JPH05176788A - インターロイキン−６の産生方法 - Google Patents
インターロイキン−６の産生方法Info
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- JPH05176788A JPH05176788A JP3221556A JP22155691A JPH05176788A JP H05176788 A JPH05176788 A JP H05176788A JP 3221556 A JP3221556 A JP 3221556A JP 22155691 A JP22155691 A JP 22155691A JP H05176788 A JPH05176788 A JP H05176788A
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- cells
- cell
- interleukin
- producing
- adhesion
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 高収率で安定に産生させることができ、かつ
培養条件を一定に制御することが可能なインターロイキ
ン−６の産生方法を提供する。 【構成】 インターロイキン−６産生細胞でかつ接着依
存性動物細胞を、マイクロキャリヤーもしくは中空糸で
接着培養、あるいはマイクロカプセルで固定化培養す
る。
培養条件を一定に制御することが可能なインターロイキ
ン−６の産生方法を提供する。 【構成】 インターロイキン−６産生細胞でかつ接着依
存性動物細胞を、マイクロキャリヤーもしくは中空糸で
接着培養、あるいはマイクロカプセルで固定化培養す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、インターロイキン−６
の大量産生方法に関する。
の大量産生方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】インターロイキンー６（以下、ＩＬ−６
と略す）は、Ｂリンパ球分化因子、インターフェロンβ
２、２６Ｋ蛋白、ハイブリドーマ／プラズマサイトーマ
増殖因子、あるいは肝細胞刺激因子などとよばれていた
サイトカインの統一名である。ＩＬ−６は、活性化され
たＢ細胞に対し、抗体産生細胞への分化を誘導する。Ｔ
細胞に対しては、マイトジェン刺激を受けたＴ細胞にＩ
Ｌ−２産生を誘導したり、ある種のＴ細胞株や胸腺細胞
にＩＬ−２レセプターを誘導する。造血細胞に対しては
ＩＬ−３存在下でＩＬ−６が造血幹細胞の増殖を相乗的
に誘導する。また、最近、ＩＬ−６はトロンボポエチン
としての作用を有していることが報告されている。この
様にＩＬ−６は、多くの生理活性を有しており、医薬と
しての応用が期待されている。
と略す）は、Ｂリンパ球分化因子、インターフェロンβ
２、２６Ｋ蛋白、ハイブリドーマ／プラズマサイトーマ
増殖因子、あるいは肝細胞刺激因子などとよばれていた
サイトカインの統一名である。ＩＬ−６は、活性化され
たＢ細胞に対し、抗体産生細胞への分化を誘導する。Ｔ
細胞に対しては、マイトジェン刺激を受けたＴ細胞にＩ
Ｌ−２産生を誘導したり、ある種のＴ細胞株や胸腺細胞
にＩＬ−２レセプターを誘導する。造血細胞に対しては
ＩＬ−３存在下でＩＬ−６が造血幹細胞の増殖を相乗的
に誘導する。また、最近、ＩＬ−６はトロンボポエチン
としての作用を有していることが報告されている。この
様にＩＬ−６は、多くの生理活性を有しており、医薬と
しての応用が期待されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】現在ＩＬ−６は、遺伝
子組換え体で産生され提供されている。しかし、遺伝子
組換え大腸菌で産生される物は、糖鎖を有していない。
また、遺伝子組換えＣＨＯ細胞で産生される物は、糖鎖
構造が天然の物と異なる可能性がある。糖鎖構造の差異
は、生理活性や体内動態に影響すると考えられる。天然
ＩＬ−６の生理活性や体内動態などの性質を臨床応用す
るには、天然型ＩＬ−６の大量生産が必要である。天然
型ＩＬ−６は例えば線維芽細胞をある種のサイトカイン
などで刺激することによって産生されることが知られて
いる。後述するような種々の刺激がＩＬ−６を産生させ
ることが報告されているが、必ずしも工業的規模での製
造には充分な産生量を示さない。
子組換え体で産生され提供されている。しかし、遺伝子
組換え大腸菌で産生される物は、糖鎖を有していない。
また、遺伝子組換えＣＨＯ細胞で産生される物は、糖鎖
構造が天然の物と異なる可能性がある。糖鎖構造の差異
は、生理活性や体内動態に影響すると考えられる。天然
ＩＬ−６の生理活性や体内動態などの性質を臨床応用す
るには、天然型ＩＬ−６の大量生産が必要である。天然
型ＩＬ−６は例えば線維芽細胞をある種のサイトカイン
などで刺激することによって産生されることが知られて
いる。後述するような種々の刺激がＩＬ−６を産生させ
ることが報告されているが、必ずしも工業的規模での製
造には充分な産生量を示さない。
【０００４】また従来、正常二倍体線維芽細胞等の接着
依存性細胞の培養方法として、ルー瓶もしくはローラー
瓶を用いる方法が知られているが、この方法では大量の
接着依存性細胞を培養することは極めて困難と考えられ
ている。すなわち、この方法では、細胞はルー瓶の底
面、もしくはローラ瓶の内側面に単層に増殖するだけで
あるため、大量培養には多量の瓶を必要とする。また、
ｐＨや培地中溶存酸素濃度等の培養条件を一定に制御す
ることはほとんど不可能である。本発明の目的は、臨床
応用のために、大量で、かつ培養条件を一定に制御する
ことが可能なＩＬ−６の産生方法を提供することにあ
る。
依存性細胞の培養方法として、ルー瓶もしくはローラー
瓶を用いる方法が知られているが、この方法では大量の
接着依存性細胞を培養することは極めて困難と考えられ
ている。すなわち、この方法では、細胞はルー瓶の底
面、もしくはローラ瓶の内側面に単層に増殖するだけで
あるため、大量培養には多量の瓶を必要とする。また、
ｐＨや培地中溶存酸素濃度等の培養条件を一定に制御す
ることはほとんど不可能である。本発明の目的は、臨床
応用のために、大量で、かつ培養条件を一定に制御する
ことが可能なＩＬ−６の産生方法を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的は、以下の本発
明により達成される。すなわち本発明は、ＩＬ−６産生
細胞でかつ接着依存性動物細胞を、マイクロキャリヤー
もしくは中空糸に接着培養、あるいはマイクロカプセル
に固定化培養することを特徴とするインターロイキン−
６の産生方法である。
明により達成される。すなわち本発明は、ＩＬ−６産生
細胞でかつ接着依存性動物細胞を、マイクロキャリヤー
もしくは中空糸に接着培養、あるいはマイクロカプセル
に固定化培養することを特徴とするインターロイキン−
６の産生方法である。
【０００６】天然型ＩＬ−６は、さまざまな細胞により
恒常的に、あるいは種々の刺激により産生される。具体
的には、ＩＬ−６は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球マクロファ
ージに代表される浮游細胞と、線維芽細胞、骨肉腫細
胞、肺癌細胞、血管内皮細胞に代表される接着依存性細
胞株により産生される。本発明は、接着依存性動物細胞
を用いた天然型ＩＬ−６の生産に関する。本発明は、接
着依存性動物細胞をマイクロキャリヤーもしくは中空糸
などに接着培養し、あるいはマイクロカプセルに固定化
培養し、誘発剤を用いないで恒常的にＩＬ−６を産生さ
せるか、もしくは各種ＩＬ−６の誘発剤で産生刺激する
ことを特徴とするＩＬ−６の産生方法である。
恒常的に、あるいは種々の刺激により産生される。具体
的には、ＩＬ−６は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球マクロファ
ージに代表される浮游細胞と、線維芽細胞、骨肉腫細
胞、肺癌細胞、血管内皮細胞に代表される接着依存性細
胞株により産生される。本発明は、接着依存性動物細胞
を用いた天然型ＩＬ−６の生産に関する。本発明は、接
着依存性動物細胞をマイクロキャリヤーもしくは中空糸
などに接着培養し、あるいはマイクロカプセルに固定化
培養し、誘発剤を用いないで恒常的にＩＬ−６を産生さ
せるか、もしくは各種ＩＬ−６の誘発剤で産生刺激する
ことを特徴とするＩＬ−６の産生方法である。
【０００７】本発明で使用するマイクロキャリヤーは、
マトリックス素材としては特に限定されないが、例え
ば、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、架橋デキスト
ランなどの天然素材、あるいは、ポリスチレンのような
合成樹脂から成るものなどが挙げられる。これらのマイ
クロキャリアーは、荷電化されているものと荷電されて
いないものがあるが、どちらも使用できる。荷電化され
ているものでは、正荷電のものが負荷電のものより好ま
しく、正荷電基としては、例えばジメチルアミノプロピ
ル、ジメチルアミノエチル、トリメチルハイドロキシア
ミノプロピルなどが挙げられる。また、マトリックス素
材をコラーゲンやゼラチンなどでコートしたものも使用
できる。具体的な市販品として、架橋デキストランにジ
メチルアミノエチルを付加した“Ｃｙｔｏｄｅｘ−１”
（ファルマシア社）、架橋デキストランに変性コラーゲ
ンをコートした“Ｃｙｔｏｄｅｘ−３”（ファルマシア
社）があるが、これに限定されるものではない。Ｃｙｔ
ｏｄｅｘ−１”（ファルマシア社）を使用する場合、そ
の濃度（使用量）は培養液対比で０．０５ないし１％の
範囲で選ばれるが、好適には０．２−０．７％の範囲で
適宜選択される。
マトリックス素材としては特に限定されないが、例え
ば、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、架橋デキスト
ランなどの天然素材、あるいは、ポリスチレンのような
合成樹脂から成るものなどが挙げられる。これらのマイ
クロキャリアーは、荷電化されているものと荷電されて
いないものがあるが、どちらも使用できる。荷電化され
ているものでは、正荷電のものが負荷電のものより好ま
しく、正荷電基としては、例えばジメチルアミノプロピ
ル、ジメチルアミノエチル、トリメチルハイドロキシア
ミノプロピルなどが挙げられる。また、マトリックス素
材をコラーゲンやゼラチンなどでコートしたものも使用
できる。具体的な市販品として、架橋デキストランにジ
メチルアミノエチルを付加した“Ｃｙｔｏｄｅｘ−１”
（ファルマシア社）、架橋デキストランに変性コラーゲ
ンをコートした“Ｃｙｔｏｄｅｘ−３”（ファルマシア
社）があるが、これに限定されるものではない。Ｃｙｔ
ｏｄｅｘ−１”（ファルマシア社）を使用する場合、そ
の濃度（使用量）は培養液対比で０．０５ないし１％の
範囲で選ばれるが、好適には０．２−０．７％の範囲で
適宜選択される。
【０００８】本発明で使用する中空糸としては、修飾セ
ルロースなどを使用したものなどがあり、例えば、“Ｖ
ｉｔａｆｉｂｅｒ”（アミコン社）などが挙げられる。
マイクロカプセルは、水透過性のあるゲルを形成するコ
ラーゲンやアルギン酸ソーダを用いて、内部に細胞を包
埋して形成する（A. Klausner, Bio/technol., 1,736(1
983)) 。
ルロースなどを使用したものなどがあり、例えば、“Ｖ
ｉｔａｆｉｂｅｒ”（アミコン社）などが挙げられる。
マイクロカプセルは、水透過性のあるゲルを形成するコ
ラーゲンやアルギン酸ソーダを用いて、内部に細胞を包
埋して形成する（A. Klausner, Bio/technol., 1,736(1
983)) 。
【０００９】ＩＬ−６産生細胞でかつ接着依存性動物細
胞を培養するには、種細胞を、マイクロキャリヤービー
ズや中空糸に接種し、またはゲル固定化細胞を作成し培
養する。培地組成、血清濃度等は、培養すべき細胞の種
類、細胞濃度等に応じて適当に選ばれる。培養中、適宜
培地交換を行い、数日間〜２０日間培養する。細胞がほ
ぼコンフルエントになるまで培養を続ける。増殖した細
胞は、誘発剤で処理するに先立ち低単位のインターフェ
ロンなどのサイトカンインと、負に荷電した水溶性高分
子を添加して数時間から数日間インキュベートすること
が望ましい。前処理するインターフエロンとしてはイン
ターフエロンα類、インターフエロンβ、インターフエ
ロンγなどが用いられるが、特にインターフエロンα類
とインターフエロンβが好ましい。インターフエロンの
濃度としては、通常０．１〜１万国際単位／ｍｌが用い
られるが、より好適には１〜１０００国際単位／ｍｌが
選択される。
胞を培養するには、種細胞を、マイクロキャリヤービー
ズや中空糸に接種し、またはゲル固定化細胞を作成し培
養する。培地組成、血清濃度等は、培養すべき細胞の種
類、細胞濃度等に応じて適当に選ばれる。培養中、適宜
培地交換を行い、数日間〜２０日間培養する。細胞がほ
ぼコンフルエントになるまで培養を続ける。増殖した細
胞は、誘発剤で処理するに先立ち低単位のインターフェ
ロンなどのサイトカンインと、負に荷電した水溶性高分
子を添加して数時間から数日間インキュベートすること
が望ましい。前処理するインターフエロンとしてはイン
ターフエロンα類、インターフエロンβ、インターフエ
ロンγなどが用いられるが、特にインターフエロンα類
とインターフエロンβが好ましい。インターフエロンの
濃度としては、通常０．１〜１万国際単位／ｍｌが用い
られるが、より好適には１〜１０００国際単位／ｍｌが
選択される。
【００１０】細胞として血管内皮細胞をなどの誘発剤を
必要としない細胞を用いる場合は、該細胞を培養するだ
けでＩＬ−６を恒常的に産生することができる。一方、
線維芽細胞、骨肉腫細胞、肺癌細胞などの誘発剤の刺激
でＩＬ−６を産生する細胞を用いる場合は、増殖した細
胞を誘発剤で処理をしてＩＬ−６を産生させる。
必要としない細胞を用いる場合は、該細胞を培養するだ
けでＩＬ−６を恒常的に産生することができる。一方、
線維芽細胞、骨肉腫細胞、肺癌細胞などの誘発剤の刺激
でＩＬ−６を産生する細胞を用いる場合は、増殖した細
胞を誘発剤で処理をしてＩＬ−６を産生させる。
【００１１】細胞を誘発剤で処理しＩＬ−６を産生させ
る方法としては、ｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（Ｃ）（以
下ポリＩ／Ｃと略）等の合成ＲＮＡもしくは天然型ＲＮ
Ａ等の誘発剤、あるいはＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＦＮ−β
などのサイトカイン、あるいはＰＤＧＦ等の増殖因子、
あるいはＰＭＡ、ＰＨＡ、リポポリサッカライドやコレ
ラ毒素などを用いて誘発させる方法が用いられる（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２３５，７３１（１９８７））。これらの
うち、合成ＲＮＡもしくは天然型ＲＮＡが好ましく、特
に合成ＲＮＡであるポリＩ／Ｃを使用するのが好まし
い。ポリＩ／Ｃの誘発刺激条件としては特に制限される
ものではないが、濃度として通常０．０１〜１０００μ
ｇ／ｍｌが使用され、特に好適には１〜２００μｇ／ｍ
ｌが使用される。ポリＩ／Ｃ刺激時間は通常数分〜数十
時間が選ばれるが、好適には１〜１０時間のなかで選択
される。
る方法としては、ｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（Ｃ）（以
下ポリＩ／Ｃと略）等の合成ＲＮＡもしくは天然型ＲＮ
Ａ等の誘発剤、あるいはＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＦＮ−β
などのサイトカイン、あるいはＰＤＧＦ等の増殖因子、
あるいはＰＭＡ、ＰＨＡ、リポポリサッカライドやコレ
ラ毒素などを用いて誘発させる方法が用いられる（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２３５，７３１（１９８７））。これらの
うち、合成ＲＮＡもしくは天然型ＲＮＡが好ましく、特
に合成ＲＮＡであるポリＩ／Ｃを使用するのが好まし
い。ポリＩ／Ｃの誘発刺激条件としては特に制限される
ものではないが、濃度として通常０．０１〜１０００μ
ｇ／ｍｌが使用され、特に好適には１〜２００μｇ／ｍ
ｌが使用される。ポリＩ／Ｃ刺激時間は通常数分〜数十
時間が選ばれるが、好適には１〜１０時間のなかで選択
される。
【００１２】また、誘発剤を用いて細胞を刺激した後、
ベラパミル、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤな
どの代謝阻害剤で細胞を処理することにより産生を増強
せしめる方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，４２４
２−４２４８（１９９０））を採用しても良い。
ベラパミル、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤな
どの代謝阻害剤で細胞を処理することにより産生を増強
せしめる方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，４２４
２−４２４８（１９９０））を採用しても良い。
【００１３】産生細胞としては特に制限されるものでは
ないが、本発明の特徴より接着依存性細胞が選択され、
特に好適には線維芽細胞が用いられる。ヒトのＩＬ−６
の産生を目的にする場合にはヒト線維芽細胞が選択され
る。ヒト線維芽細胞は正常２倍体の場合、継代数に５０
代前後という制限があるが、それでも培養条件を選ぶこ
とにより、実際上、工業的製造のための細胞として利用
することができる。
ないが、本発明の特徴より接着依存性細胞が選択され、
特に好適には線維芽細胞が用いられる。ヒトのＩＬ−６
の産生を目的にする場合にはヒト線維芽細胞が選択され
る。ヒト線維芽細胞は正常２倍体の場合、継代数に５０
代前後という制限があるが、それでも培養条件を選ぶこ
とにより、実際上、工業的製造のための細胞として利用
することができる。
【００１４】更に本発明は、ＩＬ−６産生細胞を培養
中、あるいは誘発処理中において、培養液中の溶存酸素
濃度およびｐＨを一定に制御することが好ましいことを
規定する。ＩＬ−６産生細胞として誘発剤の刺激により
ＩＬ−６を産生する細胞を用いる場合は、特に、増殖後
のＩＬ−６産生培地中の溶存酸素濃度およびｐＨを一定
に制御することが好ましい。培養液中の溶存酸素濃度
は、常に空気に対する飽和溶解度に対して２０％〜８０
％、特に４０％〜６５％の範囲に保つことが好ましい。
同様にｐＨは７．０〜８．０の範囲に制御することが好
ましい。本発明の溶存酸素濃度及びｐＨは、規定濃度の
範囲内で常に一定に制御することが好ましい。
中、あるいは誘発処理中において、培養液中の溶存酸素
濃度およびｐＨを一定に制御することが好ましいことを
規定する。ＩＬ−６産生細胞として誘発剤の刺激により
ＩＬ−６を産生する細胞を用いる場合は、特に、増殖後
のＩＬ−６産生培地中の溶存酸素濃度およびｐＨを一定
に制御することが好ましい。培養液中の溶存酸素濃度
は、常に空気に対する飽和溶解度に対して２０％〜８０
％、特に４０％〜６５％の範囲に保つことが好ましい。
同様にｐＨは７．０〜８．０の範囲に制御することが好
ましい。本発明の溶存酸素濃度及びｐＨは、規定濃度の
範囲内で常に一定に制御することが好ましい。
【００１５】本発明で用いる培地は、通常のものが使用
でき、特に制限されない。一般的に市販されている、動
物細胞培養用の各種培地が好適に使用され、またこれら
市販培地の添加物を修飾（添加物量を少し変えたもの、
ある種の添加物を除いたもの、ある種の添加物を更に加
えたものなど）した培地も好適に使用される。これらの
中で細胞および条件に適した培地を、適宜選択すること
が好ましい。
でき、特に制限されない。一般的に市販されている、動
物細胞培養用の各種培地が好適に使用され、またこれら
市販培地の添加物を修飾（添加物量を少し変えたもの、
ある種の添加物を除いたもの、ある種の添加物を更に加
えたものなど）した培地も好適に使用される。これらの
中で細胞および条件に適した培地を、適宜選択すること
が好ましい。
【００１６】
【実施例】以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、これらにより本発明が限定されるものではない。
るが、これらにより本発明が限定されるものではない。
【００１７】実施例１ 胎児牛血清５％、ジエチルアミノエチル基を有する架橋
デキストランマイクロキャリア（“Ｃｙｔｏｄｅｘ−
１”（ファルマシア社））３ｇ／Ｌを含むイーグルＭＥ
Ｍ培地 ２Ｌにヒト正常二倍体線維芽細胞を約２×１０
５個／ｍｌの割合で接種したスピナーフラスコでゆるく
撹拌しながら３７℃、ｐＨ７．２、２０％飽和酸素濃度
で６日間培養した。途中、１日目、３日目、５日目に培
地交換を行った。到達細胞数は、１．５×１０６個／ｍ
ｌであった。
デキストランマイクロキャリア（“Ｃｙｔｏｄｅｘ−
１”（ファルマシア社））３ｇ／Ｌを含むイーグルＭＥ
Ｍ培地 ２Ｌにヒト正常二倍体線維芽細胞を約２×１０
５個／ｍｌの割合で接種したスピナーフラスコでゆるく
撹拌しながら３７℃、ｐＨ７．２、２０％飽和酸素濃度
で６日間培養した。途中、１日目、３日目、５日目に培
地交換を行った。到達細胞数は、１．５×１０６個／ｍ
ｌであった。
【００１８】次に、インターフェロン−β（東レ（株）
製天然型インターフェロンβ、以下同じ）１００国際単
位／ｍｌ、カルボキシルメチルセルロースを含む、イー
グルＭＥＭ培地と交換し、３７℃、ｐＨ７．２、２０％
飽和酸素濃度で２４時間インキュベートした。次に、ポ
リＩ／Ｃを１０μｇ／ｍｌ加え３７℃で２時間インキュ
ベートした後、イーグルＭＥＭ培地で培地交換し、さら
に３７℃、ｐＨ７．２、２０％飽和酸素濃度で６日間培
養した。最終的に産生されたＩＬ−６の量は、抗ＩＬ−
６抗体（Ｎ．Ｉｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５，７２８−７３４
（１９８９））を用いた酵素抗体法で測定した。結果
は、ポリＩ／Ｃを０μｇ／mlとしたものの相対力価を１
００とすると、１μｇ／mlで刺激した場合、１４５０、
１０μｇ／mlで刺激した場合４４６０であった。
製天然型インターフェロンβ、以下同じ）１００国際単
位／ｍｌ、カルボキシルメチルセルロースを含む、イー
グルＭＥＭ培地と交換し、３７℃、ｐＨ７．２、２０％
飽和酸素濃度で２４時間インキュベートした。次に、ポ
リＩ／Ｃを１０μｇ／ｍｌ加え３７℃で２時間インキュ
ベートした後、イーグルＭＥＭ培地で培地交換し、さら
に３７℃、ｐＨ７．２、２０％飽和酸素濃度で６日間培
養した。最終的に産生されたＩＬ−６の量は、抗ＩＬ−
６抗体（Ｎ．Ｉｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５，７２８−７３４
（１９８９））を用いた酵素抗体法で測定した。結果
は、ポリＩ／Ｃを０μｇ／mlとしたものの相対力価を１
００とすると、１μｇ／mlで刺激した場合、１４５０、
１０μｇ／mlで刺激した場合４４６０であった。
【００１９】実施例２ 胎児牛血清５％、ジエチルアミノエチル基を有する架橋
デキストランマイクロキャリア（“Ｃｙｔｏｄｅｘ−
１”（ファルマシア社））３ｇ／Ｌを含むイーグルＭＥ
Ｍ培地 ２Ｌにヒト正常二倍体細胞を、約２×１０５個
／ｍｌの割合で接種したスピナーフラスコでゆるく撹拌
しながら３７℃、ｐＨ７．２、２０％飽和酸素濃度で６
日間培養した。途中、１日目、３日目、５日目に培地交
換を行った。到達細胞数は、１．５×１０６個／ｍｌで
あった。
デキストランマイクロキャリア（“Ｃｙｔｏｄｅｘ−
１”（ファルマシア社））３ｇ／Ｌを含むイーグルＭＥ
Ｍ培地 ２Ｌにヒト正常二倍体細胞を、約２×１０５個
／ｍｌの割合で接種したスピナーフラスコでゆるく撹拌
しながら３７℃、ｐＨ７．２、２０％飽和酸素濃度で６
日間培養した。途中、１日目、３日目、５日目に培地交
換を行った。到達細胞数は、１．５×１０６個／ｍｌで
あった。
【００２０】次に、インターフェロン−β１００国際単
位／ｍｌ、カルボキシルメチルセルロースを含む、イー
グルＭＥＭ培地と交換し、３７℃、ｐＨ７．２、２０％
飽和酸素濃度で２４時間インキュベートした。次に、ポ
リＩ／Ｃを１０μｇ／ｍｌ加え３７℃で２時間インキュ
ベートした後、イーグルＭＥＭ培地で培地交換し、さら
に３７℃、２０％飽和酸素濃度、ｐＨ６．８〜７．５で
６日間培養した。最終的に産生されたＩＬ−６の量は、
抗ＩＬ−６抗体（Ｎ．Ｉｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５，７２８
−７３４（１９８９））を用いた酵素抗体法で測定し
た。ｐＨ６．８の場合を１００とした相対的なＩＬ−６
の産生量はｐＨ７．２の場合２０８、ｐＨ７．５の場合
２１８であった。
位／ｍｌ、カルボキシルメチルセルロースを含む、イー
グルＭＥＭ培地と交換し、３７℃、ｐＨ７．２、２０％
飽和酸素濃度で２４時間インキュベートした。次に、ポ
リＩ／Ｃを１０μｇ／ｍｌ加え３７℃で２時間インキュ
ベートした後、イーグルＭＥＭ培地で培地交換し、さら
に３７℃、２０％飽和酸素濃度、ｐＨ６．８〜７．５で
６日間培養した。最終的に産生されたＩＬ−６の量は、
抗ＩＬ−６抗体（Ｎ．Ｉｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５，７２８
−７３４（１９８９））を用いた酵素抗体法で測定し
た。ｐＨ６．８の場合を１００とした相対的なＩＬ−６
の産生量はｐＨ７．２の場合２０８、ｐＨ７．５の場合
２１８であった。
【００２１】実施例３ 胎児牛血清５％、ジエチルアミノエチル基を有する架橋
デキストランマイクロキャリア（“Ｃｙｔｏｄｅｘ−
１”（ファルマシア社））３ｇ／Ｌを含むイーグルＭＥ
Ｍ培地 ２Ｌにヒト正常二倍体細胞を、約２×１０５個
／ｍｌの割合で接種したスピナーフラスコでゆるく撹拌
しながら３７℃、ｐＨ７．２、２０％飽和酸素濃度で６
日間培養した。途中、１日目、３日目、５日目に培地交
換を行った。到達細胞数は、１．５×１０６個／ｍｌで
あった。
デキストランマイクロキャリア（“Ｃｙｔｏｄｅｘ−
１”（ファルマシア社））３ｇ／Ｌを含むイーグルＭＥ
Ｍ培地 ２Ｌにヒト正常二倍体細胞を、約２×１０５個
／ｍｌの割合で接種したスピナーフラスコでゆるく撹拌
しながら３７℃、ｐＨ７．２、２０％飽和酸素濃度で６
日間培養した。途中、１日目、３日目、５日目に培地交
換を行った。到達細胞数は、１．５×１０６個／ｍｌで
あった。
【００２２】次に、インターフェロン−β１００国際単
位／ｍｌ、カルボキシルメチルセルロースを含む、イー
グルＭＥＭ培地と交換し、３７℃、ｐＨ７．２、２０％
飽和酸素濃度で２４時間インキュベートした。次に、ポ
リＩ／Ｃを１０μｇ／ｍｌ加え３７℃で２時間インキュ
ベートした後、イーグルＭＥＭ培地で培地交換し、さら
に３７℃、ｐＨ７．２、５〜５０％飽和酸素濃度で６日
間培養した。最終的に産生されたＩＬ−６の量は、抗Ｉ
Ｌ−６抗体（Ｎ．Ｉｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５，７２８−７
３４（１９８９））を用いた酵素抗体法で測定した。５
％飽和酸素濃度の場合のＩＬ−６産生量の相対力価を１
００とすると、１０％飽和酸素濃度では１２０、５０％
飽和酸素濃度では１８０であった。
位／ｍｌ、カルボキシルメチルセルロースを含む、イー
グルＭＥＭ培地と交換し、３７℃、ｐＨ７．２、２０％
飽和酸素濃度で２４時間インキュベートした。次に、ポ
リＩ／Ｃを１０μｇ／ｍｌ加え３７℃で２時間インキュ
ベートした後、イーグルＭＥＭ培地で培地交換し、さら
に３７℃、ｐＨ７．２、５〜５０％飽和酸素濃度で６日
間培養した。最終的に産生されたＩＬ−６の量は、抗Ｉ
Ｌ−６抗体（Ｎ．Ｉｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５，７２８−７
３４（１９８９））を用いた酵素抗体法で測定した。５
％飽和酸素濃度の場合のＩＬ−６産生量の相対力価を１
００とすると、１０％飽和酸素濃度では１２０、５０％
飽和酸素濃度では１８０であった。
【００２３】実施例４ 胎児牛血清５％、ジエチルアミノエチル基を有する架橋
デキストランマイクロキャリア（“Ｃｙｔｏｄｅｘ−
１”（ファルマシア社））３ｇ／Ｌを含むイーグルＭＥ
Ｍ培地 ２Ｌにヒト正常二倍体細胞を約２×１０５個／
ｍｌの割合で接種したスピナーフラスコでゆるく撹拌し
ながら３７℃、ｐＨ７．２、２０％飽和酸素濃度で６日
間培養した。途中、１日目、３日目、５日目に培地交換
を行った。到達細胞数は、約１．５×１０６個／ｍｌで
あった。
デキストランマイクロキャリア（“Ｃｙｔｏｄｅｘ−
１”（ファルマシア社））３ｇ／Ｌを含むイーグルＭＥ
Ｍ培地 ２Ｌにヒト正常二倍体細胞を約２×１０５個／
ｍｌの割合で接種したスピナーフラスコでゆるく撹拌し
ながら３７℃、ｐＨ７．２、２０％飽和酸素濃度で６日
間培養した。途中、１日目、３日目、５日目に培地交換
を行った。到達細胞数は、約１．５×１０６個／ｍｌで
あった。
【００２４】次に、ヒト・インターフェロン−βを０、
１、１０、１００国際単位／ｍｌ、もしくはヒト・イン
ターフェロン−α（Ｇｅｎｚｙｍｅ社より購入）を１０
国際単位／ｍｌ、もしくはヒト・インターフェロン−γ
（Ｇｅｎｚｙｍｅ社より購入）を１０国際単位／ｍｌと
カルボキシルメチルセルロースを含む、イーグルＭＥＭ
培地と交換し、３７℃、ｐＨ７．２、２０％飽和酸素濃
度で２４時間インキュベートした。次に、ポリＩ／Ｃを
１０μｇ／ｍｌ加え３７℃で２時間インキュベートした
後、イーグルＭＥＭ培地で培地交換し、さらに３７℃、
ｐＨ７．２で２０％飽和酸素濃度６日間培養した。最終
的に産生されたＩＬ−６の量は、抗ＩＬ−６抗体（Ｎ．
Ｉｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５，７２８−７３４（１９８
９））を用いた酵素抗体法で測定した。インターフェロ
ンを加えなかった時のＩＬ−６産生量の相対力価を１０
０とすると、インターフェロン−βを１、１０、１００
国際単位／ｍｌ加えたときのＩＬ−６の相対力価はそれ
ぞれ２００、５００、３０００であり、インターフェロ
ン−γを１０国際単位／ｍｌ加えたときは２００、イン
ターフェロン−αを１０国際単位／ｍｌ加えたときは２
０００であった。
１、１０、１００国際単位／ｍｌ、もしくはヒト・イン
ターフェロン−α（Ｇｅｎｚｙｍｅ社より購入）を１０
国際単位／ｍｌ、もしくはヒト・インターフェロン−γ
（Ｇｅｎｚｙｍｅ社より購入）を１０国際単位／ｍｌと
カルボキシルメチルセルロースを含む、イーグルＭＥＭ
培地と交換し、３７℃、ｐＨ７．２、２０％飽和酸素濃
度で２４時間インキュベートした。次に、ポリＩ／Ｃを
１０μｇ／ｍｌ加え３７℃で２時間インキュベートした
後、イーグルＭＥＭ培地で培地交換し、さらに３７℃、
ｐＨ７．２で２０％飽和酸素濃度６日間培養した。最終
的に産生されたＩＬ−６の量は、抗ＩＬ−６抗体（Ｎ．
Ｉｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５，７２８−７３４（１９８
９））を用いた酵素抗体法で測定した。インターフェロ
ンを加えなかった時のＩＬ−６産生量の相対力価を１０
０とすると、インターフェロン−βを１、１０、１００
国際単位／ｍｌ加えたときのＩＬ−６の相対力価はそれ
ぞれ２００、５００、３０００であり、インターフェロ
ン−γを１０国際単位／ｍｌ加えたときは２００、イン
ターフェロン−αを１０国際単位／ｍｌ加えたときは２
０００であった。
【００２５】
【発明の効果】本発明によれば、天然型のＩＬ−６を高
収率で安定に産生させることができる。また、培養条件
を最適値で制御することも容易であり、工業生産規模に
スケールアップするのに適した培養方法である。
収率で安定に産生させることができる。また、培養条件
を最適値で制御することも容易であり、工業生産規模に
スケールアップするのに適した培養方法である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 清水 洋彦 神奈川県鎌倉市手広1111番地 東レ株式会 社基礎研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 インターロイキン−６産生細胞でかつ接
着依存性動物細胞を、マイクロキャリヤーもしくは中空
糸に接着培養、あるいはマイクロカプセルに固定化培養
することを特徴とするインターロイキン−６の産生方
法。 - 【請求項２】 インターロイキン−６産生細胞でかつ接
着依存性動物細胞を培養し、誘発剤で処理することを特
徴とする請求項１記載のインターロイキン−６の産生方
法。 - 【請求項３】 細胞を培養後、該細胞にインターフェロ
ンを添加し、しかるのちに合成もしくは天然ＲＮＡから
なる誘発剤で処理することを特徴とする請求項２記載の
インターロイキン−６の産生方法。 - 【請求項４】 培養液中の溶存酸素濃度を空気に対する
飽和溶解度の２０％ないしは８０％の範囲に保つことを
特徴とする請求項１〜３記載のインターロイキン−６の
産生方法。 - 【請求項５】 培養液のｐＨを７．０〜８．０の範囲に
保つことを特徴とする請求項１〜４記載のインターロイ
キン−６の産生方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03221556A JP3128882B2 (ja) | 1990-09-04 | 1991-09-02 | インターロイキン−６の産生方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23538790 | 1990-09-04 | ||
| JP2-235387 | 1990-09-04 | ||
| JP03221556A JP3128882B2 (ja) | 1990-09-04 | 1991-09-02 | インターロイキン−６の産生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05176788A true JPH05176788A (ja) | 1993-07-20 |
| JP3128882B2 JP3128882B2 (ja) | 2001-01-29 |
Family
ID=26524382
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03221556A Expired - Fee Related JP3128882B2 (ja) | 1990-09-04 | 1991-09-02 | インターロイキン−６の産生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3128882B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT501252A1 (de) * | 2004-12-23 | 2006-07-15 | Chemiefaser Lenzing Ag | Cellulosischer formkörper und verfahren zu seiner herstellung |
-
1991
- 1991-09-02 JP JP03221556A patent/JP3128882B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT501252A1 (de) * | 2004-12-23 | 2006-07-15 | Chemiefaser Lenzing Ag | Cellulosischer formkörper und verfahren zu seiner herstellung |
| AT501252B1 (de) * | 2004-12-23 | 2008-02-15 | Chemiefaser Lenzing Ag | Cellulosischer formkörper und verfahren zu seiner herstellung |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3128882B2 (ja) | 2001-01-29 |
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