JPH04506005A

JPH04506005A - 破傷風トキシンフラグメントｃの発現

Info

Publication number: JPH04506005A
Application number: JP2508664A
Authority: JP
Inventors: フェアーウェザー，ネイル　フレイザー; マコフ，アンドリュー　ジョセフ
Original assignee: ザ　ウエルカム　ファウンデーション　リミテッド
Priority date: 1989-06-20
Filing date: 1990-06-20
Publication date: 1992-10-22
Anticipated expiration: 2014-11-22
Also published as: US5443966A; ES2084030T3; DK0478602T3; GB8914122D0; EP0478602A1; JP2981286B2; EP0478602B1; ATE132532T1; DE69024652T2; DE69024652D1; WO1990015871A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】破傷風トキシンフラグメントＣの発現本発明は、破傷風トキシンＣフラグメントの製造に関する。

大腸菌は、これまで多くの異種蛋白質を大量に製造する宿主として、存効に使用されてきた。しかしながら、異種蛋白質は、その本来の環境内では可溶性であるにもかかわらず、一般には不溶性の型に産生されることか明らかにされている（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９　ｇ　６．　２４０．　１−１２）。位相差条件下に顕微鏡で観察すると、蛋白質集合体か細菌細胞内に認められ、これは通常、封入体または屈折体と呼ばれている。

大部分を占める大腸菌蛋白質から封入体を分離することは、実験室規模では比較的容易である。これは、たとえば遠心分離で達成され、わずか一工程て著明な精製か可能である。しかしながら、封入体の精製を工業的規模で実行することは難しい。とにか（、その蛋白質を活性型で得るには、封入体を可溶化せねばならず、強力な変性剤たとえば尿素や塩化グアニジウムの使用が必要になる。ついて、蛋白質が再びその自然のコンホメーションにホールディングされるような条件下に、変性剤を除去する。これらの条件は各蛋白質について経験的に確立されるか、多くの場合きわめて薄い溶液の使用を包含する。

このためスケールアップすると、容量が巨大となり、その結果、工程操作上の問題が生じる。これらの困難性は大腸菌の高い生産力によっである程度相殺されるが、この利点を可溶性の蛋白質の製造において享受できることが望ましいことはもちろんである。

大部分の西洋諸国では一般的に、予防接種か破傷風の予防に効果を上げているが、一部の第三世界の国では不完全な予防接種か毎年百方にも及ぶ破傷風患者の原因になっている。現在の破傷風ワクチンは、病原菌である破傷風菌（Ｃ，ｔｅｔａｎｉ　）の培養によって得られる破傷風トキシンのホルムアルデヒド処理により製造されている。

ホルムアルデヒド処理時に生じる不純物が破傷風トキソイドにみられることのある存置作用の一部の原因であることが示唆されている。いずれにしても、このトキソイドの製造は、破傷風トキシンの、たとえばアフィニティーｍ製サイクルの反復による完全な分離を必要とすることから、技術的に難しい。

破傷風トキシンの構造遺伝子は、クローン化されて、その配列か決定されている（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６５．　１９８６．　２１−２７；Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ　＆　Ｌｙｎｅｓｓ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１４．　１９８６．７８０９−７８１２）。これらの研究により、破傷風トキシンの構造は、１３１５アミノ酸からなる１５０ｋＤａＷ白質であることが確認された。フラグメントＣは、このトキシンのパパイン切断によって生成する５０ｋＤ番のポリペプチドであり、Ｃ末端における４５１アミノ酸からなり、またそれに実質的に相当する。フラグメントＣはまた、大腸菌内で（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　１９８６　；　Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　［ｍｍｕｎ、、　５５　、　１９８７．２５４１−２５４５．ＥＰ−Ａ− ０２０９２８１）、大腸菌ｔｒｐＥ蛋白質の部分または破傷風トキシンのフラグメントＢに融合して、発現されている。これに関連して、ｔｒｐＥの一部とフラグメントＢに融合したフラグメントＣをコードするｐＴｅ　ｔ　１２を含む大腸菌株Ｄ８１か、１９８５年６月２８日、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　ＵＫに受付番号第１１９１８号として寄託された。これらの融合体はすべて大腸菌細胞の細胞質に不溶性である。

フラグメントＣは非毒性で、マウスおよびモルモットを免疫できることが明らかにされている（Ｈｅｌｔｉｎｇ　＆Ｚｗｉｓｌｅｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５２．　１９７７、　１８７−１９３　；　Ｈｅｌｔｉｎｇ　＆　Ｎａｕ、　Ａｃｔ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

５ｃａｎ、　５ｅｃｔ、　Ｃ，９２，１９８４，５９−６３）。

今回、破傷風トキシンのフラグメントＣは、大腸菌内において、成熟型すなわち異種または自生のポリペプチドと結合していない型で発現させると、得られた生成物は実質的に可溶性で、封入体としては産生されないことが見出された。しかも、成熟蛋白質の高い発現レベルを達成することか可能で、生化学的および免疫学的基準によって判定して、生成物は実質的に活性型として得られる。

したがって、本発明は、フラグメントＣの成熟型をコードする発現ベクターで形質転換された大腸菌を培養し、その蛋白質を回収することからなる、破傷風トキシンのフラグメントＣの製造方法を提供する。

成熟フラグメントＣをコードするＤＮＡを、適当な転写および翻訳制御要素の制御下に、正しい読取り枠でベクター内に導入する。このような要素の例には、プロモーター、転写停止暗号部位、およびもちろんＭｅｔ開始コドンか包含される。オペレーターおよび／またはアテニュエーター配列をコード配列の上流に配置してもよい。

通常、発現ベクターはプラスミドである。プロモーターは、ｌａｃ、ｔｒｐ、λ ＰＬ、λＰＲ，ｌｐｐ、Ｔ７φまたはｔａｃプロモーターとすることができる。

誘導プロモーター、たとえばｔａｃプロモーターの使用は、発現のより容易な制御を可能にするので好ましい。ｔａｃプロモーターの発現はイソプロピル−β− Ｄ−チオガラクトシド（Ｉ　ＰＴＧ）によって誘導される。

本発明に使用できる大腸菌株の例には、ＨＢＩＯＩ。

ＤＨＩまたはＭＮ２９４が包含される。大腸菌株を、成熟フラグメントＣをコードする発現ベクターで形質転換し、形質転換株を本技術分野で知られている操作を用いて培養する。

成熟フラグメントＣは、大腸菌細胞の細胞質（この細胞質に成熟フラグメントＣは可溶性である）から、細胞の溶解、ついで遠心分離、沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーによって回収できる。通常、たとえば２゜５１の培養液の増殖培養からの細胞を遠心分離で収穫し、適当な緩衝液〔たとえば、２５ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ／ＨＣ１ｐＨ８，０、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）含有１５０ｍＭ　ＮａＣＡ’）中に再懸濁する。細胞を、超音波処理、フレンチプレスセルへの通過、または非イオン界面活性剤（たとえばＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｎ　Ｐ　４０　）およびリゾチーム処理により溶解する。溶解質を遠心分離し、得られた上澄液を単離する。ついで、フラグメントＣを含む上澄液は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製できる。フラグメントＣを含む分画を集め、所望の純度に達するまでさらに精製する。さらに精製する場合には、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いるアフィニティー精製が利用できる。純度は、一般に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％である。

前述のように、フラグメントＣは破傷風トキシンのＣ末端に由来する５０ｋＤｇのポリペプチドである。大腸菌内での産生は、もちろん、そのポリペプチドのｍｅｔ−型の産生をもたらすことになる。その他の点では、アミノ酸配列はフラグメントＣの既知の配列であるか、または実質的に同じ生物学的および免疫学的性質をもつ実質的に類似の配列である。とくに、そのアミノ酸配列は、図４に示した配列であるか、または図４に示した配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％のホモロジーを有する。すなわち、この制限内で、配列には、得られたポリペプチドがフラグメントＣと同じ生物学的および免疫学的性質を実質的に保持している限り、１個もしくは２個以上のアミノ酸置換、延長、挿入および／または欠失による変動か可能である。アミノ酸置換の場合には、フラグメントＣの１個もしくは２個以上のアミノ酸残基が１個もしくは２個以上の他のアミノ酸残基で置換される。置換の候補としては、スレオニンに対してセリンおよびその逆、アスパラギン酸に対してグルタミン酸およびその逆、アスパラギンに対してグルタミンおよびその逆、イソロイシンに対してロイシンおよびその逆、バリンに対してアラニンおよびその逆、リジンに対してアルギニンおよびその逆を挙げることがてきる。

フラグメントＣのアミノ酸配列内の変化は、もちろん、フラグメントＣをコードするＤＮＡ配列を変えることによって行うことかできる。これはたとえば、制限エンドヌクレアーゼの使用、オリゴヌクレオチドリンカーの挿入、エキソヌクレアーゼおよび／またはポリメラーゼ、ならびに特定部位の突然変異誘発によって達成される。

破傷風に対する免疫を付与するワクチンは、本発明によって製造されたフラグメントＣおよび医薬的に許容される担体または希釈剤からなる。ワクチンには、他の抗原を加えて多価ワクチンとしてもよい。担体および希釈剤は通常、患者にポリペプチドを投与するビヒクルとして適当な、滅菌され、パイロジエンを含まないメジウムである。等張性食塩溶液を使用できる。

ワクチンには、免疫応答を刺激するためのアジュバントを加えて、ワクチンの効果を増強させることもできる。

有利なアジュバントは水酸化アルミニウムである。ワクチンは、フラグメントＣまたはその誘導体の最終濃度か、０、　２〜２００　ｕ　ｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０　ｕ　ｇ／ｍｌ、とくに好ましくは約３０μｇ／ｍｌになるように調製するのか便利である。調製後、ワクチンは、滅菌容器に入れついで密封して低温たとえば４°Ｃに保存してもよく、また凍結乾燥してもよい。

ワクチンは、経口および非経口（例えば皮下または筋肉内）注射を含むワクチン投与の任意の慣用方法で投与することができる。処置は、ワクチンの単回投与、またはある期間の多回投与とすることができる。１回用量は、０．１〜２ｍｌ、好ましくは０．２〜１ｍｌ、とくに好ましくは約０．５ｍｌとすることが推奨される。

以下の実施例は、本発明を例示するものである。比較例も示す。プラスミドｐＴＥＴｔａｃｌを撃留する大腸菌ＭＭ２９４はＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅ１ｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ、　Ａｂｅｒｄｅｅｎ、　ＧＢに１９８９年６月１３日、受付番号ＭＣＩＭＢ４０１５４号として寄託された。

図１は、発現プラスミドｐＴＥＴ　ｔ　ａ　ｃ’Ｈａ）およびｐＴＥＴ　ｔ　ａ　ｃ　２（ｂｌならびに使用されたオリゴヌクレオ（）；γ−ＩＦのコード配列の最初の３つのコドン（）；フラグメントＢ（）およびＣ（）のコード領域；ならびにｔｒｐａターミネータ−（）からなるプラスミドとして示されている。

図２は、ｐＴＥＴｔａｃｌおよびｐＴＥＴｔａｃ２を含有する大腸菌抽出液の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析を示す。レーン１〜５およびレーン１２〜１５はクーマシーブルー染色、レーン６〜１１はウェスタンプロットである。ｐＴＥＴｔａｃｌ非誘導（レーンｌ。

７）および誘導（レーン２．８）、ｐＴＥＴｔａｃ２非誘導（レーン３，９）および誘導（レーン４．１０）菌からの総細胞抽出液。対照抽出液（レーン６）。

破傷風菌からのフラグメントＣ（レーン５．１１）。ｐＴＥＴｔａＣ１誘導上澄液（レーン１２）、およびベレット（レーン１３）、ｐＴＥＴｔａｃ２誘導上澄液（レーン１４）、およびペレット（レーン１５）。

図３は、組換えおよび破傷風菌由来フラグメントＣの５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（図３Ａ）および非変性ＰＡＧＥ　（図３Ｂ）による分析である。５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動のサンプルは、等容量の２×サンプル緩衝液（１４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％２−メルカプトエタノールおよび０．１２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ６，８）に添加することによって調製した。非還元サンプルについてはメルカプトエタノールを省いた。サンプルは、負荷前、１００℃に５分間加熱した。図３Ａ：レーン１、蛋白質サイズマーカー（ｋＤａ　）　、レーン２゜３還元サンプル：レーン４，５；破傷風菌由来フラグメントＣ０各レーンは、５μｇのフラグメントＣを含有する。ゲルは、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。非変性ＰＡＧＥのサンプルは、５０ｍＭＮａＣＡ１０％グリセロール、５ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ／Ｈ（、ｊ！　ｐＨ７，５の最終濃度に希釈した。ゲルは、Ｂａ１ｌａｎｔｉｎｅ　＆Ｂｏｘｅｒ　（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６３．　４５４−４５９．　１９８５）の記載に従って追跡した。図３Ｂ：レーンｌ、組換えフラグメントＣ；レーン２、破傷風菌由来フラグ図４は、破傷風トキシンのフラグメントＣのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。

例発現プラスミドｐＴＥＴｔａｃｌはｐＩＦＧｔａｃ１２４Ａの誘導体であるプラスミドｐＰＦｔａｃｌ（Ｍａｋｏｆｆ　＆　Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｔｒｎａｓ、、　１　６゜１９８８．４８−４９）から構築した。

ｐＰＦｔａｃｌのＮｄｅＩ−ＮｈｅＩコード領域を破傷風トキシンのコード配列で置換した。このコード配列の大部分は２個の制限フラグメント：　ｐＴｅ　ｔ　１からのＮｄ　ｅ　ｌ−Ａｃ　ｃ１１８５８ｂｐフラグメント、およびｐＴｅ　ｔ　８からのＡｃｃ　Ｉ−ＦｏｋＴ４４２ｂｐフラグメント（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｉ　９８６　）によって与えられた。

配列の残部は、大腸菌ての発現に至適化したいずれも４２塩基長の１対の合成オリゴヌクレオチドによってプログラムした。これらのオリゴヌクレオチドは図ＩＣに示したオリゴ１および２である。

プラスミドｐＴＥＴｔａｃ２は、ｐＴＥＴｔａｃｌのＢｇｌＩ［−３ｆａＮＩ領域を、それぞれ１６１ヌクレオチド長の１対の合成オリゴヌクレオチド（図１ｂ）によって置換して構築した。これらのオリゴヌクレオチドは開始コドンの上流配列を再生し、Ｃフラグメント領域の最初のコード配列を大腸菌での発現に至適化した（図１Ｃ）。これらのオリゴヌクレオチドは、ｐＴＥＴ　ｔ　ａ　ｃｌの３０２ｂｐ　Ｓｆａ　Ｎ１−３ａｃＩ［および４４９０ｂｐＳａｃＩＩ−Ｂｇｌｌ［フラグメントにリゲートした。

いずれの構築体についてのオリゴヌクレオチドもＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ中で合成し、変性ポリアクリルアミドゲル上電気泳動によって精製した。それらの５′末端は、リゲーション前にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。リゲートした生成物を大腸菌ＭＭ２９４株にトランスホームした（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ　＆　Ｙｕａｎ。

リボヌクレオチドによって特定された配列は、オリゴヌクレオチドと同様にして合成し、精製したプライマーを用い、連鎖伸長停止法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７４．　１９７７、　５４６３−５４６７）による、両プラスミド、ｐＴＥＴｔａｃｌおよびｐＴＥＴｔａｃ２の直接配列決定で確認した。

誘導と発現蛋白質の分析上記プラスミドを含有する大腸菌ＭＭ２９４の培養は、既に報告されている方法（Ｍａｋｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３５．　１９８９．　１１−２４）をわずかに改変して誘導した。培養体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むし培地中で一夜増殖させ、同じ＜１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む新鮮なし培地に１＝５に希釈した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを６０μｇ／ｍｌになるように加えてフラグメントＣの発現を誘導した。′培養体を４時間後に収穫し、総細胞抽出物の既報のように（Ｍａｋｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、ｌ　９８９）　、７．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル上で分析した。ウェスタンプロットは、破傷風菌から単離されたフラグメントＣに対するウサギ抗血清およびウマ西洋ワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗うさぎＩｇＧ、ついてＣｏ１ｏｕｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏｒａｄ）および過酸化水素を用いて検出した。

発現した蛋白質か水溶性であったかどうかを決定するために、１．０の０Ｄ６５０で１ｍＭの細胞に相当する量を、１００μｌの５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ７　ｐＨ８，０，５０ｍＭ　ＮａＣ！！、５％グリセロール、４００μｇのりゾチームを含む１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）中、０ °Ｃで２０分間インキュベートし、ついで４回、連続的凍結−解凍サイクルを反復した。内径ｏ、ｓｍｍの針を付した１ｍｌシリンジを急速に通過させてＤＮＡを剪断し、粘度を低下させた。抽出液を４℃、１２ｋｘｇて１０分間遠心分離し、ペレットを同容量の上記緩衝液に再懸濁した。ペレットおよび上澄液の両分面を再び遠心分離し、再懸濁を反復した。サンプルを２ＸＬａｅｍｍｌ　ｉ負荷緩衝液に希釈し、各分画２０μｌを上述のように５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析した。

マウスの免疫処置大腸菌または破傷風菌からのフラグメントＣを含有するワクチンを１５ｗ／ｗ％Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ　（商標）を用いて調製した。表１に示すように希釈し、その０．５ｍＭをＮＩＨマウスに注射した。４週後、マウスに約１００Ｌ　Ｄ　ｓ。の破傷風トキシンをチャレンジし、４日後に生存したマウスは保護されたものとした。

組換えフラグメントＣの精製２．５１！の培養液からの細胞ペレット（９，６ｇ湿重量）を約３５ｍ１の２５ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ／ＨＣｊ’　ｐＨ８，１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＦＭＳＦ）含有］、５０ｍＭ　ＮａＣ１に再懸濁した。細胞の破壊は、予め冷却したフレンチプレスセル（１１，３６ｘ１０４ｋｇ（３０，０００１ｂ）　［０−”）に２回通過させることによって行った。ＥＤＴＡを最終濃度が５ｄになるように破壊細胞に加えた。破壊細胞を１７．０００ｘｇで１５分間遠心分離して除去した。抽出液は室温でｐＨ５，０の酸性にしてさらに清澄化した。

蛋白質濃度を最初１０ｍｇ／ｍｌに調整し、ついで抽出液を２Ｍ酢酸の滴下によりｐｆ（５，０とした。サンプルを１５分間攪拌し、ついで１７．０００ｘｇで１５分間遠心分離して沈殿を除いた。上澄液にＩＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｊ７ｐＨ８，０を加えて中和し、２５ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ／ＨＣｌｐＨ８，０，ｌ　ＯｍＭ　ＮａＣ１に対して透析し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　（商標）カラム（２、６Ｘ　８　ｃｍ）に適用した。カラムを、２５ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ／ＨＣＩ　ｐｉ（８，０中、１０ｍＭ　〜４００ｍＭ　ＮａＣ１の直線勾配て溶出した。

フラグメントＣを含有する分画を集め、２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣ１，１０ｍＭ　ＮａＣ１に対して透析した。透析サンプルに２Ｍ酢酸を滴下してｐＨ５，２とし、直ちに、２５ｍＭ酢酸塩ｐＨ５，２で平衡化したＳ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１，６ｘ７ｃｍ）に適用した。微細な沈殿が生成したが、これは遠心分離で分離されて、フラグメントＣの損失はほとんどなかった。

サンプルを適用したのち、カラムをｌ０ｍＭ〜４００＋ｎＭＮａＣ１の直線勾配て溶出した。フラグメントＣを含有する分画を集め、２５ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ／ＨＣ１ｐＨ８，０゜１０ｍＭＮａｃｊ７に対して透析した。最後のクロマトグラフィーはＱ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１，６ｘ７ｃｍ）で行い、溶出は再び、２５ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ／ＨＣＩＩ　ｐＨ８，０中、ｌ　Ｏｍｍｌ００ｍＭ　ＮａＣＡ’の直線勾配によって行った。ピークの分画を集め、濃縮し、５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＩ　ｐＨ７，６，０，２ｍＭ　ＮａＣ１，０，１ｍＭＥＤＴＡに対して透析した。最終蛋白質濃度２−３　ｍｇ／　ｍｌのサンプルは、４℃または一７０℃で保存した。

蛋白質アッセイフラグメントＣの、二抗体サンドイッチ酵素連結イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発した。破傷風トキソイドで過免疫したウマから調製した精製ペプシン処理抗体（Ｈｕｇｈｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂａｃｔ、、３７．　１９７４．６０３−６２２）を用いて、柔軟なポリ塩化ビニルマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ。

ＢｉｌｌｉｎｇＢｌｌｌｉｎ、　Ｇ　Ｂ　）にコーティングを施した。コーティングは、５０ｍＭ炭酸ｆト’）’）ムｐＨ９，５中、４°ｃで一夜実施した（１２．５μｇ／ｍｌペプシン処理抗体、Ｉ。

Ｏμｌ／ウェル）。プレートを、リン酸緩衝食塩溶液ｐＨ７、２，０，１２（ｗ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ　（商標）　２０　（ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ　）で３回洗浄した。プレートを、１２　（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡまたは５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）脱脂粉乳含有ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎとインキュベートして、非特異的結合を減少させた。ついて、プレートを順次、抗原、第二抗体、および抗−ラットＩｇＧベルオキシダーセ接合体（Ｋｉｎｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　ＬＩＳ　）と、３７℃で各回１時間インキュベートした。第二抗体はフラグメントＣと高い親和性で結合する（Ｓｈｅｐｐａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　［ｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、　、　土３．１９８４．７１０−７１４）ラットモノクローナル抗体（ＴＴＯ９）を、２μｇ／ｍｌの濃度で使用した。

抗−ラットベルオンキシダーゼ接合体はｌ：３０００に希釈して使用した。各試薬は、プレートに添加する前に、５％脱脂粉乳含有Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎに希釈した。プレートは、各インキュベーション前にＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。結合酵素複合体は、色素原基質としてテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を用いて検定した。１ｍｇＴＢＳ錠（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を、０．０１％過酸化水素含有０．０６２５Ｍクエン酸三ナトリウムｌｏｍｌ中に溶解した。各ウェルあたり試薬１００μｌを加え、反応は、室温て１０〜１５分間インキュベートしたのち１００μｌの２　Ｎ　Ｈ２Ｓ　Ｏ４を添加して停止させた。

プレートは、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ多走査プレートリーダー（ＭＣＣ／３４０）を用いて、４５０ｎｍで読み取った。

定量には、破傷風菌から調製したフラグメントＣ（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９８６　）を標準として使用した。

このフラグメントの数種の希釈液は、狭い幅の滴定曲線を与え、約ｌμｇ／ｍ１〜１０μｇ／ｍｌの間で直線性を示した。組換えフラグメントＣの滴定曲線は、標準曲線に匹敵する類似の傾斜および範囲を示した。未知サンプルの力価は、滴定曲線の中点を比較するか、またはより通常には、標準曲線の直線部分から直接読み取ることによって決定した。Ｍ現時には、クロマトグラフィー分画は、ペプシン処理ウマ抗体（約ｏ　、２５　ｍｇ／ｍｌ）を含む１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル中免疫拡散法により、フラグメントＣについてスクリーニングした。蛋白質は、ＢＣＡアッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）により、蛋白質標準としてウシ血清アルブミンを用いて測定した。

フラグメントＣは、２種のプラスミドｐＴＥＴｔａｃｌおよびｐＴＥＴｔａｃ２を用いて大腸菌内で発現させた。ｐＴＥＴｔａＣＩは、破傷風トキシン残基５３７〜８６４（フラグメントＢの部分）および残基８６５〜１３１５（フラグメントＣ）をコードする。残基番号はＥｉｓｅｌ　ｅｔａｌ、　ＥＭＢＯＪ、、５．　２４９５−２５０２．　１９８　６　；　Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ　＆　Ｌｙｎｅｓｓ、Ｎｕｃｌ、、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ｌ　４　。

７８０９−７８１２．１９８６によった。ｐＴＥＴｔａｃｌを撃留する大腸菌培養体に破傷風トキシンフラグメントの発現を誘発し、ドデシル硫酸ナトリウム− ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。

ｐＴＥＴｔａｃｌは、破傷風トキシンのヌクレオチド配列（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ　＆　Ｌｙｎｅｓｓ、ｌ　９８６　）から予想される９０ｋＤ蛋白質（図２）を中等度のレベルで発現した。

この９０ｋＤバンドか破傷風トキシンフラグメントであることは、抗−フラグメントＣ血清に対するウエスタンブロツイングによって確認された。細胞の破壊およびその抽出液の高速遠心分離後に、大部分の９０ｋＤ蛋白質は、大腸菌内で発現された破傷風トキシンの他のフラグメントについての記載（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　ｌ　９８６　）と同様にペレット分画に見出された（図２）。

ｐＴＥＴｔａｃ２は、Ｎ−末端にメチオニン残基が付加しているほかは、正確にフラグメントＣに相当する５０ｋＤポリペプチドを発現することが予想された。

図２に示すように、ｐＴＥＴｔａｃ２を含有する細胞の誘導では正しいサイズの、抗−フラグメントＣ抗血清で認識される（図２）蛋白質の発現を生じた。ｐＴＥＴｔａｃ２の発現レベルは、ｐＴＥＴｔａｃｌの場合よりも高かった。細胞抽出液の高速遠心分離後の可溶性分画に、はぼすへての生成物が見出された（図２）。ｐＴＥＴ　ｔ　ａ　ｃ２を撃留し、実験室規模で増殖された大腸菌によって発現されたフラグメントＣのレベルは、ＥＬＩＳＡて測定した。培養液Ｉｌから約１２ｍｇのフラグメントＣか得られ、これは総細胞蛋白質の約３％に相当した（表２）。

大腸菌内で産生されたフラグメントＣの精製および特性大腸菌内て産生されたフラグメントＣは、酸沈殿とイオン交換工程の組合わせを用いて精製した。クロマトグラフィーの間には、不均質性を示す証拠は全く認められなかった。精製操作の結果は表２にまとめる。最終工程後にも、なお、微量のある種の大腸菌夾雑物が存在し、総純度は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の濃度計測で、８５％と評価された（図３Ａ、レーン２）。

総数率は約５０％であった。

大腸菌および破傷風菌由来のフラグメントＣを電気泳動分析によって比較した。

いずれのプレバレージョンでも、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上非還上条還元条件下フラグメントＣの２つのバンドが見られる（図３Ａ、レーン４および５）。強度の弱い染色バンドが還元フラグメントＣと共移動する（図３Ａ、レーン２および３）。

組換えフラグメントＣのプレバレージョンは、非変性ＰＡＧＥ　（図３Ｂ、レーンｌ）および等電点電気泳動ゲル（データは示していない）で、大きなり−マシー染色を示した。ｐｌは７．２と測定された。ｌまたは２個の他の小さな、もっと酸性のＰｌを有する種が時に観察された。長期間（４週またはそれ以上）４° Ｃに保存したプレバレージョンでは、不均質性はもっと明瞭であった。破傷風菌からのフラグメントＣは、非変性電気泳動で類似の強度の３個のクーマシー染色バンドを示す（図３８ル−ン２）。これは、組換えフラグメントＣのプレバレージョンに見られる種と共移動する（レーンｌ）。このような不均質性は以前に破傷風菌からのフラグメントＣでも観察されていて（Ｍｅｌｔｉｎｇ　＆　Ｚｗｉｓｌｅｒ、　１９７７　）脱アミド化によるものと考えられていた。

大腸菌および破傷風菌によって酸性されたフラグメントＣの免疫原性は、フラグメントＣを含有するワクチンでマウスを免疫処置し、ついで破傷風トキシンでチャレンジして、比較した。表１は、いずれのプレバレージョンもチャレンジに対して優れた保護を与えることを示し、２種のサンプルの類似の保護能を示唆している。

表１＝フラグメントＣによるマウスの免疫処置フラグメントＣの希釈（ａｌ　生存動物数（ｂ）破傷風菌　大腸菌１／２０　ｔｏ／１０　１０／１０（ａｌ　大腸菌（４５μｇ／ｍｌ）または破傷風菌（３０μｇ／ｍｌ）からのフラグメントＣを指定のように希釈し、その０．５ｍｌをマウスに注射した。

（ｂｌ　マウスに４週後、約５０ＬＤｓ。の破傷風トキシンをチャレンジし、４日後に生存動物数を数えた。

表２：組換えフラグメントＣの精製工程　総蛋白質　フラグメントＣの回収（ｍｇ）　（ｍｇ）　（％）総溶解物　１０３０．０　２９．６　１００酸清澄化抽出物　６２２．０　２５．５　８６Ｄ［ＥＡＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　１３４．０　２３．６　８Ｏ３− ３ｅｐｈａｒｏｓｅ　２９．７　１７．６　５９Ｑ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　１５．５　１５．７　５３発現プラスミドｐＴｅｔ１８は、Ｍｅｔ−Ａｓｎ−３ｅｒ −Ａｒｇ−Ｇｌｙに続いてＢフラグメントの１２１残基およびＣフラグメントの全５４５１カルボキシ末端残基からなりポリペプチド、すなわち破傷風トキシンの残基５ｅｒ−７４４〜Ａｓｐ−１３１５（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９８７　）を発現する。このポリペプチドの大腸菌の細胞質への溶解性を評価した。

プラスミドｐＴｅ　ｔ　１８を存する大腸菌ＤＨＩをアンピシリン（１００μｇ／ｍりを含むし培地中で一夜増殖させた。細胞を、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β −Ｄ−チオガラクトシド）６０μｇ／ｍｌを含む新鮮なし培地にｌ：５に希釈し、４時間増殖させた。２１の培養液からの細胞を、５ｏｒｖａｌ　Ｇ　３３　ローターによって６．０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して収穫し、細胞ペレットを一２０°Ｃて一夜保存した。ペレットを解凍し、２５［１１ＭＴｒ　ｉ　ｓ塩酸塩（ｐＨ８，０）−１ｍＭ　ＥＤＴＡ−０，２％（ｗｔ／ｖｏｌ　）　Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ　−４０−１００ｍＭ　ＰＭＳＦ−１ｍｇ／ｍｌリゾチームの計３２ｍ１中に懸濁した。

細胞を氷上で２時間インキュベートし、０．３２ｍ１のＩ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｓ　０４およびＤＮアーゼ（１，ｍｇ／ｍｌ）を加え、インキュベーションをさらに２時間続けた。混合物を、５ｏｒｖａｌ　Ｓ　３３４　ローターによって１３．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを５０ｍＭＴｒｉｓ塩酸塩（ｐＨ８，０）’−５ｍＭ　ＥＤＴＡ−ｊＢ１１Ｊエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ。

Ｎ’、Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）−１％（ｗｔ／ｖｏｌ　）Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ　４０の１６０ｍ１中に懸濁した。ついで、混合物を前回同様に遠心分離し、ペレットを５０ｍＭＴｒｉｓ塩酸塩（ｐＨ８，０）−０，５ｍＭ　ＫＳＣＮ−５ｍＭ　ＥＤＴＡ−５ｍＭ　ＥＧＴＡの１６０ｍ１中に懸濁した。

前回同様に遠心分離し、ペレットを０．８５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）食塩溶液４０ｍ１に懸濁し、食塩溶液に対して一夜透析した。各遠心分離工程ごとに、ペレットおよび上澄液ついて、ウサギ抗−〇フラグメント血清を用い、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより破傷風菌蛋白質を検定した。破傷風菌に特異的な蛋白質ｐＴｅ　ｔ　ｌ　８は常に不溶性分画に認められた。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．破傷風トキシンの成熟フラグメントＣをコードする発現ベクター。
２．フラグメントＣは、図４に示したアミノ酸配列を有するか、または図４に示したアミノ酸配列と９０％を越えるホモロジーをもつアミノ酸配列を有する「請求項１」記載の発現ベクター。
３．フラグメントＣのアミノ酸配列は、図４に示したアミノ酸配列と９５％を越えるホモロジーを有する「請求項２」記載の発現ベクター。
４．アミノ酸配列は、図４に示したアミノ酸配列と９８％を越えるホモロジーを有する「請求項３」記載の発現ベクター。
５．「請求項１〜４」のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換された大腸菌。
６．「請求項１〜４」のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１、ＤＨ１またはＭＭ２９４。
７．「請求項５および６」のいずれかに記載の大腸菌を培養し、蛋白質を回収する破傷風トキシンの成熟フラグメントＣの製造方法。
８．「請求項８」に記載の方法によって製造された破傷風トキシンの成熟フラグメントＣと医薬的に許容される担体からなる破傷風に対する免疫を付与するためのワクチン。
９．「請求項８」に記載の方法によって製造された破傷風トキシンの成熟フラグメントＣの医薬としての使用。
１０．「請求項８」に記載の方法によって製造された破傷風トキシンの成熟フラグメントＣの、破傷風に対する免疫を付与するためのワクチンの製造における使用。
１１．「請求項８」に記載のワクチンの有効量を投与するヒトに破傷風に対する免疫を付与する方法。