JPH05139990A - セクレタリコンポーネントを有効成分とする抗炎症剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 副作用がなく、長期間連続して多量に投与す
ることのできる抗炎症剤の提供。 【構成】 セクレタリコンポーネントを有効成分とする
抗炎症剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はセクレタリコンポーネン
ト(Secretory Component，以下SCと略記する) を有効成
分とする抗炎症剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】炎症とは、発熱や発赤、腫張、疼痛など
の症状を呈する、生体の刺激に対する応答である。この
発症機構は免疫応答によるものであることが知られてい
る（鹿取、室田、山本編, 炎症・アレルギー・免疫・が
ん,東京化学同人,1988)。このような炎症に対する治療
剤として種々の抗炎症剤が使用されている。抗炎症剤に
は特定の疾患に使用される特異的抗炎症剤と、一般的な
発熱や鎮痛に使用されている非特異的な抗炎症剤があ
る。

【０００３】前者にはリウマチに効果のある金剤、アレ
ルギー疾患の治療に用いられる抗ヒスタミン剤などがあ
る。また後者には、ステロイド系抗炎症剤（ハイドロコ
ルチゾン、デキサメタゾン等) 、非ステロイド系抗炎症
剤（インドメタシン、ベンダミン等) 等の多数の薬剤が
知られている。さらに消炎作用を持つ酵素（セラチオペ
プチダーゼ、リゾチーム等) が知られている。これらの
抗炎症剤はいずれも医薬品として使用されているが、副
作用があり、長期間使用することが困難な場合がある。
一方、アレルギーなどの免疫異常による炎症性の疾患は
年々増加の一途であり、このような疾患の治療に使用で
き、食品のように日常的に長期間摂取できる抗炎症剤は
いまだ開発されていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは種々の食
品由来の成分の抗炎症作用を検討した結果、乳中に含ま
れるSCが抗炎症作用を有することを見出し、本発明を完
成するに至った。従って本発明はSCを有効成分とする抗
炎症剤を提供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】SCは分子量約75000 、糖
を12〜15％含む糖蛋白質で、免疫グロブリンA(IgA)と結
合して分泌型IgA 構成し、免疫グロブリンスーパーファ
ミリーに分類される。分泌型IgA は単量体型IgA 二分
子、J 鎖およびSCからなる。SCはもともと腺組織等の非
分泌側から分泌側へのIgAの輸送に使われるポリ免疫グ
ロブリンレセプターとして機能する。リンパ球によって
合成された2 量体型IgA(J 鎖を含む) は、腺組織の非分
泌側構成細胞表面のポリ免疫グロブリンレセプターと結
合し、細胞内部にいったん取り込まれた後、分泌側へ再
分泌される。この時、ポリ免疫グロブリンレセプターは
蛋白分解を受け、SCとなり、2 量体型IgA に結合した型
で分泌される。これが分泌型IgA で通常は分泌型IgA と
してSCは存在する。乳中やリンパ液などの分泌液中に
は、このような分泌型IgA の構成成分として以外に免疫
グロブリンに結合していない遊離型SCも存在する。

【０００６】SC およびSCの前駆体であるポリ免疫グロ
ブリンレセプターのアミノ酸配列、遺伝子配列は既に公
知である。Nature,vol.308,37-43,1984 、J.Cell.Bio
l.,vol.102,911-919,1984 にはウサギ由来のアミノ酸配
列、遺伝子配列が開示されており、またKrajciらはヒト
由来のSC、ポリ免疫グロブリンレセプターのアミノ酸配
列、DNA 配列を開示している(Krajci et.al.,B.B.R.C.,
vol.158,783-789,1989) 。SCを得るためには、これらの
遺伝子を用いて遺伝子組換により生産することが可能で
ある。特に、ヒトSCはKrajciの方法によって、容易に生
産することができる。

【０００７】また上述したように、リンパ液、唾液、
涙、乳などの分泌液から遊離型のSCを容易に回収可能で
ある。特に乳、なかでも牛乳中にはSCが大量に含まれて
おり、遺伝子組換による生産と同程度に生産することが
でき、カラムクロマトグラフィーなどで容易に回収でき
る。

【０００８】牛乳中のSC含量は約50μg/mlであるが、市
販の牛乳等の乳製品は加熱殺菌によりSCの持つ抗炎症作
用を完全に失なっている。このため、もっとも簡便にSC
を摂取するには未殺菌の乳を直接飲用すればよい。しか
し、未殺菌乳は大量飲用せねばならず、しかも病原菌の
汚染などの可能性もあり、好ましくない。このため乳由
来のSCを利用する場合は、乳から活性を保持したまま、
単離精製する必要がある。

【０００９】乳中のSCを高純度に精製するためには乳か
らカゼイン画分を除去し、塩析やクロマトグラフィーな
どを組み合わせるなどして、蛋白質の精製方法に準じて
行うことができる。工業的に精製するためには上記カゼ
イン画分を除去した後、陽イオン交換樹脂と接触させ、
SC画分を吸着させた後、イオン強度0.005 〜0.25、pH６
〜９の塩溶液を用いて溶出することができる。またスル
フォン化したキトサンビーズ( スルフォン化キトパー
ル、富士紡績製) に脱脂乳を接触させ、乳中に含有され
ているラクトフェリンやラクトパーオキシダーゼを除去
した脱脂乳を電気透析膜を用いて脱塩操作を行い、電気
伝導度を1.5mS/cm以下にまで低下させ、次いでさきのス
ルフォン化キトパールに接触させ、SCを吸着させたの
ち、イオン強度約0.2 の食塩水で溶出したのち、脱塩、
クロマトグラフィーにより、さらに高純度のSCを得るこ
とができる。これらの乳中よりSC画分を工業的に回収す
る方法は、本出願人により特願平3-49162 号として特許
出願されている。

【００１０】SCは必要に応じて、安定剤、乳化剤などの
添加物や乳糖等の増量剤を添加し、錠剤、カプセル剤、
液剤、注射剤、吸入剤、点眼剤、塗布剤などの剤型で用
いることができる。また食品や、飲料に添加して使用す
ることも可能である。SCは生体に存在する蛋白質であ
り、安全性は非常に高く、毒性は認められない。

【００１１】SCの投与量は投与形態によって、また炎症
の状況によっても異なる。経口投与製剤においては、通
常成人一人当たり、0.5mg/kg体重以上、一回30mg以上を
１日３回程度投与する。0.5mg/kg体重以下の投与量で
は、本発明の目的とする消炎効果が発揮されない。

【００１２】注射剤では、通常30mgを100ml の生理食塩
水に溶解し、これを１日数回に分けて投与することが好
ましいが、濃度や投与量を特に限定する必要はない。注
射剤の製造にあたっては、凍結乾燥により、用時調製の
製剤としても良い。注射剤として投与する場合は、0.5m
g/kg体重以上投与しても効果はそれ以上高くはならない
ため、0.5mg/kg体重以下で用いることが経済的である。
注射は、筋注あるいは静注の形で行うとよい。

【００１３】飲食品に添加する場合は一日当たり30mg程
度を摂取するように添加することが抗炎症効果の上で好
ましい。飲食品としては、ジュースその他の飲料、ジェ
リーのような菓子、ヨーグルト、アイスクリーム、粉乳
等乳製品に添加することが望ましい。

【００１４】以下、本発明の有効成分SCの単離を参考例
として、また本発明の抗炎症剤を実施例として示し、本
発明を具体的に説明する。

【００１５】

【参考例１】牛乳からの高純度SCの回収 生脱脂乳400kg をスルフォン化キトパール（富士紡績
製)1.7lを充填した回転型カラム反応器 (東京理化器械
製) に200l/ 時の流速で2 時間循環通液した後、水でカ
ラムを十分洗浄し、さらに1.0M食塩水60l を通液してラ
クトフェリン画分を得た。ラクトフェリン画分を分取し
た残りの脱脂乳をSP- セファデックス (ファルマシア社
製)1.7l を充填した回転型カラム反応器に200l/ 時の流
速で4 時間循環通液し、SCを吸着させた後、水でカラム
を十分洗浄し、0.13M 食塩水60l で不純物をさらに洗浄
し、次いで0.22M 食塩水60l を通液してSC含有画分を溶
出した。この溶出画分を分画分子量が50000 の限外濾過
膜を用いて脱塩濃縮し、DEAE- セルロファイン (生化学
工業製)200gと30分間攪拌接触させた後、濾過布で樹脂
を除去して上清を得、凍結乾燥をして9.5gのSCを得た。
このSCをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により純度を
検定したところ82％であった。

【００１６】

【参考例２】スルフォン化キトパール 1.7l を充填した
回転型カラム反応器にpH6.4 、電気伝導度6mS/cmの脱脂
乳200lを200l/ 時の流速で２時間循環通液した後、水で
カラムを十分洗浄し、さらに0.7M食塩水60l を通液して
ラクトフェリン画分を得た。次いで水洗し、樹脂を再生
した。一方、ラクトフェリン画分を分取した残りの脱脂
乳を電気伝導度1.5mS/cmとなるまで電気透析膜を用いて
脱塩し、先のカラムに200l/ 時の流速で４時間通液し、
SCを吸着させた。次に、水を通液し、回転型カラム反応
器を十分洗浄し、さらにイオン強度を0.003 に調整した
食塩水を通液し、洗浄した。その後イオン強度0.2 の食
塩水を通液してSCを溶出した。この溶出画分60l を分画
分子量50000 の限外濾過膜を用いて2lになるまで濃縮
し、電気透析膜を用いて電気伝導度0.3mS/cmまで脱塩し
た後、DEAE- セファロースCL-6B(ファルマシア社製)500
mlを充填しイオン強度0.001 、pH7.0 のリン酸緩衝液で
平衡化したカラム(5.8×30cm) に3ml/分の流速で通液し
て未吸着画分を回収した後、濃縮凍結乾燥を行い、3.9g
のSCを得た。このSCをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動
により純度を検定したところ88％であった。

【００１７】

【参考例３】母乳からの高純度SCの回収 母乳1lを実施例１と同様に処理を行い、約200mg のSCを
得た。このSCの純度はSDS-PAGEで82％であった。

【００１８】

【参考例４】遺伝子組換によるヒトSCの生産 Krajici らの方法(P.Krajici et.al.,B.B.R.C.,vol.15
8,783-789,1989)に従い、ヒトSCのアミノ酸配列をコー
ドするcDNAを得て、これを常法により、動物細胞中に組
み込み、遺伝子組み換え細胞を作製した。SC-cDNA をpZ
IP-NeoSV(X)1ベクター(Cepko et al, Cell, 37, 1053-1
062 (1984)) のBamHI サイトにライゲーションし、これ
をリン酸カルシウム法(Wigler etal,Cell, 14, 725-731
(1978)) でCHO-K1細胞に導入し、2mg/mlのG418を含む
培地中で培養してSC-cDNA の導入された細胞を選択培養
した。細胞のクローニングを３回行ない、培養上清中に
SC分泌量の多いCHO-SC1 を得た。CHO-SC1 を１％ウシ胎
児血清を含むITES-ERDF 培地（極東製薬）中で培養して
得た培養上清200lを抗ヒトSC抗体（ウサギ）を固定した
アフィゲル-10(バイオラッド）カラムを用いたアフィニ
ティクロマトグラフィーにより 2.6ｇの組換ヒトSCを得
た。SDS-PAGEによる純度は96％であった。

【００１９】

【実施例１】SC含有製剤の製造 参考例１、参考例２、参考例３で得たSCを用いてSC含有
製剤を調製した。

【００２０】（１）錠剤 下記の表１の成分を配合し、常法による錠剤化手段によ
って 500mgずつに打錠し、SC配合錠剤を調製した。

【００２１】

【表１】

【００２２】（２）注射剤 SCを生理食塩水1l当たり 300mgを溶解し、濾過滅菌を行
い、無菌的に 100mlずつ、滅菌バイアルボトルに充填
し、静注剤を得た。

【００２３】（３）吸入剤 下記の表２の成分の配合により、SC配合吸入剤を調製し
た。

【００２４】

【表２】

【００２５】（４）塗布剤 下記の表３の成分の配合により、SC配合塗布剤を調製し
た。

【００２６】

【表３】

【００２７】（５）飲料 下記の表４の成分の配合により、混合した原料ミックス
に水を加えて100lとし、これをジャケット式タンクで65
℃ 30分間加熱殺菌後、プラスチック無菌ブローボトル
に250ml づつ充填した。

【００２８】

【表４】

【００２９】

【実施例２】マウス足蹠反応の抑制 実施例１（２）で製造した注射剤を用いてマウス炎症反
応に対する消炎効果を確認した。Balb/c マウス(8週
齢、オス) に牛乳βラクトグロブリン0.5mg をフロイン
トアジュバントとともに皮下注射し、3 週間後に右足足
蹠（フットパッド) に10μg/mlのβラクトグロブリン0.
1ml を皮下注射し、48時間後にダイヤルゲージで足蹠の
腫れを測定した。生理食塩水を注射した左足蹠を対照と
して、以下の計算式１から反応値を計算した。

【００３０】

【式１】抗原注射後の右足蹠の厚さ／生理食塩水注射後
の左足蹠の厚さ−１＝反応値

【００３１】抗原（βラクトグロブリン) を足蹠投与す
る24時間前に、SCを表５に示す投与量静脈注射し、SCの
消炎効果を調べた。なおマウスは１群５頭として平均値
をもとめた。SCの効果を表５に示した。

【００３２】

【表５】 この表に示すように、投与量に応じた強い消炎効果が確
認された。

【００３３】

【実施例３】ラットカラゲニン胸膜炎の抑制 実施例１（２）で製造した注射剤を用いてラットカラゲ
ニン胸膜炎に対する消炎効果を確認した。SD系ラット(8
週齢、オス) をエーテル麻酔し、2 ％λカラゲニン0.1m
l を右胸腔内に注射した。注射6時間後にラットを放血
死させ、開胸して浸出液を採取して容量を測定した。SC
はカラゲニン投与の6 時間前に腹腔内に投与した。SCの
効果を表６に示した。

【００３４】

【表６】 この表に示すように、10μg のSCは浸出液量を20％まで
低下させた。

【００３５】

【実施例４】アレルギー性鼻炎（花粉症) の改善 実施例１（３）で製造した吸入剤を用いて花粉症による
鼻炎患者の症状改善を確認した。花粉症患者（２〜４
月) に、SCを0.1 重量％含む吸入剤を用いて治療を試み
た。吸入剤10mlを加圧瓶に入れ、９名の患者に１日３回
吸入させた。患者の症状は表７に示すように改善され、
SCの消炎効果が確認された。

【００３６】

【表７】

【００３７】

【発明の効果】本発明によると、SCを有効成分とする新
規な抗炎症剤を提供することができる。本発明の抗炎症
剤は副作用がないので、長期間凍連続で多量に投与する
ことができ、抗炎症作用を持続することができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 セクレタリコンポーネントを有効成分と
   する抗炎症剤。
2. 【請求項２】 セクレタリコンポーネントが乳由来であ
   る請求項１記載の抗炎症剤。
3. 【請求項３】 セクレタリコンポーネントが遺伝子組換
   法により生産されたものである請求項1 記載の抗炎症
   剤。
4. 【請求項４】 セクレタリコンポーネントが、ヒトまた
   はウシ由来である請求項１〜３のいずれかに記載の抗炎
   症剤。