JPH04502327A - 水溶性ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水溶性ポリペプチドの製造方法 本発明はフンブレックスの可溶性受容体の製造に関する。さらに詳しくは、本発 明は細胞マトリックスまたは血漿タンパク質の組換え受容体の合成に関する。

細胞膜は脂質二重層に存在するポリペプチドを含有している。このようなポリペ プチドは、細胞膜にタンパク質を固定するドメイン、１水性のトランスメンブラ ンドメインを、多くの場合、ｃ−末端細胞質配列と共に含有している。通常、こ れらのポリペプチドは１本鎖の分子であるか、または翻訳後のタンパク質加水分 解プロセッシングによって元の１本鎖発現産物から導かれる複数鎖の分子である 。

このような複数鎖のポリペプチドは、ジスルフィド結合によって共有結合してい るのが普通である。しかし、これらポリペプチドの一部は、塩架橋、ファン・デ ル・ワールスカ、疎水性の相互作用などによって互いに非共有結合しており、こ のような場合にはポリペプチドサブユニットのさらに大きな集合体への会合か生 物学的活性のための前提条件である。

このような膜結合した複数サブユニット分子の生物学的活性は異なるが、通常は 受容体または結合機能を反映する。受容体は細胞の外部環境中の物質または状態 を考慮して細胞にシグナルを送るのに役立つか、細胞外物質を内部化するのに役 立つか、または細胞を互いに、細胞外マトリックス物質、細胞表面もしくは血漿 タンパク質に結合させるように機能する。

別のサブクラスに属する膜結合の複数サブユニットのポリペプチドは、それぞれ のサブユニットが異なっており、即ち実質的にホモローガスではな（、別個の遺 伝子によってコードされているポリペプチドである。このようなポリペプチドを 、本発明の目的のためにｒＭｓＰＪ（ｉ数すブユ１ットボリペプチド）と呼ぶ。

このようなポリペプチドまたは受容体の多数の例が知られているが、最も重要な 群は細胞外マトリックス分子のための細胞表面受容体のクラスであリ、その一部 は現在同定されており、それをコードしているＤＮＡがクローニングされている ［例えば、Ｂ　ｕｃｋら＋　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

３：　１７９（１９８７）およびＲｕｏｓｌａｈｔｉら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ３８：　４９１（１９８７）を参照］。

特に重要なものは、血小板糖タンパク質１１ｂ−１１１ａ、即ち、血小板凝集に 関与しており、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびフ ォノ・ビレブランド因子に結合する血小板膜結合受容体である。この受容体を構 成する２つのサブユニットが同定されている［Ｆ　ｉｔｚｇｅｒａｌｄら、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６：　８１５ｇ（１９８７）およびＦ　ｉｔｚｇｅ ｒａｌｄら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２（９）：　３９３６（１９８７） コ。Ｂ　ｅｎｎｅｔｔらはＣｏ５−１細胞でのＧ　Ｐ　Ｉｌｂサブユニットの発 現を報告したが、このサブユニットは細胞膜上に見い出されなかった［Ａ　ＨＡ 第６１回科学会議；　１９８８年１１月１５日］。Ｂ　ｅｎｎｅｔｊらは、膜局 在化が１ｌｂ−１１１ａコンプレツクスの形成を必要としているのかもしれない と示唆した。

組換えの膜結合Ｇ　Ｐ　１ｌｂ−１１１ａを調製することができたなら、それは その適切なリガンド（例えば、フィブリノーゲン）に結合するであろうと教示ま たは示唆するものはなかった。さらに、同じ会議におけるＦ　ｒｅｌｉｎｇｅｒ らの口頭発表は、未同定の組換え細胞表面での完全長Ｇ　Ｐ　ｌ１ｂｉＩｌａの 一時的な発現を示すものと主張したが、発表のように発現が得られた方法に関す る他の情報は提供されなかった。

Ｃｏｒｂｉらは、１９８８年９月のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ により後援されたＴｉｔｉｓｅｅ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍにおいて、ＣＯＳ細胞に おける機能的な完全長Ｌ　Ｆ　Ａ−１の一時的な発現を口頭で報告した。

膜結合のＭＳＰは、疎水性のドメインがＭＳＰをミセルまたは集合体に誘導する 傾向があるので、精製および安定性に困難を与える。

適切なヘテロニ量体の組立て以上に複数分子集合体を形成することなく、特に血 液などの体液中、および食塩水などの薬理学的担体中で可溶性である形態のこれ ら受容体が必要とされている。即ち、本発明の目的はこのようなＭＳＰ形態を合 成することである。

別の目的は、通常のリガンドを適切に結合することができる可溶形態のＧ　Ｐ　 １ｌｂ−１１１ａ受容体を得ることである。

さらに別の目的は、組換え細胞培養においてＧＰ目１ａを発現させることである 。

また、別の目的は、組換え細胞培養によってＧ　Ｐ　ｌ１ｂ−１１１ａを高収率 で製造することである。

これらおよびその他の目的は本出願の全体を考慮することによって明らかとなろ う。

本発明によれば、細胞膜結合の複数サブユニットポリペプチド（ＭＳＰ）（その 各サブユニットは別個の遺伝子によってコードされている）の分泌型類似体を製 造するための方法であって、（１）サブユニットのそれぞれをコードしている核 酸中に、ＭＳＰがもはや脂質二重層にとどまることができないようにするＭＳＰ のアミノ酸配列変異体をコードしている突然変異を導入し、（２）工程（１）の 核酸で宿主細胞をトランスフェクションし、（３）工程（２）の宿主細胞を培養 し、そして（４）この宿主細胞培養物から生物学的に活性な可溶性ＭＳＰを回収 する、 ことを特徴とする方法が提供される。また、本発明によれば、インテグリン鎖の アミノ酸配列変異体、特に、インテグリン鎖のトランスメンブランドメインが修 飾されており、従ってもはや細胞膜にとどまることができない変異体をコードし ている核酸および発現ベクターが提供される。

また、Ｇ　、Ｐ　ｌ１ｂ−［１ａの製造方法であって、Ｇ　Ｐ　ｒｌｂ−１１１ ａをコードしている核酸で許容宿主細胞を形質転換し、そしてＧ　Ｐ　１ｌｂ− １１１ａが細胞膜に蓄積するまでこの宿主細胞を培養することを特徴とする方法 が提供される。

特定の態様においては、本発明の目的は、（ａ）不活性化された膜アンカードメ インを有するＭＳＰのアミノ酸配列変異体、および （ｂ）ＭＳＰとは異なるポリペプチド（これは、例えば免疫グロブリンの不変ド メインなどの長い血漿半減期を有するタンパク質または免疫原から選ばれる）の 配列に融合したＭＳＰの細胞外ドメインを含有するポリペプチド、 からなる群から選ばれる生物学的に活性なＭＳＰのアミノ酸配列変異体を提供す ることによって達成される。

別の態様においては、ＭＳＰまたは本明細書の別のところに記載するＭＳＰ類似 体のＭＳＰアミノ酸残基または炭水化物置換体を、共有結合修飾によって誘導体 化するか、またはポリエチレングリコールなどの非タンパク質性ポリマーにコン ジュゲートさせて、改善された循環半減期を示すＭＳＰ誘導体を製造する。

具体的な態様においては、インテグリンの生物学的に活性な細胞外ドメインを含 有するポリペプチドをそのＣ〜末端のところで免疫グロブリンの不変ドメインに 融合させるか、または免疫原性ポリペプチドに連結する。

本発明で提供されるＭＳＰ変異体を精製し、診断もしくは調合用に薬理学的に許 容しうる担体中に配合する。

図１　ａ〜１　ｒは、Ｍ　Ｓ　Ｐ　Ｇ　Ｐ　１ｌｂ−１１１ａの分泌型のＧＰＩ ｌｂサブユニットのアミノ酸およびヌクレオチド配列を示すものである。このサ ブユニットの重および軽形態のシグナルプロセッシング部位をそれぞれ矢印−Ｈ および矢印−して示す。

図２ａ〜２ｄは、ＭＳ　Ｐ　Ｇ　Ｐ　ｌ１ｂ−１１１ａの分泌型のＧ　Ｐ　ｌ１ ｌａサブユニツトのアミノ酸およびヌクレオチド配列を示すものである。シグナ ルプロセッシング部位は矢印で示されている。

図３は、Ｇ　Ｐ　１ｌｌａ遺伝子の５′末端のところで天然および再設計核酸配 列を比較するものである。

本明細書においてＭＳＰとは、その少なくとも１つの鎖が通常は細胞膜に固定さ れており、そしてその少な（とも２つの鎖が別個にコードされている複数鎖のポ リペプチドと定義される。通常、ＭＳＰは少なくとも２つの独立した鎖を含有し ており、その２つは細胞膜中に直接入っている。通常は細胞膜中に入っているＭ ＳＰ鎖に１またはそれ以上の別の鎖が共有結合または非共有結合していてもよい が、この別の鎖はそれ自体が膜中に固定されるものであってはならない。通常、 このような鎖は、膜固定されることになる１本鎖の翻訳後プロセッシングによっ て得られる。別個にフードされているサブユニットは単一の翻訳されたタンパク 質の翻訳後プロセッシングによって得られるものではなく、それらのアミノ酸配 列はホモローガスではなく（即ち、このサブユニットの配列は同一ではない）、 また、天然において同一ポリペプチドの二量体または多量体に組立てられないも のである。それとは異なり、これらは独立したｍＲＮＡまたはポリシストロン性 メツセージの翻訳によって産生される。

即ち、複数のＭＳＰポリペプチドをコードしている複数の核酸は、天然において は異なるプロモーターおよび他の転写コントロール配列の制御下で見い出される のが普通である。ＭＳＰには、細胞付着受容体とも定義される細胞外マトリック ス分子に対する細胞表面受容体が主として含まれる。多数のこれら受容体および それらのリガンド（これらリガンドにはフィブリノーゲンなどの血漿タンパク質 および細胞外マトリックス分子が含まれる）ならびに細胞表面タンパク質（１− ＣＡＭなど）が、傷治癒、形態形成移動、発生とは無関係の細胞移動、止血およ び転移に関与している細胞付着現象の中心をなしている。これらの細胞付着受容 体は機能的および構造的特徴によって識別されている。機能的には、通常、これ ら受容体は配列ＲＧＤを含むポリペプチドに結合し、ペプチドＲＧＤＳまたはＲ ＧＤＶなどのＲＧＤ配列を含有する他のポリペプチドとの競合によってそれから 解離する。また、これらはリガンド結合のためにカルシウムなどの２価のカチオ ンを必要とすることが多い。ＭＳＰには、Ｔ細胞受容体などの免疫グログリン上 材の構成員が含まれることもあるし、また含まないこともある。細胞表面の細胞 内付着相互作用に関与しているＭＳＰの群はインテグリンと呼ばれている［Ｂ　 ｕｃｋら。

Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　３．：　１７９−２０５（１９８７） を参照］。

構造的には、このような細胞付着受容体は、第１の１本鎖ポリペプチドまたはジ スルフィド架橋した複数鎖ポリペプチド（α−鎖）が第２の別のポリペプチド（ β−鎖と呼ぶ）と非共有結合によって会合してそれによってヘテロマルチマーを 形成している超遺伝子族のマルチマーに属する。これら受容体のα−鎖はそれら のアミノ酸配列に関しては全く異なっており、鳥類インテグリン（バンドｌ）の αサブユニット；ＶＬＡＩ、２および４のα１、α、およびα４；鳥類インテグ リン（バンド２）およびＶＬＡ３のα３；フィブロネクチン受容体およびＶＬＡ ５のａ＋−＋ＬＦＡ−１のａ　Ｌ　；　Ｍａｃ−１のａｓ：　ｐ　１５０，９５ のα、；ＧＰＩｌｂのα□α、；ならびにビトロネクチンのα９が含まれる。通 常、β−鎖は３つの群、即ちβ汀鳥類インテグリン（ノンド３）；フィブロネク チン受容体およびＶＬＡ］、βｔ［ＬＦＡ−１／Ｍａｃ−１；　ｐｌ　５０．９ ５］およびβ３（Ｇ　Ｐ　１ｌｂ−１１１ａおよびビトロネクチン受容体）に分 類され、それぞれのβ群の構成員は実質的にホモローガスであるか、または同一 である。選択したＭＳＰが、天然では互いに会合しているのがＷ２Ｎである２つ （またはそれ以上）の鎖を含んでいるのが好ましいが、これは非天然のヘテロマ ーがコンプレックスを形成しないと推定されるためである。

ＭＳＰのそれぞれの鎖はその天然の環境下で分泌シグナルを含有するプレタンパ ク質として発現され、これが受容体の細胞外配向の間にプロセッシングされる。

また、それぞれのサブユニットの少なくとも１つの鎖は、ポリペプチドのＣ−末 端部分に位置して約１０〜３０個の疎水性の高い残基（ｐｈｅ、　ｌｅｕ、　ｉ ｌｅ、　ｖａｔ、ｌ１ｌｅｔｓ　ｇｌｙおよびａｌａなど）を含有するドメイン 、または脂質（例えば、リン脂質）の共有結合付加のための部位として働くポリ ペプチド配列を含有する疎水性のアンカーを有しているであろう。このような膜 アンカー配ハ列またはドメインは、本明細書ではまとめて膜アンカードメインと 呼ぶ。通常、１０−１００残基のオーダーの短い親水性の細胞質ドメインがトラ ンスメンブランドメインのＣ−末端に見い出される。

サブユニットなる用語はポリペプチド鎖を意味するものと理解されるべきであり 、あるポリペプチド鎖のドメインまたは機能的なサブ領域を指すものではない。

ある種のＭＳ、Ｐは他の構造的特徴を共有している。例えば、ある受容体のサブ ユニットはシスティンに富む直列のアミノ酸配列反復（ここでは、約８０％以上 のシスティン残基がＣＰ　ｌ１ｌａの約２残基のシスティン残基の直列反復内に 並べられる）を含んでおり、また、あるサブユニットはコンセンサスＮ−末端配 列Ｔ　ｙｒ／　Ｐ　ｈｅ／　Ｌ　ｅｕ−Ａ　５ｎ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｐを有して いるが、またはあるサブユニットはカルモジニリンのカルシウム結合部位に実質 的な配列相同性を有するアミノ酸ドメインを含有している。

さらに、インテグリン上材の上記構成員にホモローガスな受容体がＭＳＰの範囲 内に含まれる。本明細書で定義するホモローガスなる用語は、インテグリン上材 の既知構成員に対して少なくとも実質的に同一のアミノ酸配列の相同性を有する （あらゆる現在既知の構成員があらゆる他の既知の構成員に対して有しているよ うに）インテグリン上材の構成員のポリペプチド配列を有することを意味する。

通常、ホモローガスとは、保存性の置換を考慮に入れることなく最大の相同性が 得られるように配列を並べた後に、約４０％以上のアミノ酸の相同性を有するこ とを意味する。

本発明はその一部には、独立してコードされているＭＳＰが、宿主細胞膜中に挿 入するその能力を削除するように修飾されたときに、なお組換え宿主細胞によっ て完全に組立てられ、生物学的に活性な形態で分泌されるという発見に基づいて いる。サブユニットの適切な会合がもはや細胞膜における並置によって促進され ないにもかかわらず、組換え宿主細胞は互いに正しく会合したサブユニットを分 泌し、この組立て物は天然ＭＳＰの細胞外ドメインの生物学的活性を示す。さら に、このＭＳＰ配列がマルチマー形成ポリペプチドに融合されていないときであ っても適切な組立てが得られた。即ち、外性の架橋ポリペプチド（免疫グロブリ ン鎖など）の助けがないときであってもＭＳＰが正しく会合することが見い出さ れた。

生物学的活性は、天然環境においてＭＳＰが通常結合するリガンドに定性的に結 合する、分泌型ＭＳＰの能力の点で定義されるが、分泌型ＭＳＰによるリガンド 結合の動力学またはその他の量的な性質が天然細胞結合ＭＳＰのものとは異なっ ていることもあることは理解されよう。分泌型のＭＳＰは天然ＭＳＰに対して生 成させた抗体と交差反応することができる多数の機能的な免疫エピトープを保持 している可能性が高いが、分泌型のＭＳＰが本明細書で定義する生物学的活性を 示すものとするにはこれだけでは不十分である。即ち、「生物学的活性コな分泌 型のＭＳＰは、そのリガンドに結合する能力も同様に示さなければならない。し かし、本発明に従って製造されるＭＳＰのすべてが、本明細書で定義した意味に おいて生物学的活性を示す必要がある訳ではないことは理解されよう。このよう な生物学的には不活性であるが、しかし例えば免疫学的に活性なＭＳＰ類似体は 、診断検定において、ＭＳＰに対する抗体の生成において、またはＭＳＰに対す る抗体の精製において用途が見い出される。

本発明は、特にＭＳＰのアミノ酸配列変異体に関する。ＭＳＰのアミノ酸配列変 異体は考慮される種々の目的で調製され、これには、ＭＳＰのその結合相手に対 する親和性の増大、？ｖ！ＳＰの安定性、精製および調製の容易化（水溶性の増 大および膜親和性の減少を含む）、その血漿半減期の増大、上記のような治療効 率の改善、追加の機能の導入、およびＭＳＰを治療に用いたときの副作用の重さ もしくは発生の軽減などが含まれる。ＭＳＰのアミノ酸配列変異体は、挿入、置 換または削除変異体の１つまたは組合せに分類される。それぞれのＭＳＰ変異体 または類似体は１つの不活性化された膜アンカードメインを有しており、これは 挿入、置換または削除によって達成されるであろうが、これらの変異体は所望に より天然ＭＳＰの１つの鎖の膜アンカードメインを不活性化すること以外のこと に関係している別の突然変異を含んでいることもある。

挿入アミノ酸配列変異体は、ＭＳＰに対して外性の１またはそれ以上のアミノ酸 残基がＭＳＰ中の予め決めた部位（ＣまたはＮ末端を含む）に導入されているも のである。このような変異体は、挿入された位置にＭＳＰにおいて通常見い出さ れる配列以外の配列を含むポリペプチドとＭＳＰの融合体と呼ばれる。いくつか の群の融合体が本発明において意図されている。

免疫学的に活性なＭＳＰ融合体は、非ＭＳＰエピトープを含有するポリペプチド とＭＳＰからなる。この非ＭＳＰエピトープは任意の免疫学的にコンピテントな ポリペプチドである。即ち、融合体を投与しようとしている動物において免疫反 応を誘導することができるか、または非ＭＳＰポリペプチドに対して生成させた 抗体と結合することができるあらゆるポリペプチドである。代表的な非ＭＳＰエ ピトープはアレルゲン、自己免疫エピトープ、または他の強力な免疫原もしくは 抗原（融合体の投与を受けるものに予め存在する抗体によって認識される）が保 持しているものであり、これには細菌性ポリペプチド（例えば、ｔｒｐＬ　Ｅ　 、β−ガラクトシダーゼ）、ウィルス性ポリペプチド（例えば、ヘルペスｇＤタ ンパク質）などが含まれる。免疫原の融合体は、免疫原ポリペプチドをフードし ているＤＮＡで形質転換された組換え細胞培養によって、またはインビトロの架 橋によって調製される。この免疫原の融合体は、免疫原性配列がペプチド結合に よってＭＳＰまたはそのフラグメントに結合または挿入された融合体であるのが 好ましい。従って、これらの産物は、ＭＳＰエピトープとＭＳＰに対して外性の 少な（とも１つのエピトープを含有する直線状のポリペプチド鎖からなる。これ らエピトープをＭＳＰ分子またはそのフラグメント中のどこかに導入することが 本発明の範囲内にあることは理解されよう。このような融合体は組換え宿主細胞 において、または２官能性の架橋剤を使用することによって調製するのが好都合 である。架橋剤を用いてＭＳＰを免疫原性ポリペプチドに融合させるのは、この 架橋産物を構造的に均質な形態で合成するのが容易ではないので、直線状の融合 体はどには望ましいものではない。

これらの免疫原挿入体は、薬理学的に許容しうる担体中に配合され、ＭＳＰに対 する抗体を生成させるために対象に投与されたときに特に有用であり、次いでこ れらの抗体は診断において、または自体既知の免疫アフィニティー法によるＭＳ Ｐの精製において有用となる。別法では、ＭＳＰの精製において、融合した非Ｍ ＳＰポリペプチドの結合相手（例えば、抗体、受容体またはりガント）を用いて 不純な混合物から融合体を吸着させ、次いでこの融合体を溶離し、そして所望な らＭＳＰを例えば酵素切断などによって融合体から回収する。

免疫学的に活性であってもよいし、また活性でなくてもよいその他の融合体には 、成熟ＭＳＰ配列とＭＳＰに対して異種のシグナル配列との融合体、トランスメ ンブラン修飾されたＭＳ　Ｐ（このＭＳＰが細胞膜にとどまれないようにする配 列の削除または修飾を含む）と例えば高められた血漿半減期（通常は〉約２０時 間）を有するポリペプチド（高められた血漿半減期を与える免疫グロブリン鎖ま たはそのフラグメントなど）との融合体が含まれる。

シグナル配列との融合は、ＭＳＰの分泌を一層迅速にするために行われる。異種 のシグナルを天然のＭＳＰシグナルと置換し、得られた融合体が宿主細胞によっ て認識、即ちプロセッシングされ、切断されたときに、ＭＳＰが分泌される。シ グナルは意図している宿主細胞に基づいて選択され、これには細菌、酵母、哺乳 動物およびウィルス配列が含まれる。天然のＭＳＰシグナルあるいはヘルペスｇ Ｄ糖タンパク質シグナルが哺乳動物発現系で使用するのに適している。

修飾された膜アンカードメインを有する可溶型のＭＳＰの血漿半減期よりも長い 高められた血漿半減期を有する血漿タンパク質には、血清アルブミン、免疫グロ ブリン、アポリポタンパク質、およびトランスフェリンが含まれる。融合に使用 されるＭＳＰ−血漿タンパク質は、それが使用される動物において免疫原性が有 意なものではなく（即ち、治療対象に対してホモローガスであり）、また、この 血漿タンパク質はその正常な生物学的活性の故に患者に望ましくない副作用を引 き起こすものではないのが好ましい。

ある具体的な態様では、ＭＳＰの細胞外ドメインを免疫グロブリンの不変領域配 列とコンジュゲートさせる。免疫グロブリンおよびそのある種の変異体が既知で あり、多数が組換え細胞培養において調製されている。例えば、米国特許４，７ ４５，０５５．　ＥＰ　２５６，６５４；　Ｆａｕｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ 　２９ｇ＋　２８６（１９ｇ２）；　Ｅ　Ｐ　１２０，６９４；　Ｅ　Ｐ　１２ ５，０２３；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、１２３：　７９３（１９ ７９）：　Ｋｄｈｌｅｒら、Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　ＵＳＡ　７７：　２１９ ７（１９１１ｔＯ）ＨＲａ５ｏら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４１：　２０７３（ １９８１）；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎら＊　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、ＩｍｍｕｎＯｌ、２： 　２３９（１９８４）；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、５ｃｉｅｎｃｅ２２９：　１２ ０２（１９８５）；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、ＵＳＡ　８１：　 ６８５１（１９８４）；Ｅ　Ｐ　２５５．６９４；　Ｅ　Ｐ　２６６．６６３； およびＷｏ　８８１０３５５９を参照。また、再分類された免疫グロブリン鎖も 既知である。例えば、米国特許４゜４４４．８７８：　Ｗｏ　８８／（１３５６ ５；およびＥＰ　６ｇ、７６３ならびニコれらに引用された文献を参照。さらに 、Ｇ　ａｓｃｏｉｇｎｅら、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、ＵＳＡ　８４：　２９３６−２ ９４０（１９８７年５月）；　ＥＰ　３２５，２２４；およびＡｎｄｒｅｗ　５ ｃｏｔｔ　Ｐｅｔｅｒｓｏｎの論文（Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ； 　１９８８年１１月２２日に学位が与えられた）をも参照。

通常、ＭＳＰの細胞外ドメインはそのＣ−末端で、免疫グロブリンの不変領域の Ｎ−末端にその可変領域の代わりに融合しており、免疫グロブリン重鎮の不変領 域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは保持して いる。２種類の形態のこのような融合体が本発明に包含されている。その１つに おいては、２またはそれ以上の通常の膜結合ＭＳＰ鎖の細胞外ドメインがＮまた はＣ末端で免疫グロブリンネ変領域に融合しており（ペテロ融合）、一方、他の 形態では、ＭＳＰの１つの鎖だけが不変領域に融合している（モノ融合）。この ペテロ融合には、軽もしくは重鎮不変領域のいずれか、または両者との融合が含 まれる。このペテロ融合体は、軽鎖融合体、重鎮融合体または両者をコードして いるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することによって得られる。例えば、重鎮不変 領域に融合させた１つのＭＳＰ鎖と軽鎖不変領域に融合させた他のＭＳＰＭをコ ードしているＤＮＡでトランスフェリンタンすると、ＭＳＰ鎖との軽および重鎖 融合を有するヘテロ四量体またはへテロニ量体が得られよう。これらは生物学的 に活性である可能性がそれほど高くないので、モノ融合はどには望ましくない。

モノ融合体は１を越える融合鎖を含有することもできるが、この場合にはＭＳＰ 鎖は常に同一のサブユニットに由来するであろうことに注意すべきである。

モノ融合体は免疫グロブリン変異体であり、ＭＳＰの１つの鎖が重または軽鎖（ またはその不変ドメイン）に融合しているが、ＭＳＰの残りの鎖が免疫グロブリ ンに融合しておらず、代わりに、実質的に天然ＭＳＰの場合に普通であるような 方法で融合鎖と会合している。通常、モノ融合体中の融合および非融合ＭＳＰ鎖 の両者は、膜アンカードメインが膜中に存在しないように修飾された変異体であ り、最も普通には、１つのＭＳＰ鎖の膜アンカードメインが削除され、他方の膜 アンカードメインが削除されて次いで残存する細胞外領域がそのＮ−末端で免疫 グロブリンネ変ドメインのＣ−末端に融合している。このＭＳＰ鎖またはそのフ ラグメントは軽鎖または重鎮のいずれかに融合しているが、重鎮に融合している のが好ましい。

ＭＳＰが１つの膜アンカードメインだけを含有しているときには、残りの鎖は通 常その天然の配列を有しているであろう。

免疫グロブワンの抗原結合能力ならびにＭＳＰリガンドに結合する能力を有する モノまたはポリ融合体を得るのが望ましいこともある。このような産物は、抗原 と結合することができる軽および重鎖（または、それまでに軽鎖を産生ずるよう に選択される）を軽および／または重鎖ＭＳＰ融合体および非融合ＭＳＰ鎖（モ ノ融合体の場合）と共にコードしているＤＮＡで宿主細胞を形質転換することに よって調製される。これによって、例えば免疫グロブリンの一方または両方の軽 −重アームがＭＳＰの１つの鎖との融合からなり、次いでこれがＭＳＰの残りの 鎖と組立てられる（共有結合または非共有結合によって）ことを除いて免疫グロ ブリンの正常な構造を有する構築物が得られるであろう。

融合形質転換体がＭＳＰサブユニットに融合していない免疫グロブリン鎖をも産 生ずる（または、産生ずるように形質転換される）場合には、この免疫グロブリ ンの可変ドメインはある抗原に対して未知または既知の特異性を有していてよい 。宿主細胞は構成的に未決定の抗体を調製することができないものであって、抗 体を産生ずるときには既知の免疫グロブリンをコードしているＤＮＡによる形質 転換によってであるものが好ましい。このような免疫グロブリン（重鎮ならびに 軽鎖の両方を含んでいてもよい）は、既知の抗原に対して特異性を示す。別法で は、これらのコンパニオン免疫グロブリン鎖は、機能的な可変または超可変ドメ インを欠いているであろう（マルチマーの組立ては可能であるが、抗原結合活性 はないように）。

例えば、無傷の重および軽鎖コンパニオン免疫グロブリンを発現しつる宿主細胞 から分泌され、回収することができる生成ＭＳＰ融合体は、抗原結合機能とＭＳ Ｐ機能を保持しているであろう。このような産物はＭＳＰリガンドと任意の所望 の抗原との架橋を容易にするであろう。宿主細胞は、そのような多重形質転換に おいて１を越える免疫グロブリン産物を調製し、従って、あるマルチマー形態を 他の形態から回収することが必要となろう。しかし、これはＭＳＰリガンド、抗 原もしくはその両方に基づくアフィニティークロマトグラフィーによる、または ゲルもしくは他のクロマトグラフィー法による分離を必要とする通常の必要事項 であろう。

免疫グロブリン鎖の代わりにトランスフェリン、アルブミン、アポリポタンパク 質またはその他の配列を用いることを除き、延長された血漿半減期を有する他の タンパク質を同様の方法でＭＳＰに融合する。通常はマルチマーに組立てられな い１本鎖の血漿タンパク質にＭＳＰ鎖を融合するときにはモノ融合体が好ましい 。

通常、ＭＳＰの細胞外ドメインの境界は膜アンカードメインのＮ−末端であるか 、またはそれからＮ−末端約２０残基内であり、ＭＳＰ配列の精査によって容易 に同定される。しかし、比較的小さなセグメントがリガンド結合に十分であるこ とが普通に見い出されているので、全ＭＳＰ細胞外ドメインを使用する必要はな い。このようなセグメントは、削除突然変異体または酵素消化物を調製し、リガ ンド結合についてスクリーニングして活性フラグメントを同定することにより常 法によって同定され、ｒＭＳＰＪなる用語の範囲内に含まれる。

通常、ＭＳＰの細胞外ドメインはそのＣ−末端で、免疫グロブリンネ変領域また は他の安定な血漿タンパク質のＮ−末端に融合される。融合が行われる正確な部 位は必須ではなく、可溶性ＭＳＰの分泌または結合の性質を最適なものにするた めに、成熟Ｎ−末端の血漿タンパク質のＣ−末端または細胞外領域の内部または それに隣接する他の部位を選択することもできる。この最適部位は通常の実験に よって決定されるであろう。

本発明に従って製造されるヘテロおよびキメラのＭＳＰ−免疫グロブリン変異体 の例を以下に図式的に示す。ｒＡＪはリガンド結合部位を含むＭＳＰの細胞外ド メインの少なくとも一部を意味し；Ａ３、Ａ１、Ａ３などはＡの個々のサブユニ ット鎖を示し；　Ｖｔ、、ｖＨＸＣｔ。

およびＣＩ（は免疫グロブリンの軽鎖または重鎮の可変または不変ドメインを示 し、ｎは整数であり；そして、Ｙは共有結合架橋部分を示す。

（ｃ）ＡＣａ−［ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣ ＋４．またはｖＬＣＬ−ＶＨＣＨコ；（ｄ）ＡＣ＋、−ＡＣｏ−［ＡＣＨ，ＡＣ Ｌ−ＡＣＩＩ、　ＡＣＬ−ＶＨＣＩ４．　ＶＬＣＬ−ＡＣＨ９またはＶＬＣＬ− ＶＭＣＩＩ］　：（ｅ）　ＡｃＬ−ＶｏＣＨ−［ＡＣｏ、　ＡＣＬ−ＡＣＨ，Ａ ＣＬＪＨＣＨ，ｋｃｔ−ＡＣｈ、またはＶｔ、Ｃｔ−Ｖ−ＣＪ　：（ｆ）ＶＬＣ ｔ−ＡＣＭ−［ＡＣｏ、　ＡＣＬ−ＡＣＭ、　ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−Ａ ＣＨ，またはＶＬＣＬ−ＶＨＣ−１］　：また■ （ｇ）［Ａ−Ｙ］ｎ−［ｖＬＣＬ−ＶＨＣＨ］ｔ。

この表に示した構造は重要な特徴のみを示すものであり、これらはジスルフィド 結合を示していない。これらは簡潔にするために削除した。しかし、そのような ドメインが結合活性に必要であるところでは、免疫グロブリンドメイン中でそれ らが占める通常の位置にそれらは存在しているものとする。これらの例としては ２価の抗体が代表的である。さらに複雑な構造が他のクラス（例えば、ＩｇＭ） に由来する免疫グロブリン重鎮配列を使用することから生じる。フンバニオン免 疫グロブリンとも呼ばれる免疫グロブリンＶＬＶＨ抗体結合部位は予め決めた抗 原に結合しうるものであるのが好ましい。

免疫グロブリン構築物の例を以下に図式的に示す。垂直の線は非共有または共有 結合の関係を示している。

（ｈ）　（１） （ｎ）　（ｏ） ［ここで、ＣＨｖドメインは削除 されているコ 好都合なコンパニオン免疫グロブリン結合部位および融合相手はヒトＩｇＧ−１ 、−２、−３もしくは一４サブタイプ、ＩｇＡＳ　ＩｇＥ。

ＩｇＤまたはＩｇＭから得られるが、好ましいのはＩｇＣ；−１である。

可溶型のＩｇＭ、またはＩｇＭの膜アンカードメインを修飾してもはや膜にとど まることができないようにしたものを用いるのが好ましい。

好ましい態様は、ＩｇＧＦｃを化学的に規定するパパイン切断部位［重鎮不変領 域の最初の残基を１１４として残基２１６　ＣＫ　ａｂａｔら。

”５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ ｃａＩ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ″、第４版、　１９８７年）、または他の免疫グロブ リンの類似の部位］のすぐ上流のヒンジ領域において始まる配列とＭＳＰのＮ− 末端部分の融合体である。

免疫グロブリンまたは他の血漿安定性ポリペプチドを１またはそれ以上のＭＳＰ サブユニットのＣ−末端に、通常はＭＳＰ鎖の少なくとも１つのトランスメンブ ランおよび細胞質ドメインの代わりに融合されるが、１つのサブユニットだけを 置換するのが普通である。

Ｇ　Ｐ　１ｌｂ−１１１ａの場合には、これはβサブユニットであろう。また、 重鎖などの免疫グロブリンドメインを、末端切除または無傷の免疫グロブリン重 鎮と普通の方法で結合させることができる。

免疫グロブリン鎖の可変領域の代わりにＭＳＰの細胞外ドメインが置換されてい る変異体は、改善されたインビボの血漿半減期を示すものと考えられる。これら のキメラは、ある種の抗体由来の可変ドメインを別の種の可変ドメインの代わり に置換するキメラ抗体と同様の方法で構築する。例えば、Ｅ　Ｐ　Ｏ１２５０２ ３；　Ｍｕｎｒｏ［Ｎａｔｕｒｅ３１２　（１９８４年１２月１３日）］；　Ｎ 　ｅｕｂｅｒｇｅｒら［Ｎａｔｕｒｅ　３１２　（１９８４年１２月１３日）］ 　；　Ｓ　ｈａｒｏｎら［Ｎａｔｕｒｅ　３０９　（１９８４年５月２４日）］ ；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎら［Ｐｒ。

！　２２９：　１２０２−１２０７（１９８５）］：および、Ｂ　ｏｕｌｉａｎ ｎｅら［Ｎａｔｕｒｅ　３１２：　６４３−６４６（１９８４年１２月１３日） コを参照。ＭＳＰの細胞外ドメインをコードしているＤＮＡを、制限酵素により 、このドメインをフードしているＤＮＡの３′末端もしくはその近接点で、およ び成熟ＭＳＰポリペプチドのＮ−末端をコードしているＤＮＡのところもしくは その近接点（異なるリーダーの使用が意図されているとき）で、またはＭＳＰの Ｎ−末端暗号領域のところもしくはその近接点（天然のＭＳＰシグナルを使用す るとき）で切断する。次いで、このＤＮＡフラグメントを、例えば免疫グロブリ ンの軽鎖または重鎮不変領域をコードしているＤＮＡ中に挿入し、そして必要な ら削除突然変異誘発によって加工するのは容易である。好ましくは、これはヒト 免疫グロブリンである。免疫グロブリンの軽鎖または重鎮不変領域をコードして いるＤＮＡは既知であるか、またはｃＤＮＡライブラリーから入手するのが容易 であるか、または合成される。例えば、Ａ　ｄａｍｓら［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　１９：　２７１１−２７１９（１９８０）］　；　Ｇｏｕｇｈら［Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９：　２７０２−２７１０（１９８０）］　；　Ｄｏｌ ｂｙら［ｐ、Ｎ、Ａ、ｓ、ｕｓＡ７７：　６０２７−６０３１（１９８０）］： Ｒｉｃｅら［Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　ＵＳＡ　７９：　７８６２−７８６５（ １９８２）］　；　Ｆ　ａｌｋｎｅｒら［匝ｅ　２９８：　２８６−２８８（１ ９８２）］　：および、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら［Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　１ｍｍｕｎ ｏｌ。

罎２３９−２５６（１９８４）］を参照。

キメラ鎖をコードしているＤＮＡを発現用の宿主細胞中にトランスフェクション する。宿主細胞がトランスフェクション前に免疫グロブリンを産生じているとき には、ヘテロ抗体を産生させるためには軽鎖または重鎮に融合させたＭＳＰでト ランスフェクションすることが必要になるだけである。ＭＳＰドメインを保持す る１またはそれ以上のアームおよびコンパニオン可変領域を保持する１またはそ れ以上のアームを有する前記の免疫グロブリンにより、ＭＳＰリガンドおよび抗 原に対する２つの特異性が得られることになる。これらは上記の組換え法によっ て、またはインビトロの方法によって得られる。後者の場合には、例えば自体既 知の方法に従い、免疫グロブリンおよびＭＳＰ融合体のＦ　（ａｂ’　）ｔフラ グメントを調製し、このＦ　（ａｂ’　）ｔフラグメントを穏やかな還元条件の もとての還元によってＦａｂ“フラグメントに変換し、次いで酸性条件のもと互 いの存在下で再酸化する［米国特許４．４４４．８７８をも参照］。

さらに、異なる特異性を有する免疫グロブリンから無傷のへテロ抗体を製造する 方法が知られている。これまでに使用されていたいずれかの免疫グロブリンの代 わりにＭＳＰ融合体を単に置換することによって、これらの方法をヘテロキメラ 抗体のインビトロ製造用に採用する。

また、ヘテロ機能性の抗体を製造する別の方法においては、ＭＳＰ−免疫グロブ リン融合体を産生ずる宿主細胞（例えば、トランスフェクションされたミエロー マ）を、ある抗原に対する所望のコンパニオン特異性を有する抗体を分泌するハ イブリドーマまたはＢ細胞と融合させる。ヘテロ二機能性抗体がこのようなハイ ブリドーマの培養培地から回収され、従って通常のインビトロ法によるよりも若 干好都合に製造することができる（Ｅ　Ｐ　６８，７６３）。

別の群のＭＳＰ変異体は削除変異体である。削除は、ＭＳＰ配列から１またはそ れ以上のアミノ酸残基を除去することを特徴とする。

通常、全ＭＳＰサブユニットの膜アンカーおよび細胞質ドメインが削除される。

しかし、ＭＳＰのマトリックスタンパク質またはリガンド結合能力を保存してい るトランスメンブランのＮ−末端側の他のあらゆる部位が適している。削除変異 体の範囲から除外されるのは、これまでＭＳＰのアミノ酸配列を解明する過程で 得られることもあったタンパク質消化フラグメントである。

（以下、余白） 置換変異体は、ＭＳＰ配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その位置に別 の残基が挿入されているものである。通常、ＭＳＰの性質を微妙に調節する結果 になる置換を以下の表１に示す。

Ａ　ｓｎ　ｇｉｎ　；　ｈｉｓ Ｈｉｓａｓｎ　；　ｇｉｎ Ｌ　ｙ８　ａｒｇ　；　ｇｉｎ　；　ｇｌｕＭｅｔ　’　ｌｅｕ　：　ｉ　ｌｅ Ｐ　ｈｅ　ｍｅｔ　；　ｌｅｕ　；　ｔｙｒ表１の置換より保存性が少ない置換 を選択することによって、即ち、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構 造、例えばシートまたは螺旋の立体配座、（ｂ）標的部位における分子の電荷ま たは疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ、を維持するその作用がもっと有意に異 なっている残基を選択することによって、機能または免疫学的な独自性の実質的 な変換が行われる。通常、ＭＳＰの性質に最大の変化をもたらすと予想される置 換は、（ａ）親水性の残基（例えば、セリルまたはトレオニル）が、疎水性の残 基（例えば、ロイシル、インロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニ ル）に代えて（または、によって）置換されているもの：（ｂ）システイニルま たはプロリルが他のいずれかの残基に代えて（または、によって）置換されてい るもの；（Ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基（例えば、リジル、フルギニルまた はヒスチジル）が、電気陰性の残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル） に代えて（または、によって）置換されているもの；または（ｄ）大きな側鎖を 有する残基（例えば、フェニルアラニル）が、側鎖を有さない残基（例えば、グ リシル）に代えて（または、によって）置換されているものであろう。

好ましい群の置換または削除変異体は、ＭＳＰの膜アンカー領域カ関係している 変異体である。ＭＳＰサブユニットのトランスメンプラン領域は、細胞膜の脂質 ２Ｍ層をまたぐに適切な大きさの疎水性または親油性の高いドメインである。こ れらはＭＳＰを細胞膜に固定するものと考えられている。他の細胞表面分子が、 リン脂質アンカーによるように、脂質の修飾によって固定される。

膜アンカードメインの削除または置換は、ＭＳＰの細胞または膜脂質親和性を減 少させ、その水溶性を改善することによって、可溶型のＭＳＰを与え、その回収 を容易にするであろう。膜アンカードメインが削除されるときには、身体によっ て外来と認識されるであろう他の点では細胞内であるポリペプチドの暴露または 免疫原の可能性がある異種ポリペプチドの挿入のいずれかによる、免疫原の可能 性力あるエピトープの導入を避ける。膜アンカードメインが削除されたＭＳＰの 主な利点は、それが組換え宿主の培養培地中に分泌されることである。この変異 体は血液などの体液に可溶性であり、細胞膜脂質に対して検出しつるほどの親和 性を有さず、従ってこれを組換え細胞培養物から回収するのをかなり簡単なもの にする。驚くべきことに、もはや細胞膜中に安定に挿入することができないよう に膜挿入鎖が修飾されたＭＳＰは、このＭＳＰ鎖が免疫グロブリンなどのマルチ マー形成配列に融合されていないときであっても、適切に会合し、組換え宿主細 胞から分泌されうる。マルチマー形成配列は、天然において非融合形態にあると きに共有または非共有結合の複数鎖構造を形成する複数績ポリペプチドの部分を 含有する複数績のボッペプチドである。

置換、削除、挿入またはこれらの任意の組合せを導入して最終的な構築物に至る ことは上記の説明によって十分に明らかであろう。

これら変異体はいずれも機能的な膜アンカードメインを有しておらず、また好ま しくは機能的な細胞質配列を有していないであろう。

通常、これは関連ドメインの削除によって達成されるが、適切な挿入または置換 変異体もこの目的に有効である。例ノ、ば、トランスメンブランドメインを、全 体として親水性のハイドロパシープロフィールを示す約５〜５０のセリン、トレ オニン、リジン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸などの親水性残基か らなるランダムな配列または予め決めた配列などの任意のアミノ酸配列によって 置換する。削除された（末端切除された）ＭＳＰと同様、これらの変異体は組換 え宿主の培養培地に分泌される。

ＭＳＰ変異体はＭＳＰをコードしているＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的な 突然変異誘発によって製造するのが好都合である。

これによって変異体をフードしているＤＮＡを得、次いで組換え細胞培養でこの ＤＮＡを発現させる。明らかに、変異ＭＳＰをコードしているＤＮＡ中の変化は この配列を読み枠の外側に置くものであってはならず、また好ましくは、発現に 有害な２次的なｏ＋ＲＮＡ構造を生じることもある相補領域を創製しないもので あろう（ＥＰ７５，４４４Ａ）。通常、ＭＳＰ変異体は天然の原型が示す活性と 同じマトリックスまたはリガンド結合活性を示すが、上に示したようなＭＳＰの 性質を修飾するためにも変異体を選択する。

アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決めるが、突然変異自体は予め決める必 要がない。例えば、ある部位での突然変異の効果を最大にするため、ランダムま たは飽和突然変異誘発（ここでは、可能性ある２０残基のすべてが挿入される） を標的コドンまたは領域で行い、発現したＭＳＰ変異体を目的活性の最適組合せ についてスクリーニングしてよい。

マトリックスタンパク質またはリガンドに結合することができないＭＳＰ変異体 はそれでも、少なくとも１つのＭＳＰエピトープが活性のままである限り、ＭＳ Ｐに対する抗体を生成させるための免疫原として、または免疫検定キットの成分 （ラベルして天然ＭＳＰの競争試薬として、または未ラベルでＭＳＰ検定の標準 として）として有用である。

１またはそれ以上のＭＳＰサブユニットが非タンパク性ポリマーとコンジュゲー トしているＭ’Ｓ　ＰまたはＭＳＰのアミノ酸配列もしくはグリコジル化変異体 （上に既述した変異体を含む）が本発明に意図されている。ＭＳＰとコンジユゲ ートする非タンパク性ポリマーには天然または出発のＭＳＰ中の同一位置に存在 するオリゴサツカリドが含まれないことは理解されよう。即ち、このポリマーは ＭＳＰに対して外性または異種のものである。

炭水化物置換基の位置を変えるか、またはその数を増加させるために、ＭＳＰポ リペプチドの部位指向性の突然変異誘発によってグリコジル化部位を移動、追加 または削除することは本発明の範囲内に含まれる。選択した炭水化物を添加する （または、全くグリコジル化しない）宿主細胞を選択することによって、または インビトロの酵素消化によって、常法により炭水化物の性質を修飾する。

通常、非タンパク性のポリマーは親水性の合成ポリマー、即ち他の方法では天然 に見い出されないポリマーである。しかし、天然に存在するポリマーてあって組 換えもしくは種々の方法により製造されるポリマーが、天然から単離されるポリ マーと同様に有用である。

親水性のポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピ ロリドンが本発明の範囲内にある。特に有用なポリマーは、ポリエチレングリコ ール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンエステルもしくはメトキ シポリエチレングリコールなどのポリアルキレンエーテル：ポリオキシエチレン 、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの ブロックコポリマー（プルロニック）などのポリオキシアルキレン；ポリメタク リレート；カルボマー；サツカリド単量体であるＤ−マンノース、ＤおよびＬ− ガラクトース、フフース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、 Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（即ち、 ポリマンヌロン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン 、Ｄ　。

−グルツースおよびノイラミン酸からなる分岐型もしくは非分岐型のポリサツカ リド［ラクトース、アミロペクチン、スターチ、ヒドロキシエチルスターチ、ア ミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、も しくは酸性ムコポリサツカリド（例えば、ヒアルロン酸）のポリサツカリドサブ ユニ、ツトなどのホモポリサツカリドおよびヘテロポリサプカリドを含むコ；ポ リソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコールのポリマー；および 、ヘパリンである。ポリサツカリドに、天然のグリコシル化もしくはＭＳＰの組 換え発現に付随するグリコジル化がなされている場合には、通常の置換部位はＭ ＳＰのＮまたは○結合グリコジル化部位以外の位置にあるか、またはこのＭＳＰ 変異体は追加もしくは置換のＮまたはＯ結合部位が分子中に導入されているアミ ノ酸配列変異体である。

このようなポリマーの混合物を用いるか、またはこのポリマーは均質なものであ ってもよい。架橋前のポリマーは水溶性である必要はないが（水溶性であるのが 好ましい）、最終フンシュゲートは血液などの生物学的液体に可溶性でなくては ならない。さらに、治療用にはこのポリマーはＭＳＰに結合したときに高い免疫 原性を有していてはならず、静脈内注入もしくは注射による投与が意図されてい るときにはそれに適合しない粘度を有していてはならない。

このポリマーはＭＳＰと反応する基を１つだけ含んでいるのか好ましい。これが ＭＳＰ分子の架橋を避けるための助けとなる。しかし、反応条件を最適なものに して架橋を減少させるか、または反応生成物をゲル濾過もしくはクロマトグラフ ィー・シーブによって精製して実質的に均質な誘導体を回収することが本発明の 範囲内に含まれる。

ポリマーの分子量は約１００から５００，０００の範囲であり、好ましくは約１ ，０００から２０，０００の範囲である。選択される分子量はポリマーの性質お よび置換の程度に依存するであろう。一般に、ポリマーの親水性が高（なり置換 の度合が大きくなるほど、使用可能な分子量は小さくなる。最良の分子量は通常 の実験により決定されるであろう。通常、ＭＳＰ−ポリマーフンシュゲートの分 子量は約７０，０００を越えるものであろうが、より低分子量の分子が適当であ る。

通常、ポリマーは、ポリマーおよびＭＳＰの１もしくはそれ以上のアミノ酸もし くは糖残基と反応する多官能性架橋剤によりＭＳＰに共有結合させる。しかし、 誘導体化したポリマーをＭＳＰと反応させるか、もしくはその逆によりポリマー をＭＳＰに直接架橋させることも本発明の範囲内にある。

適切なＭＳＰの共有結合架橋部位はＮ−末端アミノ基およびリジン残基上にある ε−アミ７基であるが、他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルヒドリル、ヒ ドロキシルまたは他の親水性の基も有用な置換部位として作用する。多官能性（ 通常は２官能性）の架橋剤を用いずに、ポリマーをＭＳＰに直接共有結合させる こともできる。

このような架橋剤の例には、１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエ タン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４ −アジドサリチル酸とのエステル、３，３′−ジチオビス（スクシンイミジルー プロビオ不一ト）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ２官能性イミド エステルおよびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの２官能性マレイ ミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジド−フェニル）ジチオ］プロピオイ ミデートなどの誘導化剤は、光の存在下で架橋を生成させることができる光活性 化が可能な中間体を与える。別法では、米国特許第３．９５９，０８０号；３， ９６９，２８７号：　３，６９１，０１６号；４．１９５，１２８号：　４，２ ４７，６４２号；４，２２９，５３７号：４．０５５．６３５号および４，３３ ０，４４０号に開示されている臭化シアンにより活性化された炭水化物などの反 応性の水溶性マトリックスおよび系を、ポリマーおよびＭＳＰの架橋用に適切に 修飾する。

ＭＳＰアミ７基に対する共有結合は、塩化シアヌリン、カルボニルジイミダゾー ル、アルデヒド反応性基（ＰＥＧアルコキシキンブロモアセトアルデヒドのジエ チルアセタール；ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよヒ無水酢酸、または塩化ＰＥＧ＋４−ヒ ドロキシベンズアルデヒドのフェノキシト、スクシンイミンル活性エステル、活 性化ジチオカルボネートＰＥＧ、２．４．５−）リクロロフエニルりロロホルメ ートまたはｐ−ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧに基づく既知の化 学により行われる。カルボキシル基はカルボジイミドを用いるＰＥＧ−アミンの 結合により誘導化される。

オリゴサツカリドをビオチンもしくはアビジンでラベルする目的でＨｅｉｔｚｍ ａｎｎら［ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、７１　：　３５３７−３５４１（１９７４） ］またはＢａｙｅｒら［ルロｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６２：　 ３１０（１９７９）］が開示した方法と同じ方法で、化学酸化（例えば、メタペ リオデート）または酵素酸化（例えば、グルコースオキシダーゼもしくはガラク トースオキシダーゼ）によつて炭水化物のアルデヒド誘導体を得、続いてヒドラ ジドもしくはアミノ誘導化ポリマーと反応させることによってオリゴサツカリド 置換基にポリマーをコンジュゲートさせる。さらに、オリゴサツカリドおよびポ リマーを結合させるためにこれまで用いられていた他の化学法もしくは酵素法も 適しているであろう。置換されたオリゴサツカリドが特に有利であるが、これは 、誘導体化のためにはアミノ酸部位より少ない炭水化物置換基しか存在しないの でコンジュゲートの安定性、活性および均質性が改善されるためである。最後に 、ポリマーの誘導体化の前に、または最終産物として、ＭＳＰオリゴサツカリド 置換基を酵素によって、例えばメイラミニダーゼ消化によって修飾して糖を除去 する。

このポリマーは、ＭＳＰのアミノ酸側鎖またはＮもしくはＣ末端と直接反応する 基、または多官能性架橋剤と反応する基を有するであろう。一般に、このような 反応性基を有するポリマーは、固定化タンパク質の調製用に知られている。この ような化学を本発明で使用するためには、これまでタンパク質の固定化に用いら れていた不溶性のポリマーと同じ方法で誘導体化した水溶性のポリマーを用いる べきである。臭化シアンによる活性化は、ＭＳＰにポリサツカリドを架橋させる のに用いる特に有用な方法である。

出発ポリマーについて用いる「水溶性」なる用語は、フンシュゲート反応に用い られるポリマーまたはその反応性中ＩＪｉ体が、ＭＳＰとの誘導体化反応に関与 するに十分な水溶性を有することを意味する。

ＭＳＰの置換の程度は、タンパク質上の反応性部位の数、使用されるＭＳＰが無 傷かまたは先端切除されているか、ＭＳＰがＭＳＰに対して異種のタンパク質と の融合物であるか否か、分子量、ポリマーの親水性およびその他の性質、および 選択した特定の部位に依存して変化するであろう。通常、フンシュゲートのＭＳ Ｐ部分は約１〜１０ポリマー分子で置換されるが、ＭＳＰ部分の活性に有意な悪 影響を与えない限り、ＭＳＰに融合される任意の異種配列は本質的に限定されな い数のポリマー分子で置換することができる。最適の架橋度は、時間、温度およ び他の反応条件を変えて置換の程度を変化させ、次いでマトリックスタンパク質 またはリガンドに結合するコンジュゲートの能力を測定する実験マトリックスに より容易に決定される。

ＰＥＧなどの非タンパク性のポリマーでタンパク質を共有結合修飾するための自 体既知の多種多様の方法により、ポリマー、例えばＰＥＧをＭＳＰに架橋させる 。しかし、これらの方法の一部は本発明の目的にとって好ましくない。塩化シア ヌリンの化学（法）はタンパク質の架橋を含む多くの副反応をもたらす。さらに 、スルヒドリル基を含むタンパク質の不活性化を招く可能性が特に挙げられよう 。

カルボニルジイミダゾールの化学［Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、　Ａｎａｌ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　１３１・２５−３３（１９８３）］は高いｐＨ（＞８．５）を必 要とし、これはタンパク質を不活性化しうる。さらに、「活性化ＰＥＧＪ中間体 は水と反応しうるので、タンパク質に対して大過剰モルの「活性化ＰＥＧ」が必 要となる。通常、アルデヒドの化学（Ｒｏｙｅｒ、米国特許第４．００２．５３ １号）は、４０倍モル過剰のＰＥＧと１〜２時間のインキュベートのみを必要と するので好ましい。しかし、ＰＥＧアルデヒドの製造用にＲｏｙｅｒにより示さ れた二酸化マンガンは、「金属ベースの酸化剤とでコンプレックスを形成するＰ ＥＧの傾向が明らかであるため」［Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ、Ｐｏｌｙｍ、Ｓｃｉ、 、Ｐｏ１ｙ＋ｎ、Ｃｈｅｍ、Ｅｄ、２２：　３４１−３５２（１９８４）］問題 がある。ＤＭＳＯおよび無水酢酸を用いるＭｏｆｆａｔｔ酸化を用いることによ り、この問題が回避される。さらに、Ｒｏｙｅｒにより示された水素化ホウ素ナ トリウムは高いｐＨで用いなければならず、ジスルフィド結合を減少させる著し い傾向がある。これに対して、ナトリウム・シア／ボロヒドリドは中性ｐＨで有 効であり、ジスルフィド結合を減少させる傾向はほとんどない。

通常、本発明のＭＳＰフンシュゲートはゲル濾過によって未反応の出発物質から 分離する。最も簡便には、ＭＳＰコンジュゲートをアルキルセファロースなどの 疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から、減少性の塩勾配液により溶離する 。この方法は、上述のゲル濾過法と同様、置換度に基づいてフンシュゲートを分 離する。

ＭＳＰをコードしているＤＮＡは既知の方法によって、はとんどの場合、ＭＳＰ をコードしているＤＮＡを記載している刊行物を参照することによって得られる 。通常は、原核生物をＭＳＰ変異体のＤＮＡ配列をクローニングするために用い る。例えば、Ｍ１３ファージを増殖させるための大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　 Ｍ　１０１の耐性株［Ｍｅｓｓｉｎｇら、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ジ （２）：　３０９−３２１（１９８１）］および大腸ｍＫ１２株２９４　（Ａ　 Ｔ　ＣＣＮｏ、　３１４４６）が特に有用である。使用可能な他の微生物株には 大腸菌ＢまたはＵＭＩＯＩが含まれる。これらの例は限定のためのものではなく 例示のためのものである。また、核酸は周知の種々のインビトロ増幅法を用いて クローニングする。

変異ＭＳＰをコードしているＤＮＡを、発現のため、意図している宿主細胞に適 合する種から導いたプロモーターおよびフントロール配列を含有するベクター中 に挿入する。通常、このベクターは、複製部位ならびに１またはそれ以上のマー カー配列（形質転換細胞における表現型選択を与えることができる）を担持して いる（必ずしも必要ではない）。例えば、大腸菌は大腸菌種から導かれたプラス ミドであるｐＢＲ３２，２の誘導体を用いて形質転換されるのが普通である［Ｂ ｏｌｉｖａｒら、　釦朋２：　９５　（１９７７）］。ｐＢ　Ｒ３２２はアンピ シリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含んでおり、従って形質転 換された細胞を同定するための簡単な手段を与える。このｐＢ　Ｒ３２２プラス ミドまたは他の微生物プラスミドは、組換えＤＮＡの構築に普通に用いられるプ ロモーターおよびその他のコントロール要素を含んでいるか、または含むように 修飾されなければならない。

原核宿主で用いるのに適したプロモーターを例示すると、β−ラクタマーゼおよ びラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇら、　Ｎａｔｕｒｅ　２７５：　６１ ５（１９７８）およびＧｏｅｄｄｅｌら、　Ｎａｔｕｒｅ　２８１　：　５４４ （１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモー ター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８　：　 ４０５７（１９８０）およびＥＰＯ出願公開Ｎ　ｏ、　３６．７７６］、および ｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター［）１．　ｄｅＢｏａｒら 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　出口２ｌ −２５（１９８３）］が含まれる。

しかし、その他の機能的な細菌性プロモーターも適している。これらのヌクレオ チド配列は広く知られており、従って当業者はこれらを、任意の必要な制限部位 を供給するだめのリンカ−またはアダプターを用いて、ＭＳＰをコードしている ＤＮＡに機能的に連結することができる［５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、　Ｃｅ１ｌ 　２０　：　２６９（１９８０）］。また、細菌性の系で用いるためのプロモー ターは、抗原をコードしているＤＮＡに機能的に結合させたシャインーダルガル ノ（ＳＤ）配列を含有していよう。

原核生物に加えて酵母培養物などの真核微生物がクローニングまたは発現宿主と して有用である。Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは 通常のパン酵母が最も普通に用いられる真核微生物であるが、他の多数の菌株も 普通に用いることができる。Ｓ　ａｃｃｈａｒｏＢｃｅｓ中で発現させるために は、通常、例えばプラスミドＹ　Ｒｐ７　［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら。

ヒフアン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ、４４ ，０７６またはＰ　Ｅ　Ｐ　４−１　［Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃ１＋８５　 ：　１２（１９７７）］のための選択マーカーを与えるｔｒｐｌ遺伝子を既に含 有している。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの性質としてｔｒｐ　１欠損が存在す ると、トリプトファンの非存在下での増殖によって有効な選択手段が得られる。

酵母宿主で用いるのに適した促進配列には、３−ホスホグリセレート　キナーゼ のためのプロモーター［Ｈｉｔｚｅｍａｎら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２ ５５　：　２０７３（１９８０）］、またはその他のグルコース分解酵素、例え ば工／ラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート　デヒドロゲナーゼ、ヘ キソキナーゼ、ピルベート　デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グ ルコース−６−ホスフェート　イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート　ムター ゼ、ピルベート　キナーゼ、トリオセホスフエート　イソメラーゼ、ホスホグル コースイソメラーゼ、およびグルフキナーゼなどのプロモーター［Ｈｅ５ｓら、 　Ｊ、Ａｄｖ、ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ、　７　：　１４９（１９６８）およびＨｏ １ｌａｎｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７　：　４９００（１９７，８） ］が含まれる。

増殖条件によってコントロールされる転写の別の利点を有している誘導性プロモ ーターであるその他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イ ソチトクロムＣ１酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、メタロチ オネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート　デヒドロゲナーゼ、ならび にマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素群のプロモーター領域であ る。酵母発現において用いるのに適したベクターおよびプロモーターはＲ，Ｈｉ ｔｚｅｍａｎら（欧州特許公開Ｎ　ｏ、　７３．６５７Ａ）がさらに開示してい る。また、酵母エンハンサ−を酵母プロモーターと共に用いるのが有利である。

哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写をコントロールするためのプロモータ ーは、種々の供給源、例えばポリオーマ、サルウィルス４０（ＳＶ４０）、アデ ノウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスおよび最も好ましくはサイトメ ガロウィルスなどのウィルスのゲノムから、または、例えばβ−アクチンプロモ ーターなどのへテロローガスな哺乳動物プロモーターから得ることができる。Ｓ Ｖ４０ウィルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４　Ｑのウィルス性複製 起点をも含有する５Ｖ４Ｑ制限フラグメントとして好都合に得られる［Ｆｉｅｒ ｓら、　Ｎａｔｕｒｅ、２７３：　１１３（１９７ｇ）］。ヒトサイトメガロウ ィルスの即時型プロモーターはＨｉｎｄ目ｒＥ制限フラグメントとして好都合に 得られる［Ｇｒｅｅｎａｗａｙ、　Ｐ、　Ｊ、ら、　Ｇｅｎｅ、　１８　：　３ ５５−３６０（１９８２）コ。また、宿主細胞またはその関連種由来のプロモー ターが有用であるのは勿論である。

高等真核生物中でのＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサ−配列を挿入する ことによって増大する。エンハンサ−は、通常約１０〜３００ｂｐのシス作用性 のＤＮＡ要素であり、プロモーターの転写開始能力を増強するように作用する。

エンハンサ−は、その配向および位置には比較的依存せず、転写単位の５　’　 ［Ｌａ１ｍ１ｎｓ、　Ｌ、ら、　Ｐｒ。

・のエンハンサ−配列が哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン 、α−フェトプロティンおよびインスリン）から既知となっている。しかし、真 核細胞ウィルス由来のエンハンサ−を用いるのが普通である。その例には、ＳＶ ４０の複製起点の後期側のエンハンサ−（ｂｐ　１０　Ｑ〜２７０）、サイトメ ガロウィルスの初期プロモーターエンハンサ−、ポリオーマの複製起点の後期側 のエンハンサ−１およびアデノウィルスのエンハンサ−が含まれる。

また、真核宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞） で用いる発現ベクターは、＋ｏＲＮＡの発現に影響を及ぼす転写の終止に必要な 配列をも含んでいるであろう。これらの領域は、ＭＳＰをコードしているｍＲＮ Ａの非翻訳化部分中のポリアデニル化されたセグメントとして転写される。

通常、発現ベクター系は選択遺伝子（選択マーカーとも呼ばれる）を含んでいる 。哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ ）、チミジンキナーゼまたはネオマイシンである。このような選択マーカーが哺 乳動物宿主細胞中に成功裏に移転されると、この形質転換された哺乳動物宿主細 胞は選択圧のもとに置かれたときに生存することができる。選択法には広く用い られている２つの別個のカテゴリーが存在する。第１のカテゴリーは、追加培地 とは無関係に増殖する能力を欠く突然変異セルラインの使用と細胞の代謝に基づ いている。例を２つ挙げると、ＣＨＯＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞 である。これらの細胞は、チミジンまたはヒボキサンチンなどの栄養素の追加な しでは増殖する能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路 に必要なある種の遺伝子を欠いているので、この欠失したヌクレオチドが追加培 地に供給されなければ生存することができない。培地に追加を行うことの代替は 、無傷のＤＨＰＲまたはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠く細胞中に導入して それらの増殖要件を変えることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換さ れなかった個々の細胞は、未追加の培地では生存することができないであろう。

第２のカテゴリーは優性選択であり、あらゆる細胞種において用いられる選択法 であり、突然変異セルラインの使用を必要としない。

通常、この方法は宿主細胞の増殖を抑制する薬物を用いる。新規な遺伝子を保持 するこれら細胞は薬物耐性を与えるタンパク質を発現し、選択に耐えるであろう 。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン［５ｏｕｔｈｅｒｎ、　ｐ、お よびＢｅｒｇ、　Ｐ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、↓ ：３２７（１９８２）］、］ミコフェノール酸ＭＬＩＩ　ｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ ，およびＢｅｒｇ、　Ｐ、　、　５ｃｉｅｎ例は、真核性のコントロール下に細 菌性遺伝子を用いて、それぞれ適当な薬物Ｇ４１８もしくはネオマイシン（ジエ ネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する 耐性を与えるものである。

「増幅」とは、細胞の染色体Ｄ　Ｎ　Ａ中の隔離された領域の増加または複製を 意味する。選択試薬、例えばＤＨＦＲによって不活性化されるメトトレキセート （ＭＴＸ）を用いて増幅を行う。増幅すなわちＤＨＦＲ遺伝子の連続コピーの生 成によって、ＭＴＸ量の増加につれて生成するＤＨＦＨ量が増加する結果になる 。内生のＤＨＦＨの存在にかかわらず、さらに多量のＭＴＸを培地に加えること によて増幅圧をかける。同時組込みが可能なりＨＦＲまたは増幅遺伝子と所望の タンパク質をコードしているＤＮＡを保持するプラスミド！　で哺乳動物宿主細 胞を同時トランスフェクションすることによって、ｌ　所望の遺伝子の増幅を達 成することができる。さらに増加させたＭＴＸ濃度のもとで増殖することができ る細胞だけを選択することによって、細胞がさらに多量のＤＨＦＲを要求するこ とを確実なものにする（この要求は選択遺伝子の複製によって満たされる）。所 望の異種タンパク質をフードしている遺伝子が選択遺伝子と同時組込みされる限 り、この遺伝子の複製によって所望のタンパク質をコードしている遺伝子の複製 が得られる。この結果、コピー数が増加した所望の異種タンパク質をコードして いる遺伝子（即ち、増幅された遺伝子）は、さらに多量の所望の異種タンパク質 を発現することに本発明のＭＳＰ変異体を発現させるのに好ましい宿主細胞は哺 乳動物宿主−ベクター系であり、適当な宿主の例には次のものが含まつ　れる： ５Ｖ４Ｑで形質転換されたサル腎ＣＶ１ライン［ＣＯ３−７、ＡＴＣＣＣＲＬ　 １６５１］；ヒト肝腎ライン［２９３、Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、　Ｌ。

ら、Ｊ、Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ、３６　：　５９（１９７７）および２９３Ｓ細胞 ；この両方が等しく満足するコニ新生ハムスター腎細胞［ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣ Ｌ１０］；チャイニーズ＋ハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ［ＣＨＯ，１Ｊｒｌａ ｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　７７　：　４２１６（１９８０）］　；マウスセルドーリ細胞［７Ｍ４ 、Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ、　Ｐ、　、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　２３　：　 ２４３−２５１（１９８０）］　；サル腎細胞［ＣＶｌ、ＡＴＣＣＣＣＬ　７０ ］；アフリカミドリザル腎細胞［ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７］ ；ヒト子宮頚癌細胞［ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ　２］；イヌ腎細胞［ＭＤＣＫ 、ＡＴＣＣＣＣＬ　３４コ；バッフアロラット肝細胞［ＢＲＬ　３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ　１４４２］：ヒト肺細胞［Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ　７５］；ヒト肝 細胞［ＨｅｐＧ２、ＨＢ　８０６５］；マウス乳腫瘍［ＭＭＴ　０６０５６２、 ＡＴＣＣＣＣＬ５１細胞］；およびＴＲＩ細胞［Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ、　Ｐ、’ ら、Ａｎｎａ！ｓ　Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　３８３：　４４−６８（１９ ８２）］。

「形質転換」とは、染色体外要素として、または染色体組込みのいずれかによっ て、複製可能なように生物中にＤＮＡを導入することを意味する。宿主細胞の形 質転換に適した方法の１つは、Ｇ　ｒａｈａｍ、　Ｆ、およびｖａｎ　ｄｅｒ　 Ｅｂ、　Ａ、　［Ｊｉｒｏｌｏｇｙ　５２　：　４５６−４５７（１９７ｇ）］ の方法である。しかし、細胞中にＤＮＡを導入するための他の方法、例えば核注 射による方法またはプロトプラスト融合による方法なども用いることができる。

原核細胞または強固な細胞壁を有する細胞を宿主として用いるときには、好まし いトランスフェクション法はＣｏｈｅｎ。

Ｆ、　Ｎ、ら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　 ６９　：　２１１０（１９７２）つが開示している塩化カルシウム使用のカルシ ウム処理法である。

所望の暗号配列およびコントロール配列を含有する適切なベクターの構築には通 常操作の連結法を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを切断 し、加工し、そして目的の形に再連結して必要なプラスミドを得る。本明細書に 記載した構築に適切な方法は周知である。例えば、Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ、　Ｔ、 ら［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　１３３−１３４　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ（１９８２）］　；″Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｔａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”［Ａｕ５ｕｂｅｌら編、Ｇ ｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　＆　Ｗｉｌｅｙ− １ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ版（１９８７）］を参照。

通常、あるＭＳ　Ｐ（またはトランスメンプラン修飾した変異体）のそれぞれの サブユニットをコードしているＤＮＡを宿主細胞に同時にトランスフェクション するが、このようなトランスフェクションを連続して行うこともできる。異種の へテロニ量体を調製するためにあるサブユニットを別のＭＳＰの類似サブユニ、 トと交換したＭＳＰ変異体は、例えば、Ｇ　Ｐ　ｌ１ｂ−１１１ａのαサブユニ ットの代わりにフィブロネクチンのαサブユニットを交換するが（αサブユニッ ト交換）、またはＧ　Ｐ　Ｊｉｂ−１１１ａのβサブユニットの代わりにフィブ ロネクチンのβサブユニットを交換しくβサブユニツト交換）、組換え宿主（通 常は哺乳動物細胞）をそれぞれの異種サブユニットで同時形質転換することによ って得られる。

Ｍｅｓｓｉｎｇら［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：　３０９（１ ９８１）］の方法またはＭａｘａｍら［Ｍｅｔｈｏｄｔ＋　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ　６５：　４９９（１９８０）］の方法により、大腸菌に１２株２９４ （ＡＴＣＣ３１４４６）を連結混合物で形質転換し、適当なところで成功裏の形 質転換体をアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性で選択し、形質転換体から プラスミドを調製し、次いで制限酵素消化による分析および／または配列決定に よって正しいプラスミド配列を確認する。

宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換する。次いで、これを、例えばプロ モーターを誘導、形質転換体を選択、または遺伝子を増幅するための物質を含有 する適当な培養培地で培養する。温度、ｐＨなどの培養条件は発現用に選択した 宿主細胞でこれまで用いられていた条件であり、当業者には明らかであろう。Ｇ 　Ｐ　ｌ１ｂ−１１１ａの発現のためには、分泌型のＧ　Ｐ　１ｌｂ−１１１ａ および他のカルシウム依存性ＭＳＰの安定性を高めるために２価のカチオンが必 要とされるので、カルシウムおよびマグネシウム塩を培養培地に含ませるのが好 ましい。

分泌されたＭＳＰ変異体を、培養上清または組換え宿主のリゼイトから回収およ び精製する。通常は、上清を限外濾過によって濃縮し、リガンド（例えば、ＲＧ Ｄ）またはマトリックスタンパク質アフィニティーまたは免疫アフィニティー樹 脂に接触させてＭＳＰ変異体を吸着させ、そして吸着体から溶出させる。所望に より、ＭＳＰをＨＰＬＣ，レクチンカラム、ゲル排除、疎水相互作用またはイオ ン交換クロマトグラフィーによって精製する。

この精製したＭＳＰを通常の薬理学的に許容しうる担体中に配合する。

本発明の可溶性のＭＳＰ変異体は、治療、診断および製造法において有用である 。診断においては、可溶性のＭＳＰを標準または対照として膜抽出物の代わりに 用いるか、またはＭＳＰもしくはその抗体の競争型の放射免疫検定もしくは放射 受容体検定で用いるための放射性同位体もしくは他の検出可能な基でラベルする 。

可溶性のＭＳＰを本明細書中に記載した方法によって不溶性の支持体に架橋させ 、そのリガンドまたはマトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチン、フ ィブリノーゲンなど）の精製に用いる。

別法では、可溶性のＭＳＰを用いて溶液中でリガンドまたはマトリックスタンパ ク質を吸着させ、次いで抗血清、硫酸アンモニウムなどよって沈澱させ、リガン ドまたはマトリックスタンパク質のコンプレックスを回収する。次いで、このコ ンプレックスをＨＰＬＣＳＮ気泳動、ゲルクロマトグラフィーまたはその他の常 法によって解離させる。

可溶性ＭＳＰの治療用の使用はそれぞれのＭＳＰの生物学的活性の関数であり、 それから明らかであろう。本発明の可溶性ＭＳＰ変異体は、対応する天然の膜結 合受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。例えば、可溶性の Ｇ　Ｐ　ｆｉｂ−１１１ａ受容体は、抗凝固薬として、および血小板凝集に関係 した疾患の治療に、特に血栓溶解治療の後の再閉塞の防止に有用である。また、 可溶性のマトリックス受容体、特に可溶性のＧ　Ｐ　ｌ１ｂ−１１１ａは、マト リックス付着依存性の新生物転移に対するアンタゴニストとして有用である。

可溶性のＬ　Ｆ　Ａ−１変異体はＴ−リンパ球機能のアンタゴニストであり、そ れによって特に再潅流障害において免疫抑制薬または抗炎症薬として有効である 。可溶性のＭａｃ−１変異体は、補体活性化障害の治療にその用途が見い出され よう。

以下に挙げる実施例の理解を容易にするため、一部の頻繁に現れる方法および／ または用語を次に説明する。

「プラスミド」は、小文字ｐ、その前および／またはその後の大文字および／ま たは数字で表す。本発明の出発プラスミドは、市販品から入手可能であるか、制 限のない状態でだれでも入手可能であるか、または入手可能なプラスミドから公 知の方法に従って構築することができる。さらに、記載したものと等価なプラス ミドが当分野で知られているが、これらは当業者には明らかであろう。

ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡ中のある配列にのみ作用する制限酵素によるＤＮ Ａの触媒的切断を意味する。本発明で用いられる種々の制限酵素は市販品から入 手可能であり、それらの反応条件、補助因子およびその他の必要条件は、当業者 に既知である条件を用いた。分析用には、通常、１ｇｇのプラスミドまたはＤＮ Ａフラグメントを、約２０μｌの緩衝液中、約２単位の酵素と共に用いる。プラ スミド構築のためのＤＮＡフラグメントの単離のためには、通常、５〜５０μｇ のＤＮＡを、さらに大きい容量中、２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の 制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は製造元によって指定されている。

通常は３７℃で約１時間のインキュベート時間を用いるが、供給元の指示に従っ て変えてもよい。消化の後、反応液を直接ポリアクリルアミドまたはアガロース ゲルの電気泳動にかけ、所望のフラグメントを単離する。

制限消化物からのあるＤＮＡフラグメントの「回収」または「単離」とは、ポリ アクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動による消化物の分離、その移動度 と既知分子量のマーカーＤ　ＮＡフラグメントの移動度の比較による目的フラグ メントの同定、目的のフラグメントを含有しているゲル切片の取り出し、および ゲルからのＤＮＡの分離を意味する。この方法は広く知られている［Ｌａｗｎ、 　Ｒ，ら。

ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、、　９−　：　６１０３−６１１４（１９８ １）およびＧｏｅｄｄｅｌ、　Ｄら、黙碧１ｅｉｃＡｃ１ｄｓＲｅｓ、　８−　 ：　４０５７（１９８０）］。

「連結（ライゲート）」とは、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でホスホジエ ステル結合を形成させる過程を指す［Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら。

上記、１４６頁］。特に記さなければ、連結は、連結しようとするほぼ等しい量 のＤＮＡフラグメント（０，５μｇ）に対してＴ４　ＤＮＡリガーゼ（「リガー ゼｊＸ１０単位）を用い、既知の緩衝液および条件を用いて行ってよい。

以下に挙げる実施例は、本発明を実施するために現在意図されている最良の態様 を単に説明するためのものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。

（以下、余白ン 実施例１ 糖タンパク質１１ｂ（ＣＰ　１ｌｂ）ｃＤ　Ｎ　Ａのクローニング培養したヒト 赤白血病細胞（ＨＥＬ、ＡＴＣＣＴＩＢ　１８０）からメツセンジャーＲＮＡを 調製した。バタテリオファージλＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）においてこのｍＲＮＡを用いてオリゴ（ｄＴ）プライムし たｃＤＮＡライブラリーを調製した。このλＺＡＰライブラリーを、ＨＥＬ細胞 由来のＧＰＩＩｂの公知ｃＤＮＡ配列［Ｐｏｎｃｚら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、２６２（１ｇ）：　８４７６−８４８２（１９８７）］の５”末端から導い た４　５−ｍａｒのオリゴヌクレオチド（２ｂｌ）でスクリーニングした。いく つかのポジティブにハイブリダイズするファージを精製し、それらが含んでいる ｃＤＮＡ挿入体を制限酵素消化分析にかけた。

これらの結果から、ＧＰＩｌｂの完全長の暗号挿入体を含んでいると考えられる ファージをさらに分析するために選択した。このファージ挿入Ｄ　Ｎ　ＡのＤＮ Ａ配列決定により３００塩基余りが得られ、これは、その５“末端に４個の付加 的な塩基を有することを除き、ｍＲＮＡの５′末端由来の公知ｃＤＮＡ配列（Ｐ ｏｎｃｚら）と正確に一致した。

このｃＤＮＡ挿入体をＥｃｏＲＩ（この部位は、ライブラリーの調製中にｃＤＮ Ａの末端に連結したリンカ−から導かれる）およびＨｉｎｄｌｌｌ（これは、暗 号配列末端から下流の唯一の部位でＧｐＨｂ挿入体を切断する）で消化した。Ｇ ＰＩｌｂの全暗号領域を含有するこのＥｃｏＲＩ−Ｈ１ｎｄｌｌ＋制限フラグメ ントを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化しておいた哺乳動物細胞発現ベ クターｐＲＫ　５　［欧州特許出願公開Ｎｏ。

３０７、２４７（１９８９年３月１５日公開）］に連結し、発現ベクターＧ　Ｐ 　ｌ１ｂ−ｐＲＫ５を回収した。

ｏｏｄ　７２（２）＋　５９３（１９８８）］。このｃＤＮＡは、プラスミドベ クターｐＩＢ　Ｉ　２０　（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）中のＥ　ｃｏＲｒ　（ｃＤＮＡライブラリー作成 のリンカ−から導かれる部位）−Ｐｓｔｌ（暗号配列の末端から下流の部位）挿 入体として得られる。このプラスミドをＨｉｎｄｌｌｌで消化して、ｃＤＮＡ挿 入体中の末端Ｐ　ｓ、ｔ　１部位の下流のｐｌＢＩ２０中の唯一のＨｉｎｄｌ１ １部位でこのプラスミドを切断し、そしてＡｐａｌで不完全に消化して、配列の ５′末端のＡｐａＩ部位とプラスミドベクター由来のＨｉｎｄｌｌｌで囲まれた ｃＤＮＡフラグメントを得た。この構築のための関連ドメインを以下に示す。

ＬＡＧＶＧＶＧＧＰＮＩＣＴ 、、、、　ＣＴＧ　ＧＣＧ　ＧＧＣＧＴＴ　ＧＧＣＧＴＡ　ＧＧＡ　ＧＧＧ　Ｃ ＣＣＡＡＣＡＴＣＴＧＴ　ＡＣＣ、、，１、、、ＧＡＣＣＧＣＣＣＧ　ＣＡＡ　 ＣＣＧ　ＣＡＴ　ＣＣＴ　ＣＣＣＧＧＧ　ＴＴＧ　ＴＡＧ　ＡＣＡ　ＴＧＧ　、 、、。

ＥｃｏＲＩ　Ａｐａｌ　Ｈ４ｎｄｌ　ＩＩ基づいて、Ｇ　Ｐ　１ｌｌａの完全長 の暗号構築物を再構築した。Ａｐａｌで終わるオリゴヌクレオチド配列を上記の Ａ　ｐａ　ｒ　−Ｈ１ｎｄｌｌ＋フラグメントのＡｐａ１部位に連結し、Ｅｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで囲まれたＤＮＡフラグメントを得た。Ｇ　Ｐ　１ｌ ｌａの完全な暗号領域を含有するこのＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌ１１フラグメ ントを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化しておいたｐＲＫ５に連結し、 発現ベクターＧ　Ｐ　ｌ１ｌａ−ｐＲＫ　５を回収した。関係のオリゴヌクレオ チド配列を以下に示す。

ＭＲＡＲＰＲＰＲＰＬＷ ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＣＣＧＣＣＡＴＧ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＣＧＴ　ＣＣ Ｔ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＣＧＴ　ＣＣＴ　ＣＴＣＴＧＧＧＡ　ＴＣＴ　ＣＧＧ　Ｃ ＧＧ　ＴＡＣＴＣＴ　ＣＧＴ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＧＧ Ａ　ＧＡＧ　ＡＣＣｃｏＲＩ ｂａｌ ＡＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧＧＰ ＧＣＧ　ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＴＧ　ＧＧＡ　ＧＣＡ　ＣＴＧ　 ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＧＧＧ@ＣＣ ＣＧＣＴＧＡ　ＣＡＣＧＡＣＣＧＴ　ＧＡＣＣＣＴ　ＣＧＴ　ＧＡＣＣＧＡ　Ｃ ＣＡ　ＣＡＡ　ＣＣＴ　ＣＡＴ　ＣＣＴ　Ｃｐａｌ この合成オリゴヌクレオチドは、コードされているアミノ酸は公知のクローンさ れたｃＤ　Ｎ　Ａ　（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら、Ｒｏｓａら）から予想されるア ミノ酸と同一であるが、そのコドンは天然のクローンされたＣＤＮＡと必ずしも 同一ではない。図３は合成および天然配列の暗号路を比較するものである。それ ぞれの配列の間の星印は、どのヌクレオチドが同一であるかを示している。これ らの変化は３つの理由から導入した。

１、ｃＤＮＡを配列決定する際に直面した困難性に照らして、我々はこのｃＤＮ Ａが翻訳効率に悪影響を及ぼす２次構造を含んでいるものと結論した。発現構築 物から産生されるｍＲＮＡ中の可能性ある２次構造を最少にするため、一部のコ ドンを他のコドンに変えることによって、即ち、より少ないＧおよび／またはＣ 含量を有するが同じアミノ酸をコードしているコドンに変えることによって、天 然の暗号配列中のＧおよびＣ塩基の割合を少なくした。これらの変化させたコド ンは、ｃＤＮＡの残りに頻繁に用いられるコドンだけ２、イニシエーターのメチ オニンコドン（Ｍ、−２６）にすぐ続＜アルギニン（Ｒ，−２５）のコドンを、 ＣＧＡからＡＧＡに変えた［Ｋｏｚ３、イニシエーターのメチオニンコドンの上 流のＤＮＡ配列は天然のＤＮＡ配列に基づいていない。合成した相補性オリゴヌ クし・オチドは、一方の末端にＥｃｏＲ１部位が存在し、それにＸｂａＩ認識配 列が続き、次いでイニンエーターのメチオニンのすぐ上流にＧＣＣＧＣＣが続い ている［Ｋｏｚａｋ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、同上］。

ＧＰＩＩｂおよびＧＰＩＩＩａをコードするプラスミド（Ｇ　Ｐ　ｌ１ｂ−ｐＲ Ｋ５およびＧ　Ｐ　ｌ１ｌａ−ｐＲＫ　５　）を２９３８細胞にトランスフェク ションし、以下に記載するような一時的な発現のための通常の条件下で培養した 。この細胞を集め、Ｇ　Ｐ　ｌ１ｂ−１ｌｌａの発現について分析したＦＡＣ３ 選別によって免疫学的に可視化したウェスタン・ゲルにおける正しい大きさのバ ンドの存在、および３５Ｓで代謝的にラベルしたかまたは１２５１表面ラベルに よる無傷細胞の免疫沈澱によって発現を確認した。

実施例２ 末端切除したＧＰＩｌｂをコードしているｃＤＮＡの構築Ｇ　Ｐ　Ｉｌｂの末端 切除された形態を構築するための出発点は実施例１記載のＣＰＩＩｂの完全長の 暗号構築物である。この構築物の関係ドメインを以下に示す。

推定のトランス メンプラン領域 ＬＲＡＬＥＥＲＡ　１ 、、、、、　ＣＴＣＣＧＧ　ＧＣＣＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＧＣＣＡ ＴＴ　、、、、。

、、、、、　ＧＡＧ　ＧＣＣＣＧＧ　ＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＧＧ　ＴＡＡ 　、、、、。

ＥｃｏＲＩ　５ｔｙｌ 上に示したＥｃｏＲ１部位（イニンエーターＡＴＧコドンの上流）から５ｔｙｒ 部位までのＤＮＡフラグメントを単離し、補足的な合成オリゴヌクレオチドに連 結し、こうして得られたＤＮＡ配列が天然ＧｐＨｂ配列のアミノ酸残基９６２（ アルギニン）までをフードしており、次いでこれにＴＧＡ停止コドンが続くよう にした。

Ａ　Ｌ　Ｅ　Ｅ　Ｒ停止 ＣＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＴＧＡ　ＴＧＡ　、ＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣ ＣＡＣＴ　ＡＣＴ　ＴＴＣＧＡＳｔｙｌ　Ｈｉｎｄ［ＩＩ 天然の配列では、アルギニン９６２に約２６アミノ酸の推定の疎水性トランスメ ンブランドメインおよび細胞質ドメインが続いている（Ｐｏｎｃｚら）。即ち、 この構築において、これらドメインの両方を構築物の暗号領域から削除した。こ の合成フラグメントの末端はＨｉｎｄｌｌｌ制限部位で終わっている。ＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄｌｌ＋制限部位で囲まれたこの全ＤＮＡフラグメントを、Ｅｃ ｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化しておいたｐＲＫ５に連結した。発現ベクタ ーＧ　Ｐ　ｌ１ｂｔｒｕｎｃ−ｐＲＫ　５を回収した。

上記のＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントをＧ　Ｐ　ｌ１ｂｔｒｕｎ ｃ−ｐＲＫ　５から取り出し、ＤＮＡ配列決定分析にかけた。挿入体のそれぞれ の末端から２５０塩基余りを配列決定したところ、予想される配列と正確に一致 していた。

末端切除したＧ　Ｐ　ｌ１ｌａをフードしているｃＤＮＡの構築Ｇ　Ｐ　ｌ１ｌ ａの末端切除された形態を構築するための出発点は実施例１記載のＧ　Ｐ　ｆｌ ｌａの完全長の暗号構築物である。この構築物の関係ドメインを以下に示す。

推定のトランス メンプラン領域 Ｘｂａｌ　Ａｐａｌ 上に示したＸｂａ１部位（イニシエーターＡＴＧコドンの上流）からＡｐａＩ部 位までのＤＮＡフラグメントを串離し、補足的な合成オリゴヌクレオチドに連結 し、こうして得られたＤＮＡ配列が天然ＧＰＩ１１８配列のアミノ酸残基６９２ （アスパラギン酸）までをコードしており、次いでこれにＴＧＡ停止コドンが続 （ようにした。

ＧＰＤ　停止 ＣＴ　ＧＡＣＴＧＡ　ＴＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＡ天然の配列では、アスパラギン酸 ６９２に約２９アミノ酸の推定の疎水性トランスメンブランドメインおよび細胞 質ドメインが続いている（ＦｉｔｚｇｅｒａＭら）。即ち、この構築において、 これらドメインの両方を構築物の暗号領域から削除した。この合成フラグメント の末端はＨｉｎｄｌｌ＋制限部位で終わっている。ＸｂａｌおよびＨｉｎｄｌｌ ｌ制限部位で囲まれたこの全フラグメントを、予めＸｂａｌおよびＨｉｎｄｌｌ ｌで消化しておいたｐＲＫ５に連結し、ｔｒｕｎｃ発現ベクターＧ　Ｐ　ｌ１ｌ ａｔｒｕｎｃ−ｐＲＫ　５を回収した。

上記のＸｂａｌ−ＨｉｎｄｌｌｌフラグメントをＧ　Ｐ　ｔｌｌａｔｒｕｎｃ− ｐＲＫ　５から取り出し、ＤＮＡ配列決定分析にかけた。挿入体のそれぞれの末 端から２００塩基余りを配列決定したところ、予想される配列と正確に一致して いた。

真核宿主における末端切除したヒトＧ　Ｐ　１ｌｂ−１１１ａ受容体の発現ＥＰ 　２６０，１４８に記載されている宿主系を用い、ＣａＰＯ，を用いて、ヒト胚 腎細胞（２９３Ｓ）を発現ベクターＧ　Ｐ　ｌ１ｂｔｒｕｎｃ−ｐＲＫ　５およ びＧ　Ｐ　ｌ１ｌａｔｒｕｎｃ−ｐＲＫ　５で同時トランスフェクションした［ Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：　４５６　（１９７３）］。

一時的な発現 ２９３Ｓ細胞をＧ　Ｐ　１ｌｂｔｒｕｎｃ−ｐＲＫ　５、Ｇ　Ｐ　１ｌｌａｔｒ ｕｎｃ−ｐＲＫ　５およびアデノウィルスＶＡ　ＲＮＡ−ＤＮＡ［欧州出願公開 Ｎ　ｏ、　３０９．２３７（１９８９年３月２９日公開）　；　Ａｋｕｓｊａｒ ｖｉｅｔａｌ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　７：　５４９（１９８７）］で 同時トランスフェクンヨンし、スタンダード増殖培地［５０％ダルベツコ改良イ ーグル培地、５０％Ｆ１２混合物、２＋ｎＭＬ−グルタミンおよび１０％ウシ胎 児血清］で増殖させたときに、高レベルの一時的な発現が得られた。グリセロー ルショックを与えて１６時間後に、細胞を血清不含の培地［ダルベツコ改良イー グル培地、０．１％グルコース、１０μｇ／ｍｌインスリン］に移し、さらに４ ８時間増殖させ、細胞および培養培地を集めた。培養した細胞の培養液を遠心し て不純な細胞の残骸を除去し、次いでドライアイス−エタノールで急速凍結し、 分析を行うまで一７０℃で保存した。細胞は、０．６ｍｌの１５０ｍＭ　ＮａＣ １，１０ｍＭ　トリス（ｐＨ７，５）、１％トリトンＸ−１００，２ｍＭＰＭＳ Ｆ、０．５μｇ／ｍｌロイペプチンおよび２μｇ／ｍｌペプスタチンＡに浮遊さ せ、次いで撹拌しながら氷上で３０分間抽出することによって６ｃｍプレートか ら除去した。

１０．０００ｇでの遠心によって細胞の残骸を除き、試料を一７０℃で保存した 。１０倍カラム容量の２０ｍＭＭＥＳ緩衝液／ｌｍＭＣａＣｂ（ｐＨ６、５）と ０〜４００ｍＭ　ＮａＣ１の勾配溶離によるＱ−セファロース（ファースト−フ ロー）クロマトグラフィーによって、可溶性のＧ　Ｐ　ｌ１ｂ−１１１ａを回収 した。ピークの可溶性Ｇ　Ｐ　１ｌｂ−１１１ａは約２００〜２５０１ＭＮａＣ ｌのところで溶出した。この溶出液をＳ−３００カラムのカラム容量の３％まで 濃縮し、次にこの濃縮液を１０ｍＭトリス／１５０ｍＭ　ＮａＣｌ／１ｍＭ　Ｃ ａＣｌ、（ｐＨ７，５）を用いてａ−３５０カラムの排除クロマトグラフィーに かけた。２９３Ｓ細胞にトランスフェクションされた完全長のＧＰＩＩｂの一部 は内生のα９と結合した。可溶性のＧ　Ｐ　Ｉｌｂを可溶性のＧ　Ｐ　ｌ１ｌａ と共に分泌させると、完全長のサブユニットを使用したときのように、αｖＢ３ ビトロネクチン受容体からＢ　Ｐ　ｆｉｂ−１１１ａを精製する必要が避けられ Ｇ　Ｐ　１ｌｂｔｒｕｎｃ−ｐＲＫ　５およびＧ　Ｐ　ｌ１ｌａｔｒｕｎｃ−ｐ ＲＫ　５を同時トランスフェクションすることによって、末端切除したＣ　Ｐ　 ｌ１ｂ−１１１ａを発現する安定な２９３Ｓクローンを樹立した。トランスフェ クションの４８時間後に、細胞を８００ｇｇ／ｍｌ　Ｇ　４１８を含有するスタ ンダード増殖培地に継代した。２週間後に６４１８耐性のクローンを取り、４０ ０ｇｇ／ｍｌ　Ｇ　４１８を含有するスタンダード増殖培地で増殖させた。クロ ーンを血清不含の培地で４８時間増殖させ、培養を行った培養培地につき、ウェ スタンプロット分析によって分泌型のＧ　Ｐ　ｌ１ｂ−１１１ａの発現を調べた 。

発現された末端切除ＣＰ　１ｌｂ−１１１ａの分析一時的にトランスフェクショ ンされた細胞の発現を、パルス−チェース分析とそれに続く免疫法Ｒ（精製した 血小板Ｇ　Ｐ　１ｌｂ−１１１ａに対して生成させたモノクローナル抗体のパネ ルを用いる）によって調べた。３５Ｓ−システィンおよび３５８＝メチオニンで 代謝的にラベルしたタンパク質を、上記のようにＧ　Ｐ　１ｌｂｔｒｕｎｃ−ｐ ＲＫ　５およびＧＰＩ＋Ｉａｔｒｕｎｃ−ｐＲＫ　５の両方で同時トランスフェ クションした細胞の培養液から回収した。マウスモノクローナル抗体Ａ　Ｐ　２ ［ＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙマウスＩｇＧに指向性のウサギＩｇＧ抗体と結合させた プロティンＡ　′セファロースＣＬ　４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とインキ ュベートすることによりて、末端切除したＧ　Ｐ　ｌ１ｂ−１１１ａを細胞培養 液から免疫沈澱させた。

この免疫沈澱させたタンパク質の電気泳動によって、組換えの末端切除Ｇ　Ｐ　 １ｌｂ−１１１ａの分泌が証明され、その大きさは修飾されたｃＤＮＡから予想 される分子量と一致した。Ｇ　Ｐ　Ｊｉｂ−１１１ａコンプレツクス（ＡＰ２） 、Ｇ　Ｐ　１ｌｂ（２Ｄ　２．３Ａ８）およびＧ　Ｐ　ｌ１ｌａ（４Ｂ　１２、 ＡＰ３）に特異的なモノクローナル抗体はすべてＧＰＩＩｂおよびＧＰ１１１ａ 末端切除タンパク質の両方を沈澱させ、組換えの分泌タンパク質がコンプレック スの形態で存在していることを示した。ＤＮＡを与えなかったか、またはＧ　Ｐ 　ｌ１ｂｔｒｕｎｃ−ｐＲＫ　５単独もしくはＧＰ［ＩＩａｔｒｕｎｃ−ｐＲＫ 　５単独を与えた細胞は、ＧＰＩｌｂまたはＧ　Ｐ　ｌ１ｌａに対するモノクロ ーナル抗体によって検出しうるレベルではタンパク質を分泌しない。

一時的にトランスフェクションされた細胞におけるＧＰＩｌｂまたはＧ　Ｐ　ｌ １ｌａの個々のサブユニットの発現はウェスタンプロット分析を用いて証明した 。細胞を上記のように抽出し、上記のように回収した培養培地を限外濾過によっ て２倍に濃縮し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に、 、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：　６８０−６８５　（１９７０）］およびウェスタ ンプロット法［Ｔｏｗｂｉｎら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ　７６：４３５０−４３５４　（１９７９）］によって分析した。Ｇ　Ｐ　 ＩｌｂおよびＧＰＩ目ａに特り　異的なマウスモノクローナル抗体をこの分析に 用いた。ネズミモノクローナルに対して指向性の西洋ワサビベルオキシダーゼー フンジュゲートした抗体を用いて抽出物中の個々のＧ　Ｐ　１ｌｂｔｒｕｎｃお よびＧＰ７　１１１ａｔｒｕｎｃタンパク質を可視化した。

Ｇ　Ｐ　ｌ１ｂ−１１１ａの末端切除構築物を発現する安定なりローンは、つ■ 　ニスタンプｏ　ソト分析により予想される大きさの組換えタンパク質げ　を分 詑・することかわかった。

ｌ　安定なりローンから分泌されるＧ　Ｐ　１ｌｂ−１１１ａ　ｔｒｕｎｃタン パク質がコンプレックスとして存在することは、吸引によって培養培地をニトロ セルロースに直接移した後に、モノクローナル抗体ＡＰ２にょテ　る検出によっ て証明した。

と　末端切除されたＧＰＩＩｂまたはＧ　Ｐ　ｌ１ｌａタンパク質は個々のサブ ユニ・、トとして発現されたときには培養培地中に検出されなかった。

これは、分泌されなかったか、または免疫沈澱もしくはウェスタンプロット分析 による検出を不可能にするレベルまで分泌効率が低下したことによるであろう。

実施例３ 分泌型ヒトＧ　Ｐ　ｌ１ｂ−１１１ａポリペプチドコンプレツクスのフィブリノ ーゲン結合の証明 分泌型の末端切除Ｇ　Ｐ　ｌ１ｂ−１１１ａの機能的な活性を、Ｇ　Ｐ　ｌＩｂ −１１１ａ受容体に対する天然のリガンドであるフィブリ／−ゲンを含むアフィ ニティーマトリックスへのその特異的な吸収によって示す。

ＧＰＩＩｂ〜１１１ａ末端切除ポリペプチドコンプレックスを発現している実施 例２由来の安定なりローンを、血清不含の条件下［Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培養培地、０ ．１％グルフース、１０ａｇ／ｍｌインスリン、１．５μｇ／ｍ１Ｌ−システィ ン、２．４μｇ／ｍ１Ｌ−メチオニン、２００μＣ４／ｍｌ”Ｓメチオニンおよ び２００μＣｉ／ｍｌ　”Ｓ　７ステイ７’３て２０時間増殖させた。培養した 細胞培養液を初めに限外濾過によって濃縮し、次いでフィブリノーゲンアフィニ ティークロマトグラフィーによって精製した。このフィブリノーケンアフィニ゛ ティーカラムは、製造元の推奨法を用い、精製度の高いヒトフィブリ／−ゲンを ＣＮＢｒ活性化したセファロース４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させる ことによって調製した。初めに、濃縮した細胞培養液を対照のトリス／エタノー ルアミン反応させたＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂカラムにかけ、未結合の物 質をフィブリノーゲン−セファロースカラムに直接かけた。１ｍＭｃａ”、１ｍ Ｍ　Ｍｇ”″、２５ｍＭオクチルグルコシド（ＯＧ）および２ｍＭ７ノ化フエニ ルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有するリン酸緩衝食塩溶液を用い、室温で 不純タンパク質を洗い落とした。結合したＧ　Ｐ　Ｉ［ｂ−［１１ａは、１５ｍ ＭＥＤＴＡ、２５ｍＭ０Ｇおよび２ｍＭ　ＰＭＳＦを含むリン酸緩衝食塩水を用 い、室温でカラムから溶離した。次いで、この溶出したＧ　Ｐ　１ｌｂ−１１１ ａを限外濾過によって濃縮し、予想される分子量のサブユニットをオートラジオ グラフィーおよびウェスタンプロット分析［Ｇ　Ｐ　１ｌｂ（３Ａ８）およびＧ 　Ｐ　１ｌｌａ（４Ｂ　１２）に特異的なモノクローナル抗体を用いる］によっ て同定した。このフィブリノーゲンカラムへの結合の特異性は、両方法で測定し た対照カラムからの溶出液中にタンパク質が存在しないことによって示される。

実施例４ ＬＦＡ−１およびＭａｃ−１は、同一のβ鎖（β−２）と別のα鎖（それぞれ、 α−上およびα−Ｍ）を有するインテグリンである。本研究においては、完全長 の鎖を宿主細胞中に導入した。さらに、これらインテグリンのそれぞれのαおよ びβ鎖のトランスメンブランドメインをコードしているＤＮＡを削除し、末端切 除したＤＮＡを同時発現用に宿主細胞中に導入した。

完全長のＬ　Ｆ　Ａ−１のα−り鎖で形質転換しても検出可能な細胞結合のα− りは全く発現されなかったが、末端切除α−りおよび末端切除β−２で、または 末端切除α−Ｍおよび末端切除β−２で同時形質転換すると末端切除へテロニ量 体が分泌される結果になった。おもしろいことに、Ｍａｃ−１の完全長α−Ｍ鎖 単独で形質転換すると細胞表面α−Ｍが生成した。組換えのα−Ｍ鎖が宿主細胞 にとって内生のβ鎖と結合するようになることが考えられるので、この生成物が 安定なα−Ｍ単量体を示すものであるとは確認されなかった。

国際調査報告 、情−、内、ａ＊ｓ−ｃ、Ｉ−−−：　ｐ（７；２５　Ｂ９．３５’、４：国際 調査報告 １　’ １　・

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．複数サブユニットのポリペプチド（ＭＳＰ）の可溶性類似体の製造方法であ って、 （１）該サブユニットの１つをコードしている核酸に突然変異を導入し、この突 然変異した核酸がＭＳＰのアミノ酸配列変異体をコードするようにして、該ＭＳ Ｐがもはや細胞膜にとどまることができないようにし、 （２）工程（１）の核酸で宿主細胞を形質転換し、（３）工程（２）の宿主細胞 を培養し、そして（４）この宿主細胞培養物から生物学的に活性な可溶性ＭＳＰ を回収すること、 を特徴とする方法。 ２．サブユニットが天然において膜アンカードメインを含むものであり、突然変 異が十分な膜アンカードメインを削除または修飾するものであって、このアンカ ードメインがもはやＭＳＰ類似体を細胞膜に固定するに十分な疎水性を持たない ようにするものである請求項１に記載の方法。 ３．サブユニットが非共有結合によって結合している請求項１に記載の方法。 ４．ＭＳＰが、細胞間の付着または細胞外マトリックスタンパク質への細胞の付 着に直接関与しているヘテロ二量体の受容体である請求項１に記載の方法。 ５．ＭＳＰが、ｐ１５０，９５、Ｍａｃ−１、ＬＦＡ−１、またはＧＰＩｌｂ− ＩＩＩａである請求項４に記載の方法。 ６．突然変異が、第１のサブユニットの十分な膜アンカードメインを、ＭＳＰが もはや細胞膜にとどまることができないようにするに十分な親水性を有するアミ ノ酸配列で置換するものである請求項２に記載の方法。 ７．親水性のアミノ酸配列が免疫グロブリンの不変ドメインからなる請求項６に 記載の方法。 ８．突然変異が、マルチマー形成ポリペプチドをコードしているＤＮＡを、ＭＳ ＰサブユニットをコードしているＤＮＡ中に導入することからなるものではない 請求項１に記載の方法。 ９、膜アンカードメインがトランスメンブランドメインである請求項７に記載の 方法。 １０．ＭＳＰが白血球付着受容体である請求項４に記載の方法。 １１．ＭＳＰがＶＬＡ族の一員である請求項４に記載の方法。 １２．ＭＳＰがＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａであり、回収されるＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ がフィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンまたはフォン・ビレブ ランド因子と結合することができるものである請求項５に記載の方法。 １３．ＭＳＰが、配列ＲＧＤを含有するポリペプチドと結合することができるも のである請求項１に記載の方法。 １４．突然変異が、ＭＳＰの少なくとも１つのサブユニットの膜アンカードメイ ンにアミノ酸を挿入すること、このドメインのアミノ酸を置換すること、または このドメインからアミノ酸を削除することからなる請求項２に記載の方法。 １５．膜アンカードメインが削除される請求項１２に記載の方法。 １６．細胞質ドメインが削除される請求項１５に記載の方法。 １７．ＭＳＰがコンセンサスＮ−末端配列Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌ ｅｕ−Ａｓｐを有するサブユニットを含有するか、リガンド結合のために２価の カチオンを必要とするか、またはカルモジュリンのカルシウム結合ドメインに実 質的に相同な配列を有するアミノ酸ドメインを含有するものである請求項１に記 載の方法。 １８．突然変異して膜アンカードメインを削除した第２のサブユニットをコード しているＤＮＡで宿主細胞を形質転換することをさらに含む請求項９に記載の方 法。 １９．ＭＳＰが複数のサブユニットを含有し、天然において膜アンカードメイン を含有するこれらサブユニットのすべてをコードしているＤＮＡを工程（１）に 示したように突然変異する請求項１に記載の方法。 ２０．ＭＳＰサブユニットの１つが２つのジスルフィド結合したポリペプチド鎖 を含有しており、その一方だけが膜アンカードメインを含有している請求項１４ に記載め方法。 ２１．不変ドメインが重鎖不変ドメインである請求項７に記載の方法。 ２２．宿主細胞が、 （１）第１のＭＳＰ鎖と免疫グロブリン重鎖不変ドメインの融合体をコードして いるＤＮＡ、および （２）免疫グロブリンで置換されておらず、第１のＭＳＰ鎖に直接結合すること ができる第２のＭＳＰ鎖をコードしているＤＮＡ、で形質転換される請求項７に 記載の方法。 ２３．細胞膜にとどまることができないＭＳＰポリペプチドのアミノ酸配列変異 体であって、ＭＳＰポリペプチドが２つの変異鎖を含有し、免疫グロブリン不変 ドメインを含有していない変異体。 ２４．細胞膜にとどまることができないインテグリンのアミノ酸配列変異体。 ２５．清浄剤を含まない請求項２４に記載の変異体。 ２６．請求項２４に記載の変異体の滅菌水溶液。 ２７．十分なトランスメンブランドメインが削除され、細胞膜にトランスメンブ ラン挿入することができない、インテグリンサブユニットのアミノ酸配列変異体 をコードしている核酸。 ２８．請求項２７に記載の核酸を含有するベクター。 ２９．ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａをコードしている核酸で許容性の宿主細胞を形質転 換し、この宿主細胞をＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａが細胞膜に蓄積されるまで培養する ことを特徴とするＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａの製造方法。 ３０．ドメインＧＣＣＧＣＣがＧＰＩＩＩａをコードしている核酸の開始メチオ ニンコドンのすぐ５′側に存在している請求項２９に記載の方法。 ３１．ＧＰＩＩＩａをコードしている核酸がプレＧＰＩＩＩａをコードするもの であり、このプレＧＰＩＩＩａシグナル配列中のアルギニン−２５のコドンがＡ ＧＡである請求項２９に記載の方法。 ３２．ＧＰＩＩＩａをコードしている核酸の５′末端の最初の約１００塩基中の ＧとＣの割合がＧＰＩＩＩａｃＤＮＡ中のＧとＣの割合以下に減少させたもので ある請求項２９に記載の方法。 ３３．（１）免疫グロブリンの不変ドメインを含有する配列にＣ−末端で融合し た第１のＭＳＰ鎖、および （２）免疫グロブリンの不変ドメインに融合していない第２のＭＳＰ鎖、 からなる細胞膜にとどまることができないＭＳＰの可溶性アミノ酸配列類似体。 ３４．ＭＳＰ鎖がジスルフィド結合している請求項３３に記載のＭＳＰ。 ３５．非融合の免疫グロブリン鎖をさらに含有する請求項３３に記載のＭＳＰ。 ３６．非融合鎖が可変ドメインが削除された軽鎖であり、融合した不変ドメイン が重鎖不変ドメインである請求項３５に記載のＭＳＰ。 ３７．第１のＭＳＰ鎖のトランスメンプランドメインが削除されている請求項３ ３に記載のＭＳＰ。 ３８．非融合の免疫グロブリン鎖が既知の抗原に結合することができる可変ドメ インを含んでおり、この可変ドメインを含む免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン 不変ドメインと第１のＭＳＰ鎖の融合体にジスルフィド結合している請求項３５ に記載の分泌型の類似体。 ３９．既知の抗原に結合することができるジスルフィド結合した免疫グロブリン の重および軽鎖を含有し、これが免疫グロブリン不変ドメインと第１のＭＳＰ鎖 の融合体にジスルフィド結合している請求項３８に記載の分泌型の類似体。 ４０．ＭＳＰ鎖が免疫グロブリン上科の一員ではない請求項３３に記載の分泌型 の類似体。 ４１．（１）免疫グロブリンの不変ドメインを含有する配列にＣ−末端で融合し た第１のＭＳＰ鎖、および （２）免疫グロブリンの不変ドメインに融合していない第２のＭＳＰ鎖、 からなるＭＳＰの可溶性アミノ酸配列類似体をコードしているＤＮＡで形質転換 した組換え宿主細胞。 ４２．請求項４１に記載の宿主細胞を培養し、この宿主細胞培養物から可溶性の 類似体を回収することからなる方法。