JPH0488988A - 酵母プロモーター - Google Patents
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Abstract
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Description
ミセスセレビッシx (5accharos+yces
cereviceae) )のコード配列の発現を指令
するヌクレオチド配列に関する。既に酵母から数種のこ
のようなプロモーターが単離されており、酵母の異種コ
ード配列(COding 5eqUenCf! )の発
現を指令するのに有用であることが証明されている。本
明細書で「異種」とは、該コード配列はプロモーターの
存在する野生型微生物の中のプロモーターにより発現が
指令されるものではないという意味である;普通類コー
ド配列は野生型微生物には全く存在しないものである。
の断片を見いだし、それらは予測できなかった利点を有
していた。
種又は機能性部分を、野生型のサツ力ロミセスセレビッ
シエ中で通常該配列に隣接するであろうコード配列から
分離された形で与える。
融合蛋白が産生きれるため普通は好ましくはないが、本
発明のプロモーターは、通常隣接するコード配列の一部
分を伴っていてもよい。
オチド配列が少し変化したもの及び/又は長さが短いも
のであるか、比較されている2つの発現系の他のパラメ
ーター(例えば3′制御領域)は同じで、前記の配列の
下流に位W1するコード配列の転写を促進する該配列の
能力の少なくとも10%(好ましくは80%、90%、
95%又は99%)を保持しているものである。該配列
の一部の場合、このような制御活性はその部分のみ(即
ち他の5′制御配列はなし)について、又はその部分の
5′又は3′に位置する別の5′制御配列とともに測定
される。好ましくは「変種」は該配列と80%、90%
、95%又は99%の相同性を有する。
性のある領域と、80%、90%、95%、99%又は
100%の相同性を有する。好ましくはこの部分は少な
くとも100ヌクレオチドの長さであり、さらに好まし
くは少なくとも200.300.400.500.10
00又は第500ヌクレオチドの長さである。「機能性
部分」は、複合炭素W(例えばブドウ糖又はショ糖)の
存在下では抑制され、このような炭素源が存在しない場
合は、グリセロール又はエタノールの存在の有無にかか
わらず脱抑制されるような該配列の能力を保持している
ことが適当である。
に対応し、該部分は3′から5′方向に連続的に約1.
35又は1.40に塩基対まで延長していることが適当
であり、ここから先は(本来の環境中rハ) A l
a−tRNA60LIの遺伝子のようである。天然の形
では5EQ1の3′未満はATGftf!始コドンのす
ぐ前にある。
のすぐ上流の379塩基対領域)からなり、随時さらに
配列の5′部分を含むことが有利である。
変更したものは、以後本発明の10(−ターと称する。
セロール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼのプロモ
ーターであるようである(GuT2、ジー・エフ・スプ
レーグとアール・クロナン(Sprague、 G、F
、 and Cronan、 R) 、ジャーナル・オ
ブ番バクテリオロジ−(J、Bact、)第129巻、
1335−1342頁、(1977年))。グリセロー
ル−3−ホスフエートデヒド0ゲナーゼコード領域は、
マウス、ウサギ、そしてショウジヨウバエ(Droso
phila salanogaster )のグリセロ
ール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼと相同性があ
り、それらに対してそれぞれ64%、60%、そして5
6%の相同性がある。グリセロール−3−ホスフェート
デヒドロゲナーゼはグリセロールをジヒドロキシアセト
ンホスフェートに変換するのに必要な2つの酵素のうち
の1つである;グリセロールを単一の炭素源として与え
たときは、これらは必須の遺伝子である。
′領域の一部を示し、5E01領域とその蒸留の123
塩基対そしてATGltfl始コドンにより構成される
。
始コドンに関して正しいリーディングフレーム(rea
ding frag+e )中に存在するように、本発
明のプロモーターは制限部位に隣接して、クロニングベ
クター又は発現ベクター中に位置していてもよい。開始
コドンはベクター上(例えばプロモーターのすぐ横の3
′ )で供給してもよいし、又は異種コード配列の5′
末端として挿入してもよい。必要であれば本発明のプロ
モーターと開始コドンの間にリンカ−を加えることもで
きる。
ード配列とともに挿入することができる。
(polyadenylation )の正しいシグナ
ルを含有する真核細胞遺伝子の3′隣接配列(3’ f
lanking 5equence )であることが好
ましい。適当なフランキング配列としては、例えば0U
T2遺伝了のフランキング配列であるか、又は別のもの
でもよい。好ましくは停止シグナルはサツカロミセスセ
レビッシエPGK1又はADHlのものである。本発明
のDNA構成体は、この構成体のクローニングベクター
中への挿入とクローニングを可能にする合成オリゴヌク
レオチドリンカーを両端に有する形で与えられることが
好ましい。本発明のプロモーター、DNAコード配列そ
して菌類の転写停止シグナルは、機能的な形で結合され
る。即ちそれらの正常なll燵が維持されるように隣接
して配列される。即ちその並び方は、発現制御配列はコ
ード配列の正しい発現を可能にし、転写停止シグナルは
転写とポリアデニル化の正しい停止を可能にするような
ものである。
る合成オリゴヌクレオチドリンカーにより結合されるこ
とが好ましい。
なる1つ又は複数のDNA挿入体、目的のポリペプチド
をコードするDNA配列よりなるプロモーターの転写の
制御下にあるDNA断片、そして真核細胞転写停止シグ
ナルを含有するDNA配列を有するハイブリッドベクタ
ー(hybrid vectpr )が与えられる。
ミツド又は線状DNAベクターであり、形質転換される
予定の宿主生物により選択される。
そして転写停止シグナルを含有する配列とは別に、プロ
モーターの機能(即ち目的のポリペプチドの発現)には
必須ではないか又はそれはと重要ではないが、例えばハ
イブリッドプラスミツドで形質転換した細胞の増殖にお
いて重要な役割を果たす追加のDNA配列を含むハイブ
リッドプラスミツトに関する。この追加のDNA配列は
、原核細胞及び/又は真核細胞でもよく、染色体DNA
及び/又は染色体外DNA配列を含んでいてもよい。例
えば追加のDNA配列は、プラスミツトDNA (例え
ば細菌性又は真核細胞プラスミツドDNA) 、ウィル
スDNA及び/又は染色体DNA (例えば細菌、酵母
又は高等真核細胞の染色体DNA)由来でも(又は、よ
り構成されていても)よい。好適なハイブリッドプラス
ミツトは、細菌性プラスミツド(特に大腸菌(Esch
erichia coli)プラスミツドpBR322
又は関連プラスミツド)、バクテリオファージ、酵母2
μプラスミツド、及び/又は酵母染色体DNA由来の追
加のDNA配列を含む。
加のDNA配列は酵母の複製開始点と酵母の選択的遺伝
マーカーを有する。酵母の複製開始点を含むハイブリッ
ドプラスミツト(例えば自律的に複製する断片(ars
) )は、形質転換後に酵母細胞中で染色体外で維持さ
れ、糸状分裂で自律的に複製される。II母の2μプラ
スミツドDNAに相同性のある配列を含むハイブリッド
プラスミツドを使用することもできる。これらのハイブ
リッドプラスミツトはすでに細胞内に存在する2μプラ
スミツド中に組換えにより取り込まれるか、又は自律的
に複製される。取り込みベクターであるヨーロッパ特許
出願第251744号の取り込みベクター(inegr
ation vector )又はヨーロッパ特許出願
第286424号の「分解」ベクター(disinte
gration” vector)を使用することもで
きる。
型発現による形質転換体の選択を促進する任意のマーカ
ー遺伝子が使用できる。酵母の適当なマーカーとしては
特に抗生物質耐性を示すもの、又は栄養要求性(all
XOtrophic )酵母突然変異体の場合は宿主の
障害を補正する遺伝子である。
に対する耐性を与え、栄養要求性酵母突然変異体(例え
ばURAl、URA3、ARG4、LEU2、HIS4
、HIS3、TRP5又はTRPI遺伝子)に無機物か
ら栄養を取る能力(ブooトロフィー (protot
rophy ) )を与える。
DNA配列はまた、複製開始点と細菌宿主(特に大l!
菌)の選択的遺伝マーカーを有することが有効である。
開始点大WA菌のマーカーが存在することには有用な特
色がある。まず大腸菌中での増殖と増幅により大量のハ
イブリッドプラスミツトDNAが得られること、第2に
大ttmに基づく全範囲のクローニング技術が利用でき
るため大m菌中でのハイブリッドプラスミツトの作成が
便利であることである。大limプラスミツド(例えば
pBR322など)は、大腸菌複製開始点と抗生物質(
例えばテトラサイクリンやアンピシリン)耐性を与える
大腸菌遺伝マーカーを含み、酵母のハイブリッドベクタ
ーの一部として有効に使用できる。
御配列と、目的の蛋白をコードするDNA配列よりなる
1つ又は複数のDNA挿入体を含む。もしハイブリッド
ベクターが複数のDNA挿入体(例えば2つから4つの
DNA挿入体)を含む場合、これらはハイブリッドベク
ター中で一列に並んで、又は異なる位置に存在する。
数のDNA挿入体を含む。DNA挿入体は特に頭から尾
に配列している。
法で調製される。ハイブリッドベクターの調製法は、本
発明のプロモーター、目的のポリペプチドをコードする
DNA配列よりなり発現制御配列の転写制御下にあるD
NA断片、そして菌類の転写停止シグナルを含有するD
NA配列を含有する1つ又は複数のDNA作成体をその
まま、又は該DNA作成体の成分をあらかじめ決められ
た順序で、ベクターに導入することよりなる。
用することにより作成される。プラスミツトの成分は通
常の制限部位及び/又は合成リンカ−分子及び/又はプ
ラント末端結合法により結合される。
ッカロミセスセレビツシエ又はシゾサツカロミセスボン
ベ(Schizosaccharomycesposb
e ) 、又はプロモーターが有効である他の任意の宿
主)中で使用できる。菌類細胞としては、ピキア(Pi
chia)属、サツカロミセス(5accharosy
ces )属、クルイヘロミセス(にIuyveros
yces ) j11キャンデイダ(Candida
)属、トルロプシス(Torulopsis)属、ハン
ゼニュラ(Hansenula )属、シゾサツカロミ
セス(Schizosaccharomyces )属
、シテロミセス(Citeromyces ) ji、
バキソレン(Pachysolen)属、デバロミセス
(Debaromyces ) jig、メチユニコピ
ア (Hetshunikowia )属、0−ドスボ
リジウム(Rhodosporidius)属、ロイコ
スボリジウム(LeUCO3pOridiUI)属、ポ
ツリオアスカス(Botryoascus )属、スボ
リジオボラス(Sporidiobolus )属、エ
ンドミコプシス(Endosycopsis> IjA
などがある。好適な属は、ピキア(Pichia)属、
サツカロミセス(saccharog+yces )属
、クルイベロミセス(にIuyverosyces )
属、ヤロビア(Varrowia )属そしてハンゼニ
ュラ(Hansenula )属よりなる群から選択さ
れるものである。その理由は、現在これらの酵母のDN
Aを操作する能力は、上記の他の属の酵母より充分に開
発されているからである。
シエ、サッカ0ミセスイタリカス(5accharoa
yces 1talicus)そしてサツカロミセスル
ーキシ−(saccharosyces rouxii
)がある。
ジリス(に1uyveroayces flaoili
s)とクルイベロミセスラクテイス(に+uyvero
mVces 1actis)がある。ハンゼニュラの例
としては、ハンゼニュラボリモルフ7 (Hansen
ula polysorpha)とハンセニュラアノマ
ラ(Hansenula anowala )そしてハ
ンゼニュラカブスラータ(HanSenUlacaps
ulata )がある。ヤ0ビアリボリテイ力(Yar
rowia l1polytica )は適当なり0ビ
ア種の例である。糸状性の菌類としては、アスペルギル
スニガー(Aspergillus niger )が
ある。
(5pheroplast )を産生し:(b)スフェ
ロプラストを形質転換DNA (種々の供給源から入手
されたものであり、天然又は非天然のDNA配列を含む
)と混合し;そして(C)形質転換細胞を再生させるこ
とにより形質転換される。次に再生した細胞を、形質転
換DNAの導入のためにスクリーニングする。
ロビア属そしてハンゼニュラ属の―類細胞は、細胞壁を
酵素で消化してスフェロプラストを産生させて形質転換
し:次にスフェロプラストを形質転換DNAと混合し、
カルシウムイオンとポリエチレングリコールの存在上で
インキュベートし、形質転換したスフェロプラストを再
生培地中で再生することにより、形質転換できることが
証明されている。
パ特許第251744号、第258067号、そしてW
090101063号に一般的に記載されており、これ
らは全て参考のため本明細書に引用されている。
グズオブナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブ
’l−X スI −(Pr0C,Natl、^cad、
sci。
、ハイブリッドベクターで酵母を形質転換することがで
きる。この方法は3つの段階に分類できる: (1) 例えばカタツムリの消化管液(out ju
ices)(例えばグルスラーゼ(Glusulase
’ ) 又ハヘ’Jカーゼ(HelicaseR)
)のような種々のグルコシダーゼ調製物、又は微生物よ
り得られた酵素混合物(例えばザイモリアーゼ(Zym
olyase R) )を用いて、浸透圧を安定化させ
た溶液(例えば1Mンルビトール)中で、酵母の細胞壁
又はその一部を除去。
存在下でDNAベクターによる「裸の」酵母細胞(スフ
ェロプラスト)の処理。
した細胞の選択。この再生はスフェロプラストを寒天中
に埋め込んで行うのが便利である。例えば溶解した寒天
(約50℃)をスフェロプラストと混合する。溶液を酵
母の増殖温度(約30℃)に冷却して固体層を得る。こ
の寒天層は、スフェロプラストからの必須高分子の急速
な拡散と消失を防ぐためであり、従って細胞壁の再生を
促進する。
表面に広げることによっても、(効率は低いが)細I!
壁の再生は可能である。
きるように、再生寒天を調製する。選択マーカー(−同
上)としてアミノ酸生合成経路の酵素をコードする酵母
遺伝子が一般的に使用されるため、再生は好ましくは酵
母の最小培地寒天中で行われる。非常に効率の^い再生
が必要な場合は、以下の2段階法が有効である: (1) 栄養豊富な複合培地(rich cospl
ex■edium)中での細胞壁の再生、そして(2)
選択寒天平板への細胞層のレプリカ平板法による形
質転換細胞の選択。
る線状DNAベクターの場合、形質転換は好ましくは、
酵母の選択マーカーを含む第2のベクターの存在下で行
われる。この共形質転換(cotransrorsat
ton)により、直接には選択することができないDN
Aを取り上げた宿主細胞を濃縮することができる。コン
ビタントな (competent )細胞は任意の型のDNAを取
り上げるため、選択ベクターで形質転換した大多数の細
胞は追加のDNA (例えば上記の線状DNAベクター
)を持っている。目的のポリペプチドの産生に当たって
は、当業者に公知の方法を用いて突然変異や選択により
、形質転換宿主細胞を改良することができる。突然変異
は例えば紫外線照射又は適当な化学試薬により行うこと
ができる。プロテアーゼA又はBの欠損した株が特に好
ましく、このような株は一般的に入手することができる
。
を含む)をコードする。ポリペプチドとしては、フィブ
ロネクチン又はその一部(例えばヨーロッパ特許207
51号に記載のコラーゲン又はフィブリン結合部分)、
ウロキナーゼ、ブローウロキナーゼ、CD4の1−36
8部分(デイ−・スミス(D、5Iith )ら、サイ
エンス(Science )第328巻、1704−1
707頁(1987年))、血小板由来増殖因子(コリ
ンズ(Coffins )ら、ネーチt−(Natur
e)第316巻、748−750頁(1985年))、
形質転換増殖因子β(プリンク(Derynck )ら
、ネーチt −(Nature)第316巻、701−
705頁(1985年))、ホンビルプラント因子(V
on Ni1lebr and’s Factor)の
1−272部分(ボンタム(80ntha■)ら、ヌク
レイックアシッズリサーチ(Nucl、Ac1ds R
es、 )第145巻、7125−7127頁)、フィ
ブロネクチンのカテプシンD断片(585−第578)
、α1−アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクティ
ベーターインヒビター、第■因子、α−グロビン、β−
グロビン、ミオグロビン、神経増殖因子、LAC!(リ
ポ蛋白関連凝固インヒビター)(ジー・ジエイ・ブロー
ス(Broze、 G、J、 ) 、バイオケミストリ
ー(Biochemistry)第29巻、7539−
7546頁(1990年))、ラクトフェリン(ジエイ
・フレンチt −(Fletcher、 J、)、「免
疫、腫瘍、炎症における鉄J (’ Iron in
Im−unit■Cancer 畠1nflag+na
tion“)、1989年、ウィリーアンドサンズ(賛
iey & Song) 、エム・デソウサとジェイ・
エイチ・ブロック(de 5ousa、 H。
胞増殖因子(PDECGF)(エフ・イシカワ(Ish
ikawa、 F、)、ネーチ1y −(nature
)第338巻、557−562頁(1989年))、又
はこれらの保存的変種がある。ポリペプチドはまた、H
8A又はそのN−末端部分と他のポリペプチド(例えば
上記したもの)との融合物でもよい。好ましくはポリペ
プチドは天然に存在するヒト血清アルブミン、修飾ヒト
血清アルブミン又はこれらのいずれかの断片(このよう
な修飾型や断片が1変種」である)、又はα−又はβ−
グロビンである。これらの変種は、H8Aの少なくとも
1つの生理学的機能を果たし、(当業者によりH8Aの
型又は断片と見なされる)構造的(特に3次元構造)に
H8Aに充分類似の全ての型のH8A又はH8Aの断片
を含む。
酸に関して)の少なくとも50%(好ましくは80%、
又は95%)、及び/又はその作用の少なくとも50%
(好ましくは80%又は90%)を保持するH8Aの変
種又は断片が含まれる。このような性質はジェイ・アー
ル・ブラウンとビー・シ3ツクレイ(Brown、 J
R& 5hockleyP )(1982年)、脂質
−蛋白相互作用(Lipid−Protein Int
eraction )第1巻、2668頁、ビー・シー
・ジョストとオー・エイチ・グリフイス(Jost、
P C& GriHith、 OH)編)に討論されて
いる。
Aの部分は、本発明のプロモーターの使用により発現さ
れる有用なH8A断片の例である。
て発現される。)ISAの場合はこれは例えば、天然の
H8Aリーダー、サツ力ロミセスセレビッシェのαメー
ティング因子(−atinlJfactor) 、クル
イベロミセスラクティス(にluyverowyces
1actis)キラー毒素リーダー又は天然のH8A
リーダーと上記酵母リーダーのいずれかとの融合物であ
る。即ちリーダーは5EQ4と5EQ5のいずれか、又
はいずれかの配列の保存的に修飾された変種(WO90
101063に記載)である。
るために発酵される。ポリペプチドは公知の方法(例え
ば(もしポリペプチドが分泌されない場合)細胞を分離
し、溶解し、上澄液を集め、濃縮しそしてクロマトグラ
フィーでポリペプチドを分離)により精製される。
で(グリセロールとエタノールの存在にかかわらず)脱
抑制され、これは酵母の大量培養に有用である。即ち本
発明は形質転換した酵母を大量に増殖させ、培地から複
合炭素域を枯渇させて単純な炭素源(例えばグリセロー
ル又はエタノール)を添加して目的のポリペプチドの発
現を誘導する方法を与える。
る。
E274、pAYE275、pAYE334、pAYE
276、pAYE323、pAYE324、pSAC3
5そして pAYE321の制限酵素地図である。
の写真である。
エートデヒドロゲナーゼのプロモーターの発現の経時変
化を示す写真である。
ある。
。
。
80dlaCZデルタM第5、デルタ(l acZYA
−araF> Ul 69、recAl、endAI、
hsdR17(rk −mk” >、5LIpE44、
ラムダ、thi−1、QyrA、relAl)を使用し
た。M13ベクターの増殖のために、大腸菌X L、
1−ブルー(ストラータジーン(Stratagene
) 、e n d A 1、hsdR17(r −1
m +)、5upE44、k thi−1、ラムダ、recAl、QyrA96、re
lAl、(lac−)、[F’ 1)rOAB。
)を使用した。組換えアルブミン発現の宿主としてサツ
カロミセスセレビッシよ りBlcir” (a、1eu2)を使用した。使用
した他のサツ力ロミセスセレビッシエ株はAH22c
i r” (a、canl、1eu2、his4):
BJ1991c i r” (cr、prbl−11
22、pep4−3.1eu2、trpl、ura3−
52)と522c i r” (a、adel、ad
e2、ural、his7、tyrl、Iys7、ga
l 1、Qut2)である。酵母細胞は30℃で、適当
な炭素源を補ったYEP (1%(賛/V)!I母エキ
ス、2%(W/V)バタトベプトン)栄養寒天(nut
rient agar )上で行った。サツ力ロミセス
セレビッシエ形質転換体は、50−の円錐形振盪フラス
コ中の10dYEP、2%(Ill/v)ショ糖中で、
30℃、200rp−で72FR間増殖さセタ。1%(
W/V)電気泳動品質のアガロースを含有するYEPを
50℃に冷却してH8A抗体平板を調製した。次に適当
な炭素源と共に2.5%(V/V)になるようにウサギ
抗−ヒトアルブミン抗血清(キャンビオ(Cambio
) 、ケンブリッジ(Ca−bridge ) 、英国
)を加え、栄養培地(nutrient medium
)をシャーレのなかに注ぎ、冷却させた。
iatis)ら、1982年、モレキュラークロニング
、実験室マニュアル(MolecularClonin
g、^Laboratory Manual) ; ]
−]ルドスブリングハーパーCold Spring
Harbor) ;サンプルーフ(5asbrook)
ら、1989年(第2版))。
ーチン的に回収した(ビー・フォーゲルスタイン(Vo
gelstein、 B、) 、アナリテイカルバイオ
ケミストリ−(Anal、 B10Chel ) 、第
160@、1第5−118頁(1987年))。放射標
識DNAは[α−32P]dATP(アマ−ジャムイン
ターナショナル(Amesha−1nterna口on
al )PLO)とランダムブライマー′l!AIE払
(ニー・ビー・フエインバーグとビー・フォーゲルスタ
イン(Fe1nbero、 A P and Vooe
lstein、 B、 ) 、7ナリテイカルバイオケ
ミストリー(Anal、 8ioche置)第137巻
、266−267頁(1984年))を用いて行った。
DNAポリメラーゼそして大腸菌DNAポリメラーゼ
■(フレノウ断片)はベーリンガーマンハイム(Boe
hringer−Hannnheig*)社より入手し
た。
UT2)I母プロモーター断片は、酵母DNAのBQI
II制限により得られた断片のゲノムライブラリーから
得た。Bq l I[III限断片は、単、純ヘルペス
(Herpes Simplex)のチミジンキナーゼ
(丁K)遺伝子を含むプラスミツトの単一のBqlI[
部位に挿入された。プロモーター断片がチミジンキナー
ゼ遺伝子の前にクローン化される場合のみ、このプラス
ミツトで形質転換した酵母は葉酸アンタゴニスト(例え
ばスルファニルアミドとアメトプテリン)の存在下で増
殖する(グツデイ(Goodey )ら、モレキュラー
アンドジエネラルジエネテイツクス(Molecula
r and GeneralGenetics)第20
4巻、505−511頁(1986年)、参考のため本
明細書中に引用されている)。
より、活性プロモーターを有するプラスミツドを選択し
た。
限断片中に封じ込めた(図1)。グリセロール−3−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼプロモーターの1.48に
塩基対の断片の配列を決定した(SEQ2>。酵母プロ
モーターの3′末端上に5fiI制限工ンドヌクレアー
ゼ部位を導入してプロモーター断片を修飾した。
る。
aI断片(即ち5EQ117)1031−1036位の
CTGC八Gかへ1314−1317位のGTACまで
)と56塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドリンカ− 5′− TATAAAG ATG AAG TGG GTA−5
′ TCGA−3’ (この51 31鎖は5EQ12を構成する)をM13
mp18のpst■とl−1i n d I[[部位に
挿入しくVニツシューベロン(Yanisch−Per
ron)ら、ジーン(Gone)第33巻、103−1
09頁(1985年))プラスミツドpAYF274
(図2)を作成し、単一のSf’i丁5’ 部位を翻訳
開始部位に導入した。EC0RIとPstIでpAYE
274を線状化し、pXL5 (図1)からの2.3k
bのEcoRI−PstI断ハで再び環状化し、pAY
E275を作成した(図3)。これをE、C0RT−H
indllで消化し2.3kbの0UT2プロモ一ター
断片を精製した。
用される)の作成は、同時継続出願第8927480.
7号に記載されているが、本明細書でも繰り返して記載
する。
、1987年:イーストバイオテクノロジー(Yeas
t BioLechnologV ) 、401−42
9 頁、デイ−・アール・べり−、アイ・ラッセルとシ
ー・ジー・スヂュア−1−(Berry、 D、R,、
Ru5sell I。
ン−/’ > ドア ンウィン社(八1lenn a
nd Unwin)発行)をB a m LI I テ
部分消化して線状化した。5′の突き出た末端を14D
NAポリメラーゼでプラント末端にし、二本鎖オリゴヌ
クレオチドリンカー: 5 ’ −GCGGCCGC−3’ 3 ’−CGCCGGCG−5 ’ L−−−−−」 NotI で結合させた。ADHIターミネータ−(tervin
ator)の3′末端でBamHI部位がNotI制限
部位に置き変わっている組換えプラスミツドpAYE3
34 (図4)を選択した。
4からの450塩基対のHindlll−NotI
ADHIターミネータ−断片を、それ自身のNotIH
1部位 (b ’ (] CG G CCG
Ct 3 ’ ) が B a
m HI部位に導入されBam111部位を破壊
しているp△丁第53に結合しくライラグとシエラット
(Twigg and 5herratt) 、
1 9 8 0 年 ) 、pΔYIE276を作成
した(図5)。
状化し、3′のへこんだ(recessed )末端を
1“4DNΔポリメラービとdNTPで埋め、過剰のN
otlリンカ− (5’−GCGGCCGC−3’ )で再環状化してプ
ラスミツドpAYE323を作成したく図6)。このプ
ラスミツドをHindllで線状化し、二本鎖オリゴヌ
クレオチドリン力m: HirxiXXX AAGA−3’ TTCT−5’ (この5’ −3’ 鎖は5EQ13を構成する)と、
XhoIr線状化したrnp19.7 (ml−0ツバ
特許出願第201239号)から放出される1、9に塩
基対のHAcDNA断片で再環状化し、S1ヌクレアー
ゼでプラント末端にしだ後Hinduで消化してプラス
ミドpAYE324を作成した(図7)。プラスミツド
pAYE324(図7)中に作られた3、72に塩基対
のNO1■制限断片は、次に単一のNotl制限部位を
含有する適当な酵母複製ベクター(例えばDSAC35
、図8)に移し、pAYE321(図9ンのようなプラ
スミツドを作成することができる。
x (Chinery and Hinchliff
e) (カレントジx ネ−r イ’y ス(Curr
、Genet、 )第16巻、21−25頁(1989
年))とヨーロッパ特許第286424号に記載された
E)SAC3の誘導体である。LEU2選択マーカーは
、pSAC3の5naBI部位に挿入されたYEP13
(ジェイ−7−ル・ブローチ(Broach J R)
ら、セル(Cell)第16巻、827−839頁(1
979年))からのI 、 95 kJ忌基対の5as
III D a I llli片である。LELJ2m
伝子は単一の’r t b I−11I部位をf′1す
る。このW9素で処理した後人a菌DN△ポリメラーゼ
■のフレノウ断片で処理して5′の突き出た末端を除去
した。プラント末端と線状化したDNAを配列 5’−GCGGCCGC−3’ 3’−cccccccc−s’ の二本鎖オリゴヌクレAチドと結合させて、No t
I、l識部位を挿入してpsAc35を作成した。
ードづるDNA断片を修飾するのに、多くの方法がある
ことが当業者には認識できるであろう。
泌ベクター(pAYE321)について記載する。この
ベクターは5つの異なる酵母株を形質転換づるのに使用
されている:これら5つの全ての株は培養上澄液中にl
−18Aを分泌した。プロモーターの制御下にあるH8
Aの発現のタイミングも調べた。細胞が後期対数増殖期
に達すると、まずH3A mRNAが検出された。培
養物が静止用に入ってからち高レベルのH8A mR
NAが維持された。
限部位がその横に存在する全プロモーター/H8A分泌
カセットを有するpA7第53ベースのベクターである
。この3.175に塩基対の分泌カセットは以下の特徴
を有する:1)上記したように(SEQ7)ATGの上
流の30から40塩基対の間の部位で4つのヌクレオチ
ドの置換が導入されている以外は、天然のプロモーター
ATG環境を含む1.35ktl基対のプロモーター断
片。
子融合リーダー配列(WO90101063)。
ータ−aI域。
秘カセットを精製しpsAc35 (図8)(7)11
−のN0tIり0−ニング部位に挿入してプラスミツド
pAYE321を作成した(図9)。
totrophy )にした:即ち株1[cir” コ
、株2[cir’l、株3[cir’]、株4[cir
’]、株5[cir’]、形質転換は基本的にベッグズ
(B13111111S )の記載する方法(ネーチャ
−(Nature)第275巻、104−109頁(1
978年))に従い実施したが、以下の変更を行った。
2.5μl f)20% (W/V )ポリエチレング
リコール3350 (シグマ)、10mHCaCl
、10mMトリス/塩1(pH7,5>中で、10μm
N!2イオン水中の形質転換DNAを50μmのスフェ
ロプラストと静かに混合させ、氷の上に第5分間保持し
た。さらに500μmの20%(W/V)ポリエチレン
グリコール3350(ジグv)、10m?4 0aC1
,10m1リス/塩11(pt17,5)を添加してか
ら、スフェロプラストを51の1.2Mソルビトール選
択寒天培地と静かに混合し、平板に広げた。各棟からの
2つの独立の形質転換体を、10−IのYEP (1%
w/v illll生エキス%−/Vバクトベブトンそ
して2%−/Vブドウ糖)中で、200 rp−で攪拌
して30℃で72時間増殖させた。
、プロモーターは酵母中の異種蛋白の発現/分泌を指令
することができることを示していた。 2: の
タイミン 4001のYEP、2% <W/V )f)7ドウm’
F:含む1リツトルのシェークフラスコに株1pAYE
321を接種し、30℃、20 Orpmでインキュベ
ートした。接種後24時間目、48時間目、72時間目
、96時図目、120時間目に試料(20ml)を採っ
た。各時間で培養物の光学密度と分泌されたH8Aを測
定した。次に遠心分離により試料をS胞ベレットと培養
上澄液に分離した。上澄液に分泌されたH8Aの濃度は
ロケットゲル電気泳動で測定し、細胞ベレットがらRN
Aを抽出した。ゲル電気泳動で各FR間でのRNAを各
成分に分離し、ノーザンプロットを行い、PGKと)I
sAI造遺伝子に相同性のある放射標lDNAをプロー
ブとして検出した。リンゲイスト(Linguist)
ノ方F1. (ネーチャー (Nature)第29
3巻、311−314頁(1981年))により酵母細
胞からRNAを抽出した。10μ9の全酵母RNAを1
.0%アガロース−ホルムアルデヒドグル上で溶解し、
20XSSPEからポールバイオダイン(Paul b
io−dyne )ナイロン膜上にバキュームプロット
し、クロチエツクとシーペット(にroczek an
d 5iebet)の方法(アナリテイ力ルバイオケミ
ストリ−(Anal、Biocheg+)第184巻、
90−95頁(1990年))に従い、紫外線で架橋さ
せた。6xSSPE、5xデンハルツ(Denhard
ts ) 、0.1%(1/V)SO8゜100μg/
■1の変性したニシンの精子DNA中で50℃で18時
時間イブリダイゼーションを行った。洗浄のストリンジ
ャンシー (washing stringency) は0
. 2XSSPE。
とri−IAのレベルを示す。接種後最初の時間の24
11間目では、PGK mRNAが観察されたが、H
8Aの分泌もl−I S A m RN Aも検出さ
れなかった。接種後48時間目では、PGKとH8Aの
mRNAが細胞内に検出される。分泌されたH8Aは培
養上澄液中に観察されるため、H8A mRNAは翻
訳に使用することができる。
20時間目)では、H8A mRNAのみが観察され
、PGK mRNAは消失していた。
前の時間より増加していたが、それ以上の増加は見られ
なかった。従って以下の結論が得られる: 1)増殖の初期にH8A遺伝子は発現されず、PGKの
発現を反映していない。
され、H8Aが分泌される。
。
d batch )であろうが、又は連続培養であろう
が、発酵容器の調節された環境中では発現のタイミング
は操作することができる。単一の炭素源として抑制性の
炭素源(例えばショ糖又はブドウ糖)を与えると、異種
蛋白の発現は抑制される。
ない。オペレーターがあらかじめ決めた点でショ糖又は
ブドウ糖を非抑制性の炭素源(例えばグリセ0−ル又は
エタノール)に交換することができる。これらの条件下
では、異種蛋白の発現は脱抑制される。従って目的の生
成物の合成を最適化するように産生を調節することがで
きる。
pAYE321を30℃t”200rplt”72時間
増殖させた。対照実験でブドウ糖の代わりにショ糖を与
えたが、最終的なH8A分鄭レベルは同じである。他の
すべての実験で)ISA分泌の刺激が観察される。その
結果を以下の表1に示す。
V)グリセロールの組合せのようである。−目では刺激
効果はそれほど大きくないようであるか、ショ糖を炭素
源として得られた値はショ糖とエタノールを炭素源とし
て得られた値であることに注意すべきである。ショ糖を
過剰にして培養を続けると、分泌されるH8Aのレベル
は大きく低下するであろう。
9.5 i、s o、s io、s
l、0 1.0 12.50.
5 1.5 11.0大11引
A 本例ではサツ力ロミセスセレピツシエのジアスタテイカ
ス(diastatlcus )変種のグルコアミラー
ゼを発現し、分泌させるためのプラスミツドpDVX4
について記載する。
0 (図12)の作成t’あり、コt’L Lt以下の
DNA配列を含んでいた: a)修飾したGUT2UO2F2ター(pAYE275
ンの0.34kJi基対の3rna 1.−8 f i
1断片 b)SfiI、BullそしTHindmのilJ限酵
素部位を含む合成オリゴヌクレAヂドリン力−合成Aリ
ゴヌクレAチドリンカ− Fl I Bgl U Hlnd m Derived 5equence オリゴ 5− CGGCCAGATCTA
3− (12)合成: 3 ’GGGG
CCGGTCTΔGATTCGA 5″5’ −3’
修飾領域と2つのAリボヌクレオチドはそれぞれ5E
Q14.5EQ8.5EQ9として記載されている。
アール・ニー・ヒッツエマン(u r tzeIlan
、 R^)ら、ネーチャー(nature)第293巻
、717頁(1981年))。
そのフランキング配列(flankinasequec
nces )はそれぞれ0.7に塩基対のKpnI−X
baI断片と0.38に塩基対のBamHI−KpnI
断片上に存在した(エム・カリシ(にarin、 H)
ら、プロシーデイングズオブナショナルアカデミーオブ
サイエンシーズ(Proc、Natl、Acacl、S
ci、 )第81巻、337頁(1984年))。cu
p−i遺伝子は醸造酵母の形質転換の選択的遺伝マーカ
ーとして使用した。
の細菌性DNA (pLJC9)(チネリとヒンチュリ
フx (Chinery and Hinchliff
e) 、カレントジエネチツクス(Curr、Gene
t、 )第16巻、21−25頁(1989年))。
る2、2に塩基対Hindl断片(ジエイ・アール・ブ
ローチ(Broach J R) (1982年)。「
酵母サツカロミセスセレビッシエの分子生物学:生活史
と遺伝」 (″” The Mo1ecular Bi
olooy orthe yeast Sacch
arowyces cerevisiae:LifeC
ycle and Inheritance ″)中の
酵母プラスミツド2ttmサークル(The yeas
t plasmid 2μmcircle)。ジエイ・
エフ・ストラーサーン、イー・ダブリュー・ジミーンズ
とジェイ・アール・ブローチ(Strathern、
J N、 E HJones and JRBroac
h)編、コールドスプリングハーバ−(ColdSpr
ing Harbor) 、445頁)o 2μmD
NAの全DNA配列も知られている(ジエイ・エル・ハ
ートレイとジェイ・イー・ドネルソン(t+art+e
y。
ーチty −(Nature)第226巻、860頁、
(1980年))グルコアミラーゼをコードするDEX
I遺伝子はサツ力ロミセスセレビッシェのジアスタテイ
カス変種から単離した(ビー・ター・ミーデン(Hea
den P K)ら、ジーン(aene)第34巻、3
25頁(1985年) 、PCT/GB8510059
9:バルド(PardO) ’3、(エフ・イー・ヒー
ーIス−し9−ズ(FEBS、 Lett )第239
巻、179−184頁(1988年)はDEXIプ0モ
ーターとそのオーブンリーディングフレームの一部につ
いて記載している)。DEX1遺伝子を有する2、75
に塩基対のBgIm断片をpDXL200中の単一のB
alII部位にクローン化し、DNA配列を5EQ10
とし、そのコードする蛋白はを5EQI 1として現れ
た。、得られたプラスミツト、pDVX2 (図13)
をXbaIで消化して、細菌性DNAを含有する小さい
断片(2,7に塩基対)を除去した。ゲル精製の後大き
いXba■断片を醸造酵母中に形質転換し、このプラス
ミツドをpDVX4とした(図14)。
母株を、ヘキソキナーゼ−vU定量法(ベーリンガーマ
ンハイム社(BoehrinoerMannheis)
)を用いて、グルコアミラーゼ産生について測定した
。すべての例で銅耐性形質転換体は多量の細胞外グルコ
アミラーゼを産生した。
の特徴 (^)長さ:13571基対 (8)型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (0)トポロジー:直鎖状 (iil 分子の型:DNA(ゲノム)(i ハイボ
セテイカル:NO (転) アンチセンス=NO 簡) 起源 (^)生物芯: 5accharoayces cer
evisiae(ix)特徴: (A)名称/キーニブ0モーター (B)位置:42..52 (D)他の情報:/機能=RNA POLII[プロ
モーター ボックスA (ix)特徴: (^)名称/キーニブOモーター (8)位置:86..96 (0)他の情報:/機能=RNA POLI[[プロ
モーター ボックスA (1x)特@: (^)名称/キ一二プロモーター (8)位1f:113..118 (D)他の情報:/機能=RNA ターミネータ− 0LBI (ix)特徴: (^)名称/キー:蛋白結合 (B)位1!:1091..1103 (D)他の情報:/結合部分=RAPI/GRFI/T
UFI (ix)特徴: (A)名称/キー:蛋白結合 (B)位置:1106..1118 (0)他の情報:/結合部分−RAPI/GRFI/T
UFI (ix)特徴: (^)名称/キー:m1scシグナル (B)位置:1176、.1241 (D)他の情報 /1N能−ビリミジン(0丁)ブロッ
ク (iX)特徴: (A)名称/キー: TATAシグナル(B)位[:1
326..1335 (D)他の情報: (1x)特徴: (^)名称/キー:m1scシグナル (B)位置: 1369..1406 (D)他の情報:/機能−ビリミジン(CT)ブロック (ix)特徴: (^)名称/キー:m1scシグナル (8)位置:1418..1421 (0)他の情報二様能=CAAGボックス(iX)特徴
: (A)名称/キー:m1scシグナル (B)位置:1425..1429 (D)他の情報:/機能=CCAΔ■ボックス (ix)特徴: (^)名称/キー:m1sc特徴 (B)位1:1031..1036 (D)他の情報:/機能=ps t ■制限酵素部位 (ix)特徴: ^)名称/キー:m1sc特徴 B)位置:1314..1317 D)他の情報: 5EQ1の配列 (xi (2)配列順2 (SEQ2)の情報:(il 配列
の特徴: (A)長さ: 1483塩基対 (B)型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (0)トポロジー:直鎖状 (ii) 配列の種類:DNA(ゲノム)(ix)特
徴: (A)名称/キー:m1sc特徴 (B)位置:123..124 (D)他の情報:/機能−3stl[制限酵素部位 (xi)SEQ2の配列: (2)配列Nn3 (SEQ3)の情報:(1) 配
列の特W1: (A)長さ:380塩基対 (B)型:核酸 (C)鎖の数二二本鎖 (D)トポ0ジー二直鎖状 (ii) 配列の型:DNA(ゲノム)(i へイボ
セテイカル二NO ■ アンチセンス二N0 (ix)特徴: (A)名称/キー:m1sc特徴 (8)位1:54..59 (D) I!Iの情報:/機能−pst4制限酵素部位 (A)名称/キー:m1sc特徴 (B)位M:337..340 (0)他の情報:/4IN能−RsaI制限酵素部位 (xi)SEQ3の配列: (ix)特徴: (A)名称/キー二miscgR徴 (B)位1!:54..59 (D)他の情報:/機能=pst■制限酵素部位 (ix)特徴: Σ− (2)配列NC14(SEQ4)の情報:(it 配
列の特m: (A)長さ=24アミノ酸 (8)型ニアミノ酸 (C)鎖の数ニー重鎖 (0)トポロジー=M鎖状 (ii) 配列の型:ペプチド i) ハイボセテイカル:N0 OVl アンチセンス=NO (v) フラグメント型:N−末端 (ix)特徴: (A)名称/キー:ペプチド (8)位11:1..24 (D)他の情報:/ラベル=リーダー /ノート=合成分泌リーダ ー配列 (xi)SEQ4の配列: (2)配列NQ5 (SEQ5)の情報:(1) 配
列の特徴: (A)長さ:21アミノ酸 (B)型ニアミノ酸 (C)鎖の数ニー重鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii) 配列の型:ペプチド (it ハイボセテイカル二NO CM アンチセンス:No (vl フラグメント型:N−末端 (ix)特I!: (A)名称/キー:ペプチド (B)位@:i、、2i (D)他の情報:/ラベル=リーダー /ノート=合成分泌リーダ ー配列 (xi)SEQ5の配列: 工H(1) (il 配列の特徴: (A)長さ:47塩基対 (B)型:核酸 (C)鎖の数ニー末鎖 (0)トポロジー:直鎖状 (i:) 配列の型:DNA(ゲノム)(1ハイボセ
テイカル:NO (M アンチセンス:No (ix 特徴: A)名称/キー:修飾塩基 B)位1f:5 D)他の情報: (ix 特徴: ^)名称/キー:修飾塩基 B)位w:6 (D) I!!の情報: (ix)特徴: (^)名称/キー:修飾塩基 (B)位1f:14 (2)配列No、6(SFQ6)の情報:fil 配
列の特@: (八)長さ二47塩基対 (Bl型:核酸 (C)鎖の数ニー・本鎖 (D)1−ボ【Jジー:直鎖状 配列の型:DNA(ゲノム) ハイボセテイカル:NO アンチセンス=NO 起源 八)生物上: 5accl+aromyces cer
evisiae(ix)特m: ^)名称/キー:エクソン B)位1t!!t:1. 、47 D)他の情報:/ノートーGLIT2プロモーターの天
然ATG環境 (xi)SEQ6の配列: GTACACCCCCCCCCTeCACA AACA
CAAATA TTGATAATAT AAAGATG
l))他の情報: (ix 特yi: ^)名称/4−:修m堤葛 B)位置:第5 0)他の情報: (ix 特徴: ^)名称/キー: B)位置:5..17 0)他の情報:/ラベル=Sfil /ノート=Sf i I制限酵 素部位 (xi)SEQ7の配列: GTACGGCCCCCCCGGCCACA AACA
CAAATA TTGATAATA’I’ AAAGA
TG(2)配列Nn8(SEQ8)の情報:(it
配列の特m: (^)長さ:12塩基対 (B)型:核酸 (C)鎖の数ニー・木鎖 (D) l−ボ1]ジー: i:j鎖状(iil 配
列の型:cDNA (il ハイボヒテイカル二NO (M アンチセンス:N0 (ix)特徴: (八)名称/↓−:m1sc特徴 (R)位置:1..12 (0)他の情報:/機能=SEQ14の横築に用いる合
成オリゴ (xi)SEQ8の配列: CGGCCAGATCTA ]−2配列Nf19
(SEQ9)の情報: lit 配列の特徴: (^)長さ:19塩基対 (B)型:核酸 (C)鎖の数ニー重鎖 (0)l−ボロジー:直鎖状 (ii) 配列の型: cDNA (ix)特徴; (八)名称/4−:…1scfi徴 (B)位置: i 、 、 ’+ 9 (D)他の情報:/機能== S r−Q ’+ 4の
横築に用いる合成Aリボ /ノートーこのオリゴは S L Q 8に相補性 (Xi)SEQ9の配列: AGCTTAGATCTGGCCGGGG 19(
2)配列Nu 10 (S E Q 10 )の情報:
(H配列の特yi= (^)長さ:2754塩基対 (B)型:核酸 (C)鎖の数二二本鎮 (D)トポロジー:直鎖状 1ii) 配列の型:DNA(ゲノム)禰) ハイボ
セテイカル:NO (M アンチセンス=NO M)起源 (A)生物名: Saccharowyces cer
evisiae(B)株: S、cerevisiae
var、diastattcus5106−9A (ix)特t!: (^)名称/キー:m1sc特徴 (B)位1!:98..103 (D)他の情報:/機能=StulI/BQJII部位 (ix)特t!= (^)名称/キー: C05 (B)位置: 126..2543 (D)他の情報: (xi)SEQIOの配列: +1+814cJ仁c+cJ1w υト屍陪 8
沫 藁浜 8田 51 む月 j8= 8虱 ベト <I−I U−ヘ トU11 拐h
118精目 (!l> ego (j> <u>
rq■ 韮 目μ 韮 8′;!目 E品 筒3第5 8月 8モ 3Hr、2g ベト トリへ ベE−I CJJI 韮 1
韮1芭 韮 引J u 吋右 舅泪 藁f 淀α 詣3 擬託耘d 9召 訪 Fお 本蓄睡召 目 ≦只 8月 8月ま 藁才 LILI <h <E−1へ のべ8四
藁陪 認3 子沼 むy ご芸 1々 i智 ベ−<E−I CDC!l L)>C!l
、−+w !−,1Bg 口≧E−1−!−1111
1LI−1(Jl−I Lll−1<1−ICE
lペヘ トψ べ−<P4(JQI (J
(110?cllhWj < 川 トHい
8−り> a< <HM <5E−I
QI QQ、 (J−トーロ<at
oI−I(J ■ U■1Ll< E@h
トリ −のnLl1171 E−Ia
h−+ LIO巳調 8聞 赳ε 8記 詫狂葺灯 話 2卦 旧 圏紅話 属ぢ 院フ ロぶ H斥舅1 aa ■ 目却 葺罪 Lll−I CJIJ (!+1:
(JOE屑 1≧ 6四 8と !−4−ロ ベ一 (Jul o>l−Iψ閂
0〉 υ−uO Uト じ−哨 Llα トΦ oI−1hIIIIC+4cpy E−1,−IC
!+0 じ〉「つ E−4ト ベH
CJH<I−I C!lクロ トに25 ×陪
ごg; 淡5 ■ 践佇 訂 at ぺl−1?C: Llり トωとα 2=
83 扛起 トωu’+oυ Uづ 〈Φl−I山I′
I′I ベニ Oペ ベHベ一 〇
コo 1−II−1<い 第5 肛3薫 躍α 舅曝 赳々 ?z uお粗 ゴ只 aa o> <u’rr”+ 0
G(2)配列順11 (SEQl 1 )の情報=1i
) 配列の特i!: (^)長さ二806アミノ酸 (B)型ニアミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (iil 配列の型:蛋白質 (xi)SEQllの配列: 四 駒 日 と 百〇aI −り よ じい ρ4 石 日 角 −ロ リ ■す < 切り (2)配列PIQ12 (SEQl 2)の情報:(i
l 配列の特WI: (A)長さ=54塩基対 (B)型:核酸 (C)鎖の数ニー末鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (11) 配列の型:DNA(ゲノム)(2) ハイ
ポセテイカル:NO (M アンチセンス=NO (ix)特徴: (A)名称/キ一二 (8)位1f:1..54 (0)他の情報:/ラベル=リンカー /ノートーpAYE274 の構築に用いるリンカ− (xi)SEQl2の配列: (2)配列NQ13 (SEQl3)の情報:(i)
配列の特wl: (^)長さ:60塩基対 (8)型:核酸 (C)鎖の数ニー末鎖 (0)トポロジー:直鎖状 (iil 配列の型:DNA(ゲノム)(ix)特!
!: (A)名称/キー: (B)位置:1..60 (0)他の情報:/ラベルーリンカー /ノート=pAYE309 の構築に用いる合成オリゴ ヌクレオジチドリン力− 8EQI 3の配列: (ix) (2)配列No14(St:(JI4)の情報:(it
配列の特ffi: (八)長さ:29J!基対 (Bl型:核酸 (C)鎖の数ニー末鎖 (0)1−ボロジー:直鎖状 1ii1 配列の型=DNA(ゲノム)1i1 ハ
イボセデイカル:N。
1..19 (0)他の情報:/機能−リンカー /ノートーr)DXL200 の構築に用いるリンカ− 8fiI、egzIF及び )1indlll11位を含む (xi)SEQ14の配列:
1)AYE274、pAYE275、pAYE334、
E)AYE276、E)AYE323、pAYE324
、pSAC35そしてE)AYE321の制限酵素地図
である。 第10図は、異なる時間に撮った標識RNAを示すゲル
の写真である。 第11図は、第10図に対応するグリセロール−3−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼのプロ干−ターの発瑣の経
時変化を示す写真である。 第12図はプラスミツドpDXL200の制限酵素地図
である。 第13図と第14図は、それぞれプラスミツドpDVX
2とE)DVX4の鯖限酵素地図である。
Claims (11)
- (1)野生型のサッカロミセスセレビッシエ(Sacc
haromycescerevisiae)中で通常隣
接するであろうコード配列(codingsequen
ce)から分離している、DNAプロモーター配列SE
Q1又はその変種又はその機能性部分。 - (2)特許請求の範囲第1項に記載のプロモーターにお
いて、プロモーターはその変種であるか又は機能性部分
であり、その下流に位置するコード配列の転写を促進す
る該配列の能力の少なくとも80%を有する、上記プロ
モーター。 - (3)該配列と少なくとも80%の相同性を有する、特
許請求の範囲第1項又は第2項に記載のプロモーター。 - (4)少なくとも200ヌクレオチドの長さがある、特
許請求の範囲第1項から第3項までのいずれか1項に記
載のプロモーター。 - (5)上記特許請求の範囲のいずれか1項に記載のプロ
モーターよりなるクローニングベクター又は酵母発現ベ
クターにおいて、異種コード配列はプロモーターの下流
に位置し、翻訳開始コドンに対して正しいリーディング
フレーム(readeingframe)中にあるよう
に制限部位に隣接する、上記ベクター。 - (6)特許請求の範囲第5項に記載されたように挿入さ
れた異種コード配列よりなる、特許請求の範囲第5項に
記載の酵母発現ベクター。 - (7)異種コード配列はヒト血清アルブミン又はその変
種又はその一部をコードし、随時分泌リーダー配列を有
する、特許請求の範囲第6項に記載の酵母発現ベクター
。 - (8)異種コード配列はサッカロミセスセレビツシエの
ジアスタテイカス(diastaticus)変種のグ
ルコアミラーゼをコードする、特許請求の範囲第6項に
記載の酵母発現ベクター。 - (9)特許請求の範囲第6項、7項又は8項に記載の発
現ベクターで形質転換した酵母。 - (10)特許請求の範囲第9項に記載の酵母を発酵させ
て、該異種コード配列で発現されるポリペプチドを少な
くとも部分的に精製することよりなる、ポリペプチドの
調製方法。 - (11)特許請求の範囲第10項に記載の方法において
、最初、母をポリペプチドの発現を抑制する1つ又は複
数の炭素源中で増殖させ、次に炭素源を非抑制性の化合
物又はこのような化合物の混合物に変えることよりなる
、上記方法。
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