JPH0455609B2

JPH0455609B2 -

Info

Publication number: JPH0455609B2
Application number: JP24254586A
Authority: JP
Inventors: Yoshio Ito; Mitsunori Itoyama; Hiroaki Yabe
Original assignee: Fuji Spinning Co Ltd
Current assignee: Fuji Spinning Co Ltd
Priority date: 1986-10-13
Filing date: 1986-10-13
Publication date: 1992-09-03
Also published as: JPS6397633A

Description

【発明の詳細な説明】

〓産業上の利用分野〓本発明は安全性，生体適合性，膨潤性に優れた
新規なキトサン粒状物に関するもので、本発明に
よるキトサン粒状体は、生理活性物質の分離，精
製及び固定化，細胞培養用等に利用出来る。〓従来の技術〓従来、キトサン成形物の細胞培養用基質への利
用はなされたことがなかつた。本発明者等は、先
に特願昭60−191624号としてキトサンを酸性水溶
液に溶解し、これを塩基性溶液で成形させたキト
サン粒状物である細胞培養用基質或いはそれに架
橋処理をした細胞培養用基質を発明し、出願し
た。この発明によつて得られたキトサン粒状体
は、形状，安全性，生体適合性，機械的強度に関
して全く問題はなかつた。しかしながらこのよう
にして得られたキトサン粒状体は膨潤性が乏しい
ために液体中での懸濁性に問題があり均一な懸濁
状態が得られなかつた。〓発明が解決しようとする問題点〓本発明は、上述したキトサン粒状物の膨潤性を
向上させ均一な懸濁液を得るための懸濁性を解決
するものである。即ち、本発明は従来のキトサン粒状物の有する
安全性，生体適合性を損うことなく膨潤性を附与
させた粒径0.10〜0.35mm，見掛密度0.015〜0.030
ｇ／mlである新規なキトサン粒状物を得ることを
目的とする。〓問題点を解決するための手段〓本発明の新規なキトサン粒状物は、キトサンを
原料として、これを酸性水溶液中に溶解し、これ
を塩基性溶液中で粒状体に成形し、該成形物を芳
香族化合物で反応させ更に有機ジイソシアネート
化合物で架橋する製造方法により得られる。使用するキトサンは特に限定はされないが、平
均分子量が10000〜230000の低分子量キトサンを
用いることが好ましい。キトサンは、酢酸，ジク
ロル酢酸，蟻酸等の単独、若しくは混合物の水溶
液に溶解する。キトサン酸性水溶液の濃度は３〜
６％が好ましく、該キトサン酸性水溶液は水酸化
ナトリウム，水酸化カリウム，炭酸ナトリウム，
炭酸カリウム，アンモニア，エチレンジアミン等
のアルカリ性物質を含む塩基性溶液中で凝固せし
める。塩基性溶液にはメタノール，エタノール等
の極性を有するアルコール類を加えて使用するこ
とも出来る。キトサン酸性水溶液を吐出口より圧力下に塩基
性溶液よりなる凝固浴中に連続的又は一定量ずつ
供給，凝固させ粒状物を得、これを中性になるま
で充分に水洗を行う。上記のようにして得られたキトサン粒状物は、
塩化シアヌル，無水フタル酸，無水安息香酸，サ
リチル酸，ベンジルクロライド，ベンズアルデヒ
ド等の芳香族化合物のキトサンのグルコサミン残
基１モルに対し0.1〜0.5モルの割合で溶解した極
性溶媒中で反処処理を行い、更に有機ジイソシア
ネート化合物を５〜10％含む極性溶媒中で架橋反
応を行う。これを更に極性溶媒で洗浄後、充分に
水洗して新規な膨潤性に優れたキトサン粒状物が
得られる。上記のようにして得られたキトサン粒状物は、
芳香族置換基を有する架橋キトサンよりなるが、
使用する芳香族化合物がキトサンのグルコサミン
残基１モルに対し、0.1モル以下の場合には有機
ジイソシアネート化合物による架橋が強固なもの
となり膨潤性が低下して好ましくなく、又、0.5
モル以上の芳香族化合物を使用すると、得られる
キトサン粒状物の見掛密度が0.08ｇ／ml以上とな
つて堅い粒状物となり、懸濁性が阻害されるので
好ましくない。上記反応に使用する極性溶媒としては、メタノ
ール，エタノール，イソプロピルアルコール等の
アルコール類、アセトン，メチルエチルケトン等
のケトン類，ジメチルホルムアミド，ジメチルア
セトアミド等のアミド類が使用出来る。又、架橋
反応に使用する有機ジイソシアネート化合物とし
ては、４，4′−ジフエニルメタンジイソシアネー
ト，１，４−フエニレンジイソシアネート、２，
４−トリレンジイソシアネート，ナフタレンジイ
ソシアネー，１，４−シクロヘキサンジイソシア
ネート，４，４−ジシクロヘキシルジイソシアネ
ート，キシリレンジイソシアネート，イソフオロ
ジイソシアネート，ヘキサメチレンジイソシアネ
ート等が使用出来る。本発明によつて得られる新規なキトサン粒状物
は、粒径0.10〜0.35mm，見掛密度0.015〜0.030
ｇ／mlであることが望ましい。見掛密度は上記の
ように反応させる芳香族化合物及び有機ジイソシ
アネート化合物の量を適宜選定することによつて
調節することができる。粒径についてはキトサン
成形時に用いるキトサン酸性水溶液の濃度，キト
サン酸性水溶液の吐出液量，ノイズ孔径等によつ
て調節可能である。本発明のキトサン粒状物を細
胞培養用基質等生理活性物質用担体として使用す
るためには、キトサン粒状体の表面積を大きくす
ること及び懸濁液として用いる場合の撹拌抵抗を
小さくする等の理由から0.10〜0.35mmであること
が望ましく、また、見掛密度については、次のよ
うな理由から上記範囲が定められる。先に、本発明者等が特願昭60−191624号で出願
した細胞培養用のキトサン粒状物は、粒径の調節
は可能であるが見掛密度が0.08〜0.10ｇ／mlであ
り、これを使用して液体中で均一な懸濁液を得る
ことは、かなり困難であり、例えば細胞培養用の
撹拌機（バイオフアーメンターBF−R403A，シ
バタハリオ製）では90rpm以上の回転力が必要と
なり、実用に供するのに問題がある。通常のマイ
クロキヤリヤー培養の場合には50〜60rpm、改良
タイプの撹拌機では20〜40rpmの撹拌速度である
ことが好ましく、本発明によりキトサン粒状物に
膨潤性をもたせ、上記の見掛密度とすれば通常の
撹拌において充分な懸濁液が得られる。〓実施例〓次に実施例を挙げて本発明を説明する。尚、本
発明において粒径の測定は、マイクロメーターを
挿入した双眼実体顕微鏡で測定し、見掛密度は
100mlの試料の絶乾重量（ｇ）より求めた。実施例１平均分子量48000で脱アセチル化度82％のキト
サン10ｇを酢酸５ｇを含む酸性水溶液200mlに溶
解し、0.15mmφのノズルからN₂圧，2.0Kg／cm²で
10％NaOH，30％CH₃OHと水からなる塩基性溶
液中に落下させて凝固成形した。これを中性にな
る迄充分水洗し粒径0.074〜0.105mm（湿潤状態）
のキトサン粒状物100mlを得た。これを100mlのジ
メチルホルムアミドで３回置換後、塩化シアヌル
４ｇを含むジメチルホルムアミド100mlを加えて
室温で１時間反応させた。更にジメチルホルムア
ミドで洗浄した後、ヘキサメチレンジイソシアネ
ート５ｇを含むジメチルホルムアミド100mlを加
え、室温で１時間反応架橋させた。これをジメチ
ルホルムアミドで洗浄した後充分に水洗してキト
サン粒状物を得た。このキトサン粒状物の粒径は0.21〜0.29mm（湿
潤状態）で、見掛密度は0.025〜0.030ｇ／mlであ
り、撹拌装置（バイスフアーメンターBF−
R403A，シバタハリオ製）を用い30〜50rpmで撹
拌したところ充分均一な懸濁状態が得られた。上記のようにして得られたキトサン粒状物〔試
料〕と、比較のために上記のキトサン酸性水溶
液から凝固再生したキトサン粒状物を塩化シアヌ
ルで処理することなく、ヘキサメチレンジイソシ
アネート10ｇを含むジメチルホルムアミド100ml
を加え、室温で１時間の架橋処理をして得た粒径
0.1〜0.2mm，見掛密度0.08〜0.09ｇ／mlのキトサ
ン粒状体〔試料〕についてそれぞれ細胞培養に
おける効果を調べた。即ち、試料及びの夫々0.1mlに対してマウ
ス結合組織由来の線維芽細胞Ｌ−929を10％の血
清を含むイーグルの最少必須培地に5.0×
10⁴cells／mlになるように調整した細胞懸濁液５
mlを加え、37℃，CO₂5％雰囲気下で１，２，４
日間培養し、浮遊細胞と培養液を燐酸緩衝液で除
去し、生着細胞をトリプシン−EDTA溶液処理
で剥離し、しかる後溶液を700rpm，６分間遠心
分離し、トリプシン−EDTA溶液等を除去後、
沈澱した細胞を燐酸緩衝液２ml中に懸濁し、血球
計算盤により計測し細胞数について第１表の如き
結果を得た。この結果から本発明の製造方法で得たキトサン
粒状物は細胞培養用に供するに充分なる効果のあ
ることが判る。

【表】実施例２平均分子量60000で脱アセチル化度80％のキト
サン６ｇを酢酸５ｇを含む酸性水溶液200mlに溶
解し、0.15mmφのノズルからN₂圧2.0Kg／cm²で、
10％NaOH，30％CH₃OHと水からなる塩基性溶
液中に落下させて凝固成形した。これを中性にな
る迄十分水洗し粒径0.074〜0.105mm（湿潤状態）
のキトサン粒状物100mlを得た。これを100mlのジ
メチルホルムアミドで３回置換後、無水安息香酸
１ｇを含むジメチルホルムアミド100mlを加えて
室温で１時間反応させた。更にジメチルホルムア
ミドで洗浄した後、４，4′−ジフエニルメタンジ
イソシアネート５ｇを含むジメチルホルムアミド
100mlを加え室温で１時間反応架橋させた。これ
をジメチルホルムアミドで洗浄した後充分に水洗
してキトサン粒状物を得た。このキトサン粒状物の粒径は0.31〜0.35mm（湿
潤状態）で見掛密度は0.015〜0.022ｇ／mlで、撹
拌装置（バイオフアーメンターBF−R403A，シ
バタハリオ製）を用い20〜30rpmで撹拌したとこ
ろ充分均一な懸濁状態が得られた。実施例３平均分子量38000で脱アセチル化度78％のキト
サン12ｇを酢酸５ｇを含む酸性水溶液200mlに溶
解し、0.15mmφのノズルからN₂圧2.0Kg／cm²で10
％NaOH，30％CH₃OHと水からなる塩基性溶液
中に落下させて凝固成形した。これを中和になる
迄充分水洗し粒径0.074〜0.105mm（湿潤状態）の
キトサン粒状物100mlを得た。これを100mlのジメ
チルホルムアミドで３回置換後、無水フタル酸
1.2ｇを含むジメチルホルムアミド100mlを加えて
室温で１時間反応させた。更にジメチルホルムア
ミドで洗浄した後、ヘキサメチレンジイソシアネ
ート10ｇを含むジメチルホルムアミド100mlを加
え室温で１時間反応架橋させた。これをジメチル
ホルムアミドで洗浄した後、充分に水洗してキト
サン粒状物を得た。このキトサン粒状物の粒径は0.27〜0.31mm（湿
潤状態）で、見掛密度は0.023〜0.029ｇ／mlで、
撹拌装置（バイオフアーメンターBF−R403A，
シバタハリオ製）を用い20〜40rpmで撹拌したと
この充分均一な懸濁状態が得られた。〓発明の効果〓本発明の製造方法によつて得られたキトサン粒
状物は、上記実施例の記載から明らかなように膨
潤性が高いので、液体中でも温和な撹拌条件で均
一な懸濁状態を得ることが出来、取扱いが更に便
利なものにすることが出来る。更にキトサン本来
の具備している安全性，生体適合性を損うことが
ないので極めて有用なキトサン粒状体が提供され
るものである。

Claims

【特許請求の範囲】１キトサン酸性水溶液を塩基性溶液中で成形し
て得られたキトサン粒状体を、芳香族化合物と反
応せしめた後、有機ジイソシアネート化合物で架
橋させてなる新規なキトサン粒状物。２見掛密度が0.015〜0.030ｇ／mlである特許請
求の範囲第１項に記載の新規なキトサン粒状物。３粒径が0.10〜0.35mmである特許請求の範囲第
１項又は第２項に記載の新規なキトサン粒状物。４キトサン酸性水溶液を塩基性溶液中で成形し
て得られたキトサン粒状体を、芳香族化合物と反
応せしめた後、有機ジイソシアネート化合物で架
橋させてなる、見掛密度が0.015〜0.30ｇ／ml，
粒径が0.10〜0.35mmであるキトサン粒状物よりな
る生理活性物質用担体。