JPH04502327A - 水溶性ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

水溶性ポリペプチドの製造方法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水溶性ポリペプチドの製造方法 本発明はフンブレックスの可溶性受容体の製造に関する。さらに詳しくは、本発 明は細胞マトリックスまたは血漿タンパク質の組換え受容体の合成に関する。
細胞膜は脂質二重層に存在するポリペプチドを含有している。このようなポリペ プチドは、細胞膜にタンパク質を固定するドメイン、1水性のトランスメンブラ ンドメインを、多くの場合、c−末端細胞質配列と共に含有している。通常、こ れらのポリペプチドは1本鎖の分子であるか、または翻訳後のタンパク質加水分 解プロセッシングによって元の1本鎖発現産物から導かれる複数鎖の分子である 。
このような複数鎖のポリペプチドは、ジスルフィド結合によって共有結合してい るのが普通である。しかし、これらポリペプチドの一部は、塩架橋、ファン・デ ル・ワールスカ、疎水性の相互作用などによって互いに非共有結合しており、こ のような場合にはポリペプチドサブユニットのさらに大きな集合体への会合か生 物学的活性のための前提条件である。
このような膜結合した複数サブユニット分子の生物学的活性は異なるが、通常は 受容体または結合機能を反映する。受容体は細胞の外部環境中の物質または状態 を考慮して細胞にシグナルを送るのに役立つか、細胞外物質を内部化するのに役 立つか、または細胞を互いに、細胞外マトリックス物質、細胞表面もしくは血漿 タンパク質に結合させるように機能する。
別のサブクラスに属する膜結合の複数サブユニットのポリペプチドは、それぞれ のサブユニットが異なっており、即ち実質的にホモローガスではな(、別個の遺 伝子によってコードされているポリペプチドである。このようなポリペプチドを 、本発明の目的のためにrMsPJ(i数すブユ1ットボリペプチド)と呼ぶ。
このようなポリペプチドまたは受容体の多数の例が知られているが、最も重要な 群は細胞外マトリックス分子のための細胞表面受容体のクラスであリ、その一部 は現在同定されており、それをコードしているDNAがクローニングされている [例えば、B uckら+ Ann、Rev、Ce1l Biol。
3: 179(1987)およびRuoslahtiら、 5cience 2 38: 491(1987)を参照]。
特に重要なものは、血小板糖タンパク質11b−111a、即ち、血小板凝集に 関与しており、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびフ ォノ・ビレブランド因子に結合する血小板膜結合受容体である。この受容体を構 成する2つのサブユニットが同定されている[F itzgeraldら、 B iochemistry 26: 815g(1987)およびF itzge raldら、J、Biol、Chem、262(9): 3936(1987) コ。B ennettらはCo5−1細胞でのG P Ilbサブユニットの発 現を報告したが、このサブユニットは細胞膜上に見い出されなかった[A HA 第61回科学会議; 1988年11月15日]。B ennetjらは、膜局 在化が1lb−111aコンプレツクスの形成を必要としているのかもしれない と示唆した。
組換えの膜結合G P 1lb−111aを調製することができたなら、それは その適切なリガンド(例えば、フィブリノーゲン)に結合するであろうと教示ま たは示唆するものはなかった。さらに、同じ会議におけるF relinger らの口頭発表は、未同定の組換え細胞表面での完全長G P l1biIlaの 一時的な発現を示すものと主張したが、発表のように発現が得られた方法に関す る他の情報は提供されなかった。
Corbiらは、1988年9月のBoehringer Ingelheim により後援されたTitisee Symposiumにおいて、COS細胞に おける機能的な完全長L F A−1の一時的な発現を口頭で報告した。
膜結合のMSPは、疎水性のドメインがMSPをミセルまたは集合体に誘導する 傾向があるので、精製および安定性に困難を与える。
適切なヘテロニ量体の組立て以上に複数分子集合体を形成することなく、特に血 液などの体液中、および食塩水などの薬理学的担体中で可溶性である形態のこれ ら受容体が必要とされている。即ち、本発明の目的はこのようなMSP形態を合 成することである。
別の目的は、通常のリガンドを適切に結合することができる可溶形態のG P  1lb−111a受容体を得ることである。
さらに別の目的は、組換え細胞培養においてGP目1aを発現させることである 。
また、別の目的は、組換え細胞培養によってG P l1b−111aを高収率 で製造することである。
これらおよびその他の目的は本出願の全体を考慮することによって明らかとなろ う。
本発明によれば、細胞膜結合の複数サブユニットポリペプチド(MSP)(その 各サブユニットは別個の遺伝子によってコードされている)の分泌型類似体を製 造するための方法であって、(1)サブユニットのそれぞれをコードしている核 酸中に、MSPがもはや脂質二重層にとどまることができないようにするMSP のアミノ酸配列変異体をコードしている突然変異を導入し、(2)工程(1)の 核酸で宿主細胞をトランスフェクションし、(3)工程(2)の宿主細胞を培養 し、そして(4)この宿主細胞培養物から生物学的に活性な可溶性MSPを回収 する、 ことを特徴とする方法が提供される。また、本発明によれば、インテグリン鎖の アミノ酸配列変異体、特に、インテグリン鎖のトランスメンブランドメインが修 飾されており、従ってもはや細胞膜にとどまることができない変異体をコードし ている核酸および発現ベクターが提供される。
また、G 、P l1b−[1aの製造方法であって、G P rlb−111 aをコードしている核酸で許容宿主細胞を形質転換し、そしてG P 1lb− 111aが細胞膜に蓄積するまでこの宿主細胞を培養することを特徴とする方法 が提供される。
特定の態様においては、本発明の目的は、(a)不活性化された膜アンカードメ インを有するMSPのアミノ酸配列変異体、および (b)MSPとは異なるポリペプチド(これは、例えば免疫グロブリンの不変ド メインなどの長い血漿半減期を有するタンパク質または免疫原から選ばれる)の 配列に融合したMSPの細胞外ドメインを含有するポリペプチド、 からなる群から選ばれる生物学的に活性なMSPのアミノ酸配列変異体を提供す ることによって達成される。
別の態様においては、MSPまたは本明細書の別のところに記載するMSP類似 体のMSPアミノ酸残基または炭水化物置換体を、共有結合修飾によって誘導体 化するか、またはポリエチレングリコールなどの非タンパク質性ポリマーにコン ジュゲートさせて、改善された循環半減期を示すMSP誘導体を製造する。
具体的な態様においては、インテグリンの生物学的に活性な細胞外ドメインを含 有するポリペプチドをそのC〜末端のところで免疫グロブリンの不変ドメインに 融合させるか、または免疫原性ポリペプチドに連結する。
本発明で提供されるMSP変異体を精製し、診断もしくは調合用に薬理学的に許 容しうる担体中に配合する。
図1 a〜1 rは、M S P G P 1lb−111aの分泌型のGPI lbサブユニットのアミノ酸およびヌクレオチド配列を示すものである。このサ ブユニットの重および軽形態のシグナルプロセッシング部位をそれぞれ矢印−H および矢印−して示す。
図2a〜2dは、MS P G P l1b−111aの分泌型のG P l1 laサブユニツトのアミノ酸およびヌクレオチド配列を示すものである。シグナ ルプロセッシング部位は矢印で示されている。
図3は、G P 1lla遺伝子の5′末端のところで天然および再設計核酸配 列を比較するものである。
本明細書においてMSPとは、その少なくとも1つの鎖が通常は細胞膜に固定さ れており、そしてその少な(とも2つの鎖が別個にコードされている複数鎖のポ リペプチドと定義される。通常、MSPは少なくとも2つの独立した鎖を含有し ており、その2つは細胞膜中に直接入っている。通常は細胞膜中に入っているM SP鎖に1またはそれ以上の別の鎖が共有結合または非共有結合していてもよい が、この別の鎖はそれ自体が膜中に固定されるものであってはならない。通常、 このような鎖は、膜固定されることになる1本鎖の翻訳後プロセッシングによっ て得られる。別個にフードされているサブユニットは単一の翻訳されたタンパク 質の翻訳後プロセッシングによって得られるものではなく、それらのアミノ酸配 列はホモローガスではなく(即ち、このサブユニットの配列は同一ではない)、 また、天然において同一ポリペプチドの二量体または多量体に組立てられないも のである。それとは異なり、これらは独立したmRNAまたはポリシストロン性 メツセージの翻訳によって産生される。
即ち、複数のMSPポリペプチドをコードしている複数の核酸は、天然において は異なるプロモーターおよび他の転写コントロール配列の制御下で見い出される のが普通である。MSPには、細胞付着受容体とも定義される細胞外マトリック ス分子に対する細胞表面受容体が主として含まれる。多数のこれら受容体および それらのリガンド(これらリガンドにはフィブリノーゲンなどの血漿タンパク質 および細胞外マトリックス分子が含まれる)ならびに細胞表面タンパク質(1− CAMなど)が、傷治癒、形態形成移動、発生とは無関係の細胞移動、止血およ び転移に関与している細胞付着現象の中心をなしている。これらの細胞付着受容 体は機能的および構造的特徴によって識別されている。機能的には、通常、これ ら受容体は配列RGDを含むポリペプチドに結合し、ペプチドRGDSまたはR GDVなどのRGD配列を含有する他のポリペプチドとの競合によってそれから 解離する。また、これらはリガンド結合のためにカルシウムなどの2価のカチオ ンを必要とすることが多い。MSPには、T細胞受容体などの免疫グログリン上 材の構成員が含まれることもあるし、また含まないこともある。細胞表面の細胞 内付着相互作用に関与しているMSPの群はインテグリンと呼ばれている[B  uckら。
Ann、Rev、Ce1l Biol、 3.: 179−205(1987) を参照]。
構造的には、このような細胞付着受容体は、第1の1本鎖ポリペプチドまたはジ スルフィド架橋した複数鎖ポリペプチド(α−鎖)が第2の別のポリペプチド( β−鎖と呼ぶ)と非共有結合によって会合してそれによってヘテロマルチマーを 形成している超遺伝子族のマルチマーに属する。これら受容体のα−鎖はそれら のアミノ酸配列に関しては全く異なっており、鳥類インテグリン(バンドl)の αサブユニット;VLAI、2および4のα1、α、およびα4;鳥類インテグ リン(バンド2)およびVLA3のα3;フィブロネクチン受容体およびVLA 5のa+−+LFA−1のa L ; Mac−1のas: p 150,95 のα、;GPIlbのα□α、;ならびにビトロネクチンのα9が含まれる。通 常、β−鎖は3つの群、即ちβ汀鳥類インテグリン(ノンド3);フィブロネク チン受容体およびVLA]、βt[LFA−1/Mac−1; pl 50.9 5]およびβ3(G P 1lb−111aおよびビトロネクチン受容体)に分 類され、それぞれのβ群の構成員は実質的にホモローガスであるか、または同一 である。選択したMSPが、天然では互いに会合しているのがW2Nである2つ (またはそれ以上)の鎖を含んでいるのが好ましいが、これは非天然のヘテロマ ーがコンプレックスを形成しないと推定されるためである。
MSPのそれぞれの鎖はその天然の環境下で分泌シグナルを含有するプレタンパ ク質として発現され、これが受容体の細胞外配向の間にプロセッシングされる。
また、それぞれのサブユニットの少なくとも1つの鎖は、ポリペプチドのC−末 端部分に位置して約10〜30個の疎水性の高い残基(phe、 leu、 i le、 vat、l1lets glyおよびalaなど)を含有するドメイン 、または脂質(例えば、リン脂質)の共有結合付加のための部位として働くポリ ペプチド配列を含有する疎水性のアンカーを有しているであろう。このような膜 アンカー配ハ列またはドメインは、本明細書ではまとめて膜アンカードメインと 呼ぶ。通常、10−100残基のオーダーの短い親水性の細胞質ドメインがトラ ンスメンブランドメインのC−末端に見い出される。
サブユニットなる用語はポリペプチド鎖を意味するものと理解されるべきであり 、あるポリペプチド鎖のドメインまたは機能的なサブ領域を指すものではない。
ある種のMS、Pは他の構造的特徴を共有している。例えば、ある受容体のサブ ユニットはシスティンに富む直列のアミノ酸配列反復(ここでは、約80%以上 のシスティン残基がCP l1laの約2残基のシスティン残基の直列反復内に 並べられる)を含んでおり、また、あるサブユニットはコンセンサスN−末端配 列T yr/ P he/ L eu−A 5n−L eu−A spを有して いるが、またはあるサブユニットはカルモジニリンのカルシウム結合部位に実質 的な配列相同性を有するアミノ酸ドメインを含有している。
さらに、インテグリン上材の上記構成員にホモローガスな受容体がMSPの範囲 内に含まれる。本明細書で定義するホモローガスなる用語は、インテグリン上材 の既知構成員に対して少なくとも実質的に同一のアミノ酸配列の相同性を有する (あらゆる現在既知の構成員があらゆる他の既知の構成員に対して有しているよ うに)インテグリン上材の構成員のポリペプチド配列を有することを意味する。
通常、ホモローガスとは、保存性の置換を考慮に入れることなく最大の相同性が 得られるように配列を並べた後に、約40%以上のアミノ酸の相同性を有するこ とを意味する。
本発明はその一部には、独立してコードされているMSPが、宿主細胞膜中に挿 入するその能力を削除するように修飾されたときに、なお組換え宿主細胞によっ て完全に組立てられ、生物学的に活性な形態で分泌されるという発見に基づいて いる。サブユニットの適切な会合がもはや細胞膜における並置によって促進され ないにもかかわらず、組換え宿主細胞は互いに正しく会合したサブユニットを分 泌し、この組立て物は天然MSPの細胞外ドメインの生物学的活性を示す。さら に、このMSP配列がマルチマー形成ポリペプチドに融合されていないときであ っても適切な組立てが得られた。即ち、外性の架橋ポリペプチド(免疫グロブリ ン鎖など)の助けがないときであってもMSPが正しく会合することが見い出さ れた。
生物学的活性は、天然環境においてMSPが通常結合するリガンドに定性的に結 合する、分泌型MSPの能力の点で定義されるが、分泌型MSPによるリガンド 結合の動力学またはその他の量的な性質が天然細胞結合MSPのものとは異なっ ていることもあることは理解されよう。分泌型のMSPは天然MSPに対して生 成させた抗体と交差反応することができる多数の機能的な免疫エピトープを保持 している可能性が高いが、分泌型のMSPが本明細書で定義する生物学的活性を 示すものとするにはこれだけでは不十分である。即ち、「生物学的活性コな分泌 型のMSPは、そのリガンドに結合する能力も同様に示さなければならない。し かし、本発明に従って製造されるMSPのすべてが、本明細書で定義した意味に おいて生物学的活性を示す必要がある訳ではないことは理解されよう。このよう な生物学的には不活性であるが、しかし例えば免疫学的に活性なMSP類似体は 、診断検定において、MSPに対する抗体の生成において、またはMSPに対す る抗体の精製において用途が見い出される。
本発明は、特にMSPのアミノ酸配列変異体に関する。MSPのアミノ酸配列変 異体は考慮される種々の目的で調製され、これには、MSPのその結合相手に対 する親和性の増大、?v!SPの安定性、精製および調製の容易化(水溶性の増 大および膜親和性の減少を含む)、その血漿半減期の増大、上記のような治療効 率の改善、追加の機能の導入、およびMSPを治療に用いたときの副作用の重さ もしくは発生の軽減などが含まれる。MSPのアミノ酸配列変異体は、挿入、置 換または削除変異体の1つまたは組合せに分類される。それぞれのMSP変異体 または類似体は1つの不活性化された膜アンカードメインを有しており、これは 挿入、置換または削除によって達成されるであろうが、これらの変異体は所望に より天然MSPの1つの鎖の膜アンカードメインを不活性化すること以外のこと に関係している別の突然変異を含んでいることもある。
挿入アミノ酸配列変異体は、MSPに対して外性の1またはそれ以上のアミノ酸 残基がMSP中の予め決めた部位(CまたはN末端を含む)に導入されているも のである。このような変異体は、挿入された位置にMSPにおいて通常見い出さ れる配列以外の配列を含むポリペプチドとMSPの融合体と呼ばれる。いくつか の群の融合体が本発明において意図されている。
免疫学的に活性なMSP融合体は、非MSPエピトープを含有するポリペプチド とMSPからなる。この非MSPエピトープは任意の免疫学的にコンピテントな ポリペプチドである。即ち、融合体を投与しようとしている動物において免疫反 応を誘導することができるか、または非MSPポリペプチドに対して生成させた 抗体と結合することができるあらゆるポリペプチドである。代表的な非MSPエ ピトープはアレルゲン、自己免疫エピトープ、または他の強力な免疫原もしくは 抗原(融合体の投与を受けるものに予め存在する抗体によって認識される)が保 持しているものであり、これには細菌性ポリペプチド(例えば、trpL E  、β−ガラクトシダーゼ)、ウィルス性ポリペプチド(例えば、ヘルペスgDタ ンパク質)などが含まれる。免疫原の融合体は、免疫原ポリペプチドをフードし ているDNAで形質転換された組換え細胞培養によって、またはインビトロの架 橋によって調製される。この免疫原の融合体は、免疫原性配列がペプチド結合に よってMSPまたはそのフラグメントに結合または挿入された融合体であるのが 好ましい。従って、これらの産物は、MSPエピトープとMSPに対して外性の 少な(とも1つのエピトープを含有する直線状のポリペプチド鎖からなる。これ らエピトープをMSP分子またはそのフラグメント中のどこかに導入することが 本発明の範囲内にあることは理解されよう。このような融合体は組換え宿主細胞 において、または2官能性の架橋剤を使用することによって調製するのが好都合 である。架橋剤を用いてMSPを免疫原性ポリペプチドに融合させるのは、この 架橋産物を構造的に均質な形態で合成するのが容易ではないので、直線状の融合 体はどには望ましいものではない。
これらの免疫原挿入体は、薬理学的に許容しうる担体中に配合され、MSPに対 する抗体を生成させるために対象に投与されたときに特に有用であり、次いでこ れらの抗体は診断において、または自体既知の免疫アフィニティー法によるMS Pの精製において有用となる。別法では、MSPの精製において、融合した非M SPポリペプチドの結合相手(例えば、抗体、受容体またはりガント)を用いて 不純な混合物から融合体を吸着させ、次いでこの融合体を溶離し、そして所望な らMSPを例えば酵素切断などによって融合体から回収する。
免疫学的に活性であってもよいし、また活性でなくてもよいその他の融合体には 、成熟MSP配列とMSPに対して異種のシグナル配列との融合体、トランスメ ンブラン修飾されたMS P(このMSPが細胞膜にとどまれないようにする配 列の削除または修飾を含む)と例えば高められた血漿半減期(通常は〉約20時 間)を有するポリペプチド(高められた血漿半減期を与える免疫グロブリン鎖ま たはそのフラグメントなど)との融合体が含まれる。
シグナル配列との融合は、MSPの分泌を一層迅速にするために行われる。異種 のシグナルを天然のMSPシグナルと置換し、得られた融合体が宿主細胞によっ て認識、即ちプロセッシングされ、切断されたときに、MSPが分泌される。シ グナルは意図している宿主細胞に基づいて選択され、これには細菌、酵母、哺乳 動物およびウィルス配列が含まれる。天然のMSPシグナルあるいはヘルペスg D糖タンパク質シグナルが哺乳動物発現系で使用するのに適している。
修飾された膜アンカードメインを有する可溶型のMSPの血漿半減期よりも長い 高められた血漿半減期を有する血漿タンパク質には、血清アルブミン、免疫グロ ブリン、アポリポタンパク質、およびトランスフェリンが含まれる。融合に使用 されるMSP−血漿タンパク質は、それが使用される動物において免疫原性が有 意なものではなく(即ち、治療対象に対してホモローガスであり)、また、この 血漿タンパク質はその正常な生物学的活性の故に患者に望ましくない副作用を引 き起こすものではないのが好ましい。
ある具体的な態様では、MSPの細胞外ドメインを免疫グロブリンの不変領域配 列とコンジュゲートさせる。免疫グロブリンおよびそのある種の変異体が既知で あり、多数が組換え細胞培養において調製されている。例えば、米国特許4,7 45,055. EP 256,654; Faulknerら、Nature  29g+ 286(19g2); E P 120,694; E P 12 5,023; Morrisonら、J、Immun、123: 793(19 79): Kdhlerら、P、 N、 A、 S、 USA 77: 219 7(1911tO)HRa5oら、Cancer Res、41: 2073( 1981); Morrisonら* Ann、Rev、ImmunOl、2:  239(1984); Morrisonら、5cience229: 12 02(1985); Morrisonら、P、N、A、S、USA 81:  6851(1984);E P 255.694; E P 266.663; およびWo 88103559を参照。また、再分類された免疫グロブリン鎖も 既知である。例えば、米国特許4゜444.878: Wo 88/(1356 5;およびEP 6g、763ならびニコれらに引用された文献を参照。さらに 、G ascoigneら、 P、N、A、S、USA 84: 2936−2 940(1987年5月); EP 325,224;およびAndrew 5 cott Petersonの論文(Harvard University;  1988年11月22日に学位が与えられた)をも参照。
通常、MSPの細胞外ドメインはそのC−末端で、免疫グロブリンの不変領域の N−末端にその可変領域の代わりに融合しており、免疫グロブリン重鎮の不変領 域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、CH2およびCH3ドメインは保持して いる。2種類の形態のこのような融合体が本発明に包含されている。その1つに おいては、2またはそれ以上の通常の膜結合MSP鎖の細胞外ドメインがNまた はC末端で免疫グロブリンネ変領域に融合しており(ペテロ融合)、一方、他の 形態では、MSPの1つの鎖だけが不変領域に融合している(モノ融合)。この ペテロ融合には、軽もしくは重鎮不変領域のいずれか、または両者との融合が含 まれる。このペテロ融合体は、軽鎖融合体、重鎮融合体または両者をコードして いるDNAで宿主細胞を形質転換することによって得られる。例えば、重鎮不変 領域に融合させた1つのMSP鎖と軽鎖不変領域に融合させた他のMSPMをコ ードしているDNAでトランスフェリンタンすると、MSP鎖との軽および重鎖 融合を有するヘテロ四量体またはへテロニ量体が得られよう。これらは生物学的 に活性である可能性がそれほど高くないので、モノ融合はどには望ましくない。
モノ融合体は1を越える融合鎖を含有することもできるが、この場合にはMSP 鎖は常に同一のサブユニットに由来するであろうことに注意すべきである。
モノ融合体は免疫グロブリン変異体であり、MSPの1つの鎖が重または軽鎖( またはその不変ドメイン)に融合しているが、MSPの残りの鎖が免疫グロブリ ンに融合しておらず、代わりに、実質的に天然MSPの場合に普通であるような 方法で融合鎖と会合している。通常、モノ融合体中の融合および非融合MSP鎖 の両者は、膜アンカードメインが膜中に存在しないように修飾された変異体であ り、最も普通には、1つのMSP鎖の膜アンカードメインが削除され、他方の膜 アンカードメインが削除されて次いで残存する細胞外領域がそのN−末端で免疫 グロブリンネ変ドメインのC−末端に融合している。このMSP鎖またはそのフ ラグメントは軽鎖または重鎮のいずれかに融合しているが、重鎮に融合している のが好ましい。
MSPが1つの膜アンカードメインだけを含有しているときには、残りの鎖は通 常その天然の配列を有しているであろう。
免疫グロブワンの抗原結合能力ならびにMSPリガンドに結合する能力を有する モノまたはポリ融合体を得るのが望ましいこともある。このような産物は、抗原 と結合することができる軽および重鎖(または、それまでに軽鎖を産生ずるよう に選択される)を軽および/または重鎖MSP融合体および非融合MSP鎖(モ ノ融合体の場合)と共にコードしているDNAで宿主細胞を形質転換することに よって調製される。これによって、例えば免疫グロブリンの一方または両方の軽 −重アームがMSPの1つの鎖との融合からなり、次いでこれがMSPの残りの 鎖と組立てられる(共有結合または非共有結合によって)ことを除いて免疫グロ ブリンの正常な構造を有する構築物が得られるであろう。
融合形質転換体がMSPサブユニットに融合していない免疫グロブリン鎖をも産 生ずる(または、産生ずるように形質転換される)場合には、この免疫グロブリ ンの可変ドメインはある抗原に対して未知または既知の特異性を有していてよい 。宿主細胞は構成的に未決定の抗体を調製することができないものであって、抗 体を産生ずるときには既知の免疫グロブリンをコードしているDNAによる形質 転換によってであるものが好ましい。このような免疫グロブリン(重鎮ならびに 軽鎖の両方を含んでいてもよい)は、既知の抗原に対して特異性を示す。別法で は、これらのコンパニオン免疫グロブリン鎖は、機能的な可変または超可変ドメ インを欠いているであろう(マルチマーの組立ては可能であるが、抗原結合活性 はないように)。
例えば、無傷の重および軽鎖コンパニオン免疫グロブリンを発現しつる宿主細胞 から分泌され、回収することができる生成MSP融合体は、抗原結合機能とMS P機能を保持しているであろう。このような産物はMSPリガンドと任意の所望 の抗原との架橋を容易にするであろう。宿主細胞は、そのような多重形質転換に おいて1を越える免疫グロブリン産物を調製し、従って、あるマルチマー形態を 他の形態から回収することが必要となろう。しかし、これはMSPリガンド、抗 原もしくはその両方に基づくアフィニティークロマトグラフィーによる、または ゲルもしくは他のクロマトグラフィー法による分離を必要とする通常の必要事項 であろう。
免疫グロブリン鎖の代わりにトランスフェリン、アルブミン、アポリポタンパク 質またはその他の配列を用いることを除き、延長された血漿半減期を有する他の タンパク質を同様の方法でMSPに融合する。通常はマルチマーに組立てられな い1本鎖の血漿タンパク質にMSP鎖を融合するときにはモノ融合体が好ましい 。
通常、MSPの細胞外ドメインの境界は膜アンカードメインのN−末端であるか 、またはそれからN−末端約20残基内であり、MSP配列の精査によって容易 に同定される。しかし、比較的小さなセグメントがリガンド結合に十分であるこ とが普通に見い出されているので、全MSP細胞外ドメインを使用する必要はな い。このようなセグメントは、削除突然変異体または酵素消化物を調製し、リガ ンド結合についてスクリーニングして活性フラグメントを同定することにより常 法によって同定され、rMSPJなる用語の範囲内に含まれる。
通常、MSPの細胞外ドメインはそのC−末端で、免疫グロブリンネ変領域また は他の安定な血漿タンパク質のN−末端に融合される。融合が行われる正確な部 位は必須ではなく、可溶性MSPの分泌または結合の性質を最適なものにするた めに、成熟N−末端の血漿タンパク質のC−末端または細胞外領域の内部または それに隣接する他の部位を選択することもできる。この最適部位は通常の実験に よって決定されるであろう。
本発明に従って製造されるヘテロおよびキメラのMSP−免疫グロブリン変異体 の例を以下に図式的に示す。rAJはリガンド結合部位を含むMSPの細胞外ド メインの少なくとも一部を意味し;A3、A1、A3などはAの個々のサブユニ ット鎖を示し; Vt、、vHXCt。
およびCI(は免疫グロブリンの軽鎖または重鎮の可変または不変ドメインを示 し、nは整数であり;そして、Yは共有結合架橋部分を示す。
(c)ACa−[ACH,ACL−ACH,ACL−VHCH,VLCL−AC +4.またはvLCL−VHCHコ;(d)AC+、−ACo−[ACH,AC L−ACII、 ACL−VHCI4. VLCL−ACH9またはVLCL− VMCII] :(e) AcL−VoCH−[ACo、 ACL−ACH,A CLJHCH,kct−ACh、またはVt、Ct−V−CJ :(f)VLC t−ACM−[ACo、 ACL−ACM、 ACL−VHCH,VLCL−A CH,またはVLCL−VHC−1] :また■ (g)[A−Y]n−[vLCL−VHCH]t。
この表に示した構造は重要な特徴のみを示すものであり、これらはジスルフィド 結合を示していない。これらは簡潔にするために削除した。しかし、そのような ドメインが結合活性に必要であるところでは、免疫グロブリンドメイン中でそれ らが占める通常の位置にそれらは存在しているものとする。これらの例としては 2価の抗体が代表的である。さらに複雑な構造が他のクラス(例えば、IgM) に由来する免疫グロブリン重鎮配列を使用することから生じる。フンバニオン免 疫グロブリンとも呼ばれる免疫グロブリンVLVH抗体結合部位は予め決めた抗 原に結合しうるものであるのが好ましい。
免疫グロブリン構築物の例を以下に図式的に示す。垂直の線は非共有または共有 結合の関係を示している。
(h) (1) (n) (o) [ここで、CHvドメインは削除 されているコ 好都合なコンパニオン免疫グロブリン結合部位および融合相手はヒトIgG−1 、−2、−3もしくは一4サブタイプ、IgAS IgE。
IgDまたはIgMから得られるが、好ましいのはIgC;−1である。
可溶型のIgM、またはIgMの膜アンカードメインを修飾してもはや膜にとど まることができないようにしたものを用いるのが好ましい。
好ましい態様は、IgGFcを化学的に規定するパパイン切断部位[重鎮不変領 域の最初の残基を114として残基216 CK abatら。
”5equences or Proteins of Immunologi caI Interest″、第4版、 1987年)、または他の免疫グロブ リンの類似の部位]のすぐ上流のヒンジ領域において始まる配列とMSPのN− 末端部分の融合体である。
免疫グロブリンまたは他の血漿安定性ポリペプチドを1またはそれ以上のMSP サブユニットのC−末端に、通常はMSP鎖の少なくとも1つのトランスメンブ ランおよび細胞質ドメインの代わりに融合されるが、1つのサブユニットだけを 置換するのが普通である。
G P 1lb−111aの場合には、これはβサブユニットであろう。また、 重鎖などの免疫グロブリンドメインを、末端切除または無傷の免疫グロブリン重 鎮と普通の方法で結合させることができる。
免疫グロブリン鎖の可変領域の代わりにMSPの細胞外ドメインが置換されてい る変異体は、改善されたインビボの血漿半減期を示すものと考えられる。これら のキメラは、ある種の抗体由来の可変ドメインを別の種の可変ドメインの代わり に置換するキメラ抗体と同様の方法で構築する。例えば、E P O12502 3; Munro[Nature312 (1984年12月13日)]; N  eubergerら[Nature 312 (1984年12月13日)]  ; S haronら[Nature 309 (1984年5月24日)] ; Morrisonら[Pr。
! 229: 1202−1207(1985)]:および、B oulian neら[Nature 312: 643−646(1984年12月13日) コを参照。MSPの細胞外ドメインをコードしているDNAを、制限酵素により 、このドメインをフードしているDNAの3′末端もしくはその近接点で、およ び成熟MSPポリペプチドのN−末端をコードしているDNAのところもしくは その近接点(異なるリーダーの使用が意図されているとき)で、またはMSPの N−末端暗号領域のところもしくはその近接点(天然のMSPシグナルを使用す るとき)で切断する。次いで、このDNAフラグメントを、例えば免疫グロブリ ンの軽鎖または重鎮不変領域をコードしているDNA中に挿入し、そして必要な ら削除突然変異誘発によって加工するのは容易である。好ましくは、これはヒト 免疫グロブリンである。免疫グロブリンの軽鎖または重鎮不変領域をコードして いるDNAは既知であるか、またはcDNAライブラリーから入手するのが容易 であるか、または合成される。例えば、A damsら[Biochemist ry 19: 2711−2719(1980)] ; Goughら[Bio chemistry 19: 2702−2710(1980)] ; Dol byら[p、N、A、s、usA77: 6027−6031(1980)]: Riceら[P、 N、 A、 S、 USA 79: 7862−7865( 1982)] ; F alknerら[匝e 298: 286−288(1 982)] :および、Morrisonら[Ann、 Rev、 1mmun ol。
罎239−256(1984)]を参照。
キメラ鎖をコードしているDNAを発現用の宿主細胞中にトランスフェクション する。宿主細胞がトランスフェクション前に免疫グロブリンを産生じているとき には、ヘテロ抗体を産生させるためには軽鎖または重鎮に融合させたMSPでト ランスフェクションすることが必要になるだけである。MSPドメインを保持す る1またはそれ以上のアームおよびコンパニオン可変領域を保持する1またはそ れ以上のアームを有する前記の免疫グロブリンにより、MSPリガンドおよび抗 原に対する2つの特異性が得られることになる。これらは上記の組換え法によっ て、またはインビトロの方法によって得られる。後者の場合には、例えば自体既 知の方法に従い、免疫グロブリンおよびMSP融合体のF (ab’ )tフラ グメントを調製し、このF (ab’ )tフラグメントを穏やかな還元条件の もとての還元によってFab“フラグメントに変換し、次いで酸性条件のもと互 いの存在下で再酸化する[米国特許4.444.878をも参照]。
さらに、異なる特異性を有する免疫グロブリンから無傷のへテロ抗体を製造する 方法が知られている。これまでに使用されていたいずれかの免疫グロブリンの代 わりにMSP融合体を単に置換することによって、これらの方法をヘテロキメラ 抗体のインビトロ製造用に採用する。
また、ヘテロ機能性の抗体を製造する別の方法においては、MSP−免疫グロブ リン融合体を産生ずる宿主細胞(例えば、トランスフェクションされたミエロー マ)を、ある抗原に対する所望のコンパニオン特異性を有する抗体を分泌するハ イブリドーマまたはB細胞と融合させる。ヘテロ二機能性抗体がこのようなハイ ブリドーマの培養培地から回収され、従って通常のインビトロ法によるよりも若 干好都合に製造することができる(E P 68,763)。
別の群のMSP変異体は削除変異体である。削除は、MSP配列から1またはそ れ以上のアミノ酸残基を除去することを特徴とする。
通常、全MSPサブユニットの膜アンカーおよび細胞質ドメインが削除される。
しかし、MSPのマトリックスタンパク質またはリガンド結合能力を保存してい るトランスメンブランのN−末端側の他のあらゆる部位が適している。削除変異 体の範囲から除外されるのは、これまでMSPのアミノ酸配列を解明する過程で 得られることもあったタンパク質消化フラグメントである。
(以下、余白) 置換変異体は、MSP配列中の少なくとも1つの残基が除去され、その位置に別 の残基が挿入されているものである。通常、MSPの性質を微妙に調節する結果 になる置換を以下の表1に示す。
A sn gin ; his Hisasn ; gin L y8 arg ; gin ; gluMet ’ leu : i le P he met ; leu ; tyr表1の置換より保存性が少ない置換 を選択することによって、即ち、(a)置換領域におけるポリペプチド骨格の構 造、例えばシートまたは螺旋の立体配座、(b)標的部位における分子の電荷ま たは疎水性、または(c)側鎖の大きさ、を維持するその作用がもっと有意に異 なっている残基を選択することによって、機能または免疫学的な独自性の実質的 な変換が行われる。通常、MSPの性質に最大の変化をもたらすと予想される置 換は、(a)親水性の残基(例えば、セリルまたはトレオニル)が、疎水性の残 基(例えば、ロイシル、インロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニ ル)に代えて(または、によって)置換されているもの:(b)システイニルま たはプロリルが他のいずれかの残基に代えて(または、によって)置換されてい るもの;(C)電気陽性の側鎖を有する残基(例えば、リジル、フルギニルまた はヒスチジル)が、電気陰性の残基(例えば、グルタミルまたはアスパルチル) に代えて(または、によって)置換されているもの;または(d)大きな側鎖を 有する残基(例えば、フェニルアラニル)が、側鎖を有さない残基(例えば、グ リシル)に代えて(または、によって)置換されているものであろう。
好ましい群の置換または削除変異体は、MSPの膜アンカー領域カ関係している 変異体である。MSPサブユニットのトランスメンプラン領域は、細胞膜の脂質 2M層をまたぐに適切な大きさの疎水性または親油性の高いドメインである。こ れらはMSPを細胞膜に固定するものと考えられている。他の細胞表面分子が、 リン脂質アンカーによるように、脂質の修飾によって固定される。
膜アンカードメインの削除または置換は、MSPの細胞または膜脂質親和性を減 少させ、その水溶性を改善することによって、可溶型のMSPを与え、その回収 を容易にするであろう。膜アンカードメインが削除されるときには、身体によっ て外来と認識されるであろう他の点では細胞内であるポリペプチドの暴露または 免疫原の可能性がある異種ポリペプチドの挿入のいずれかによる、免疫原の可能 性力あるエピトープの導入を避ける。膜アンカードメインが削除されたMSPの 主な利点は、それが組換え宿主の培養培地中に分泌されることである。この変異 体は血液などの体液に可溶性であり、細胞膜脂質に対して検出しつるほどの親和 性を有さず、従ってこれを組換え細胞培養物から回収するのをかなり簡単なもの にする。驚くべきことに、もはや細胞膜中に安定に挿入することができないよう に膜挿入鎖が修飾されたMSPは、このMSP鎖が免疫グロブリンなどのマルチ マー形成配列に融合されていないときであっても、適切に会合し、組換え宿主細 胞から分泌されうる。マルチマー形成配列は、天然において非融合形態にあると きに共有または非共有結合の複数鎖構造を形成する複数績ポリペプチドの部分を 含有する複数績のボッペプチドである。
置換、削除、挿入またはこれらの任意の組合せを導入して最終的な構築物に至る ことは上記の説明によって十分に明らかであろう。
これら変異体はいずれも機能的な膜アンカードメインを有しておらず、また好ま しくは機能的な細胞質配列を有していないであろう。
通常、これは関連ドメインの削除によって達成されるが、適切な挿入または置換 変異体もこの目的に有効である。例ノ、ば、トランスメンブランドメインを、全 体として親水性のハイドロパシープロフィールを示す約5〜50のセリン、トレ オニン、リジン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸などの親水性残基か らなるランダムな配列または予め決めた配列などの任意のアミノ酸配列によって 置換する。削除された(末端切除された)MSPと同様、これらの変異体は組換 え宿主の培養培地に分泌される。
MSP変異体はMSPをコードしているDNA中のヌクレオチドの部位特異的な 突然変異誘発によって製造するのが好都合である。
これによって変異体をフードしているDNAを得、次いで組換え細胞培養でこの DNAを発現させる。明らかに、変異MSPをコードしているDNA中の変化は この配列を読み枠の外側に置くものであってはならず、また好ましくは、発現に 有害な2次的なo+RNA構造を生じることもある相補領域を創製しないもので あろう(EP75,444A)。通常、MSP変異体は天然の原型が示す活性と 同じマトリックスまたはリガンド結合活性を示すが、上に示したようなMSPの 性質を修飾するためにも変異体を選択する。
アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決めるが、突然変異自体は予め決める必 要がない。例えば、ある部位での突然変異の効果を最大にするため、ランダムま たは飽和突然変異誘発(ここでは、可能性ある20残基のすべてが挿入される) を標的コドンまたは領域で行い、発現したMSP変異体を目的活性の最適組合せ についてスクリーニングしてよい。
マトリックスタンパク質またはリガンドに結合することができないMSP変異体 はそれでも、少なくとも1つのMSPエピトープが活性のままである限り、MS Pに対する抗体を生成させるための免疫原として、または免疫検定キットの成分 (ラベルして天然MSPの競争試薬として、または未ラベルでMSP検定の標準 として)として有用である。
1またはそれ以上のMSPサブユニットが非タンパク性ポリマーとコンジュゲー トしているM’S PまたはMSPのアミノ酸配列もしくはグリコジル化変異体 (上に既述した変異体を含む)が本発明に意図されている。MSPとコンジユゲ ートする非タンパク性ポリマーには天然または出発のMSP中の同一位置に存在 するオリゴサツカリドが含まれないことは理解されよう。即ち、このポリマーは MSPに対して外性または異種のものである。
炭水化物置換基の位置を変えるか、またはその数を増加させるために、MSPポ リペプチドの部位指向性の突然変異誘発によってグリコジル化部位を移動、追加 または削除することは本発明の範囲内に含まれる。選択した炭水化物を添加する (または、全くグリコジル化しない)宿主細胞を選択することによって、または インビトロの酵素消化によって、常法により炭水化物の性質を修飾する。
通常、非タンパク性のポリマーは親水性の合成ポリマー、即ち他の方法では天然 に見い出されないポリマーである。しかし、天然に存在するポリマーてあって組 換えもしくは種々の方法により製造されるポリマーが、天然から単離されるポリ マーと同様に有用である。
親水性のポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピ ロリドンが本発明の範囲内にある。特に有用なポリマーは、ポリエチレングリコ ール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンエステルもしくはメトキ シポリエチレングリコールなどのポリアルキレンエーテル:ポリオキシエチレン 、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの ブロックコポリマー(プルロニック)などのポリオキシアルキレン;ポリメタク リレート;カルボマー;サツカリド単量体であるD−マンノース、DおよびL− ガラクトース、フフース、フルクトース、D−キシロース、L−アラビノース、 D−グルクロン酸、シアル酸、D−ガラクツロン酸、D−マンヌロン酸(即ち、 ポリマンヌロン酸またはアルギン酸)、D−グルコサミン、D−ガラクトサミン 、D 。
−グルツースおよびノイラミン酸からなる分岐型もしくは非分岐型のポリサツカ リド[ラクトース、アミロペクチン、スターチ、ヒドロキシエチルスターチ、ア ミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、も しくは酸性ムコポリサツカリド(例えば、ヒアルロン酸)のポリサツカリドサブ ユニ、ツトなどのホモポリサツカリドおよびヘテロポリサプカリドを含むコ;ポ リソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコールのポリマー;および 、ヘパリンである。ポリサツカリドに、天然のグリコシル化もしくはMSPの組 換え発現に付随するグリコジル化がなされている場合には、通常の置換部位はM SPのNまたは○結合グリコジル化部位以外の位置にあるか、またはこのMSP 変異体は追加もしくは置換のNまたはO結合部位が分子中に導入されているアミ ノ酸配列変異体である。
このようなポリマーの混合物を用いるか、またはこのポリマーは均質なものであ ってもよい。架橋前のポリマーは水溶性である必要はないが(水溶性であるのが 好ましい)、最終フンシュゲートは血液などの生物学的液体に可溶性でなくては ならない。さらに、治療用にはこのポリマーはMSPに結合したときに高い免疫 原性を有していてはならず、静脈内注入もしくは注射による投与が意図されてい るときにはそれに適合しない粘度を有していてはならない。
このポリマーはMSPと反応する基を1つだけ含んでいるのか好ましい。これが MSP分子の架橋を避けるための助けとなる。しかし、反応条件を最適なものに して架橋を減少させるか、または反応生成物をゲル濾過もしくはクロマトグラフ ィー・シーブによって精製して実質的に均質な誘導体を回収することが本発明の 範囲内に含まれる。
ポリマーの分子量は約100から500,000の範囲であり、好ましくは約1 ,000から20,000の範囲である。選択される分子量はポリマーの性質お よび置換の程度に依存するであろう。一般に、ポリマーの親水性が高(なり置換 の度合が大きくなるほど、使用可能な分子量は小さくなる。最良の分子量は通常 の実験により決定されるであろう。通常、MSP−ポリマーフンシュゲートの分 子量は約70,000を越えるものであろうが、より低分子量の分子が適当であ る。
通常、ポリマーは、ポリマーおよびMSPの1もしくはそれ以上のアミノ酸もし くは糖残基と反応する多官能性架橋剤によりMSPに共有結合させる。しかし、 誘導体化したポリマーをMSPと反応させるか、もしくはその逆によりポリマー をMSPに直接架橋させることも本発明の範囲内にある。
適切なMSPの共有結合架橋部位はN−末端アミノ基およびリジン残基上にある ε−アミ7基であるが、他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルヒドリル、ヒ ドロキシルまたは他の親水性の基も有用な置換部位として作用する。多官能性( 通常は2官能性)の架橋剤を用いずに、ポリマーをMSPに直接共有結合させる こともできる。
このような架橋剤の例には、1.1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエ タン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4 −アジドサリチル酸とのエステル、3,3′−ジチオビス(スクシンイミジルー プロビオ不一ト)などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ2官能性イミド エステルおよびビス−N−マレイミド−1,8−オクタンなどの2官能性マレイ ミドが含まれる。メチル−3−[(p−アジド−フェニル)ジチオ]プロピオイ ミデートなどの誘導化剤は、光の存在下で架橋を生成させることができる光活性 化が可能な中間体を与える。別法では、米国特許第3.959,080号;3, 969,287号: 3,691,016号;4.195,128号: 4,2 47,642号;4,229,537号:4.055.635号および4,33 0,440号に開示されている臭化シアンにより活性化された炭水化物などの反 応性の水溶性マトリックスおよび系を、ポリマーおよびMSPの架橋用に適切に 修飾する。
MSPアミ7基に対する共有結合は、塩化シアヌリン、カルボニルジイミダゾー ル、アルデヒド反応性基(PEGアルコキシキンブロモアセトアルデヒドのジエ チルアセタール;PEG+DMSOおよヒ無水酢酸、または塩化PEG+4−ヒ ドロキシベンズアルデヒドのフェノキシト、スクシンイミンル活性エステル、活 性化ジチオカルボネートPEG、2.4.5−)リクロロフエニルりロロホルメ ートまたはp−ニトロフェニルクロロホルメート活性化PEGに基づく既知の化 学により行われる。カルボキシル基はカルボジイミドを用いるPEG−アミンの 結合により誘導化される。
オリゴサツカリドをビオチンもしくはアビジンでラベルする目的でHeitzm annら[p、 N、 A、 S、71 : 3537−3541(1974) ]またはBayerら[ルロhods in Enzymology 62:  310(1979)]が開示した方法と同じ方法で、化学酸化(例えば、メタペ リオデート)または酵素酸化(例えば、グルコースオキシダーゼもしくはガラク トースオキシダーゼ)によつて炭水化物のアルデヒド誘導体を得、続いてヒドラ ジドもしくはアミノ誘導化ポリマーと反応させることによってオリゴサツカリド 置換基にポリマーをコンジュゲートさせる。さらに、オリゴサツカリドおよびポ リマーを結合させるためにこれまで用いられていた他の化学法もしくは酵素法も 適しているであろう。置換されたオリゴサツカリドが特に有利であるが、これは 、誘導体化のためにはアミノ酸部位より少ない炭水化物置換基しか存在しないの でコンジュゲートの安定性、活性および均質性が改善されるためである。最後に 、ポリマーの誘導体化の前に、または最終産物として、MSPオリゴサツカリド 置換基を酵素によって、例えばメイラミニダーゼ消化によって修飾して糖を除去 する。
このポリマーは、MSPのアミノ酸側鎖またはNもしくはC末端と直接反応する 基、または多官能性架橋剤と反応する基を有するであろう。一般に、このような 反応性基を有するポリマーは、固定化タンパク質の調製用に知られている。この ような化学を本発明で使用するためには、これまでタンパク質の固定化に用いら れていた不溶性のポリマーと同じ方法で誘導体化した水溶性のポリマーを用いる べきである。臭化シアンによる活性化は、MSPにポリサツカリドを架橋させる のに用いる特に有用な方法である。
出発ポリマーについて用いる「水溶性」なる用語は、フンシュゲート反応に用い られるポリマーまたはその反応性中IJi体が、MSPとの誘導体化反応に関与 するに十分な水溶性を有することを意味する。
MSPの置換の程度は、タンパク質上の反応性部位の数、使用されるMSPが無 傷かまたは先端切除されているか、MSPがMSPに対して異種のタンパク質と の融合物であるか否か、分子量、ポリマーの親水性およびその他の性質、および 選択した特定の部位に依存して変化するであろう。通常、フンシュゲートのMS P部分は約1〜10ポリマー分子で置換されるが、MSP部分の活性に有意な悪 影響を与えない限り、MSPに融合される任意の異種配列は本質的に限定されな い数のポリマー分子で置換することができる。最適の架橋度は、時間、温度およ び他の反応条件を変えて置換の程度を変化させ、次いでマトリックスタンパク質 またはリガンドに結合するコンジュゲートの能力を測定する実験マトリックスに より容易に決定される。
PEGなどの非タンパク性のポリマーでタンパク質を共有結合修飾するための自 体既知の多種多様の方法により、ポリマー、例えばPEGをMSPに架橋させる 。しかし、これらの方法の一部は本発明の目的にとって好ましくない。塩化シア ヌリンの化学(法)はタンパク質の架橋を含む多くの副反応をもたらす。さらに 、スルヒドリル基を含むタンパク質の不活性化を招く可能性が特に挙げられよう 。
カルボニルジイミダゾールの化学[Beauchampら、 Anal、 Bi ochem、 131・25−33(1983)]は高いpH(>8.5)を必 要とし、これはタンパク質を不活性化しうる。さらに、「活性化PEGJ中間体 は水と反応しうるので、タンパク質に対して大過剰モルの「活性化PEG」が必 要となる。通常、アルデヒドの化学(Royer、米国特許第4.002.53 1号)は、40倍モル過剰のPEGと1〜2時間のインキュベートのみを必要と するので好ましい。しかし、PEGアルデヒドの製造用にRoyerにより示さ れた二酸化マンガンは、「金属ベースの酸化剤とでコンプレックスを形成するP EGの傾向が明らかであるため」[Harrisら、J、Polym、Sci、 、Po1y+n、Chem、Ed、22: 341−352(1984)]問題 がある。DMSOおよび無水酢酸を用いるMoffatt酸化を用いることによ り、この問題が回避される。さらに、Royerにより示された水素化ホウ素ナ トリウムは高いpHで用いなければならず、ジスルフィド結合を減少させる著し い傾向がある。これに対して、ナトリウム・シア/ボロヒドリドは中性pHで有 効であり、ジスルフィド結合を減少させる傾向はほとんどない。
通常、本発明のMSPフンシュゲートはゲル濾過によって未反応の出発物質から 分離する。最も簡便には、MSPコンジュゲートをアルキルセファロースなどの 疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から、減少性の塩勾配液により溶離する 。この方法は、上述のゲル濾過法と同様、置換度に基づいてフンシュゲートを分 離する。
MSPをコードしているDNAは既知の方法によって、はとんどの場合、MSP をコードしているDNAを記載している刊行物を参照することによって得られる 。通常は、原核生物をMSP変異体のDNA配列をクローニングするために用い る。例えば、M13ファージを増殖させるための大腸菌(E、coli) J  M 101の耐性株[Messingら、 Nucl、Ac1ds Res、ジ (2): 309−321(1981)]および大腸mK12株294 (A  T CCNo、 31446)が特に有用である。使用可能な他の微生物株には 大腸菌BまたはUMIOIが含まれる。これらの例は限定のためのものではなく 例示のためのものである。また、核酸は周知の種々のインビトロ増幅法を用いて クローニングする。
変異MSPをコードしているDNAを、発現のため、意図している宿主細胞に適 合する種から導いたプロモーターおよびフントロール配列を含有するベクター中 に挿入する。通常、このベクターは、複製部位ならびに1またはそれ以上のマー カー配列(形質転換細胞における表現型選択を与えることができる)を担持して いる(必ずしも必要ではない)。例えば、大腸菌は大腸菌種から導かれたプラス ミドであるpBR32,2の誘導体を用いて形質転換されるのが普通である[B olivarら、 釦朋2: 95 (1977)]。pB R322はアンピ シリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含んでおり、従って形質転 換された細胞を同定するための簡単な手段を与える。このpB R322プラス ミドまたは他の微生物プラスミドは、組換えDNAの構築に普通に用いられるプ ロモーターおよびその他のコントロール要素を含んでいるか、または含むように 修飾されなければならない。
原核宿主で用いるのに適したプロモーターを例示すると、β−ラクタマーゼおよ びラクトースプロモーター系[Changら、 Nature 275: 61 5(1978)およびGoeddelら、 Nature 281 : 544 (1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモー ター系[Goeddel、 Nucleic Ac1ds Res、 8 :  4057(1980)およびEPO出願公開N o、 36.776]、および tacプロモーターなどのハイブリッドプロモーター[)1. deBoarら 、 Proc、 Nat’ 1. Acad、 Sci、 IJSA 出口2l −25(1983)]が含まれる。
しかし、その他の機能的な細菌性プロモーターも適している。これらのヌクレオ チド配列は広く知られており、従って当業者はこれらを、任意の必要な制限部位 を供給するだめのリンカ−またはアダプターを用いて、MSPをコードしている DNAに機能的に連結することができる[5iebenlistら、 Ce1l  20 : 269(1980)]。また、細菌性の系で用いるためのプロモー ターは、抗原をコードしているDNAに機能的に結合させたシャインーダルガル ノ(SD)配列を含有していよう。
原核生物に加えて酵母培養物などの真核微生物がクローニングまたは発現宿主と して有用である。S accharomyces cerevisiaeまたは 通常のパン酵母が最も普通に用いられる真核微生物であるが、他の多数の菌株も 普通に用いることができる。S accharoBces中で発現させるために は、通常、例えばプラスミドY Rp7 [Stinchcombら。
ヒフアン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばATCCNo、44 ,076またはP E P 4−1 [Jones、Genetic1+85  : 12(1977)]のための選択マーカーを与えるtrpl遺伝子を既に含 有している。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの性質としてtrp 1欠損が存在す ると、トリプトファンの非存在下での増殖によって有効な選択手段が得られる。
酵母宿主で用いるのに適した促進配列には、3−ホスホグリセレート キナーゼ のためのプロモーター[Hitzemanら、 J、Biol、Chem、 2 55 : 2073(1980)]、またはその他のグルコース分解酵素、例え ば工/ラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、ヘ キソキナーゼ、ピルベート デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グ ルコース−6−ホスフェート イソメラーゼ、3−ホスホグリセレート ムター ゼ、ピルベート キナーゼ、トリオセホスフエート イソメラーゼ、ホスホグル コースイソメラーゼ、およびグルフキナーゼなどのプロモーター[He5sら、  J、Adv、EnzymeReg、 7 : 149(1968)およびHo 1land、 Biochemistry 17 : 4900(197,8) ]が含まれる。
増殖条件によってコントロールされる転写の別の利点を有している誘導性プロモ ーターであるその他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イ ソチトクロムC1酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、メタロチ オネイン、グリセルアルデヒド−3−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、ならび にマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素群のプロモーター領域であ る。酵母発現において用いるのに適したベクターおよびプロモーターはR,Hi tzemanら(欧州特許公開N o、 73.657A)がさらに開示してい る。また、酵母エンハンサ−を酵母プロモーターと共に用いるのが有利である。
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写をコントロールするためのプロモータ ーは、種々の供給源、例えばポリオーマ、サルウィルス40(SV40)、アデ ノウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルスおよび最も好ましくはサイトメ ガロウィルスなどのウィルスのゲノムから、または、例えばβ−アクチンプロモ ーターなどのへテロローガスな哺乳動物プロモーターから得ることができる。S V40ウィルスの初期および後期プロモーターは、SV4 Qのウィルス性複製 起点をも含有する5V4Q制限フラグメントとして好都合に得られる[Fier sら、 Nature、273: 113(197g)]。ヒトサイトメガロウ ィルスの即時型プロモーターはHind目rE制限フラグメントとして好都合に 得られる[Greenaway、 P、 J、ら、 Gene、 18 : 3 55−360(1982)コ。また、宿主細胞またはその関連種由来のプロモー ターが有用であるのは勿論である。
高等真核生物中でのDNAの転写は、ベクター中にエンハンサ−配列を挿入する ことによって増大する。エンハンサ−は、通常約10〜300bpのシス作用性 のDNA要素であり、プロモーターの転写開始能力を増強するように作用する。
エンハンサ−は、その配向および位置には比較的依存せず、転写単位の5 ’  [La1m1ns、 L、ら、 Pr。
・のエンハンサ−配列が哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン 、α−フェトプロティンおよびインスリン)から既知となっている。しかし、真 核細胞ウィルス由来のエンハンサ−を用いるのが普通である。その例には、SV 40の複製起点の後期側のエンハンサ−(bp 10 Q〜270)、サイトメ ガロウィルスの初期プロモーターエンハンサ−、ポリオーマの複製起点の後期側 のエンハンサ−1およびアデノウィルスのエンハンサ−が含まれる。
また、真核宿主細胞(酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞) で用いる発現ベクターは、+oRNAの発現に影響を及ぼす転写の終止に必要な 配列をも含んでいるであろう。これらの領域は、MSPをコードしているmRN Aの非翻訳化部分中のポリアデニル化されたセグメントとして転写される。
通常、発現ベクター系は選択遺伝子(選択マーカーとも呼ばれる)を含んでいる 。哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR )、チミジンキナーゼまたはネオマイシンである。このような選択マーカーが哺 乳動物宿主細胞中に成功裏に移転されると、この形質転換された哺乳動物宿主細 胞は選択圧のもとに置かれたときに生存することができる。選択法には広く用い られている2つの別個のカテゴリーが存在する。第1のカテゴリーは、追加培地 とは無関係に増殖する能力を欠く突然変異セルラインの使用と細胞の代謝に基づ いている。例を2つ挙げると、CHODHFR−細胞およびマウスLTK−細胞 である。これらの細胞は、チミジンまたはヒボキサンチンなどの栄養素の追加な しでは増殖する能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路 に必要なある種の遺伝子を欠いているので、この欠失したヌクレオチドが追加培 地に供給されなければ生存することができない。培地に追加を行うことの代替は 、無傷のDHPRまたはTK遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠く細胞中に導入して それらの増殖要件を変えることである。DHFRまたはTK遺伝子で形質転換さ れなかった個々の細胞は、未追加の培地では生存することができないであろう。
第2のカテゴリーは優性選択であり、あらゆる細胞種において用いられる選択法 であり、突然変異セルラインの使用を必要としない。
通常、この方法は宿主細胞の増殖を抑制する薬物を用いる。新規な遺伝子を保持 するこれら細胞は薬物耐性を与えるタンパク質を発現し、選択に耐えるであろう 。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン[5outhern、 p、お よびBerg、 P、 、 J、 Mo1ec、 Appl、 Genet、↓ :327(1982)]、]ミコフェノール酸MLII ligan、 R,C ,およびBerg、 P、 、 5cien例は、真核性のコントロール下に細 菌性遺伝子を用いて、それぞれ適当な薬物G418もしくはネオマイシン(ジエ ネチシン)、xgpt(ミコフェノール酸)、またはハイグロマイシンに対する 耐性を与えるものである。
「増幅」とは、細胞の染色体D N A中の隔離された領域の増加または複製を 意味する。選択試薬、例えばDHFRによって不活性化されるメトトレキセート (MTX)を用いて増幅を行う。増幅すなわちDHFR遺伝子の連続コピーの生 成によって、MTX量の増加につれて生成するDHFH量が増加する結果になる 。内生のDHFHの存在にかかわらず、さらに多量のMTXを培地に加えること によて増幅圧をかける。同時組込みが可能なりHFRまたは増幅遺伝子と所望の タンパク質をコードしているDNAを保持するプラスミド! で哺乳動物宿主細 胞を同時トランスフェクションすることによって、l 所望の遺伝子の増幅を達 成することができる。さらに増加させたMTX濃度のもとで増殖することができ る細胞だけを選択することによって、細胞がさらに多量のDHFRを要求するこ とを確実なものにする(この要求は選択遺伝子の複製によって満たされる)。所 望の異種タンパク質をフードしている遺伝子が選択遺伝子と同時組込みされる限 り、この遺伝子の複製によって所望のタンパク質をコードしている遺伝子の複製 が得られる。この結果、コピー数が増加した所望の異種タンパク質をコードして いる遺伝子(即ち、増幅された遺伝子)は、さらに多量の所望の異種タンパク質 を発現することに本発明のMSP変異体を発現させるのに好ましい宿主細胞は哺 乳動物宿主−ベクター系であり、適当な宿主の例には次のものが含まつ れる: 5V4Qで形質転換されたサル腎CV1ライン[CO3−7、ATCCCRL  1651];ヒト肝腎ライン[293、Graham、 F、 L。
ら、J、Gen Virol、36 : 59(1977)および293S細胞 ;この両方が等しく満足するコニ新生ハムスター腎細胞[BHK、ATCCCC L10];チャイニーズ+ハムスター卵巣細胞−DHFR[CHO,1Jrla ubおよびChasin、 Proc、 Natl、 Acad、 Sci、  USA 77 : 4216(1980)] ;マウスセルドーリ細胞[7M4 、Mather、 J、 P、 、 Biol、 Reprod、 23 :  243−251(1980)] ;サル腎細胞[CVl、ATCCCCL 70 ];アフリカミドリザル腎細胞[VERO−76、ATCCCRL−1587] ;ヒト子宮頚癌細胞[HELA、ATCCCCL 2];イヌ腎細胞[MDCK 、ATCCCCL 34コ;バッフアロラット肝細胞[BRL 3A、ATCC CRL 1442]:ヒト肺細胞[W138、ATCCCCL 75];ヒト肝 細胞[HepG2、HB 8065];マウス乳腫瘍[MMT 060562、 ATCCCCL51細胞];およびTRI細胞[Mather、 J、 P、’ ら、Anna!s N、Y、Acad、Sci、 383: 44−68(19 82)]。
「形質転換」とは、染色体外要素として、または染色体組込みのいずれかによっ て、複製可能なように生物中にDNAを導入することを意味する。宿主細胞の形 質転換に適した方法の1つは、G raham、 F、およびvan der  Eb、 A、 [Jirology 52 : 456−457(197g)] の方法である。しかし、細胞中にDNAを導入するための他の方法、例えば核注 射による方法またはプロトプラスト融合による方法なども用いることができる。
原核細胞または強固な細胞壁を有する細胞を宿主として用いるときには、好まし いトランスフェクション法はCohen。
F、 N、ら[Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 (USA)  69 : 2110(1972)つが開示している塩化カルシウム使用のカルシ ウム処理法である。
所望の暗号配列およびコントロール配列を含有する適切なベクターの構築には通 常操作の連結法を用いる。単離したプラスミドまたはDNAフラグメントを切断 し、加工し、そして目的の形に再連結して必要なプラスミドを得る。本明細書に 記載した構築に適切な方法は周知である。例えば、Maniat is、 T、 ら[Mo1ecular Cloning、 133−134 Co1d Sp ring Harbor(1982)] ;″Current Protoco ls in Mo1ecutar Biology”[Au5ubelら編、G reene Publishing As5ociates & Wiley− 1nterscience版(1987)]を参照。
通常、あるMS P(またはトランスメンプラン修飾した変異体)のそれぞれの サブユニットをコードしているDNAを宿主細胞に同時にトランスフェクション するが、このようなトランスフェクションを連続して行うこともできる。異種の へテロニ量体を調製するためにあるサブユニットを別のMSPの類似サブユニ、 トと交換したMSP変異体は、例えば、G P l1b−111aのαサブユニ ットの代わりにフィブロネクチンのαサブユニットを交換するが(αサブユニッ ト交換)、またはG P Jib−111aのβサブユニットの代わりにフィブ ロネクチンのβサブユニットを交換しくβサブユニツト交換)、組換え宿主(通 常は哺乳動物細胞)をそれぞれの異種サブユニットで同時形質転換することによ って得られる。
Messingら[Nucleic Ac1ds Res、 9: 309(1 981)]の方法またはMaxamら[Methodt+ in Enzymo logy 65: 499(1980)]の方法により、大腸菌に12株294 (ATCC31446)を連結混合物で形質転換し、適当なところで成功裏の形 質転換体をアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性で選択し、形質転換体から プラスミドを調製し、次いで制限酵素消化による分析および/または配列決定に よって正しいプラスミド配列を確認する。
宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換する。次いで、これを、例えばプロ モーターを誘導、形質転換体を選択、または遺伝子を増幅するための物質を含有 する適当な培養培地で培養する。温度、pHなどの培養条件は発現用に選択した 宿主細胞でこれまで用いられていた条件であり、当業者には明らかであろう。G  P l1b−111aの発現のためには、分泌型のG P 1lb−111a および他のカルシウム依存性MSPの安定性を高めるために2価のカチオンが必 要とされるので、カルシウムおよびマグネシウム塩を培養培地に含ませるのが好 ましい。
分泌されたMSP変異体を、培養上清または組換え宿主のリゼイトから回収およ び精製する。通常は、上清を限外濾過によって濃縮し、リガンド(例えば、RG D)またはマトリックスタンパク質アフィニティーまたは免疫アフィニティー樹 脂に接触させてMSP変異体を吸着させ、そして吸着体から溶出させる。所望に より、MSPをHPLC,レクチンカラム、ゲル排除、疎水相互作用またはイオ ン交換クロマトグラフィーによって精製する。
この精製したMSPを通常の薬理学的に許容しうる担体中に配合する。
本発明の可溶性のMSP変異体は、治療、診断および製造法において有用である 。診断においては、可溶性のMSPを標準または対照として膜抽出物の代わりに 用いるか、またはMSPもしくはその抗体の競争型の放射免疫検定もしくは放射 受容体検定で用いるための放射性同位体もしくは他の検出可能な基でラベルする 。
可溶性のMSPを本明細書中に記載した方法によって不溶性の支持体に架橋させ 、そのリガンドまたはマトリックスタンパク質(例えば、フィブロネクチン、フ ィブリノーゲンなど)の精製に用いる。
別法では、可溶性のMSPを用いて溶液中でリガンドまたはマトリックスタンパ ク質を吸着させ、次いで抗血清、硫酸アンモニウムなどよって沈澱させ、リガン ドまたはマトリックスタンパク質のコンプレックスを回収する。次いで、このコ ンプレックスをHPLCSN気泳動、ゲルクロマトグラフィーまたはその他の常 法によって解離させる。
可溶性MSPの治療用の使用はそれぞれのMSPの生物学的活性の関数であり、 それから明らかであろう。本発明の可溶性MSP変異体は、対応する天然の膜結 合受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。例えば、可溶性の G P fib−111a受容体は、抗凝固薬として、および血小板凝集に関係 した疾患の治療に、特に血栓溶解治療の後の再閉塞の防止に有用である。また、 可溶性のマトリックス受容体、特に可溶性のG P l1b−111aは、マト リックス付着依存性の新生物転移に対するアンタゴニストとして有用である。
可溶性のL F A−1変異体はT−リンパ球機能のアンタゴニストであり、そ れによって特に再潅流障害において免疫抑制薬または抗炎症薬として有効である 。可溶性のMac−1変異体は、補体活性化障害の治療にその用途が見い出され よう。
以下に挙げる実施例の理解を容易にするため、一部の頻繁に現れる方法および/ または用語を次に説明する。
「プラスミド」は、小文字p、その前および/またはその後の大文字および/ま たは数字で表す。本発明の出発プラスミドは、市販品から入手可能であるか、制 限のない状態でだれでも入手可能であるか、または入手可能なプラスミドから公 知の方法に従って構築することができる。さらに、記載したものと等価なプラス ミドが当分野で知られているが、これらは当業者には明らかであろう。
DNAの「消化」とは、DNA中のある配列にのみ作用する制限酵素によるDN Aの触媒的切断を意味する。本発明で用いられる種々の制限酵素は市販品から入 手可能であり、それらの反応条件、補助因子およびその他の必要条件は、当業者 に既知である条件を用いた。分析用には、通常、1ggのプラスミドまたはDN Aフラグメントを、約20μlの緩衝液中、約2単位の酵素と共に用いる。プラ スミド構築のためのDNAフラグメントの単離のためには、通常、5〜50μg のDNAを、さらに大きい容量中、20〜250単位の酵素で消化する。特定の 制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は製造元によって指定されている。
通常は37℃で約1時間のインキュベート時間を用いるが、供給元の指示に従っ て変えてもよい。消化の後、反応液を直接ポリアクリルアミドまたはアガロース ゲルの電気泳動にかけ、所望のフラグメントを単離する。
制限消化物からのあるDNAフラグメントの「回収」または「単離」とは、ポリ アクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動による消化物の分離、その移動度 と既知分子量のマーカーD NAフラグメントの移動度の比較による目的フラグ メントの同定、目的のフラグメントを含有しているゲル切片の取り出し、および ゲルからのDNAの分離を意味する。この方法は広く知られている[Lawn、  R,ら。
NucleicAcidsRes、、 9− : 6103−6114(198 1)およびGoeddel、 Dら、黙碧1eicAc1dsRes、 8−  : 4057(1980)]。
「連結(ライゲート)」とは、2つの2本鎖核酸フラグメントの間でホスホジエ ステル結合を形成させる過程を指す[Maniatis、 T、ら。
上記、146頁]。特に記さなければ、連結は、連結しようとするほぼ等しい量 のDNAフラグメント(0,5μg)に対してT4 DNAリガーゼ(「リガー ゼjX10単位)を用い、既知の緩衝液および条件を用いて行ってよい。
以下に挙げる実施例は、本発明を実施するために現在意図されている最良の態様 を単に説明するためのものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。
(以下、余白ン 実施例1 糖タンパク質11b(CP 1lb)cD N Aのクローニング培養したヒト 赤白血病細胞(HEL、ATCCTIB 180)からメツセンジャーRNAを 調製した。バタテリオファージλZAP(Stratagene Clonin g Systems)においてこのmRNAを用いてオリゴ(dT)プライムし たcDNAライブラリーを調製した。このλZAPライブラリーを、HEL細胞 由来のGPIIbの公知cDNA配列[Ponczら、 J、Biol、Che m、262(1g): 8476−8482(1987)]の5”末端から導い た4 5−marのオリゴヌクレオチド(2bl)でスクリーニングした。いく つかのポジティブにハイブリダイズするファージを精製し、それらが含んでいる cDNA挿入体を制限酵素消化分析にかけた。
これらの結果から、GPIlbの完全長の暗号挿入体を含んでいると考えられる ファージをさらに分析するために選択した。このファージ挿入D N AのDN A配列決定により300塩基余りが得られ、これは、その5“末端に4個の付加 的な塩基を有することを除き、mRNAの5′末端由来の公知cDNA配列(P onczら)と正確に一致した。
このcDNA挿入体をEcoRI(この部位は、ライブラリーの調製中にcDN Aの末端に連結したリンカ−から導かれる)およびHindlll(これは、暗 号配列末端から下流の唯一の部位でGpHb挿入体を切断する)で消化した。G PIlbの全暗号領域を含有するこのEcoRI−H1ndll+制限フラグメ ントを、EcoRIおよびHindlllで消化しておいた哺乳動物細胞発現ベ クターpRK 5 [欧州特許出願公開No。
307、247(1989年3月15日公開)]に連結し、発現ベクターG P  l1b−pRK5を回収した。
ood 72(2)+ 593(1988)]。このcDNAは、プラスミドベ クターpIB I 20 (International Biotechno logies、 Inc、 )中のE coRr (cDNAライブラリー作成 のリンカ−から導かれる部位)−Pstl(暗号配列の末端から下流の部位)挿 入体として得られる。このプラスミドをHindlllで消化して、cDNA挿 入体中の末端P s、t 1部位の下流のplBI20中の唯一のHindl1 1部位でこのプラスミドを切断し、そしてApalで不完全に消化して、配列の 5′末端のApaI部位とプラスミドベクター由来のHindlllで囲まれた cDNAフラグメントを得た。この構築のための関連ドメインを以下に示す。
LAGVGVGGPNICT 、、、、 CTG GCG GGCGTT GGCGTA GGA GGG C CCAACATCTGT ACC、、,1、、、GACCGCCCG CAA  CCG CAT CCT CCCGGG TTG TAG ACA TGG 、 、、。
EcoRI Apal H4ndl II基づいて、G P 1llaの完全長 の暗号構築物を再構築した。Apalで終わるオリゴヌクレオチド配列を上記の A pa r −H1ndll+フラグメントのApa1部位に連結し、Eco RIおよびHindlllで囲まれたDNAフラグメントを得た。G P 1l laの完全な暗号領域を含有するこのE coRI −H1ndl11フラグメ ントを、EcoRIおよびHindlllで消化しておいたpRK5に連結し、 発現ベクターG P l1la−pRK 5を回収した。関係のオリゴヌクレオ チド配列を以下に示す。
MRARPRPRPLW AAT TCT AGA GCCGCCATG AGA GCA CGT CC T CGA CCA CGT CCT CTCTGGGA TCT CGG C GG TACTCT CGT GCA GGA GCT GGT GCA GG A GAG ACCcoRI bal ATVLALGALAGVGVGGP GCG ACT GTG CTG GCA CTG GGA GCA CTG  GCT GGT GTT GGA GTA GGA GGG@CC CGCTGA CACGACCGT GACCCT CGT GACCGA C CA CAA CCT CAT CCT Cpal この合成オリゴヌクレオチドは、コードされているアミノ酸は公知のクローンさ れたcD N A (Fitzgeraldら、Rosaら)から予想されるア ミノ酸と同一であるが、そのコドンは天然のクローンされたCDNAと必ずしも 同一ではない。図3は合成および天然配列の暗号路を比較するものである。それ ぞれの配列の間の星印は、どのヌクレオチドが同一であるかを示している。これ らの変化は3つの理由から導入した。
1、cDNAを配列決定する際に直面した困難性に照らして、我々はこのcDN Aが翻訳効率に悪影響を及ぼす2次構造を含んでいるものと結論した。発現構築 物から産生されるmRNA中の可能性ある2次構造を最少にするため、一部のコ ドンを他のコドンに変えることによって、即ち、より少ないGおよび/またはC 含量を有するが同じアミノ酸をコードしているコドンに変えることによって、天 然の暗号配列中のGおよびC塩基の割合を少なくした。これらの変化させたコド ンは、cDNAの残りに頻繁に用いられるコドンだけ2、イニシエーターのメチ オニンコドン(M、−26)にすぐ続<アルギニン(R,−25)のコドンを、 CGAからAGAに変えた[Koz3、イニシエーターのメチオニンコドンの上 流のDNA配列は天然のDNA配列に基づいていない。合成した相補性オリゴヌ クし・オチドは、一方の末端にEcoR1部位が存在し、それにXbaI認識配 列が続き、次いでイニンエーターのメチオニンのすぐ上流にGCCGCCが続い ている[Kozak、 J、Mo1.Biol、、同上]。
GPIIbおよびGPIIIaをコードするプラスミド(G P l1b−pR K5およびG P l1la−pRK 5 )を2938細胞にトランスフェク ションし、以下に記載するような一時的な発現のための通常の条件下で培養した 。この細胞を集め、G P l1b−1llaの発現について分析したFAC3 選別によって免疫学的に可視化したウェスタン・ゲルにおける正しい大きさのバ ンドの存在、および35Sで代謝的にラベルしたかまたは1251表面ラベルに よる無傷細胞の免疫沈澱によって発現を確認した。
実施例2 末端切除したGPIlbをコードしているcDNAの構築G P Ilbの末端 切除された形態を構築するための出発点は実施例1記載のCPIIbの完全長の 暗号構築物である。この構築物の関係ドメインを以下に示す。
推定のトランス メンプラン領域 LRALEERA 1 、、、、、 CTCCGG GCCTTG GAG GAG AGG GCCA TT 、、、、。
、、、、、 GAG GCCCGG AACCTCCTCTCCCGG TAA  、、、、。
EcoRI 5tyl 上に示したEcoR1部位(イニンエーターATGコドンの上流)から5tyr 部位までのDNAフラグメントを単離し、補足的な合成オリゴヌクレオチドに連 結し、こうして得られたDNA配列が天然GpHb配列のアミノ酸残基962( アルギニン)までをフードしており、次いでこれにTGA停止コドンが続くよう にした。
A L E E R停止 CTTG GAG GAG AGG TGA TGA 、ACTCCCTCTC CACT ACT TTCGAStyl Hind[II 天然の配列では、アルギニン962に約26アミノ酸の推定の疎水性トランスメ ンブランドメインおよび細胞質ドメインが続いている(Ponczら)。即ち、 この構築において、これらドメインの両方を構築物の暗号領域から削除した。こ の合成フラグメントの末端はHindlll制限部位で終わっている。EcoR IおよびHindll+制限部位で囲まれたこの全DNAフラグメントを、Ec oRIおよびHindlllで消化しておいたpRK5に連結した。発現ベクタ ーG P l1btrunc−pRK 5を回収した。
上記のE coRI −H1ndlllフラグメントをG P l1btrun c−pRK 5から取り出し、DNA配列決定分析にかけた。挿入体のそれぞれ の末端から250塩基余りを配列決定したところ、予想される配列と正確に一致 していた。
末端切除したG P l1laをフードしているcDNAの構築G P l1l aの末端切除された形態を構築するための出発点は実施例1記載のG P fl laの完全長の暗号構築物である。この構築物の関係ドメインを以下に示す。
推定のトランス メンプラン領域 Xbal Apal 上に示したXba1部位(イニシエーターATGコドンの上流)からApaI部 位までのDNAフラグメントを串離し、補足的な合成オリゴヌクレオチドに連結 し、こうして得られたDNA配列が天然GPI118配列のアミノ酸残基692 (アスパラギン酸)までをコードしており、次いでこれにTGA停止コドンが続 (ようにした。
GPD 停止 CT GACTGA TGA GAT CTA天然の配列では、アスパラギン酸 692に約29アミノ酸の推定の疎水性トランスメンブランドメインおよび細胞 質ドメインが続いている(FitzgeraMら)。即ち、この構築において、 これらドメインの両方を構築物の暗号領域から削除した。この合成フラグメント の末端はHindll+制限部位で終わっている。XbalおよびHindll l制限部位で囲まれたこの全フラグメントを、予めXbalおよびHindll lで消化しておいたpRK5に連結し、trunc発現ベクターG P l1l atrunc−pRK 5を回収した。
上記のXbal−HindlllフラグメントをG P tllatrunc− pRK 5から取り出し、DNA配列決定分析にかけた。挿入体のそれぞれの末 端から200塩基余りを配列決定したところ、予想される配列と正確に一致して いた。
真核宿主における末端切除したヒトG P 1lb−111a受容体の発現EP  260,148に記載されている宿主系を用い、CaPO,を用いて、ヒト胚 腎細胞(293S)を発現ベクターG P l1btrunc−pRK 5およ びG P l1latrunc−pRK 5で同時トランスフェクションした[ Grahamら、Virology 52: 456 (1973)]。
一時的な発現 293S細胞をG P 1lbtrunc−pRK 5、G P 1llatr unc−pRK 5およびアデノウィルスVA RNA−DNA[欧州出願公開 N o、 309.237(1989年3月29日公開) ; Akusjar vietal、Mo1.Ce11.Biol、 7: 549(1987)]で 同時トランスフェクンヨンし、スタンダード増殖培地[50%ダルベツコ改良イ ーグル培地、50%F12混合物、2+nML−グルタミンおよび10%ウシ胎 児血清]で増殖させたときに、高レベルの一時的な発現が得られた。グリセロー ルショックを与えて16時間後に、細胞を血清不含の培地[ダルベツコ改良イー グル培地、0.1%グルコース、10μg/mlインスリン]に移し、さらに4 8時間増殖させ、細胞および培養培地を集めた。培養した細胞の培養液を遠心し て不純な細胞の残骸を除去し、次いでドライアイス−エタノールで急速凍結し、 分析を行うまで一70℃で保存した。細胞は、0.6mlの150mM NaC 1,10mM トリス(pH7,5)、1%トリトンX−100,2mMPMS F、0.5μg/mlロイペプチンおよび2μg/mlペプスタチンAに浮遊さ せ、次いで撹拌しながら氷上で30分間抽出することによって6cmプレートか ら除去した。
10.000gでの遠心によって細胞の残骸を除き、試料を一70℃で保存した 。10倍カラム容量の20mMMES緩衝液/lmMCaCb(pH6、5)と 0〜400mM NaC1の勾配溶離によるQ−セファロース(ファースト−フ ロー)クロマトグラフィーによって、可溶性のG P l1b−111aを回収 した。ピークの可溶性G P 1lb−111aは約200〜2501MNaC lのところで溶出した。この溶出液をS−300カラムのカラム容量の3%まで 濃縮し、次にこの濃縮液を10mMトリス/150mM NaCl/1mM C aCl、(pH7,5)を用いてa−350カラムの排除クロマトグラフィーに かけた。293S細胞にトランスフェクションされた完全長のGPIIbの一部 は内生のα9と結合した。可溶性のG P Ilbを可溶性のG P l1la と共に分泌させると、完全長のサブユニットを使用したときのように、αvB3 ビトロネクチン受容体からB P fib−111aを精製する必要が避けられ G P 1lbtrunc−pRK 5およびG P l1latrunc−p RK 5を同時トランスフェクションすることによって、末端切除したC P  l1b−111aを発現する安定な293Sクローンを樹立した。トランスフェ クションの48時間後に、細胞を800gg/ml G 418を含有するスタ ンダード増殖培地に継代した。2週間後に6418耐性のクローンを取り、40 0gg/ml G 418を含有するスタンダード増殖培地で増殖させた。クロ ーンを血清不含の培地で48時間増殖させ、培養を行った培養培地につき、ウェ スタンプロット分析によって分泌型のG P l1b−111aの発現を調べた 。
発現された末端切除CP 1lb−111aの分析一時的にトランスフェクショ ンされた細胞の発現を、パルス−チェース分析とそれに続く免疫法R(精製した 血小板G P 1lb−111aに対して生成させたモノクローナル抗体のパネ ルを用いる)によって調べた。35S−システィンおよび358=メチオニンで 代謝的にラベルしたタンパク質を、上記のようにG P 1lbtrunc−p RK 5およびGPI+Iatrunc−pRK 5の両方で同時トランスフェ クションした細胞の培養液から回収した。マウスモノクローナル抗体A P 2 [MontgomeryマウスIgGに指向性のウサギIgG抗体と結合させた プロティンA ′セファロースCL 4 B (Pharmacia)とインキ ュベートすることによりて、末端切除したG P l1b−111aを細胞培養 液から免疫沈澱させた。
この免疫沈澱させたタンパク質の電気泳動によって、組換えの末端切除G P  1lb−111aの分泌が証明され、その大きさは修飾されたcDNAから予想 される分子量と一致した。G P Jib−111aコンプレツクス(AP2) 、G P 1lb(2D 2.3A8)およびG P l1la(4B 12、 AP3)に特異的なモノクローナル抗体はすべてGPIIbおよびGP111a 末端切除タンパク質の両方を沈澱させ、組換えの分泌タンパク質がコンプレック スの形態で存在していることを示した。DNAを与えなかったか、またはG P  l1btrunc−pRK 5単独もしくはGP[IIatrunc−pRK  5単独を与えた細胞は、GPIlbまたはG P l1laに対するモノクロ ーナル抗体によって検出しうるレベルではタンパク質を分泌しない。
一時的にトランスフェクションされた細胞におけるGPIlbまたはG P l 1laの個々のサブユニットの発現はウェスタンプロット分析を用いて証明した 。細胞を上記のように抽出し、上記のように回収した培養培地を限外濾過によっ て2倍に濃縮し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動[Laemmli、U、に、 、 Nature 227: 680−685 (1970)]およびウェスタ ンプロット法[Towbinら、 Proc、Natl、Acad、Sci、U SA 76:4350−4354 (1979)]によって分析した。G P  IlbおよびGPI目aに特り 異的なマウスモノクローナル抗体をこの分析に 用いた。ネズミモノクローナルに対して指向性の西洋ワサビベルオキシダーゼー フンジュゲートした抗体を用いて抽出物中の個々のG P 1lbtruncお よびGP7 111atruncタンパク質を可視化した。
G P l1b−111aの末端切除構築物を発現する安定なりローンは、つ■  ニスタンプo ソト分析により予想される大きさの組換えタンパク質げ を分 詑・することかわかった。
l 安定なりローンから分泌されるG P 1lb−111a truncタン パク質がコンプレックスとして存在することは、吸引によって培養培地をニトロ セルロースに直接移した後に、モノクローナル抗体AP2にょテ る検出によっ て証明した。
と 末端切除されたGPIIbまたはG P l1laタンパク質は個々のサブ ユニ・、トとして発現されたときには培養培地中に検出されなかった。
これは、分泌されなかったか、または免疫沈澱もしくはウェスタンプロット分析 による検出を不可能にするレベルまで分泌効率が低下したことによるであろう。
実施例3 分泌型ヒトG P l1b−111aポリペプチドコンプレツクスのフィブリノ ーゲン結合の証明 分泌型の末端切除G P l1b−111aの機能的な活性を、G P lIb −111a受容体に対する天然のリガンドであるフィブリ/−ゲンを含むアフィ ニティーマトリックスへのその特異的な吸収によって示す。
GPIIb〜111a末端切除ポリペプチドコンプレックスを発現している実施 例2由来の安定なりローンを、血清不含の条件下[D M E M培養培地、0 .1%グルフース、10ag/mlインスリン、1.5μg/m1L−システィ ン、2.4μg/m1L−メチオニン、200μC4/ml”Sメチオニンおよ び200μCi/ml ”S 7ステイ7’3て20時間増殖させた。培養した 細胞培養液を初めに限外濾過によって濃縮し、次いでフィブリノーゲンアフィニ ティークロマトグラフィーによって精製した。このフィブリノーケンアフィニ゛ ティーカラムは、製造元の推奨法を用い、精製度の高いヒトフィブリ/−ゲンを CNBr活性化したセファロース4 B (Pharmacia)に結合させる ことによって調製した。初めに、濃縮した細胞培養液を対照のトリス/エタノー ルアミン反応させたCNBr活性化セファロース4Bカラムにかけ、未結合の物 質をフィブリノーゲン−セファロースカラムに直接かけた。1mMca”、1m M Mg”″、25mMオクチルグルコシド(OG)および2mM7ノ化フエニ ルメチルスルホニル(PMSF)を含有するリン酸緩衝食塩溶液を用い、室温で 不純タンパク質を洗い落とした。結合したG P I[b−[11aは、15m MEDTA、25mM0Gおよび2mM PMSFを含むリン酸緩衝食塩水を用 い、室温でカラムから溶離した。次いで、この溶出したG P 1lb−111 aを限外濾過によって濃縮し、予想される分子量のサブユニットをオートラジオ グラフィーおよびウェスタンプロット分析[G P 1lb(3A8)およびG  P 1lla(4B 12)に特異的なモノクローナル抗体を用いる]によっ て同定した。このフィブリノーゲンカラムへの結合の特異性は、両方法で測定し た対照カラムからの溶出液中にタンパク質が存在しないことによって示される。
実施例4 LFA−1およびMac−1は、同一のβ鎖(β−2)と別のα鎖(それぞれ、 α−上およびα−M)を有するインテグリンである。本研究においては、完全長 の鎖を宿主細胞中に導入した。さらに、これらインテグリンのそれぞれのαおよ びβ鎖のトランスメンブランドメインをコードしているDNAを削除し、末端切 除したDNAを同時発現用に宿主細胞中に導入した。
完全長のL F A−1のα−り鎖で形質転換しても検出可能な細胞結合のα− りは全く発現されなかったが、末端切除α−りおよび末端切除β−2で、または 末端切除α−Mおよび末端切除β−2で同時形質転換すると末端切除へテロニ量 体が分泌される結果になった。おもしろいことに、Mac−1の完全長α−M鎖 単独で形質転換すると細胞表面α−Mが生成した。組換えのα−M鎖が宿主細胞 にとって内生のβ鎖と結合するようになることが考えられるので、この生成物が 安定なα−M単量体を示すものであるとは確認されなかった。
国際調査報告 、情−、内、a*s−c、I−−−: p(7;25 B9.35’、4:国際 調査報告 1 ’ 1 ・

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.複数サブユニットのポリペプチド(MSP)の可溶性類似体の製造方法であ って、 (1)該サブユニットの1つをコードしている核酸に突然変異を導入し、この突 然変異した核酸がMSPのアミノ酸配列変異体をコードするようにして、該MS Pがもはや細胞膜にとどまることができないようにし、 (2)工程(1)の核酸で宿主細胞を形質転換し、(3)工程(2)の宿主細胞 を培養し、そして(4)この宿主細胞培養物から生物学的に活性な可溶性MSP を回収すること、 を特徴とする方法。 2.サブユニットが天然において膜アンカードメインを含むものであり、突然変 異が十分な膜アンカードメインを削除または修飾するものであって、このアンカ ードメインがもはやMSP類似体を細胞膜に固定するに十分な疎水性を持たない ようにするものである請求項1に記載の方法。 3.サブユニットが非共有結合によって結合している請求項1に記載の方法。 4.MSPが、細胞間の付着または細胞外マトリックスタンパク質への細胞の付 着に直接関与しているヘテロ二量体の受容体である請求項1に記載の方法。 5.MSPが、p150,95、Mac−1、LFA−1、またはGPIlb− IIIaである請求項4に記載の方法。 6.突然変異が、第1のサブユニットの十分な膜アンカードメインを、MSPが もはや細胞膜にとどまることができないようにするに十分な親水性を有するアミ ノ酸配列で置換するものである請求項2に記載の方法。 7.親水性のアミノ酸配列が免疫グロブリンの不変ドメインからなる請求項6に 記載の方法。 8.突然変異が、マルチマー形成ポリペプチドをコードしているDNAを、MS PサブユニットをコードしているDNA中に導入することからなるものではない 請求項1に記載の方法。 9、膜アンカードメインがトランスメンブランドメインである請求項7に記載の 方法。 10.MSPが白血球付着受容体である請求項4に記載の方法。 11.MSPがVLA族の一員である請求項4に記載の方法。 12.MSPがGPIIb−IIIaであり、回収されるGPIIb−IIIa がフィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンまたはフォン・ビレブ ランド因子と結合することができるものである請求項5に記載の方法。 13.MSPが、配列RGDを含有するポリペプチドと結合することができるも のである請求項1に記載の方法。 14.突然変異が、MSPの少なくとも1つのサブユニットの膜アンカードメイ ンにアミノ酸を挿入すること、このドメインのアミノ酸を置換すること、または このドメインからアミノ酸を削除することからなる請求項2に記載の方法。 15.膜アンカードメインが削除される請求項12に記載の方法。 16.細胞質ドメインが削除される請求項15に記載の方法。 17.MSPがコンセンサスN−末端配列Tyr/Phe/Leu−Asn−L eu−Aspを有するサブユニットを含有するか、リガンド結合のために2価の カチオンを必要とするか、またはカルモジュリンのカルシウム結合ドメインに実 質的に相同な配列を有するアミノ酸ドメインを含有するものである請求項1に記 載の方法。 18.突然変異して膜アンカードメインを削除した第2のサブユニットをコード しているDNAで宿主細胞を形質転換することをさらに含む請求項9に記載の方 法。 19.MSPが複数のサブユニットを含有し、天然において膜アンカードメイン を含有するこれらサブユニットのすべてをコードしているDNAを工程(1)に 示したように突然変異する請求項1に記載の方法。 20.MSPサブユニットの1つが2つのジスルフィド結合したポリペプチド鎖 を含有しており、その一方だけが膜アンカードメインを含有している請求項14 に記載め方法。 21.不変ドメインが重鎖不変ドメインである請求項7に記載の方法。 22.宿主細胞が、 (1)第1のMSP鎖と免疫グロブリン重鎖不変ドメインの融合体をコードして いるDNA、および (2)免疫グロブリンで置換されておらず、第1のMSP鎖に直接結合すること ができる第2のMSP鎖をコードしているDNA、で形質転換される請求項7に 記載の方法。 23.細胞膜にとどまることができないMSPポリペプチドのアミノ酸配列変異 体であって、MSPポリペプチドが2つの変異鎖を含有し、免疫グロブリン不変 ドメインを含有していない変異体。 24.細胞膜にとどまることができないインテグリンのアミノ酸配列変異体。 25.清浄剤を含まない請求項24に記載の変異体。 26.請求項24に記載の変異体の滅菌水溶液。 27.十分なトランスメンブランドメインが削除され、細胞膜にトランスメンブ ラン挿入することができない、インテグリンサブユニットのアミノ酸配列変異体 をコードしている核酸。 28.請求項27に記載の核酸を含有するベクター。 29.GPIIb−IIIaをコードしている核酸で許容性の宿主細胞を形質転 換し、この宿主細胞をGPIIb−IIIaが細胞膜に蓄積されるまで培養する ことを特徴とするGPIIb−IIIaの製造方法。 30.ドメインGCCGCCがGPIIIaをコードしている核酸の開始メチオ ニンコドンのすぐ5′側に存在している請求項29に記載の方法。 31.GPIIIaをコードしている核酸がプレGPIIIaをコードするもの であり、このプレGPIIIaシグナル配列中のアルギニン−25のコドンがA GAである請求項29に記載の方法。 32.GPIIIaをコードしている核酸の5′末端の最初の約100塩基中の GとCの割合がGPIIIacDNA中のGとCの割合以下に減少させたもので ある請求項29に記載の方法。 33.(1)免疫グロブリンの不変ドメインを含有する配列にC−末端で融合し た第1のMSP鎖、および (2)免疫グロブリンの不変ドメインに融合していない第2のMSP鎖、 からなる細胞膜にとどまることができないMSPの可溶性アミノ酸配列類似体。 34.MSP鎖がジスルフィド結合している請求項33に記載のMSP。 35.非融合の免疫グロブリン鎖をさらに含有する請求項33に記載のMSP。 36.非融合鎖が可変ドメインが削除された軽鎖であり、融合した不変ドメイン が重鎖不変ドメインである請求項35に記載のMSP。 37.第1のMSP鎖のトランスメンプランドメインが削除されている請求項3 3に記載のMSP。 38.非融合の免疫グロブリン鎖が既知の抗原に結合することができる可変ドメ インを含んでおり、この可変ドメインを含む免疫グロブリン鎖が免疫グロブリン 不変ドメインと第1のMSP鎖の融合体にジスルフィド結合している請求項35 に記載の分泌型の類似体。 39.既知の抗原に結合することができるジスルフィド結合した免疫グロブリン の重および軽鎖を含有し、これが免疫グロブリン不変ドメインと第1のMSP鎖 の融合体にジスルフィド結合している請求項38に記載の分泌型の類似体。 40.MSP鎖が免疫グロブリン上科の一員ではない請求項33に記載の分泌型 の類似体。 41.(1)免疫グロブリンの不変ドメインを含有する配列にC−末端で融合し た第1のMSP鎖、および (2)免疫グロブリンの不変ドメインに融合していない第2のMSP鎖、 からなるMSPの可溶性アミノ酸配列類似体をコードしているDNAで形質転換 した組換え宿主細胞。 42.請求項41に記載の宿主細胞を培養し、この宿主細胞培養物から可溶性の 類似体を回収することからなる方法。
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