JPH04504359A - ヒト乳脂肪小球膜ムチン抗原の糖タンパク質を確認する単クローン性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４、前記単クローン性抗体を生ずる細胞が正常全乳脂肪小球膜により免疫感作し たマウス肺臓細胞である請求の範囲２記載の細胞系。

５、前記単クローン性抗体を生ずる細胞が正常ヒト乳脂肪小球成分により免疫感 作したマウス肺臓細胞である請求の範囲２記載の細胞系。

６、前記単クローン性抗体が副腎、脳、膀胱、結腸、食道、リンパ節、ミコカル デア、筋、副甲状腺、甲状腺、卵巣、中皮および肝臓からなる群から選択する正 常上皮細胞に対して結合特異性を有していない請求の範囲１記載の細胞系。

７、前記単クローン性抗体が肺臓の肺胞内層細胞、腎臓の遠位回旋状細管、膵臓 の豚房上皮細胞および胃の粘膜からなる群から選択する正常上皮細胞に特異的に 結合する請求の範囲６記載の細胞系。

８、前記単クローン性抗体が胸、肺臓、卵巣、膀胱、子宮内膜、胃および中皮腫 の腺がんからなる群から選択する腺がんの上皮細胞に特異的に結合する請求の範 囲１記載の細胞系。

９、　アメリカン　タイプ　カルチュア　コレクション、２０Ｂ５２メリーラン ド州、ロックビレ、バークラウン　ドライブ　１２３０１ニ寄託し、Ａ、Ｔ、Ｃ ，Ｃ，寄託Ｎｏ、ＨＢ　１００２８テ指定された試料の識別特性を有するハイブ リドーマ技術によって得た細胞系。

１０、抗原決定基を、 Ａ、抗原上で電気泳動して、その移動を既知の分子量の標識タンパク質の分子量 と比較して定めて４００，０００ダルトン以上の分子量を有するＢｒＥ、抗原と して同定し：Ｂ、胸部がん腫細胞の表面および細胞質において発現し：Ｃ，ムチ ン状糖タンパク質複合体分子にジスルフィド結合した約６９．０００ダルトンの 分子量を有するタンパク質に共有的に結合でき； Ｄ、　ＩｇＧ１マウス　イソタイプであるように特徴づけられたヒト胸部がん腫 細胞のムチン状糖タンパク質複合体分子に特異的に結合する単クローン性抗体。

１１、前記ＢｒＥ、抗原が副腎、脳、膀胱、結腸、食道、リンパ節、ミコカルデ ア、筋、副甲状腺、甲状腺、卵巣、中皮および肝臓からなる群から選択する正常 上皮細胞に対する結合特異性を有しない請求の範囲１０記載の単クローン性抗体 。

１２、肺臓の肺胞内層細胞、腎臓の遠位回旋状細管、肺臓の豚房上皮細胞および 胃の粘膜からなる群から選択する正常上皮細胞の表面および細胞質におけるＢｒ Ｅ＋ｒＥ＋特異的に結合する請求の範囲１０記載の単クローン性抗体。

１３、胸、肺臓、卵巣、膀胱、子宮内膜、胃および中皮腫の腺がんからなる群か ら選択する腺がんの上皮細胞の表面および細胞質におけるＢｒＥ、抗原に特異的 に結合する請求の範囲１０記載の単クローン性抗体。

１４、　Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，寄託Ｎｏ、ＨＢ　１００２８で指定されたハイブリド ーマ細胞系によって生成した単クローン性抗体の結合特異性を有する単クローン 性抗体。

１５、アメリカン　タイプ　カルチュア　コレクションに寄託し、Ａ、Ｔ、Ｃ， Ｃ，寄託Ｎｏ、１００２８で指定されたハイブリドーマ細胞系試料によって生成 した単クローン性抗体。

１６、生物学的試料におけるＢｒＥ、抗原−含有ヒトがん腫細胞または分子のＢ ｒＥ３抗原を検出する方法において、前記生物学的試料をＢｒＥ３抗原に特異的 に結合する標識に結合した単クローン性抗体と、前記単クローン性抗体と抗原と の間に免疫複合体を形成するのに十分な時間および条件下で接触させ、および前 記免疫複合体を基質反応検出性生成物において検出することを特徴とするＢｒＥ ｉ抗療の検出方法。

１７、検出された前記単クローン性抗体および抗原免疫複合体が、ＢｒＥｉ単ク ローり性抗体に特異的に結合する共通エピトープを発現する抗原の分子本体を含 む請求の範囲１５記載の方法。

１Ｂ、前記標識を微小球に被覆した請求の範囲１５記載の方法。

１９、前記標識を蛍光染料および酵素からなる群から選択する請求の範囲１５記 載の方法。

２０、化学療法または光活性毒素に接合したＢｒＥ３抗原に特異的に結合するマ ウスＩｇＧ１イソタイプのマウス単クローン性抗体。

２１゜生物学的試料におけるＢｒＥ３抗原またはＢｒＥ＋抗原含抗原含有ヒト腺 細胞または分子の存在またはその欠乏を検出する方法において、前記生物学的試 料をＢｒＥ：＋抗原に特異的に結合する標識単クローン性抗体と、前記標識単ク ローン性抗体と抗原との間に免疫複合体を形成する免疫反応に十分な時間および 条件下で接触させ、および前記免疫複合体を検出することを特徴とするＢｒＥ、 抗原の存在またはその欠乏を検出する方法。

２２、前記標識を染料、蛍光染料および酵素からなる群から選択する請求の範囲 ２０記載の方法。

２３、ヒトがん腫腫瘍を有すると思われる患者のかかる腫瘍を検出する方法にお いて、前記患者に、ＢｒＥ、抗原に特異的に結合する標識により誘導した単クロ ーン性抗体を、前記単クローン性抗体と前記腫瘍との間に免疫複合体を形成する のに十分な時間および条件下で注入し、これにより前記腫瘍をそれを検出するた めの誘導車クローン性抗体で標識することを特徴とするヒトがん腫腫瘍の検出方 法。

２４、検出される前記がん腫腫瘍が胸部がん腫である請求の範囲２２記載の方法 。

２５、検出される前記がん腫腫瘍を肺臓、卵巣、膀胱、子宮内膜、胃および中皮 腫のかん腫腫瘍からなる群から選択する請求の範囲２２記載の方法。

明細書 ヒト乳脂肪小球膜ムチン抗原の糖タンパク質を確認する単クローン性抗体 １１止旺 本発明は衛生認可（Ｈｅａｌｔｈ　ｇｒａｎｄ）　Ｎｏ、ＣＡ３９９３２および ＳＯ７ＲＲ０５９２９の国際研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ ）のもとでの政府基金援助（Ｇｏｖｅｒｎｏ＋ｅｎｔ　ｆｕｎ＋Ｈｎｇ　５ｕｐ ｐｏｒｔ）によって達成されたものである。

本発明はヒトがん腫の抗体に結合する単クローン性抗体に関し、特に極めて大き い分子量のムチン状（ｍｕｃｉｎ−１ｉｋｅ）糖タンパク質複合体をヒト胸部が ん腫細胞および他の腺がんのがん腫細胞の表面および細胞質に特異的に結合し、 かつ試験流体における高濃度の抗体の場合を除いて正常ヒト胸部上皮細胞の表面 に選択的に結合しない単クローン性抗体に関する。

Ｕ肢歪 単クローン性抗体は、正常ヒト胸部上皮細胞の表面に存在する高分子ムチン状糖 タンパク質複合体を確認するのに開発されている（ペテルソン氏ほか、’Ｉｍｐ ｅｒｉａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄ」英国ロンドン、３月 ２〜３　（１９８１）　；タイロー−ペバデミトリュ氏はか’Ｉｎｔ、　Ｊ、　 Ｃａｎｃｅｒ」２８　：　１７〜２０１９８１）　；セリアニー氏ほかｒｓｏｍ ａｔｉｃ　Ｃｏ１１　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｊ　９　：　４１５〜４２７　（１９ ８３））　、他の研究者は、免疫感作剤（ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ　ａｇｅｎｔ） としてヒト乳脂肪小球を用いる単クローン性抗体を開発しており（タイロー−ベ バデミトリュ氏はかｒ　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃｅｎｃｅｒ」２８　：　１７〜２１ 　（１９８１）　；セリアニー氏ほかｒｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ　」９　：　４１５〜４２７（１９Ｂ３）　；および免疫感作剤として異 なる胸部腫瘍細胞（ペバシデロ氏ほかｒＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｊ　 ４３　：　１７４１〜１７４７　（１９８３）　；クーフエ氏ほかｒＨｙｂｒｉ ｄｏｍａ　」３　：　２２３〜２３２　（１９８４）　：フランケル氏ほかｒＪ 、Ｂｉｏｌ、　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄ、　Ｊ　４　：　２７３〜２８６　（ １９８５）　；コルチャー氏ほかｒＶｉｒｃｈｏｅ＋ｓ　Ａｒｃｈ　Ｊ　３９４ 　：　２７９〜２９３　（１９８２）　；エリス氏はか「旧ｓｔｏｐａｔｈｏｌ ｏｇｙ」８　：　５０１〜５１６　（１９８４）　、およびアサル氏ほかｒＬａ ｎｃｅＪ　２　：　１−１１　（１９８２）はムチン状糖タンパク質を確認する のに定められている。これらの単クローン性抗体は免疫原生成に影響されるが、 約２５０．０００ダレレトン〜１００万ダルトン以上にわたるムチン状糖タンパ ク質を確認するために確かめられている（シミズ氏ほかｒＢｉｏｃｈｅｓ　Ｊ、 Ｊ　２３３　：　７２Ｓ〜７３０　（１９８６））　。

ヒト乳脂肪小球膜の高分子ムチン状糖タンパク質の生化学研究において、これら の糖タンパク質が少なくとも３種の異なる分子本体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｎ ｔｉｔｉｅｓ）を示す少なくとも３種の成分からなる複合体であることが提案さ れている（ミズノ氏ほかｒＢｉｏｃｈｅｓ　Ｊ、Ｊ　２３３　：　７２５〜７３ ０　（１９８６）。それ故、ヒト乳脂肪小球膜のムチン状糖タンパク質は、その 大きさにより、無数のエピトープを予想することのできる高分子複合体を示して いる。

セリアニー氏ほかｒｓｏａ＋ａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｊ　９　 ：　４１５〜４２７（１９８３）に記載されている正常胸部上皮細胞および悪性 胸部細胞のムチン状糖タンパク質に結合する単クローン性抗体が開発されている 。更に、モルモット乳脂肪小球膜に特異的な単クローン性抗体Ｄ−２４は、良性 線維性嚢胞疾患およびヒト胸部の浸潤性管路がん腫（ｄｕｃｔ　ｃａｒｃｉｎｏ ＊ａ）における４００．０００ダルトン以上のムチン状タンパク質の分布を確か めるのに用いられている（グリーンワルト氏ほかｒＡ＊、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ 、Ｊ　１１８　：　３５１〜３５９（１９８５）。

６８．０００ダルトン〜Ｔｏ、０００ダルトンのヒト乳脂肪小球の非ムチン状糖 タンパク質成分を確認する抗体については報告されている（イマム氏ほかｒＣｏ ｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｊ　４４　：　２０１６〜２０２２　（１９８４ ）；ヘイド氏ほかｒＢｉｏｃｈｅｎ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ」７２８　 ：　２２８〜２３８（１９８３）　；およびジエンダー氏ほか「胸部がんの診断 および治療に対する免疫手段」（Ｒ，セリアニー氏曙集）プレナム出版、ニュー ヨーク、３３〜４０ページ（１９８７）。アミノ酸組成において僅かに異なるこ れらの抗原は異なる抽出手段を用いて得られ、正常乳汁分泌胸部の頂端を染色し た。また、７０．０００ダルトンのタンパク質は胸部がん患者の血清におい検出 されている（セリアニー氏ほかｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＬＩＳＡＪ　７９　：　５４２０〜５４２４（１９８２））　。

のある上皮細胞に結合する従来の単クローン性抗体は開発されている。がん細胞 の同定、診断、予後および治療において、ヒト胸部がん腫細胞および他の組織の あるがん腫細胞の表面および細胞質において発現する独特のエピトープに選択的 に結合し、かつ正常ヒト胸部上皮細胞の表面に選択的に結合しない単クローン性 抗体を得るのが極めて有利である。

１里夏皿水 単クローン性抗体は、ヒト胸部がん細胞および他の腺がんのがん腫細胞の表面お よび細胞質における新規なムチン状糖タンパク質抗原に選択的に結合し、かつ試 験流体における高濃度の抗原の場合を除いて正常ヒト胸部上皮細胞の表面に選択 的に結合しない。単クローン性抗体は副腎、脳、膀胱、結腸、食道、リンパ節、 心筋層、筋、副甲状腺、甲状腺、卵巣、中皮および肝臓の正常組織に結合しない 。

単クローン性抗体によって確認された抗原はＢｒＥｓと名づけられ、４００．０ ００ダルトン以上の高分子ムチン状糖タンパク質を有することに特徴づけられて いる。ＢｒＥ単クワクローン性抗体異性は同定研究、および胸部がん腫の評価お よび治療における予後、診断および可能な治療適用に有利である。

Ｂｒ！ｈ単クローり性抗体は免疫感作剤として正常脱脂ヒト乳脂肪小球を用いる のに開発した。

゛モー′ 発明を実施する単クローン性抗体の開発には、一般にコーラ−およびミルスティ ン氏’ＮａｔｕｒｅＪ　２５６　：　４９５〜４９７　（１９７５）に記載され ている標準手段を用いた。宿主動物はセリアニー氏３ｒ　Ｐｒｏｃ、にａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　７４　：　５８２〜５８６　（１９７７） に記載されているようにして作った完全脱脂ヒト乳脂肪小球（ＨＭＦＧ）によっ て免疫した。宿主動物をニューシーラント　ブラック（ＮＺＢ）マウスとし、部 属の適当な期間後、マウス肺臓を採取した。

しかる後に、採取した膵臓細胞をＰ　３−　Ｘ６３−Ａｇ　８．６５３マウス骨 髄腫と周知のポリエチレン　グリコール技術を用いて融合した０本発明の単クロ ーン性抗体を生ずるハイブリドーマまたは雑種細胞系を同定するスクリーニング を、固相放射線プレート結合検定、およびセリアニー氏ほかｒｓｅ＋５ａｔｉｃ 　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」９　：　４１５〜４２７　（１９８３）に記載 されている微量滴定プレート（ｍｉｃｒ。

ｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ）のウェル（ｗｅｌｌ）におけるＨＭＦＧおよびその成 分を用いるＥＬＩＳＡを用いて行った。これら後者のかん腫細胞系を染色しない 単クローン性抗体を確認し、その抗体を生ずる雑種細胞を分離した。この単クロ ーン性抗体は抗−ＢｒＥ３として確認した。Ｂｒａｔ単クローり性抗体によって 確認された抗原の分子量またはＭｒはトラピン氏ほかｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ」７６　：　４３５０〜４３５４　（１９７９ ）に記載されているウェスタン　プロット試験（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　ｔ ｅｓｔ）およびセリアニー氏ほかｒＭｏｎｏｃｌ−ｏｎａｌ　Ａｎｔｔｂｏｄｉ ｅｓ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｔｏｎａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　Ｊブレナム出版 、ニューヨーク、３９８〜４０２　（１９８４）に記載されている面相結合検定 によって定めた。

ウェスタン　プロット試験においては、ＨＭＦＧを７％ポリアクリルアミド　ゲ ル電気泳動により分離し、次いでニトロセルロース　ペーパーにエレクトロ−プ ロットした（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｂｌｏｔｔｅｄ）。

ニトロセルロースをストリップにカットし、ストリップを単クローン性抗体と部 属した。同時に、高分子量標準をゲルの平行ラーン（ｐａｒａｌｌｅｌ　１ａｎ ｅｓ）において行った。

固相結合検定においては、ＨＭＦＧをラエミリーＶＫ氏ｒＮａｔｕｒｅＪ２２７ 　：　６８０　（１９７０）に記載されている７％ポリアクリルアミドゲルにお いて電気泳動した。ゲル　ラーン（ｇｅｌ　１ａｎｅ）をフラクシヲンにスライ スし、スライスを溶離し、溶出液を微量滴定プレートにおいて乾燥した。単クロ ール性抗体の結合は放射線免疫検定技術によって試験した。ＨＭＦＧをウェスタ ン　プロット試験および固相結合検定において電気泳動した場合に、単クロール 性抗体ＢｒＥｚはポリアクリルアミド　ゲルの供給源（ｏｒｆ−ｇｉｎ）におい てだけに見出された材料を確認した。それ故、ムチン状糖タンパク質抗原は供給 源において残留する単りローン性抗体ＢｒＥユによって同定し、ポリアクリルア ミド　ゲルは浸透しなかった。次いで、ＨＭＦＧを７％以下のポリアクリルアミ ド　ゲル上で、上述する固相結合検定を用いて電気泳動した。次いで、単クロー ン性抗体ＢｒＥ３によって同定されたＨＭＦＧのムチン状糖タンパク質の分子量 を高分子量標準を用いて評価した。この抗原の分子量は４００．０００ダルトン 以上と推定した。

ＢｒＥ、単クローン性抗体を用いる胸部がん腫細胞または分子を含有する体液の 検定において、４００．０００ダルトン以下の分子量を示す糖タンパク質分子に 結合を生ずることを確定した。ＢｒＥｘ単クローり性抗体に結合する高分子量ム チン状糖タンパク質抗原はフラグメントになるような体液に変性すると仮定され ていた。　ＢｒＥ、単クローン性抗体は高分子量抗原、および現象を説明する分 子本体またはフラグメントにおい共通のエピトープを確認できるように思われる 。それ故、ＢｒＥ、単クローン性抗体は４００、０００ダルトン以上の高分子量 抗原に特異的に結合するから、またかかる分子本体に結合した抗原の共通エピト ープに結合することができる。この事は、高分子量抗原が分子本体の複合体であ るように思われることから、可能である。

４００、０００ダルトン以上の高分子量または複合分子量抗原についての他の研 究を行った。上述するように調製したＨＭＦＧ膜を、始めニ０．３％トリト：／ 　Ｘ−１００を含有するＰＢＳ　ニ５　ｒａｇ／　ｘｄｌ　（７）濃度で可溶化 した。可溶化膜をＢｒＥｓ単クローり性抗体に共有的に結合したセファロース　 ビーズ上でアフィニティー　クロマトグラフィーを行った。ビーズに結合した材 料を２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ　）で溶離した。溶出材料を、還元剤 としてメルカプトエタノールを用いてまたは用いないで、ＳＯ５の存在で７％ポ リアクリルアミド　ゲルにおいて処理し、ウェスタンブロッティングのためのニ トロセルロース　シートに移した。

ムチン複合体から遊離した還元タンパク質は、ＭｃＲｔにより検出された６９． ０００ダルトン抗原のようなりｒＥ単ツクローン性抗体よるアフィニティー　ク ロマトグラフィによって分離することができたが（セリアニー氏ほか’Ｓｏｍａ ｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｊ　９　：４１５〜４２７　（１９８３ ））　、ＬかしＢｒＥｓ単クローり性抗体では分離できなかった。

抗−ＢｒＥ、単クローン性抗体は６９，０００ダルトン　タンパク質を共沈し、 ６９，０００ダルトン　タンパク質およびムチン状糖タンパク質複合体をポリア クリルアミド　ゲルの供給源に非還元条件下で残留した。還元下で、６９．００ ０ダルトン抗原は遊離し、６９　、０００ダルトンにおいて主帯域を有するダブ レットとして移動した。

それ故、還元が物理的に閉じ込められた６９，０００ダルトン　タンパク質を釈 放するムチンを単にばらばらに破壊する可能性について研究した。　ＨＭＦＧを ０．３〜１．０％トリトンｘ−１ｏｏ　、ｏ、１〜２％ＳＯＳ、１％ＳＯＳ＋８ Ｍ尿素および６Ｍグアニジン塩酸塩を含有する緩衝液に溶解した０次いで、ＨＭ ＦＧをノイラミニダーゼおよびエンドーーＮ−アセチルガラクトースアミニダー ゼで処理し、広範囲にわたって音波処理した。これらの手段では６９　、０００ ダルトン　タンパク質がムチン状糖タンパク質複合体から遊離しなかった。　Ｂ ｒＥ３抗原と抗体被覆ビーズの共沈は、６９．０００ダルトン帯域が、実際に、 ムチンと複合し、他の高分子量種が複合しないことを示している。それ故、６９ ．０００ダルトン　タンパク質はジスルフィド結合によってムチンと共有的に結 合することが明らかである。

ＢｒＥｓ単クローり性抗体イソタイプはマウス免疫グロブリンキットを用いてＩ ｇＧＩと定められた。

ＢｒＥ、単クローン性抗体を、組織結合特異性を更に特徴づけるために、組織切 片（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｅｃｔｉｏｎｓ）に結合するため広範囲にわ たって試験した。標準イムノペルオキシダーゼ検定手段を正常およびがん性ヒト 組織の組織切片に結合するのに用いた０組織はバラティフォーラＨ氏ｒＬａｂ　 Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｊ　５５　：　２４４〜２４８　（１９８６）に記載されるよ うに多腫瘍組織ブロックの形態に調製した。各組織ブロックは腹膜または腸にお ける組織を包装することによって、およびパラフィンに包理することによって固 定組織のストリップの収集から調製した８次いで、ブロックを結合研究の用意の ためにスライスした。この手段において、多数の異なる組織を単一染色によって 評価した。

ＢｒＥ３準Ｅ３単クローンの特徴づけに用いられた胸部ブロックは正常胸部組織 からの２１個の異なる検体試験体、２２個の腺腫、および３３個の胸部がん腫を 含有していた。ＢｒＥ、単クロール性抗体は試験したすべての試験組織を染色し た。

正常ヒト胸部上皮細胞のパラフィン切片におけるイムノペルオキシダーゼ染色に よって行った試験において、ＢｒＥ３準Ｅ３単クローンは単クローン性抗体の比 較的に高い濃度条件下を除いて、ヒト胸部上皮細胞の表面に選択的に結合しない ことを確かめた。一般に、単クロール性抗体は管路の、正常胸腺の内腔に選択的 に存在する分泌物質を検出することができる。しかしながら、ＢｒＥｚ単クロー り性抗体は単クローン性抗体の有意に低い濃度においてヒト胸部腫瘍細胞の表面 に強く結合することを確かめた。また、単クローン性抗体のかかる結合は試験し た胸部腫瘍細胞の細胞質において検出した０例えば、正常胸部上皮細胞および胸 部腫瘍細胞の比較試験において、有意な結果についての腫瘍細胞に関連する単ク ローン性抗体の所望とする濃度は、単クローン性抗体による染色を検定するだの 正常胸部上皮細胞に関連する単クローン性抗体の所望とする濃度の少なくとも１ ０分の１　（１／１０）であった。それ故、ＢｒＥ３準Ｅ３単クローンは試験試 料における単クローン性抗体の高濃度において正常ヒト胸部細胞を染色でき、し かもヒト胸部腫瘍細胞を選択的に染色し、しかも試験試料における抗体の比較的 に低い濃度において激しく染色する。　ＢｒＥ３準Ｅ３単クローンのこの結合特 性は他の線がんに適用して定めた。

ＢｒＥ：＋単りローン性抗体は、正常ヒト胸部上皮細胞のイムノペルオキシダー ゼ染色によって、パラフィン切片において試験した。一般に、ＢｒＥｚ単クロー り性抗体は管路の、正常胸腺の内腔に選択的に存在する分泌物質を検出した。こ れに対して、胸部腫瘍は、多くの場合、ＢｒＥ　ｚ単りローン性抗体によって激 しく染色し、ある場合には胸部がん細胞の細胞質に染色した。大抵の腫瘍におい て、正常胸部の管路における分泌物質を染色するのに要する濃度の少なくとも１ ０分の１　（１／１０）のＢｒＥｓ単クローり性抗体の濃度は胸部腫瘍細胞を著 しく染色するのに十分であった。

それ故、ＢｒＥ３準Ｅ３単クローンは試験流体における高濃度の抗体の場合を除 いて、正常ヒト胸部上皮細胞の表面に選択的に結合しなかった。

また、ＢｒＥ３準Ｅ３単クローンを、正常胸部組織または胸部がん腫以外の異な る正常および腫瘍組織の大きいパネルにおいて試験した。ＢｒＥｓ単クローり性 抗体は肺臓の肺胞内層細胞、腎臓の遠位回旋状細管、膵臓の豚房上皮細胞および 胃の全厚さの粘膜の正常組織に結合した。　Ｂｒｔ！、単クローン性抗体は副腎 、脳、膀胱、結腸、食道、リンパ節、ミコカルデア（ｓ＋ｙｃｏｃａｒｄｉａ） 、筋、副甲状腺、甲状腺、卵巣、中皮（＠ｅｓｏｔｈｅｌｉａ）および肝臓の正 常組織に結合しなかった。

ＢｒＥｓ単クローり性抗体は多数の腺がんに結合した。頂端膜束色（ａｐｉｃａ ｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）および細胞質染色の組合わせは大部 分の腺がんにおいて報告されている。ＢｒＥ１準Ｅ１単クローンは胸、肺、卵巣 、膀胱、子宮内膜、胃および中皮腫の多くの腺がんに結合した。ＢｒＥｚ単クロ ーり性抗体は結腸、腎臓、肝臓、リンパ節、マーケル細胞（ｍｅｒｋｅｌ　ｃｅ ｌｌ）　、膵臓、耳下腺、横絞筋肉腫、唾液腺、肉腫および甲状腺の少数の腺が んに結合した。

また、ＢｒＥ３準Ｅ３単クローンは頚部および喉頭の腫瘍に結合した。

ＢｒＥ　３単クロ一ン性抗体を生成できる１例の雑種細胞はアメリカン　タイプ 　カルチュアー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）２０８５２メリーランド州ロツクビレ、バークラウン　 ドライブ１２３０１に１９８９年２月７日に寄託し、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ。

Ｎｏ、ＨＢ　１００２８　と指定された。

ＢｒＥｘ単クローり性抗体は独特のものであり、胸部がん睡の表面におよび細胞 質に存在する極めて高分子量のムチン状糖タンパク質複合体について例外的な特 異性を有し、かつ副腎、脳、膀胱、結腸、食道、リンパ節、ミコカルデア、筋、 副甲状腺、甲状腺、中皮および肝臓の正常組織について特異性を示さない。

この結果として、ＢｒＥｚ単クローり性抗体はユニの方法に用いることができる 。すなわち、異なる結合特異性を有するアンチ−胸部抗体の「カクテル」の１成 分として用いることができる。

カクテルは異なる細胞および組織特異性を有する単クローン性抗体を含んでいる から、胸部がんＩＩＩ診断および治療に、および細胞分化および細胞タイプ特異 性の研究に用いることができる。

例えば、ＢｒＥ３準Ｅ３単クローンは腫瘍画像化についての染料または蛍光分子 または放射性トレーサーのような検出しうる標識で標識つけすることができる。

適当なトレーサーはヨウ素１３１、インジウム１１１またはテクネチウム９９で ある。ＢｒＥｔ単クローり性抗体はユニの単クローン性抗体のカクテルにおいて 抱合形態（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｆｏｒｍ）および非抱合形態で、または別々 に治療的に用いることができる。ＢｒＥａ単クローり性抗体についての適当な抱 合体は化学療法剤、毒素または放射性同位体を包含している。ヨウ素のような放 射性同位体はＢｒＥｉ単クローり性抗体に直接に抱合することができる。インジ ウム１１１またはイツトリウム９０のような放射性同位体はキレータ−（ｃｈｅ 　ｌａ　ｔｏｒｓ）の使用を介して、または他の既知の手段によってＢｒＥ＋単 クローり性抗体に間接的に抱合することができる。抱合（ｃｏｎｊ　ｕｇａｔｅ ｄ）または非抱合（ｕｎｃｏｎｊ　ｕｇａｔｅｄ）　ＢｒＥｚ単クローり性抗体 は単クローン性抗体のカクテルに、または個々の投与形態で投与することができ る。

単クローン性抗体のカクテルに用いることのできる単クローン性抗体の例につい ては本特許出願人の係属中の米国特許出願第１５３．０７２および２３７．２１ ８号明細書に記載されている。

微小球がその上に被覆した抗原または抗体と接合するのに有利であり、かつ標識 つけに適当である免疫検定は、ＢｒＥ、単クローン性抗体とインビトロ診断適用 に用いることができる。標識はここにおいて検討されるように、および当業技術 において知られているように変えることができる。インビトロ適用において、Ｂ ｒＥ、単クローン性抗体は、例えば本明細書に記載している文献の指図によって 生物学的試料の検定を完成するための他の成分を含んでいる検定キットに加える ことができる。ＢｒＥ＋単クローり性抗体は診断および治療におけるインビボ適 用に用いることができる。検定は細胞分化および細胞特異性について研究するフ ロー　サイトメトリック手段と用いることができる。また、ＢｒＥｓ単クローり 性抗体は、例えば悪性の結果、悪性の転移見込みまたは悪性の段階を定める腫瘍 の組織病理学における予後道具として用いることができる。不ｌ竺土且およびイ ンビボ適用のこれらの例はＢｒＥ、単クローン性抗体の使用の他の適用を排除す るものではない。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成３年１０月 ４日

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト胸部がん腫細胞のムチン状糖タンパク質複合体に、ジスルフィド結合に よりジスルフィド結合した６９，０００ダルトンの近似分子量のタンパク質を共 有的に結合する４００，０００ダルトン以上の分子量のムチン状糖タンパク質分 子複合体に発現する、ヒト胸部がん腫細胞および他の腺がんのヒトがん腫細胞の 表面および細胞質における独特の抗原決定基に特異的な単クローン性抗体を生成 するハイブリドーマ技術によって発生させたハイブリドーマ細胞系。
2. ２．前記基がＢｒＥ３抗原に対するマウスＩｇＧＩインタイプ抗体を生ずるＢｒ Ｅ３抗原として特徴ずけられる請求の範囲１記載の細胞系。
3. ３．前記単クローン性抗体を生ずる細胞が脱脂ヒト乳脂肪小球により免疫感作し たマウス脾臓細胞である請求の範囲２記載の細胞系。
4. ４．前記単クローン性抗体を生ずる細胞が正常全乳脂肪小球膜により免疫感作し たマウス脾臓細胞である請求の範囲２記載の細胞系。
5. ５．前記単クローン性抗体を生ずる細胞が正常ヒト乳脂肪小球成分により免疫感 作したマウス脾臓細胞である請求の範囲２記載の細胞系。
6. ６．前記単クローン性抗体が副腎、腦、膀胱、結腸、食道、リンパ節、ミコカル デア、筋、副甲状腺、甲状腺、卵巣、中皮および肝臓からなる群から選択する正 常上皮細胞に対して結合特異性を有していない請求の範囲１記載の細胞系。
7. ７．前記単クローン性抗体が肺臓の肺胞内層細胞、腎臓の遠位回旋状細管、脾臓 の腺房上皮細胞および行の粘膜からなる群から選択する正常上皮細胞に特異的に 結合する請求の範囲６記載の細胞系。
8. ８．前記単クローン性抗体が胸、肺臓、卵巣、膀胱、子宮内膜、胃および中皮腫 の腺がんからなる群から選択する腺がんの上皮細胞に特異的に結合する請求の範 囲１記載の細胞系。
9. ９．アメリカンタイプカルチュアコレクション、２０８５２メリーランド州、ロ ックビレ、パークラウンドライブ１２３０１に寄託し、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託Ｎ ｏ．ＨＢ１００２８で指定された試料の識別特性を有するハイプリドーマ技術に よって得た細胞系。
10. １０．抗原決定基を、 Ａ．抗原上で電気泳動して、その移動を既知の分子量の標識タンパク質の分子量 と比較して定めて４００，０００ダルトン以上の分子量を有するＢｒＥ３抗原と して同定し；Ｂ．胸部がん腫細胞の表面および細胞質において発現し；Ｃ．ムチ ン状糖タンパク質複合体分子にジスルフィド結合した約６９，０００ダルトンの 分子量を有するタンパク質に共有的に結合でき； Ｄ．ＩｇＧＩマウスインタイプである ように特徴づけられたヒト胸部がん腫細胞のムチン状糖タンパク質複合体分子に 特異的に結合する単クローン性抗体。
11. １１．前記ＢｒＥ３抗原が副腎、脳、膀胱、結腸、食道、リンパ節、ミコカルデ ア、筋、副甲状腺、甲状腺、卵巣、中皮および肝臓からなる群から選択する正常 上皮細胞に対する結合特異性を有しない請求の範囲１０記載の単クローン性抗体 。
12. １２．肺臓の肺胞内層細胞、腎臓の遠位回旋状細管、脾臓の腺房上皮細胞および 胃の粘膜からなる群から選択する正常上皮細胞の表面および細胞質におけるＢｒ Ｅ３抗原に特異的に結合する請求の範囲１０記載の単クローン性抗体。
13. １３．胸、肺臓、卵巣、膀胱、子宮内膜、胃および中皮腫の腺がんからなる群か ら選択する腺がんの上皮細胞の表面および細胞質におけるＢｒＥ３抗原に特異的 に結合する請求の範囲１０記載の単クローン性抗体。
14. １４．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託Ｎｏ．ＨＢ１００２８で指定されたハイブリドーマ 細胞系によって生成した単クローン性抗体の結合特異性を有する単クローン性抗 体。
15. １５．アメリカンタイプカルチュアコレクションに寄託し、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄 託Ｎｏ．１００２８で指定されたハイブリドーマ細胞系試料によって生成した単 クローン性抗体。
16. １６．生物学的試料におけるＢｒＥ３抗原−含有ヒトがん腫細胞または分子のＢ ｒＥ３抗原を検出する方法において、前記生物学的試料をＢｒＥ３抗原に特異的 に結合する標識に結合した単クローン性抗体と、前記単クローン性抗体と抗原と の間に免疫複合体を形成するのに十分な時間および条件下で接触させ、および前 記免疫複合体を基質反応検出性生成物において検出することを特徴とするＢｒＥ ３抗原の検出方法。
17. １７．検出された前記単クローン性抗体および抗原免疫複合体が、ＢｒＥ３単ク ローン性抗体に特異的に結合する共通エピトープを発現する抗原の分子本体を含 む請求の範囲１５記載の方法。
18. １８．前記標識を微小球に被覆した請求の範囲１５記載の方法。
19. １９．前記標識を蛍光染料および酵素からなる群から選択する請求の範囲１５記 載の方法。
20. ２０．化学療法または光活性毒素に接合したＢｒＥ３抗原に特異的に結合するマ ウスＩｇＧＩインタイプのマウス単クローン性抗体。
21. ２１．生物学的試料におけるＢｒＥ３抗原またはＢｒＥ３抗原含有ヒト胸がん腫 細胞または分子の存在またはその欠乏を検出する方法において、前記生物学的試 料をＢｒＥ３抗原に特異的に結合する標識単クローン性抗体と、前記標識単クロ ーン性抗体と抗原との間に免疫複合体を形成する免疫反応に十分な時間および条 件下で接触させ、および前記免疫複合体を検出することを特徴とするＢｒＥ３抗 原の存在またはその欠乏を検出する方法。
22. ２２．前記標識を染料、蛍光染料および酵素からなる群から選択する請求の範囲 ２０記載の方法。
23. ２３．ヒトがん腫腫瘍を有すると思われる患者のかかる腫瘍を検出する方法にお いて、前記患者に、ＢｒＥ３抗原に特異的に結合する標識により誘導した単クロ ーン性抗体を、前記単クローン性抗体と前記腫瘍との間に免疫複合体を形成する のに十分な時間および条件下で注入し、これにより前記腫瘍をそれを検出するた めの誘導単クローン性抗体で標識することを特徴とするヒトがん腫腫瘍の検出方 法。
24. ２４．検出される前記がん腫腫瘍が胸部がん腫である請求の範囲２２記載の方法 。
25. ２５．検出される前記がん腫腫瘍を肺臓、卵巣、膀胱、子宮内膜、胃および中皮 腫のがん腫腫瘍からなる群から選択する請求の範囲２２記載の方法。