JPH0456805B2

JPH0456805B2 -

Info

Publication number: JPH0456805B2
Application number: JP11828384A
Authority: JP
Inventors: Katsukyo Sakurai; Katsuyuki Horie; Takashi Sakamoto; Takashi Okuyama
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1984-06-11
Filing date: 1984-06-11
Publication date: 1992-09-09
Also published as: JPS6117A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ムコ多糖系癌転移抑制剤に関する。癌の治療には、主として外科療法・放射線療法
及び化学療法が試みられているが、癌の再発及び
延命効果の点で満足すべき治療効果を挙げていな
い。この原因の一つは、これらの治療法で癌の原発
巣を縮小又は除去し得ても、癌が原発巣とは別の
部位、特に脳、肺又は肝臓などの主要臓器に転移
増殖し、致命的な結果を招くからである。従つ
て、癌原発巣の縮小を計るか、癌を外科的に切除
する療法に加えて、癌の転移を防止することが癌
の根治を計る上で極めて重要である。腫瘍細胞の転移は、(a)発生部位における急速な
細胞増殖、(b)血管内への侵入、(c)特定臓器の毛細
血管内への沈着、(d)血管の内側から外側への透
過、(e)転移部位での急速な増殖など多くの過程か
ら成つている。原理的には、この中のどれか一つ
の過程を抑制すれば転移が抑制される筈である。
(c)から(e)までの過程、即ち、血管壁の内側への沈
着とそれにつづく外側への透過、そして増殖は、
一定数の腫瘍細胞を直接マウスの静脈へ注射し、
時間を追つてそれら細胞の挙動と、標的となる臓
器に新生する転移コロニーの数を組織学的、生化
学的に定量する手法があり、多くの例が報告され
ている。例えば、Razら［A.Rat，et al.；Cancer
Research，40，1645−1651（1980）］は、マウス
メラノーマ（悪性黒色細胞腫）細胞50000個を
C57BL／６マウスの静脈に注射し、18日後に肺
を切除して転移によつて生じたメラノーマ細胞の
黒色コロニーの数をカウントした場合、そのコロ
ニー数の平均値はメラノーマ細胞の細胞表面化学
組成と密接な関係があることを報告している。また、上述したように腫瘍細胞が転移するめに
は、その細胞が血管内皮に沈着する過程が不可欠
であるが、この沈着は腫瘍細胞の表面に分布する
分子と血管内皮マトリツクスを構成する分子との
相互認識、結合によつてひきおこされることが多
くの基礎実験によつて明らかにされている［R.
H.Kramer，et al.；Proceedings of Natural
Academy of Science，U.S.A.，76，5704−5708
（1979）］。一方、Honmaら［Y.Honma，et al.；Gann，
72，898−905（1981）］は、FM3A細胞に転移能が
高いほど宿主マウスの生存日数が短くなることを
証明している。更に、Kimataら［K.Kimata，et
al.；Cancer Research，43，1347−1354（1983）］
は、FM3A細胞の転移能が高いほど細胞表面にヒ
アルロン酸（以下「HA」という）を多量にもつ
ことを報告している。一般的に、HAは細胞の膜
表面のHA受容体や細胞表面及び生体内の各種組
織・器官に存在するフイブロネクチンやコラーゲ
ンに親和性を示すことが明らかにされている。また、HAはある濃度でマクロフアージの食作
用を阻害することや［E.A.Balazs；
Immunology，40，435−446（1980）］、逆に非常
に薄い濃度ではin vitro及びin vivoでマクロフ
アージや多核白血球（PMN）の運動量、代謝速
度、食作用を増加させることも知られている［L.
Ha¨kansson，et al.；Scand.J.Immunol.，11，
649−653（1980）］。しかしながら、HAの癌転移抑制剤としての適
用に関する報告は未だなされていない。また、多硫酸化多糖体が制癌効果や癌転移抑制
作用を有することが報告［Eiro Tsubura et
al.；Gann，67，849−856（1976）：Keiichi
Suemasu et al.；Gann，62，331−336（1971）：
安西重義；日医大誌，第47巻第５号，497−504
（1980）］されているが、これは多硫酸化多糖体の
有する抗血液凝固作用や線維素溶解作用によると
ころが大きく、HAはこれらの作用は殆どもつて
いない。そこで、本発明者らは、動物にHAを投与すれ
ば、これが血管内皮のHA受容体や表面にでてい
るフイブロネクチンに結合し、癌細胞が血管内皮
へ沈着することを防止し、また一度沈着した癌細
胞増と拮抗的に競合して、その癌細胞を内皮より
遊離させると共に、HAの有する免疫増強作用で
癌細胞を抑制できるのではないかと想定し、鋭意
研究を行なつた結果、本発明を完成するに至つ
た。即ち、本発明のムコ多糖系癌転移抑制剤は、
HA若しくは架橋HA又はその塩を有効成分とす
るものである。以下、本発明を更に詳細に説明する。本発明に用いるHAは、臍帯、鶏冠、硝子体な
ど特にその由来は限定れず、通常、分子量数千か
ら数百万のものを用いる。その精製法としては、
特開昭52−145594号、同52−105199号、同54−
67100号及び同55−74796号公報記載の方法などが
挙げられる。本発明において、架橋HAとは、HA又はその
塩を多官能性エポキシ化合物で架橋させて成る架
橋HAであつて、架橋数がHAのグルクロン酸と
Ｎ−アセチルグルコサミンから成成る繰り返し二
糖（以下「HAの繰り返し二糖」という）1000個
当り５以上であるものであり、特願昭59−88440
号明細書に詳述されている。本発明において、多官能性エポキシ化合物と
は、エポキシ基を少なくとも１個有する化合物で
あつて、その他に、エポキシ基を含めて、HAを
架橋するに適した官能基を１個以上有する化合物
をいう。かかる化合物としては、例えば、ハロメチルオ
キシラン化合物及びビスエポキシ化合物などが挙
げられる。ハロメチルオキシラン化合物として
は、エピクロルヒドリン、エピブロムヒドリン、
β−メチルエピクロルヒドリン及びβ−メチルエ
ピブロムヒドリンなどが挙げられる。ビスエポキ
シ化合物としては、１，２−ビス（２，３−エポ
キシプロポキシ）エタン、１，４−ビス（２，３
−エポキシプロポキシ）ブタン、１，６−ビス
（２，３−エポキシプロポキシ）ヘキサン及びビ
スフエノールＡ又はビスフエノールＦのジグリシ
ジルエーテルなどが挙げられる。 HA又は架橋HAの塩としては、ナトリウム塩、
カリウム塩などのアルカリ金属塩及びカルシウム
塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩等
が挙げられる。架橋HAは、ヒアルロニダーゼ抵抗性を有する
ものであり、次のようにして合成することができ
る。通常、分子量数千から数百万のHA又はその塩
を、0.5％以上、好ましくは1.0％以上の濃度に、
アルカリ水溶液に溶解し、水溶液有機溶剤を全液
量の30％以上、好ましくは50％以上になるように
加える。アルカリ水溶液は、PH８〜14であること
が好ましく、PH12〜14であることが更に好まし
い。アルカリとしては、通常、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどの金
属水酸化及び炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなど
の金属炭酸塩等が挙げられる。水溶性有機溶剤と
しては、メタノール、エタノール、イソプロパノ
ール、アセトン、ジオキサンなどが挙げられ、こ
れらは、単独で又は混合物として用いられる。こ
れらの水溶性有機溶剤を加えることにより反応を
有効に行なうことができ、また、アルカリによる
HAの分解（低分子化）も抑制することができ
る。次いで、得られた溶液に、前記多官能性エポキ
シ化合物の１種以上を加え、０〜100℃、好まし
くは10〜60℃、更に好ましくは20〜40℃で反応さ
せる。反応時間は、反応温度により異なるが、20
℃近辺では24時間から48時間が好ましく、40℃近
辺では２時間から３時間が好ましい。本反応において、HA又はその塩と多官能性エ
ポキシ化合物とのモル比を変えることにより、得
られる架橋HA又はその塩の架橋率を調節するこ
とができる。本発明で用いる架橋数がHAの繰り返し二糖
1000個当り５以上である架橋HAを得るには、
HAの繰り返し二糖１モルに対し、多官能性エポ
キシ化合物１モル以上用いればよい。分子量100
万前後のHAにおいては、HAの繰り返し二糖１
モルに対する多官能性エポキシ化合物の使用モル
数を１〜10モルにすれば、水溶性で曳糸性を有す
る架橋HA（以下「ｓ−架橋HA」という）を得る
ことができ、該使用モル数を10モル以上にすれ
ば、水不溶性でゲル状の架橋HA（以下「is−架橋
HA」という）を得ることができる。また、分子
量200万前後のHAにおいては、それぞれ、２〜
６モル、６モル以上で同様の目的を達成できる。ｓ−架橋HAは、高粘性、即ち、HAに比し粘
度が高く、１％生理食塩水溶液における粘度（20
℃、ずり速度1.0sec^-1）は、通常、650〜50000セ
ンチポアーズであり、非ニユートン指数（近藤
仁，北里医学，10，485（1980））は、0.5〜0.8で
ある。架橋HA及びその塩は、ヒアルロニダーゼに対
して抵抗性を示すと共に、HAの有する種々の特
性も維持している。特に、ｓ−架橋HAは、水溶性であり、また、
高粘性であるにもかかわらず、無理なく注射針を
通過することから、本発明に用いるのに好ましい
ものである。また、本発明の癌転移抑制剤に用いるHAとし
ては、極限粘度が0.2〜30であるもの、即ち、分
子量が4000〜2000000であるものが好ましい。なお、HAの分子量Mwと極限粘度［η］との
間には以下の関係式が存在しており、極限粘度を
測定することによつて分子量を算出することがで
きる（Biochim.Biophys.Acta，42，476−485
（1960））。［η］3.6×10^-4×Mw⁰.⁷⁸ 本発明の癌転移抑制剤の適用に際しては、顆粒
剤、細粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、シロツプ
剤、懸濁剤若しくは液剤等の剤型にして、又は原
末のまま経口投与してもよいし、注射剤として静
脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、胸腹腔内投
与、筋肉内投与、皮下投与又は腫瘍内投与しても
よい。また、坐剤等の剤型にして、経腸又は非経
口投与してもよい。経口、経腸若しくは非経口投
与に適した医薬用の有機又は無機の、固体又は液
体の担体若しくは希釈剤を本発明の癌転移抑制剤
の調製に用いることができる。水、ゼラチン、乳
糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、タル
ク、動植物油脂、ベンジルアルコール、ガム、ポ
リアルキレングリコール、石油樹脂、やし油、ラ
ノリン又は医薬に用いられる他のキヤリアー（担
体）はすべて、本発明に用いるHAの担体として
適用することができる。また、安定剤、湿潤剤、
乳化剤や、浸透圧を変えたり、配合剤の適切なPH
を維持するための塩類を補助薬剤として適宜用い
ることもできる。臨床投与量は、HAの分子量によつて異なる
が、通常、経口投与により用いる場合には、成人
に対しHA又は架橋HAとして、１日25mg〜５ｇ
内服するのが好ましく、年令、病態、症状により
適宜増減することが更に好ましい。前記１日量の
癌転移抑制剤は、１日に１回、又は適当な間隔を
おいて１日に２若しくは３回に分けて投与しても
よいし、間欠投与してもよい。また、注射剤として用いる場合には、成人に対
しHA又は架橋HAとして、１回量10mg〜2.5ｇを
連続投与又は間欠投与することが好ましい。本発明の癌転移抑制剤は、一般の制癌剤、例え
ば、アルキル化剤、代謝拮抗剤等にみられる骨髄
障害、心毒性、脱毛等の副作用が全くなく、鎮痛
作用や炎症による組織の破壊をすみやかに修復す
る作用を併有している。更に、本発明の癌転移抑
制剤と共に適切に投与することができる他の医薬
として有効な成分、例えば、一般の抗悪性腫瘍剤
又は抗炎症剤、抗生物質、止血剤若しくは消化性
潰瘍治療剤等と殆ど相互作用をもたないという長
所を有する。本発明の癌転移抑制剤は、その薬理からみて、
特にプロテオグリカンを活発に合成し、細胞表面
に保有している種々の悪性腫瘍の転移抑制に用い
られるが、特に、高転移性の悪性腫瘍、例えば、
悪性黒色腫（メラノーマ）、線維肉腫（フイブロ
ザルコーマ）、リンパ肉腫（リンフオザルコー
マ）、リンパ腫（リンフオーマ）等に対し優れた
効果が期待され、また外科療法時には転移が起き
やすいので、このような場合にも、優れた効果を
示すと推定される。以下に、本発明を調製例、試験例及び実施例に
基づいに詳細に説明するが、これらは、本発明の
範囲を何ら制限するものではない。なお、以下の調製例等において、極限粘度、ウ
ロン酸（グルクロン酸）含量、窒素含量、蛋白含
量の測定並びに抗原性試験、発熱性物質試験、細
菌試験は、それぞれ、「日局10」一般試験法第28
項粘度測定法、Z.Dische；．Biol.Chem.，167，
189（1947）、「日局10」一般試験法第25項窒素定量
法、O.H.Lowry，et al.；J.Biol.chem.，193，
265（1951）、「日局10」デキストラン40注射液、
「日局10」一般試験法第30項発熱性物質試験法、
衛生試験法注解［日本薬学会編］（1980年）1.4微
生物試験法記載の方法に従つて行なつた。調製例１ HAの抽出・精製鶏頭から切り離した後、直ちに凍結し鶏冠1.0
Kgを解凍し、0.06％塩化セチルピリジニウム溶液
３を加え、95℃に３時間保つた後、鶏冠を分
取、ミンチし、水３を加え、プロリシン（上田
化学工業(株)製；プロテアーゼの商品名）20万単位
を加え50℃に５時間保ち、過して液3400mlを
得た。この液3400mlに塩化ナトリウム170ｇを
添加、溶解し、次いで95％エタノール3500mlを加
え、生じた沈殿を分取・乾燥してHA6.1ｇを得
た。更に、このHAを１％の濃度になるように減菌
した生理食塩水に溶解し、一般的な操作、例え
ば、減菌過を行ないHAの生理食塩水溶液を調
製した。得られHA粉末及びHA生理食塩水溶液の物性
は次の通りであつた。 HA粉末（試料No.HA−１）極限粘度：26.5 ウロン酸含量：48.4％窒素含量：3.48％蛋白含量：0.01％抗原性：なし１％生理食塩水溶液 HA濃度：1.00％発熱性物質：なし菌数：一般細菌０個／ｇ真菌０個／ｇ調製例２ HAの抽出・精製鶏頭から切り離した後、直ちに凍結した鶏冠10
Kgを解凍し、調製例１に準じてHAを調製した。
得られたHA粉末及びHA生理食塩水溶液の物性
は次の通りであつた。 HA粉末収量62.0ｇ（試料No.HA−２）極限粘度：15.0 ウロン酸含量：48.7％窒素含量：3.46％蛋白含量：0.018％抗原性：なし１％生理食塩水溶液 HA濃度：0.99％発熱性物質：なし菌数：一般細菌０個／ｇ真菌０個／ｇ調製例３ HAの調製試料No.HA−２ 10ｇを0.1M酢酸緩衝液（PH
5.0）に1.0％に溶解し牛睾丸ヒアルロニダーゼ
（生化学工業(株)製）９mgを加え、50℃で1.3時間反
応した。得られた溶液にエタノールを1.5等量加
え沈殿物を得て、再度２％のHA濃度になるよう
に精製水に溶解し、1.5等量のエタノールを加え
て沈殿物を得た。沈殿物を２％のHA濃度になる
ように精製水に溶解し、減菌活性炭（121℃で60
分加熱処理し精製水で洗浄）を加え、滅菌ラジオ
ライト（121℃で60分加熱処理し精製水で洗浄）
を用いて過した。液にエタノールを加えて沈
殿物を得た。得られたHA粉末及びHA生理食塩水溶液の物
性は次の通りであつた。 HA粉末収量6.7ｇ（試料No.HA−３）極限粘度：7.0 ウロン酸含量：49.0％窒素含量：3.47％蛋白含量：0.010％抗原性：なし１％生理食塩水溶液 HA濃度：1.02％発熱性物質：なし菌数：一般細菌０個／ｇ真菌０個／ｇ調製例４ HAの調製試料No.HA−２を用いて調製例３に準じて以下
の表に示すHAを製造した。【表】調製例５ HAの調製試料No.HA−２ 10ｇを0.1M酢酸緩衝液（PH
5.0）に１％に溶解し、牛睾丸とヒアルロニダー
ゼ100mgを加え50℃で37時間反応した。反応液を
減圧下で濃縮し、セフアデツクスG10のカラムで
脱塩し、更にセフアデツクスG25のカラムで８糖
以上と８糖以下とに分画した。８糖以下の画分を
更にセフアデツクスG10で脱塩し、減圧下濃縮
後、過滅菌して凍結乾燥した。得られたHA粉末（試料No.HA−７）の物性は
次の通りであつた。極限粘度：0.075 ウロン酸含量：48.26％窒素含量：3.46％蛋白含量：0.011％抗原性：なし薄層クロマトグラフイー：８糖以下（メルク社キーゼルゲル60F，展開溶媒ｎ−プ
ロパノール−濃アンモニア水−水（40：30：
2.5）、発色アニスアルデヒド−硫酸）調製例６ (1) ｓ−架橋HAの合成 HAナトリウム塩（分子量7.3×10⁵）10ｇを
0.2N水酸化ナトリウム溶液450mlに冷却しつつ溶
解し、0.45μのミクロフイルターで過した。
液に10N水酸化ナトリウム溶液40ml加えて、撹拌
下、エタノール500mlとエピクロルヒドリン6.0ml
を加えた。20℃で24時間反応し、反応液を酢酸で
PH6.4に調整した。エタノール500mlを加えて白色
沈殿を得、取後、エタノールで充分に洗浄し、
減圧乾燥した。収量 8.9ｇ（試料No.ｓ−架橋HA−１） HAの繰り返し二糖1000個当りの架橋数 8.5 １％生理食塩水溶液における粘度（20℃，ずり
速度1.0sec^-1） 11000センチポアーズ非ニユートン指数 0.60 元素分析値
Ｃ：42.0％，Ｈ：4.87％，Ｎ：3.29％，Na：5.81
％ (2) ｓ−架橋HAのゲルクロマトグラフイー (1)で合成されたｓ−架橋HAと合成に使用した
HAについてガラスビーズCPG3000
（ELECTRONUCLEONIGS.INC.社）のカラム
（６×850mm）を用いて、ゲルクロマトグラフイー
を行なつた。展開溶媒は1.5M塩化ナトリウム水
溶液を水酸化ナトリウムでPH8.5に調整して使用
し、0.52mlずつ溶出画分に分け、カルバゾール−
硫酸法でウロン酸を定量した。結果を図１に示
す。図１において、〇印及び●印は、それぞれ、
ｓ−架橋HA及びHAの各フラクシヨンのカルバ
ゾール硫酸法における吸光度を表わし、Voはゲ
ル粒子外部容積を表わす。図１から、ｓ−架橋HAは、HAに比し、非常
に高分子になつていることがわかる。 (3) ｓ−架橋HAの非ニユートン指数 (1)で合成されたｓ−架橋HAと合成に使用した
HAとの１％生理食塩水溶液について回転粘度計
（(株)東京計器製Ｅ形粘度計）を用い、ずり速度を
変え、37℃で粘度を測定し、非ニユートン指数
（ｍ＝ａ／ｂ）を算出した。結果を図２に示す。図２において、〇印及び●印は、それぞれ、ｓ−架橋
HA及びHAの１％生理食塩水溶液の各ずり速度
における粘度を表わす。 (4) ｓ−架橋HAの曳糸性 (1)で合成されたｓ−架橋HAと合成に使用した
HAの曳糸性を、渡辺式曳糸性測定装置（池内
宏，日本整形外科学会雑雑誌，34，175（1960））
を模して作製した装置を用い測定した。結果を図
３に示す。図３においてて、〇印、△印、及び●
印は、それぞれ、ｓ−架橋HAの0.5％生理食塩水
溶液、同１％生理食塩水溶液及びHAの１％生理
食塩水溶液の各引き上げ速度における曳糸性を表
わす。図３から、ｓ−架橋HAは、高い曳糸性を有す
ることがわわかる。 (5) ｓ−架橋HAの鎮痛効果 (1)で合成されたｓ−架橋HAについて、次のよ
うにして、その鎮痛効果を検討した。ビーグル犬を雌雄の別なく用い、一方の後肢の
ヒザ関節に疼痛物質としてて、ブラジキニン又は
アセチルコリンのそれぞれ20μｇ又は２mgをｓ−
架橋HA2.5mg／0.5ml生理食塩水と同時に投与し、
投与側の後肢荷重の変動を経時的に測定した。ま
た、対照としててｓ−架橋HAの代りに(1)で原料
として用いたHAナトリウム塩５mg／0.5ml生理食
塩水を用いた。鎮痛効果は、正常時の500％荷重
回復時間をもつて比較した。結果を表２に示す。【表】表２から、ｓ−架橋HAは、HAナトリウム塩
と同様に優れた鎮痛効果を有することがわかる。調製例７ｓ−架橋HAの合成 HAカリウム塩（分子量1.7×10⁶）の１％水溶
液に、10N水酸化カリウム0.1mlとメタノール５
mlを加えた。撹拌下、エピブロムヒドリン17mgを
加えて、20℃で24時間反応後、反応液を酢酸でPH
6.5としてエタノール10mlを加えて白色沈殿を得
た。沈殿を取し、減圧乾燥した。収量 98mg HAの繰り返し二糖1000個当りの架橋数 7.5 １％生理食塩水溶液における粘度（20℃，ずり
速度1.0sec^-1） 34000センチポアーズ非ニユートン指数 0.65 元素分析値
Ｃ：41.98％，Ｈ：4.79％，Ｎ：3.30％，Ｋ：9.45
％調製例８架橋HAの架橋率分子量3.7×10⁵及び7.3×10⁵のHAナトリウム塩
100mgを、それぞれ、1N水酸化ナトリウム5.0ml
に溶かした溶液に、エタノール５mlとエピクロル
ヒドリン、それぞれ、25，50，100，200μとを
加え、40℃で２時間反応した。反応後は調製例６
(1)に準じて後処理を行なつた。また、分子量1.7×10⁶のHAナトリウム塩75mg
を1N水酸化ナトリウム7.5mlに溶かした溶液にエ
タノール7.5mlとエピクロルヒドリン40μ又は
80μとを加え、40℃で２時間反応した。更に、
上記反応と同時に同じ条件で［2^-14C］エピクロ
ルヒドリン（アマシヤム・ジヤパン社から入手）
を用いて反応を行ない、この標識化合物の放射活
性から架橋率を算出した。架橋率と粘度との関係
を表３に示す。表３から、ｓ−架橋HAにおいては、架橋率と
粘度とが比例関係にあることがわかる。【表】試験例１ｓ−架橋HAのヒアルロニダーゼ抵抗性分子量7.3×10⁵のHAナトリウムを出発原料と
して調製例６(1)に準じて次に示す３種のｓ−架橋
HAを合成した。 (A) HAの繰り返し二糖1000個当りの架橋数 13 １％生理食塩水溶液における粘度（20℃，ずり
速度1.0sec^-1） 45500センチポアーズ非ニユートン指数 0.77 (B) HAの繰り返し二糖1000個当りの架橋数 11.5 １％生理食塩水溶液における粘度（20℃，ずり
速度1.0sec^-1） 28000センチポアーズ非ニユートン指数 0.70 (C) HAの繰り返し二糖1000個当りの架橋数 7.5 １％生理食塩水溶液における粘度（20℃，ずり
速度1.0sec^-1） 8000センチポアーズ非ニユートン指数 0.61 これらの３種のｓ−架橋HA及び合成に使用し
たHAナトリウム塩を、それぞれ、0.1M酢酸溶液
（PH5.0）に１％の濃度に溶解し、測定（20℃，ず
り速度1.0sec^-1）したところ、次の通りであつ
た。ｓ−架橋HA(A) 45000センチポアーズｓ−架橋HA(B) 27000センチポアーズｓ−架橋HA(C) 8000センチポアーズ HAナトリウム塩 1500センチポアーズこれらの溶液に0.09重量％になるように牛睾丸
ヒアルロニダーゼを加え50℃で反応させ、15，
35，55，70分後に粘度を測定し、反応前の粘度に
対する割合を算出した。結果を図４に示す。図４におて、□印、△印、
〇印及び●印は、それぞれ、ｓ−架橋HA(A)，
(B)，(C)及びHAナトリウム塩の酢酸溶液の各反応
時間における反応前の粘度に対する割合を表わ
す。図４から、本発明に用いるｓ−架橋HAは、
HAに比し、ヒアルロニダーゼに対する抵抗性が
高く、その程度は、架橋度が高いほど顕著である
ことがわかる。試験例２腫瘍細胞の増殖能に及ぼす影響 FM3A／ｐ−15A細胞１×10⁴個／mlを含む細
胞浮遊液（イーグルMEM培地に仔牛血清10％含
む）1.5mlと各種HA溶液0.15mlを含む培地を混合
し、組織培養用シヤーレ（テルモ社製ペトレイ
12F）で５％CO₂−95％air、37℃の条件で培養し
た。培養開後、３日目及び５日目の細胞数を測定
した。実験は、１群４シヤーレとして、対照群に
は、生理食塩水を培地に添加したものを用いた。結果を表４に示す。【表】表４から、HAは細胞の増殖に対して何ら影響
を及ぼさないことわかる。試験例３腫瘍細胞の接着能に及ぼす影響 100mmフアルコン社培養皿（100mm Falcon
tissue culture dish）で培養したFM3A／ｐ−
15A細胞をダルベツコ・リン酸緩衝食塩液
（Dulbecco Phosphate Buffered Saline；Ca，
Mg−free）（以下「PBS（−）」という）で洗浄
し、ハンクス緩衝液（Hanks Balanced Salt
Solution；Ca，Mg−free）にトリプシン0.1％及
びエチレンジアミン四酢酸0.04％を溶解した溶液
（以下「TE」という）で37℃において５分処理し
た。同量の培養液［イーグルMEM培地
（Eagle′s Minimum Essential Medium）に10％
になるように牛胎児血清を加えた溶液］を加え、
1200rpmで５分遠心し、同培養液で５×10⁵個細
胞／mlに調整した（Ａ処理細胞）。一方、100mmフアルコン社ペトリ皿（100mm
Petri dish）で培養したFM3A／ｐ−15A細胞を
12000rpmで５分遠心し、前記培養液で５×10⁵個
細胞／mlに調整した（Ｂ処理細胞）。Ａ処理細胞とＢ処理細胞を１mlずつタイプＩの
コラーゲン（以下「CoI」という）、フイブロネ
クチン（以下「FN」という）又はラミニン（以
下「LN」という）で被覆した。５mmの培養皿に
入れ、１×10⁶細胞／培養皿に調整した。各種
HAを１mg／mlになるように加え、37℃で20時間
培養後、PBS（−）で洗浄し、TEで37℃におい
て15分処理して細胞数を測定した。結果を表５に
示す。【表】表中の分子量は、いずれも極限粘度から算出し
た。表５から、本発明の癌転移抑制剤は、特にLN
に対する腫瘍細胞の接着能を著しく低下させ、そ
の効果は、極限粘度0.075（分子量150）のHA−７
に比し、極限粘度15.0（分子量84万）のHA−２及
び極限粘度0.4（分子量8000）のHA−６の方が顕
著であることがわかる。試験例４急性毒性試験 (1) マウスにおけるHA−２投与後の経時的死亡
数とLD₅₀値を表６に示す。【表】 (2) ラツトにおけるHA−２投与後の経時的死亡
数とLD₅₀値を表７に示す。【表】 (3) ウサギにおけるHA−２の経時的死亡数と
LD₅₀値を表８に示す。【表】 (4) マウスにおけるHA−６投与後の経時的死亡
数とLD₅₀値を表９に示す。【表】実施例 HA及びｓ−架橋HAの癌転移抑制効果各種極限粘度の異なるHA又はｓ−架橋HAの
生理食塩水溶液をマウスC3H／Heに腹腔内投与
し、30分後マウス乳癌由来の高転移能癌細胞
FM3A／ｐ−15A7.5×10⁵個をマウス尾静脈より
注入した。注入３時間後に１回目のHA又はｓ−架橋HA
生理食塩水溶液の腹腔内投与を行ない、それを含
め１日２回計４日間HA又はｓ−架橋HA生理食
塩水溶液を腹腔内投与した。癌細胞投与21日後にマウスを殺し、肺を摘出し
て癌の転移巣を計数した。なお、対照群には、HA又はｓ−架橋HAの代
りに生理食塩水のみを投与した。結果を表10に示
す。【表】表10から、本発明の癌転移抑制剤は優れた癌転
移抑制効果を有することがわかる。

【図面の簡単な説明】

図１は、ｓ−架橋HAとHAとのゲルクロマト
グラムを示す図である。図２は、ｓ−架橋HA及
びHAの粘度測定結果を示す図である。図３は、
ｓ−架橋HA及びHAの曳糸性測定結果を示す図
である。図４は、各種ｓ−架橋HA及びHAをヒ
アルロニダーゼ処理したときの粘度低下と時間と
の関係を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

１ヒアルロン酸若しくは架橋ヒアルロン酸又は
その塩を有効成分とすることを特徴とするムコ多
糖系癌転移抑制剤。