明が解決しようとする問題点） 以上述べてきたようにプレーナ型バイオセンサの製造に
あたっては、微小な２つのホストセンサの一方に活性な
酵素固定化膜を設は作用センサとし、他方のホストセン
サ上には不活性な膜にて参照センサとする技術が必要で
ある。紫外線で酵素固定化膜中の酵素を失活させる方法
は、参照センサ上の酵素固定化膜と作用センサ上の酵素
固定化膜が似通った性質であると考えられる優れた方法
であるが、酵素の失活に長時間を要するという欠点があ
った。また失活した酵素を含む酵素固定化膜を形成する
。例えばリフトオフ法を繰り返し適用することで実現で
きるが（特願昭５９−２０９１６５）別途失活させた酵
素を用意する必要がある上、リフトオフ法を２度行なわ
なければならないため製造工程が煩雑となる。

（問題点を解決するための手段） 以上の問題点を解決するための手段として本発明は固体
の平坦な表面に形成された２つ以上の電気化学センサ例
えばｌ５ＦＥＴ、資金ｇｌ電極などの表面に酵素固定化
膜が設けられてなるプレーナ型バイオセンサの製造方法
において、 （ａ）電気化学センサが形成された固体の平坦な表面上
に有機溶剤に可溶なフォトレジストを塗布した後、ファ
トリソグラフィー法により所定の電気化学センサの表面
のフォトレジストを除く工程と、 （ｂ）前記工程を経た固体表面に酵素と架橋剤を含む蛋
白質溶液をスピン塗布して前記固体表面に酵素固定化膜
を形成する工程と、 （Ｃ）前記工程を経た固体表面に有機溶剤に可溶なポジ
型フォトレジストを塗布し、所定の電気化学センサ上を
露光してから前記固定を前記ポジ型レジスト用の現像液
に浸漬して、ポジ型レジストのうち露光された部分のポ
ジ型フォトレジストを取り除きかつ前記電気化学センサ
上にある酵素固定化膜と前記現像液を接触させて前記酵
素固定化膜中の酵素を失活させる工程と、 （ｄ）さらに前記工程を経た固定表面を前記フォトレジ
ストと前記ポジ型フォトレジストを溶解する有機溶剤で
処理して前記フォトレジストと前記ポジ型フォトレジス
トを溶解して所定の電気化学センサの表面以外に存在す
る酵素固定化膜リフトオフする工程、 とを備えることを特徴とするプレーナ型バイオセンサの
製造方法を提供するものである。

（作用） 上述の製造方法ではポジ型フォトレジスト現像液と酵素
固定化膜を接触させることにより、酵素固定化膜中の酵
素を失活させる。通常のポジ型フォトレジスト現像液の
ｐＨは１３以上であり、このような高ｐＨに露させるこ
とにより酵素は失活する。電気化学センサ上に形成され
た酵素固定化膜のうちのどれを失活させるかは、露光に
より決定することができ、露光されなかった部分では酵
素固定化膜はポジ型フォトレジストに被われており、現
像液とは接触せず、酵素固定化膜中の酵素は何ら影響を
受けない。

（実施例） 以下本発明の実施例について図面を参照して説明する。

第１図は本発明によるプレーナ型バイオセンサ製造方法
の一実施例の工程説明図で、サファイア基板上に形成さ
れた２つ１組のｌ５ＦＥＴをホストセンサとしてグルコ
ースセンサを形成する場合について示しである。第１図
（ａ）〜（Ｏにおいて１は有機溶剤可溶性のフォトレジ
スト膜、２は参照センサ用ｌ８ＦＥＴ、３は作用センサ
用ｌ５ＦＥＴ、４はサファイア基板、５は酵素固定化膜
、６は失活した酵素固定化膜である。次に製造工程を順
を追って説明する。サファイア基板にｌ５ＦＥＴが形成
されてなるウェハの表面にフォトレジスト膜、例えば東
京応化製０ＦＰＲ−８００（商品名）をスピン塗布する
（図１（ａ））。このフォトレジストはアセトン可溶性
である。次に、フォトマスクを用い露光、現像により参
照センサ用ｌ５ＦＥＴ２、作用センサ用ｌ５ＦＥＴ３双
方の表面のフォトレジスト膜を除去する（第１図（ｂ）
）。

その後、親水性プライマ、例えばＹ−アミノプロピルト
リエトキシシランの１％水溶液をウェハ上にスピン塗布
し、１１０°Ｃで５分間熱処理を行ない、酵素固定化膜
が設けられるｌ５ＦＥＴの表面にＹ−アミノプロピルト
リエトキシシランを結合させる。このウェハを５％グル
タルアルデヒド水溶液に１５分間浸漬し、次に、酵素と
架橋剤を含む蛋白質溶液、例えば尿素を検出する場合に
は３００ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミンを含む０．１Ｍピ
ペラジン−Ｎ、　Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸
）−水酸化ナトリウム（ｐＨ６，８）２体積部に５０ｍ
ｇ／ｍｌのウレアーゼ（マイルスラボラトリーズ製５３
Ｕ／ｍｇ）水溶液１体積部を加え、さらに２ｗｔ％グル
グルアルデヒド水溶液１体積部を加えた後よく混合した
溶液９００ｐｌをスピン塗布する。３０分間常温で放置
してグルタルアルデヒドによる架橋反応を完了させて酵
素固定化膜５（図１（ｅ））を形成する。さらにこの上
に再度フォトレジストをスピン塗布した後（図１（ｄ）
）、フォトマスクを用いて露光してから現像して参照用
ｌ５ＦＥＴ上に形成された酵素固定化膜を被っているフ
ォトレジスト膜を除去する（第１図（ｅ））。この時参
照センサ用ｌ５ＦＥＴ上に形成された酵素固定化膜は現
像液を接触する。本実施例では現像液に東京応化製ＮＭ
Ｄ−３を用いたが、この現像液のｐＨは１３以上であり
、このような高いｐＨに露された参照センサ用ｌ５ＦＥ
Ｔ上の酵素固定化膜に含まれる酵素完全に失活する。現
像終了後ウェハをアセトン中に浸漬し超音波洗浄器を用
いて２分間超音波処理を行なうと、フォトレジスト膜１
はアセトン中に）容出し、それとともにフォトレジスト
膜１の上に形成された酵素固定化膜も剥離する。その結
果参照ｌ５ＦＥＴ２上に形成された失活した酵素固定化
膜６および作用ｌ５ＦＥＴ３上に形成された酵素固定化
膜のみが残る（図１（Ｏ）。以上の工程により製造した
グルコースセンサを実装してその応答特性を評価した結
果、参照センサはグルコースに対して何ら応答を示さな
いが、測定試料のｐＨ変化に対しては作用センサと全く
同じ挙動を示すことが確認された。

（発明の効果） 本発明の方法によれば作用センサ上に活性な酵素固定化
膜、参照センサ上に失活した酵素固定化膜を正確かつ容
易に形成することができる。作用センサ上および参照セ
ンサ上に形成された酵素固定化膜は参照センサ上に形成
されたものが現像液に接触してその酵素活性を除いては
性状は同じであることが、本発明の方法では工程中双方
の酵素固定化膜が全く同時に形成されることにより保証
されている。従って参照センサ上に形成された酵素固定
化膜はセンサの差動出力を計測する際に理想に近い機能
をもつものと考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）〜（０は本発明の方法を半導体バイオセン
サの製造工程に適用した際の工程説明図。 図において、１はフォトレジスト膜、２は参照用センサ
用ｌ５ＦＥＴ、３は作用センサ用ｌ５ＦＥＴ、　４はサ
ファイア基板、５は酵素固定化膜、６は失活した固定化
第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 固体の平坦な表面に形成された２つ以上の電気化学セン
   サの表面に酵素固定化膜が設けられてなるプレーナ型バ
   イオセンサの製造方法において、（イ）電気化学センサ
   が形成された固体の平坦な表面上に有機溶剤に可溶なフ
   ォトレジストを塗布した後、ファトリソグラフィー法に
   より所定の電気化学センサの表面のフォトレジストを除
   く工程と、 （ロ）前記工程を経た固体表面に酵素と架橋剤を含む蛋
   白質溶液をスピン塗布して前記固体表面に酵素固定化膜
   を形成する工程と、 （ハ）前記工程を経た固体表面に有機溶剤に可溶なポジ
   型フォトレジストを塗布し、所定の電気化学センサ上を
   露光してから前記固定を前記ポジ型レジスト用の現像液
   に浸漬して、ポジ型レジストのうち露光された部分のポ
   ジ型フォトレジストを取り除きかつ前記電気化学センサ
   上にある酵素固定化膜と前記現像液を接触させて前記酵
   素固定化膜中の酵素を失活させる工程と、 （ニ）さらに前記工程を経た固定表面を前記フォトレジ
   ストと前記ポジ型フォトレジストを溶解する有機溶剤で
   処理して前記フォトレジストと前記ポジ型フォトレジス
   トを溶解して所定の電気化学センサの表面以外に存在す
   る酵素固定化膜リフトオフする工程、 とを備えることを特徴とするプレーナ型バイオセンサの
   製造方法。