DE69024043T2

DE69024043T2 - Monoklonaler antikörper mit erkennungsspezifität für ein glykoprotein des globulären membran-mucin-antigens aus menschlichem milchfett.

Info

Publication number: DE69024043T2
Application number: DE69024043T
Authority: DE
Inventors: Roberto L. Lafayette Ca 94549 Ceriani; Jerry A. Lafayette Ca 94549 Peterson
Original assignee: Cancer Research Fund of Contra Costa
Current assignee: Cancer Research Fund of Contra Costa
Priority date: 1989-04-05
Filing date: 1990-04-04
Publication date: 1996-07-25
Anticipated expiration: 2010-04-05
Also published as: JP3284133B2; WO1990012319A1; ES2082853T3; EP0466818B1; JPH04504359A; EP0466818A1; CA2049938A1; DK0466818T3; DE69024043D1; EP0466818A4; ATE131284T1; CA2049938C; US5075219A

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der an Antigene menschlicher Karzinome bindet, und betrifft insbesondere einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch an einen mucinartigen Glycoproteinkomplex sehr hohen Molekulargewichts an der Oberfläche und im Cytoplasma von menschlichen Brustkarzinomzellen und Karzinomzellen anderer Adenokarzinome bindet, der aber nicht selektiv an der Oberfläche von normalen menschlichen Brustepithelzellen bindet, ausgenommen in Fällen hoher Konzentration des Antikörpers im Testfluid.

Stand der Technik

Monoklonale Antikörper wurden entwickelt, die einen hochmolekulargewichtigen mucinartigen Glycoproteinkomplex, der an der Oberfläche normaler Brustepthelzellen vorhanden ist, erkennen. Peterson et al., Imperial Cancer Research Fund, London, England, March 2-3 (1981); Taylor-Papadimitriou et al., Int. J. Cancer, 28:17-21 (1981); Ceriani et al., Somatic Cell Genetics, 9:415-427 (1983). Andere Forscher haben monoklonale Antikörper entwickelt unter Verwendung sowohl der menschlichen Milchfettkügelchen als Immunisierungsmittel [Taylor-Papadimitriou ea al., Int. J. Cancer, 28: 17-21 (1981); Ceriani et al., Somatic Cell Genetics, 9:415-427 (1983)] als auch von verschiedenen Brusttumorzellen als Immunisierungsmittel [Papsidero et al., Cancer Research, 43:1741-1747 (1983); Kufe et al., Hybridoma, 3:223-232 (1984); Frankel et al.,J. Biol. Reponse Mod., 4:273-286 (1985); Colcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:3199-3203 (1981); Foster et al., Virchows Arch, 394:279-293 (1982); Ellis et al., Histopathology, 8:501-516 (1984); Ashall et al., Lancet, 2:1-11 (1982)], von welchen festgestellt wurde, daß sie auch ein mucinartiges Glycoprotein erkennen. Es wurde gefunden, daß diese momoklonalen Antikörper solche mucinartige Glycoproteine erkennen, die in der Masse variieren von ungefähr 250 000 Dalton bis über eine Million Dalton, in Abhängigkeit von der immunogenen Herstellung. Shimizu et al., Biochem J., 233:725-730 (1986).
Bei biochemischen Untersuchungen der hochmolekularge wichtigen mucinartigen Glycoproteine der menschlichen Milchfettkügelchenmembran wurde die Ansicht geäußert, daß diese Glycoproteine Komplexe sind, die aus zumindest drei verschiedenen Komponenten bestehen, die mindestens drei verschiedene Molekulareinheiten darstellen können. Shimizu et al., Biochem J., 233:725-730 (1986). So wurde gezeigt, daß die mucinartigen Glycoproteine der menschlichen Milchfettkügelchenmembran große Molekularkomplexe sind, bei welchen zufolge ihrer Größe erwartet werden kann, eine Unzahl von Epitopen zu haben. Monoklonale Antikörper wurden entwickelt, die an mucinartige Glycoproteine von normalen Brustepithelzellen und malignen Brustzellen binden, wie der Mc5 momnoklonale Antikörper, beschrieben in Ceriani et al., Somatic Cell Genetics, 9:415-427 (1983). Ein monoklonaler Antikörper D-274, der spezifisch ist auf Milchfettkügelchenmeinbranen von Meerschweinchen, wurde dazu verwendet, um die Verteilung von mucinartigen Glycoproteinen > 400 000 Dalton sowohl bei gutartiger fibrocystischer Erkrankung als auch infiltrierendem Ductuskarzinom der menschlichen Brust. Greenwalt et al., Am. J. Pathol., 118:351-359 (1985). Eine Reihe von momnoklonalen Antikörpern, die antigene Determinanten von hochmolekulargewichtigen mucinartigem Glycoprotein erkennen und die imstande sind, Karzinomzellen zu färben, wie Antikörper MMFG-2, LIC-LON M8, D8 und C-Mul, ist in Griffith et al., Int. J. Cancer, 40:319-327 (1987) beschrieben.
Antikörper, die Nicht-Mucin Glycoprotein von menschlichen Milchfettkügelchen mit 68 000 Dalton und 70 000 Dalton wurden beschrieben. Imam et al., Cancer research 44: 2016-2022 (1984); Heid et al., Biochern. Biophys. Acta 728: 228-238 (1983); Gendler et al., in Immunological Approaches to the Diagnosis and Therapy of Breast Cancer (R. Ceriani, Ed.) Plenum Press, N.Y., S. 30-40 (1987). Diese Antigene unterscheiden sich geringfügig in der Aminosäurezusammen-Setzung, wurden unter Verwendung unterschiedlicher Extraktionsverfahren erhalten und färben normale Milchbrustspitzen. Ein 70 000 Dalton Protein wurde auch in den Sera von Brustkarzinompatienten entdeckt. Ceriani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5420-5424 (1982).
Bekannte monoklonale Antikörper wurden entwickelt, die an normale menschliche Brustepithelzellen, Brustkarzinomzellen sowie an einige Epithelzellen anderer Gewebe binden. Es würde sehr vorteilhaft bei der Tumorzellenidentifizierung, Diagnose, Prognose und Therapie sein, einen monoklonalen Antikörper vorzusehen, der selektiv an ein einziges Epitop bindet, das an der Oberfläche und im Cytoplasma von menschlichen Karzinomzellen und einigen Karzinomzellen von anderen Geweben exprimiert ist, und das nicht selektiv an die Oberfläche von normalen menschlichen Epithelzellen bindet.

Offenbarung der Erfindung

Monoklonaler Antikörper, der an eine neue antigene Determinante von mucinartigem Glycoprotein an der Oberfläche und im Cytoplasma von menschlichen Karzinomzellen und Karzinomzellen anderer Adenokarzinome bindet und nicht selektiv an der Oberfläche von normalen menschlichen Brustepithelzellen, ausgenommen in Fällen hoher Konzentration des Antikörpers im Testfluid, bindet. Der monoklonale Antikörper bindet nicht an normales Gewebe von Nebenniere, Gehirn, Blase, Dickdarm, Speiseröhre, Lymphknoten, Herzmuskel, Muskel, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Eierstock, Mesothel und Leber.
Das durch den monoklonalen Antikörper erkannte Antigen wird mit BrE3 bezeichnet und ist daduch gekennzeichnet, daß es ein hochmolekulargewichtiges mucinartiges Glycoprotein hat, das über 400 000 Dalton hinausgeht. Die Spezifität des BrE monoklonalen Antikörpers ermöglicht vorteilhafterweise Differenzierunguntersuchungen, prognostische, diagnostische und mögliche therapeutische Anwendungen bei der Bewertung und Behandlung von Brustkarzinomen.
Der BrE3 monoklonale Antikörper wurde entwickelt unter Verwendung normaler entfetteter menschlicher Milchfettkügelchen als Immunisierungsmittel.

Beste Ausführungsform der Erfindung

Für die Entwicklung des monoklonalen Antikörpers gemäß der Erfindung wurden Standardverfahren verwendet, die allgemein von Kohler und Milstein, Nature, 256:495-497 (1975) beschrieben wurden. Das Wirtstier wurde mit vollständig entfetteten menschlichen Milchfettkügelchen (HMFG), hergestellt wie in Ceriani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:582-586 (1977) beschrieben, immunisiert. Die Wirtstiere waren schwarze Neuseelandmäuse (NZB) und nach einer entsprechenden Inkubationszeit wurden die Milzzellen der Maus gewonnen.
Die gewonnenen Milzzellen wurden dann mit P3-X63- Ag8.653 Mausmyelomazellen unter Anwendung bekannter Polyethylentechniken fusioniert. Das Screening zur Identifizie rung des Hybridoms oder der Hybridzellinie, die den monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung produzieren, wurde durchgeführt sowohl unter Verwendung eines Festphasen radioimmuno-plattenbinding Assays als auch eines ELISA unter Verwendung des HMFG und Komponenten von HMFG in Gefäßen einer Mikrotiterplatte wie in Ceriani et al., Somatic Cell Genetics, 9:415-427 (1983) beschrieben. Hierauf wurden die für HMFG positiven Gefäße an Zellinien von Gebärmutterhalskarzinom und Dickdarmkarzinom gescreent. Ein monoklonaler Antikörper wurde identifiziert, der die letztgennanten Karzinomzellinien nicht färbte, und die Hybridzellen, die diesen Antikörper produzierten, wurden isoliert. Dieser monoklonale Antikörper wird hierbei als Anti- BrE3 identifiziert. Das Molekulargewicht oder Mr des durch den BrE3 monoklonalen Antikörper identifizierten Antigens wurde mittels Western-Blot-Test, wie von Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350-4354 (1979) beschrieben, und Festphasen binding Assay, wie von Ceriani et al., Monodonal Antibodies and Functional Cell Lines, Plenum Press, New York, 398-402 (1984) beschrieben, bestimmt.
Beim Western-Blot-Test wurde HMFG durch 7 % Polyamidgelelektrophorese aufgetrennt und dann auf Nitrocellulosepapier elektroblottiert. Die Nitrocellulose wurde in Streifen geschnitten und die Streifen wurden mit dem monoklonalen Antikörper inkubiert. Hochmolekulargewichtstandards wurden gleichzeitig auf Parallelgelbahnen laufen gelassen.
Im Festpasen binding Assay wurden HMFG in 7 % Polyacrylamidgel elektrophoretisiert wie von Laemmeli VK, Nature, 227:680 (1970) beschrieben. Die Gelbahn wurde in Fraktionen aufgetrennt, die getrennten Stücke wurden eluiert und das Eluat wurde auf Mikrotiterplatten getrocknet. Binding von monoklonalem Antikörper wurde mittels einer radioimmunobinding Assay Technik getestet. Wenn HMFG sowohl im Western-Blot-Test als auch im Festpasen binding Assay elektrophoretisiert wurden, identifiziert der monoklonale Antikörper BrE3 ein Material, das nur am Anfang des Polyacrylamidgels gefunden wurde. So verbleibt das durch den monoklonalen Antikörper BrE3 identifizierte mucinartige Glycoprotein Antigen am Anfang und durchdringt nicht das Polacrylamidgel. HMFG wurden dann auf weniger als 7 % Polyacrylamidgel elektrophoretisiert unter Verwendung des oben beschriebenen Festphasen binding Assays. Das Molekulargewicht des mucinartigen Glycoprotein Antigens von HMFG, das vom monoklonalen Antikörper BrE3 identifiziert wurde, wurde dann unter Verwendung von hochmolekulargewichtigen Standards berechnet. Das Molekulargewicht dieses Antigens wurde mit > 400 000 Dalton berechnet.
Bei Assays von Körperflüssigkeiten, die Brustkarzinomzellen oder Moleküle unter Verwendung des BrE3 monoklonalen Antikörpers enthielten, stellten wir fest, daß zusätzlich zur Bindung an ein Glycoprotein > 400 000 Dalton auch eine Bindung an eine Glycoproteinmoleküleinheit erfolgte, die ein Molekulargewicht "400 000 Dalton aufweist. Es wurde vorausgesetzt, daß das hochmolekulargewichtige mucinartige Glycoprotein Antigen, an das der BrE3 monoklonale Antikörper gebunden ist, in der Körperflüssigkeit bis zur Fragmentierung denaturiert wurde. Es zeigt sich, daß der BrE3 monoklonale Antikörper ein Epitop erkennt, das zu dem Antigen mit einem Molekulargewicht > 400 000 und einer kleineren Moleküleinheit oder Fragment gehört, das vom Aufbrechen der Species mit einem Molekulargewicht > 400 000 herrühren kann. Obwohl der BrE3 monoklonale Antikörper spezifisch an das hochmelekularegewichtige > 400 000 Dalton Antigen bindet, kann er auch ebenso an ein zugehöriges Epitop des Antigens, das sich an einer solchen Moleküleinheit befindet, binden. Dies ist möglich, da das hochmelekulargewichtige Antigen ein Komplex von Moleküleinheiten zu sein scheint.
Weitere Untersuchungen des Antigens mit hohem oder komplexem Molekulargewicht > 400 000 Dalton wurden vorgenommen. HMFG Membranen, die wie oben beschrieben hergestellt sind, wurden zuerst in 0,3 % Triton X-100 in einer Konzentration von 5 mg/ml enthaltendem PBS solubilisiert. Die solubilisierten Membranen wurden einer Affinitätschromatographie an Sepharosekörner unterworfen, welche kovalent an den BrE3 monoklonalen Antikörper gebunden sind. Das an die Körner gebundene Material wurde mit 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) eluiert. Das eluierte Material wurde in 7 % Polyacrylamidgelen in Gegenwart von SDS mit oder ohne Mercaptoethanol als Reduzierungsmittel laufen gelassen und auf eine Nitrocelluloseträgerfolie zum Western-Blotting übertragen. Es ist möglich nachzuweisen, daß das Reduktionsprotein vom Mucin-Komplex, der durch Affinitätschromatographie aufgetrennt wurde, durch den BrE monoklonalen Antikörper als 69 000 Dalton Antigen, das durch McR2 [Ceriani et al., Somatic Cell Genetics, 9:415-427 (1983)] erkannt wurde, freigesetzt wurde, jedoch nicht durch BrE3 monoklonalen Antikörper.
Der BrE3 monoklonale Antikörper kopräzipitierte ein 69 000 Dalton Protein und sowohl das 69 000 Dalton Protein als auch den mucinartigen Glycoproteinkomplex, der am Anfang des Polyacrylamidgels unter nichtreduzierenden Bedingungen verbleibt. Bei Reduktion wurde das 69 000 Protein Antigen freigesetzt und wanderte als Duplet mit der Hauptbande bei 69 000 Dalton.
Die Möglichkeit, daß Reduktion lediglich das Mucin wegbricht und so ein physikalisch abgeschiedenes 69 000 Dalton Protein freisetzt, wurde untersucht. HMFG wurden in Puffern gelöst, die 0,3 - 1,0 % Triton x-100, 0,1 % - 2 % SDS, 1 % SDS plus 8M Harnstoff und 6M Guanidinhydrochlond enthalten. Dann wurden HMFG mit Neuraminidase und Endo-N- acetylgalactosaminidase behandelt und ausgiebig beschallt. Keine dieser Verfahren setzten das 69 000 Dalton Protein vom mucinartigen Glycoproteinkomplex frei. Kopräzipitation von BrE3 Antigen mit Antikörper beschichteten Körner zeigte, daß die 69 000 Dalton Bande tatsächlich einen Komplex mit dem Mucin und nicht einer anderen hochmolekulargewichtigen Species gebildet hat. Es scheint daher, daß das 69 000 Dalton Protein kovalent an Mucin durch eine Disulfidbindung gebunden ist.
Der BrE3 monoklonale Antikörper Isotyp wurde durch Verwendung eines Mäuse Immunoglobulin Kits als IgG1 bestimmt.
Der BrE3 monoklonale Antikörper wurde ausgiebig auf die Bindung an histologische Teile getestet, um seine Gewebebindungsspezifität weiter zu charakterisieren. Standardimmunoperoxidase Assay Verfahren wurden für die Bindung an histologische Teile von normalem und kanzerösem menschlichen Gewebe verwendet. Die Gewebe wurden in Form von Multi-Tumorgewebeblöcken zugerichtet, wie von Battifora, H., Lab Invest., 55:244-248 (1986) beschrieben. Jeder Gewebeblock wurde hergestellt aus einer Kollektion von Streifen von fixiertem Geweben, wobei die Gewebe in Peritonealmembran oder Darm gewickelt und in Paraffin eingebettet werden. Die Blöcke wurden dann zur Vorbereitung für die Bindungsuntersuchungen zerschnitten. Auf diese Weise wurde eine große Zahl verschiedener Gewebe mit einer einzigen Färbung bestimmt.
Der Brustblock, der zur Charakterisierung des BrE3 monoklonalen Antikörpers verwendet wurde, enthielt 21 verschiedene Proben normalen Brustgewebes, 22 Adenoma und 33 Brustkarzinome. Der BrE3 monoklonale Antikörper färbte alle untersuchten Testgewebe.
Bei Tests, die durch Immunoperoxidase Färben an Paraffinstücken normaler menschlicher Epithelzellen durchgeführt wurden, wurde gefunden, daß der BrE3 monoklonale Antikörper nicht selektiv an die Oberfläche von menschlichen Brustepithelzellen bindet, ausgenommen unter Bedingungen von relativ hohen Konzentrationen des monoklonalen Antikörpers. Im allgemeinen erkennt der monoklonale Antikörper sekretorisches Material, das im Lumen, vorzugsweise von Gängen, der normalen Brustdrüse vorhanden ist. Es wurde jedoch gefunden, daß der BrE3 monoklonale Antikörper an die Oberfläche von menschlichen Brusttumorzellen intensiv bei auffällig niedrigen Konzentrationen des monoklonalen Antikörpers bindet. Eine solche Bindung des monoklonalen Antikörpers wurde auch im Cytoplasma der untersuchten Brusttumorzellen festgestellt. In einem Vergleichstest von normalen Brustepithelzellen und Brusttumorzellen war beispielsweise die erforderliche Konzentration von monoklonalem Antikörper in bezug auf die Tumorzellen für den Erhalt sinnvoller Ergebnisse mindestens ein Zehntel (1/10) der erforderlichen Konzentration von monoklonalem Antikörper in bezug auf die normalen Brustepithelzellen, um eine Färbung durch den monoklonalen Antikörper festzustellen. Typischerweise werden eine biologische Probe von menschlichen Karzinomzellen, wie Brustkarzinomzellen, die vermutlich BrE3 Antigen enthalten, oder von Karzinomzellen abgeleitete Substanzen, die vermutlich BrE3 Antigen enthalten, mit markiertem BrE3 monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht. Der markierte Antikörper und das Antigen werden für eine Zeitdauer und unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die für die Bildung eines immunologischen Komplexes zwischen dem Antikörper und dem Antigen ausreichen. Der immunologische Komplex wird vom Reaktionssystem getrennt und analysiert, um das Vorhandensein von BrE3 Antigen festzustellen. Der BrE3 monoklonale Antikörper kann so normale menschliche Brustzellen bei hoher Konzentration von monoklonalem Antikörper in der Versuchsprobe färben, doch er wird selektiv und intensiv menschliche Brusttumorzellen bei sogar relativ niedrigen Antikörperkonzentrationen in der Versuchsprobe färben.
Diese Bindungscharakteristik des BrE3 monoklonalen Antikörpers wurde auch auf andere hierin angegebene Ardenokarzinome zutreffend festgestellt.
Der BrE3 monoklonale Antikörper wurde an Paraffinstücken durch Immunoperoxidase Färben von normalen menschlichen Brustepithelzellen untersucht. Im allgemeinen erkannte der BrE3 monoklonale Antikörper sekretorisches Material, das im Lumen, vorzugsweise von Gängen, der normalen Brustdrüse vorhanden ist. Im Gegensatz dazu färbte Brusttumor mit BrE3 monoklonalem Antikörper in vielen Fällen intensiv und in den meisten Fällen im Cytoplasma der Brustkarzinomzellen. Bei den meisten Tumoren war eine Konzentration von BrE3 monoklonalen Antikörpern von mindestens einem Zehntel (1/10) von derjenigen, die zum Färben sekretorischen Materials in Gängen der normalen Brust erforderlich ist, ausreichend für eine intensive Färbung von Brustkarzinomzellen. Der BrE3 monoklonale Antikörper bindet daher nicht selektiv an die Oberfläche von normalen menschlichen Brusttumorzellen, ausgenommen in Fällen hoher Konzentration des Antikörpers in der Testflüssigkeit.
Der BrE3 monoklonale Antikörper wurde auch an einer umfangreichen Reihe von verschiedenen normalen und Tumorgeweben, andere als normales Brustgewebe oder Brustkarzinom, getestet. Der BrE3 monoklonale Antikörper band an normales Gewebe der Alveolarzellen der Lunge, der distalen Konvoluttubulen der Niere, des Acinusepithels der Bauchspeicheldrüse und der gesamten Dicke der Magenschleimhaut. Der BrE3 monoklonale Antikörper band nicht an normales Gewebe von Nebenniere, Gehirn, Blase, Dickdarm, Speiseröhre, Lymphknoten, Herzmuskel, Muskel, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Eierstock, Mesothel und Leber.
Der BrE3 monoklonale Antikörper band an zahlreiche Adenokarzinome. Eine Kombination von Apicalmembranfärbung und Cytoplasmafärbung wurde festgestellt bei der Mehrzahl von Adenokarzinomen. Der BrE3 monoklonale Antikörper band an eine Mehrheit von Adenokarzinomen der Brust, Lunge, Eierstöcke, Blase, Gebärmutter, des Magens und Mesothels. Der BrE3 monoklonale Antikörper band an eine geringe Zahl von Adenokarzinomen des Dickdarms, der Niere, der Leber, des Lymphknotens, der Merkelzellen, der Bauchspeicheldrüse, der Ohrspeicheldrüse, des Rhabdosarkoms, der Speicheldrüse, des Sarkoms und der Schilddrüse. Der BrE3 monoklonale Antikörper band auch an Tumore der Zervix und des Kehlkopfes.
Eine Probe der Hybridzellinie, die den BrE3 monoklonalen Antikörper zu produzieren vermag, ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 seit 7. Februar 1989 hinterlegt und ist mit A.T.T.C. No. HB 10028 bezeichnet.
Der BrE3 monoklonale Antikörper ist außergewöhnlich wegen seiner außerordentlichen Spezifität für eine Antigen Determinante eines mucinartigen Glycoprotein Komplexes mit sehr hohem Molekulargewicht, der an der Oberfläche und im Cytoplasma von Brustkarzinomzellen vorhanden ist und keine Spezifität für normales Gewebe von Nebenniere, Gehirn, Blase, Dickdarm, Speiseröhre, Lymphknoten, Herzmuskel, Muskel, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Eierstock, Mesothel und Leber exprimiert. Demzufolge kann der BrE3 monoklonale Antikörper in verschiedenen Richtungen nützlich sein. Er kann als eine Komponente eines "Cocktails" von Anti-Brust Antikörpern verwendet werden, von denen jeder unterschiedliche Bindungsspezifitäten aufweist. Da der Cocktail aus monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlicher Zell- und Gewebespezifität besteht, ist er für die Brustkarzinom Diagnose und Therapie sowie die Untersuchung von Zelldifferenzierung und Zelltypspezifität brauchbar. Der BrE3 monoklonale Antikörper kann beispielsweise mit einem erkennbaren Marker, wie einem Farbstoff, fluoreszierenden Molekülen oder einem radioaktiven Markierstoff für die Tumordarstellung markiert werden. Ein geeigneter Markierungsstoff ist Jod¹³¹, Indium¹¹¹ oder Technetium&sup9;&sup9;. Der BrE3 monoklonale Antikörper kann therapeutisch sowohl in konjugierten als auch in unkonjugierten Formen in einem Cocktail verschiedener monoklonaler Antikörper oder separat verwendet werden. Geeignete Konjugate für den BrE3 monoklonalen Antikörper umfassen chemotherapeutische Medikamente, Toxine oder Radioisotope. Radioisotope, wie Jod¹³¹, können direkt mit dem BrE3 monoklonalen Antikörper konjugiert sein. Radioisotope, wie Indium¹¹¹ oder Yttrium&sup9;&sup0;, können indirekt mit dem BrE3 monoklonalen Antikörper durch Verwendung von Chelatbildnern oder durch andere bekannte Mittel konjugiert sein. Der konjugierte oder unkonjugierte BrE3 monoklonale Antikörper kann in einem Cocktail monoklonaler Antikörper oder in separat dosierter Form zugesetzt werden.
Beispiele von monoklonalen Antikörpern, die in einem solchen Cocktail monoklonaler Antikörper verwendet werden können, sind in der WO-A-89/07268, veröffentlicht am 10. August 1989, und der WO-A-90/02333, veröffentlicht am 8. März 1990, die eine gemeinsame Inhaberschaft genießen, geoffenbart.
Immunoassay, bei welchem Mikrokügelchen in Verbindung mit darauf aufgebrachten und entsprechend gekennzeichneten oder markierten Antigenen oder Antikörpern verwendet werden, können für in vitro diagnostische Anwendungen mit dem BrE3 monoklonalen Antikörper eingesetzt werden. Die Kennzeichnungen oder Markierungen können variiert werden, wie hierin und im Stand der Technik erörtert. Für in vitro Anwendungen kann der BrE3 monoklonale Antikörper in Begleitung anderer Bestandteile in einem Assaykit vorgesehen werden zur Vervollständigung des Assays einer biologischen Probe beispielsweise gemäß den Assayinstruktionen in der Einleitungsliteratur. Das gleiche kann geeignet sein für in vivo Anwendungen sowohl für diagnostische als auch therapeutische Zwecke. Der Assay kann mit durchflußzytometrischen Verfahren zur Untersuchung von Zelldifferenzierung und Zellspezifität verwendet werden. Der BrE3 monoklonale Antikörper kann auch als prognostisches Werkzeug in der Histopathologie von Tumoren verwendet werden, um beispielsweise das Resultat der Malignität, die Wahrscheinlichkeit der Streuung des Malignoms oder das Stadium des Malignoms festzustellen. Diese Beispiele von in vitro und in vivo Anwendungen sollen nicht dafür gehalten werden, andere Anwendungen der Verwendung des BrE3 monoklonalen Antikörpers auszuschließen.

Claims

1. Durch Hybridomtechnik hergestellte Zellinie, die einen monoklonalen, auf eine einzige antigene Determinante spezifischen Antikörper produziert, welche Determinante an der Oberfläche und im Cytoplasma menschlicher Brustkarzinomzellen und Zellen anderer Adenokarzinomen vorhanden ist, wobei diese Determinante an einem Glycoproteinkomplex mit einem Molekulargewicht über 400 000 Dalton exprimiert ist, und welche Zellinie bei A.T.C.C., Hinterlegungsnummer HB 10028, hinterlegt ist.

2. Zellinie nach Anspruch 1, worin die den monoklonalen Antikörper produzierenden Zellen Hybridomazellen sind, die aus mit enfetteten menschlichen Milchfettkügelchen immunisierten Milzzellen von der Maus hergestellt werden.

3. Zellinie nach Anspruch 1, worin die den monoklonalen Antikörper produzierenden Zellen Hybridomazellen sind, die aus mit normalen ganzen menschlichen Milchfettkügelchenmembranen immunisierten Milzzellen von der Maus hergestellt werden.

4. Zellinie nach Anspruch 1, worin die den monoklonalen Antikörper produzierenden Zellen Hybridomazellen sind, die aus mit Komponenten normaler menschlicher Milchfettkügelchen immunisierten Milzzellen von der Maus hergestellt werden.

5. Zellinie nach Anspruch 1, worin der monoklonale Antikörper keine Bindungsspezifität an normale Epithelzellen hat, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Nebenniere, Gehirn, Blase, Dickdarm, Speiseröhre, Lymphknoten, Herzmuskel, Muskel, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Eierstock, Mesothel und Leber.

6. Zellinie nach Anspruch 1, worin der monoklonale Antikörper spezifisch bindet an normale Epithelzellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alveolarzellen der Lunge, distale Konvoluttubulen der Niere, Acinusepithel der Bauchspeicheldrüse, Magenschleimhaut.

7. Zellinie nach Anspruch 1, worin der monoklonale Antikörper spezifisch bindet an Epithelzellen von Adenokar zinomen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenokarzinomen der Brust, Lunge, Eierstöcke, Blase, Gebärmutter, des Magens und des Mesothels.

8. Monoklonaler Antikörper, der spezifisch an eine antigene Determinante bindet, die durch den mittels A.T.T.C. Hybridoma Hinterlegungsnummer HB 10028 produzierten monoklonalen Antikörper identifiziert ist, welche antigene Determinante an einem Glycoproteinkomplex hohen Molekulargewichts von menschlichen Brustkarzinomzellen vorhanden ist und welcher monoklonale Antikörper wie folgt gekennzeichnet ist:

a) er bindet an diese antigene Determinante, die an diesem Glycoproteinkomplex hohen Molekulargewichts exprimiert ist, der ein Molekulargewicht über 400 000 Dalton, bestimmt mittels Elektrophorese an dem Antigen und durch Vergleich seiner Wanderung mit derjenigen von Markerproteinen bekannten Molekulargewichts, aufweist;

b) diese antigene Determinante ist an der Oberfläche und im Cytoplasma von Brustkarzinomzellen exprimiert;

c) sie ist vom IgG1 Mausisotyp.

9. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 8, worin der monoklonale Antikörper keine Bindungsspezifität an normale Epithelzellen hat, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Nebenniere, Gehirn, Blase, Dickdarm, Speiseröhre, Lymphknoten, Herzmuskel, Muskel, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Eierstock, Mesothel und Leber.

10. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 8, worin der monoklonale Antikörper spezifisch bindet an normale Epithelzellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alveolarzellen der Lunge, distale Konvoluttubulen der Niere, Acinusepithel der Bauchspeicheldrüse, Magenschleimhaut.

11. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 8, worin der monoklonale Antikörper spezifisch bindet an Epithelzellen von Adenokarzinomen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenokarzinomen der Brust, Lunge, Eierstöcke, Blase, Gebärmutter, des Magens und des Mesotheis.

12. Monoklonaler Antikörper hergestellt aus der Hybridomazellinienprobe, die bei der American Type Culture Collection hinterlegt und der die A.T.C.C. Hinterlegungsnummer HB 10028 zugeordnet ist.