JPH0465344B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、反応成分の１つが固体担体に吸着し
ている免疫反応で血清−及び血漿試料中の成分を
比較できるように測定する方法に関し、この場合
１種もしくは数種の溶解成分と固体担体に吸着し
た結合成分との間の免疫反応の恒温保持媒体に界
面活性剤を添加する。 従来の技術 数年前から、血清及び血漿の免疫学的測定によ
つて種々の結果が得られることは公知である。こ
の原因は、血漿中に存在しかつ固体担体に吸着し
た結合成分の活性に影響を及ぼす抑制的な因子で
ある。 Clin.Chem.24巻（1978年）第137〜139頁には、
例えば多くの放射線免疫学の測定に関して血清及
び血漿の試料間の相違が示されている。酵素免疫
検定に関しても血清及び血漿で異なる測定値が見
出されることは、例えばA¨rztl.Lad.27巻（1981
年）69〜73頁に記載されている。この論文では、
血漿のかかる内容物質、なかんずく線維素原が、
異種（heterogen）方法原理を使用するすべての
酵素免疫検定で、吸着成分と１種もしくは数種の
溶解成分との間の免疫反応の障害をもたらすとい
う結論が引き出されている。しかしながら、プラ
クチスにおいては血漿を試料媒体として使用する
ことも通常は避けられない。更に、時々測定すべ
き試料が血清又は血漿をベースとして調製されて
いるかどうかは一般に明らかではない。 それ故、成分が固体担体に吸着した形で存在す
る免疫反応で該反応成分を、試料物質、血清又は
血漿に左右されないで確かな一致する値が得られ
るように測定する方法に対する要求が生じた。
A¨rztl.Lad.27巻（1981年）69〜73頁では、前述の
障害を除去するために、試料を56℃に10分間加熱
し、続いて変性した妨害物質を遠心分離して除く
ことが提案されている。しかしながら引続いて遠
心分離が行われるこの加熱工程は、実際に測定法
に実施する場合に付加的作業工程である。更に加
熱処理によつて、他の障害および欠点が生じるこ
とが挙げられる。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、血清試料中でも並びに血漿試
料中でも比較し得る数値が得られ、更に簡単な方
法でかつ付加的工程を適用せずに実施することの
できる方法を提供することである。 問題点を解決するための手段 この課題は、１種もしくは数種の溶解成分と固
体担体に吸着した結合成分との間の免疫反応の恒
温保持媒体に界面活性剤を添加してその濃度を
0.0001〜0.005％（重量／容量）とすることによ
つて解決される。恒温保持媒体とは、血清−又は
血漿試料と更に免疫反応に一般に必要とされる成
分より成る試料溶液である。 本発明のもう１つの目的は、固体担体に吸着し
た反応成分と血清−又は血漿試料中の１種もしく
は数種の溶解成分との間の免疫反応を実施する試
薬であり、この試薬は免疫反応に通常必要な成分
に加えて界面活性剤を濃度0.0001〜0.005％（重
量／容量）で含有する。本発明による試薬は粉
末、凍結乾燥体又は溶液として存在していてもよ
い。 界面活性剤としては、非イオン及び陰イオン性
界面活性剤を使用することができる。非イオン性
界面活性剤の例は、エポキシ−脂肪酸−エステ
ル、例えばTween20（ポリオキシエチレン−ソル
ビタン−モノラウレート）、Tween80（ポリオキ
シエチレン−ソルビタン−モノオレエート）、
Triton（アルキル−ポリエーテル−アルコール−
混合物）、Brij35（ポリオキシエチレンラウリルエ
ーテル）、Non−Idet Ｐ−40（ポリオキシエチレ
ン−オクチルフエノールエーテル）、Lubrol PX
（ポリエチレンオキシド−アルキルエーテル−付
加物）、Berol EMU 043（オキシエチレン単位10
個を有するＣ−16、Ｃ−18−脂肪アルコール）そ
の他である。陰イオン性界面活性剤の例として
は、ナトリウムドデシル−サルフエート（SDS）
が挙げられる。 界面活性剤の添加によつて、免疫反応での非特
異結合を抑制するか又は除くことは公知であつ
た。免疫反応で結合成分を固体担体に吸着した形
で使用する場合には、従来は界面活性剤の添加は
回避した。それというのもこれによつて結合成分
の担体に対する吸着結合が弱化するか又は完全に
失なわされるからである。 結合成分の固体担体に対する吸着結合を損なわ
ずに、血漿の抑制因子の作用を完全に遮断するの
に、本発明による界面活性剤の添加が、前記のわ
ずかな濃度で間に合うことは驚異的なことであつ
た。 特開昭51−101121号公報には、比濁試験及び他
の免疫検出反応を有利にするため抗原−抗体−複
合体の不溶性を高めるための方法が記載されてい
る。そのためにポリエチレングリコール10〜90％
と非イオン界面活性剤90〜10％とからの混合物を
濃度３〜６％で使用する。試験中の界面活性剤の
濃度は0.3〜5.4％であり、それ故、界面活性剤濃
度は本発明による濃度0.0001〜0.005％より著し
く高い。この濃度では結合成分の固体担体への吸
着結合が損なわれる。本発明による界面活性剤濃
度を越えると、結合成分の固体担体への吸着結合
は損なわれ、血漿の抑制因子の作用を遮断するこ
とができない。更に、該文献に開示された条件下
で血漿及び血清を用いて同一の結果が達成される
かどうかは開示されていない。 本願による界面活性剤濃度0.0001〜0.005％の
上限を上廻る場合には、抗体は管壁から脱着し得
るのであり、濃度が高ければ高い程、脱着は強く
認められる。それ故、できる限り低い濃度、殊に
0.005％を下廻る界面活性剤を使用すると有利で
あり、この数値を上廻ると抗体は脱着し、試験に
おけるシグナルの低下、それ故精度の低下をもた
らす。 他方、界面活性剤濃度は一定値を下廻るべきで
はない。それというのもさもないと第２の効果、
即ち血漿を使用する場合の妨害の回避が達成され
ない。血漿は、フイブリンを含有しない血清と異
なつています。血液凝固の際に前駆体のフイブリ
ノーゲンから生成するフイブリンは例えば管壁の
ような表面に強く付着する高級ポリマー生成物で
あり、そのために血漿を使う場合に測定が妨害さ
れ易くなる。この血漿による妨害を回避するため
に本発明では一定の最低量の界面活性剤を試験系
に添加するのであり、0.0001％の量で既に達成さ
れ驚異的である。この数値を下廻ると血漿を使う
場合の妨害はもはや除去されない。 本発明の免疫反応とは、免疫学上のリセプタと
アクセプタとの間のすべての反応である。本発明
で重要なのは、反応成分を反応であるいはまた全
反応の部分工程でも固体担体に吸着した形で使用
することだけである。 例えばかかる免疫学的測定法の多くの公知の方
法には、競合検定が挙げられる。この検定では試
料中のアクセプタを測定するために、既知量の標
識したアクセプタを添加し、アクセプタ及び標識
したアクセプタは、不足量で存在し固体担体上に
存在するリセプタの結合個所に関して競合する。
更に広い分野はサンドイツチ試験であり、この試
験では少くとも２価のアクセプタを、標識したリ
セプタ及び固体担体に吸着させたリセプタと反応
させる。この反応は種々の方法で行うことができ
る： (a) アクセプタは、標識したリセプタ及び不溶性
リセプタと同時に反応する。 (b) 第１工程で、アクセプタと不溶性リセプタと
の間の反応を行う。生成複合体を、第２工程で
標識したリセプタと恒温保持する。 (c) 第１工程で、アクセプタと標識したリセプタ
との間の反応を行う。生成した可溶性複合体を
続いて不溶性リセプタと反応させる。 本発明による界面活性剤の添加は、それぞれ固
体担体に吸着したリセプタが反応に関与する工程
で行う。 アクセプタとは、殊に抗原又はハプテンであ
る。リセプタとしては、完全抗体又は抗体フラグ
メントが該当する。標識は公知方法で酵素、放射
性同位元素、蛍光発光化合物その他によつて行う
ことができる。固体担体としては、ガラス、プラ
スチツク又は類似材料からなるプレート、球、小
管、条片又は小さい棒が適当である。 実施例 例 １ 競合ELISA−試験によるジゴキシンの測定。 羊−抗−ジゴキシンを、滴定量に応じて燐酸塩
緩衝液（10ｍＭ、PH7.5）で希釈し、ポリスチレ
ンからなる試験管に充填し、１晩恒温保持する。
更に試験管中に、燐酸塩緩衝液（40ｍＭ、PH6.8）
にとかしたジゴキシンペルオキシダーゼ（20ｍ
Ｕ／ml）、牛の血清アルブミン0.25％並びに一方
はTween20を含有しない複合用緩衝液100μ及
びジゴキシンペルオキシダーゼ（20ｍＵ／ml）、
牛の血清アルブミン0.25％及び一方は
Tween200.003％を含有する複合用緩衝液1000μ
並びにジゴキシンを含有する血清又は血漿又は
標準試料100μをピペツト添加する。混合物を
室温で１時間恒温保持する。次いで試料管を吸引
し、水道水で洗浄する。 抗体へのペルオキシダーゼの共有結合は、“リ
セント・デベロープメンツ・イン・ザ・ペルヨー
デート・メソード・オブ・コンジユゲイテイン
グ・ホース・ラデイシユ・ペルオキシダーゼ
（HRPO）・トウ・アンテイボデイズ”（Recent
Developments in the Perjodate Metho de of
Conjugating Horse Radish Peroxidase
（HROP）to Antibodies）”［1978年、エルセビ
ール（Elsevier）／北オランダ、Bio−medical
社出版、イミユーンフルオレツセンス・アンド・
リレイテド・ステイニング・テクニツクス
（Immunfluorescens and Related Stai−ning
Techniques）の215〜224頁］に記載のM.B.
Wilson、Paul K.Nakaneの方法によつて行う。 続いてポリスチレン試験管の表面のペルオキシ
ダーゼの活性を公知方法で測定する。このために
は、燐酸塩／クエン酸塩緩衝液（PH4.4）100ｍＭ
中にABTS及び過酸化水素を含有する基質液
1000μを試験管にピペツトでとり、室温で１時
間恒温保持する。続いて吸光度を光度計で測定す
る。標準試料を既知のジゴキシン濃度で測定して
検量曲線を作る。未知のジゴキシン濃度での試料
の吸光度から、この検量曲線を用いて未知の試料
のジゴキシン濃度を測定する。 ABTS＝２，2′−アジノ−ジ［３−エチル−ベ
ンズチアゾリン−スルホネート(6)］。 第１図には、前記試験を界面活性剤が存在しな
いで行う場合に、種々の試料媒体に対するジゴキ
シンの検出率（％）が記載されている。１は、ジ
ゴキシン1.0ｍｇ／mlを含有する人間の透明な血
清に対する100％の値を示す。種々の血漿の試料
に対する相応する値：２＝蓚酸塩−血漿、３＝ク
エン酸塩−血漿及び４＝ヘパリン−血漿が、第１
図に同じようにして記載されている。これらの値
は、界面活性剤の不存在で著しく増大したジゴキ
シンの見かけ濃度を示す。第２図には、全く同じ
方法であるが、前述のようなTween200.003％を
添加して行つた相応する測定値が記載されてい
る。第２図に挙げられた値は、最後の場合にわず
かな偏差が認められるに過ぎないことを示す。 例 ２ サンドイツチ−ELISA−試験によるAFP［アル
フア−１−フエトプロテイン（Fo¨to−protein）］
の測定。 例１のようにして、プラスチツク試験管に羊−
抗−AFPを吸着させる、試験管を乾燥し、続い
て次のようにして使用する： 燐酸塩緩衝液（PH6.8）100ｍＭ及び牛の血清ア
ルブミン１％からなる恒温保持緩衝液1000μ及
び試料又は標準物200μを試験管に入れ、室温
で１時間恒温保持する。続いて吸引し、水道水で
１回洗浄し、ペルオキシダーゼが結合している羊
−抗−AFPからなる複合溶液を添加する。混合
物を室温で１時間恒温保持する。続いて新たに吸
引し、水道水で洗浄し、燐酸塩−クエン酸塩−緩
衝液（PH4.4）100ｍＭにとかしたABTS／過酸化
水素からなる基質液1000μと一緒に恒温保持す
る。既知のAFP含量を有する標準試料によつて、
検量曲線を作る。この検量曲線によつて、未知の
試料でAFPの濃度を測定する。 第３図には、本発明による界面活性剤を添加し
ないで、前記方法によつて見出された血清、蓚酸
塩−血漿、クエン酸塩−血漿及びヘパリン−血漿
のAFP値が示されている。記載の値は、血漿の
試験で著しくわずかなAFP濃度が測定されるこ
とを示す。 第４図には、本発明による方法で恒温保持する
際にTween200.002％を添加する場合の相応する
値が記載されている。血清と血漿との間の偏差は
わずかである。これは一般に誤差の範囲内であ
る。 完全に同じ結果は、前記測定法で界面活性剤と
してTween200.002％の代わりに、Brij350.003％
を使用すると得られる。 例 ３ サンドイツチ−ELISE−試験によるチロトロ
ピン（TSH）の測定。 例１及び２のようにして、プラスチツク試験管
にねずみのモノクロナール抗体（TSHに対する）
を吸着させ、乾燥後に次のようにして使用する： 燐酸塩緩衝液（PH6.8）100ｍＭ及び牛の血清ア
ルブミン１％を含有する恒温保持溶液1000μ
を、種々の量のTSHを含有する血清又は血漿か
らなる試験液200μと一緒にして室温で１時間
恒温保持する。続いて吸引し、洗浄し、ペルオキ
シダーゼが結合している羊−抗−TSHを含有す
る複合溶液1000μと一緒に恒温保持する。恒温
保持時間は室温で１時間である。次いで吸引し、
洗浄し、例１及び２のようにして更に処理する。 この測定法を、界面活性剤を添加しないで並び
にTween200.005％を添加して行う。血清並びに
種々の血漿の試料の検出値は、次表に記載されて
いる。 界面活性剤を添加していない及び
Tween200.005％を添加した血清及び種々の血漿
の試料のTSHの測定：

【表】 この場合にも、界面活性剤を添加しないと血清
及び血漿の試料の値は明らかに互いに異なること
が示される。本発明により界面活性剤を添加する
と、血清及び血漿の測定値は良好に一致する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、界面活性剤が存在しない種々の試料
媒体に対するジゴキシンの検出率（％）である。
第２図は、Tween200.003％を添加した相応する
測定値である。第３図は、本発明による界面活性
剤を添加しないAFPの測定値である。第４図は、
Tween200.002％を添加した相応する測定値であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 反応成分の１つを固体担体に吸着させて行う
   免疫反応において、血清−及び血漿試料中の免疫
   反応成分を比較できるように測定する方法におい
   て、１種もしくは数種の溶解成分と固体担体に吸
   着した結合成分との間の免疫反応の恒温保持媒体
   に界面活性剤を添加してその濃度を0.0001〜
   0.005％（重量／容量）とすることを特徴とする、
   免疫反応の成分を測定する方法。 ２ 界面活性剤として非イオン性又は陰イオン性
   の界面活性剤を添加する特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３ 界面活性剤をポリオキシエチレン−ソルビタ
   ン−モノラウレート、ポリオキシエチレン−ソル
   ビタン−モノオレエート、アルキル−ポリエーテ
   ル−アルコール−混合物、ポリオキシエチレンラ
   ウリルエーテル、ポリオキシエチレン−オクチル
   フエノール−エーテル、ポリエチレンオキシド−
   アルキルエーテル−付加物、オキシエチレン単位
   10個を有するＣ−16、Ｃ−18−脂肪アルコール及
   びナトリウムドデシル−サルフエートの群から選
   ぶ、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方
   法。 ４ 試料溶液に既知量の標識したアクセプタを添
   加し、測定すべきアクセプタと標識したアクセプ
   タが不足量で存在し固体担体に吸着しているリセ
   プタの結合個所に関して競合する血清−又は血漿
   試料中のアクセプタを測定する方法において、免
   疫反応の恒温保持媒体に界面活性剤を添加して、
   その濃度を0.0001〜0.005％（重量／容量）とす
   ることを特徴とする、血清−又は血漿試料中のア
   クセプタ測定法。 ５ 血清−又は血漿試料中の少くとも２価のアク
   セプタを、該アクセプタを標識したリセプタ及び
   固体担体に吸着したリセプタと接触させて測定す
   る方法において、アクセプタと固体担体に吸着し
   たリセプタとの間の免疫反応の恒温保持媒体に界
   面活性剤を添加して、その濃度を0.0001〜0.005
   ％（重量／容量）とすることを特徴とする、血清
   −又は血漿試料中の少くとも２価のアクセプタの
   測定法。 ６ 固体担体に吸着した反応成分と血清−又は血
   漿試料中の１種又は数種の溶解成分との間の免疫
   反応を実施するための試薬において、試料が免疫
   反応に必要な物質に加えて界面活性剤を濃度
   0.0001〜0.005％（重量／容量）で含有する試薬。 ７ 界面活性剤として、非イオン性又は陰イオン
   性界面活性剤を使用する、特許請求の範囲第６項
   記載の試薬。