JPH04501417A - 共有結合で連結した２つ以上のＦｃ領域を有する抗体複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 共有結合で連結した更に２つのＦｃ領域を有する抗体複合体 この発明は、複数のＦｃ領域を有する抗体誘導体であって、例えばヒトの癌療法 、または咽乳動物細胞の殺傷が望まれる他の状態の処置において、Ｆｃ活性の増 強を必要とする際の有効性の改良を意図した抗体誘導体に関する。

モノクローナル抗体を使う技術では、腫瘍の分化抗原に対する特異性をちった数 多くの抗体が利用されるようになった。Ｂリンパ球性腫瘍（各種のリンパ腫およ び白血病）では、Ｂ細胞分化の様々な段階で典型的にみられる多様な抗原が分か ってきた。これを補足するに、表面免疫グロブリン（Ｉ　ｇ）のイディオタイプ （Ｉｄ）、すなわち、全体としての特異性が基本的には個々の腫瘍に特異的であ ると見なし得る一連のエピトープを有するイディオタイプに関する進んだ研究が ある。

この明細書では以降、特記しない限り、「抗体」と［免疫グロブリン」とは同義 語として扱う。

抗体を使って新生物を排除することは、同時に損傷を受ける正常抗原を保有する 組織が抗原陰性の前駆体から再生し得る場合や、正常組織が全く損傷を受けない で済む場合には、許容し得る治療手段となることは疑いない、そういった基準に よれば、表面イディオタイプ（Ｉ　ｄ）および多数の他のＢリンパ球分化抗原は 、抗体療法における有望な標的である。なお、微生物を処理する目的で作製され た抗体が、単純に噴孔動物細胞に対する優れた殺傷抗体とはならないという大き な問題がある。それで今日上で、１３リンパ球性新生物に侵された患者であって 、抗イデイオタイプ抗体で治療を受けた患者の大部分は、担癌監が部分的かつ一 時的な減少を示すだけであった。標的細胞へ抗体の効果が及ばなくなる明らかな 因子として、抗体によりエフェクターの漸増が不充分となること、抗原性の変更 、表面イディオタイプに影響を与える突然変異、および患者の抗−抗体免疫応答 能の変化が挙げられる２抗体の細胞障害効果を高めるための１つの方法として、 キメラ誘導体の作製があり、これは、異種の抗体（通常、マウスのモノクローナ ルＩｇＧ）に由来する抗体部位とヒト正常ＩｇＧに由来するＦ　ｃ、領域を配列 したものである。キメラ抗体では、咽歯類のＩｇＧ抗体における抗原結合（Ｆａ ｂ）領域が、チオール結合によって、ヒトＩｇＧまたはヒトＩｇＧのＰｃγ領域 に連結されている。このようなキメラ抗体の調製は以前から報告されてきた。こ ういったキメラは、モノクローナル抗イデイオタイプから大量に調製され、ヒト のリンパ腫の治療に使用されてきた［ハンプリンら、　Ｂｌｏｏｄ、　４２．４ ９５　（１９８７）コ、二の化学的誘導されたキメラで、曜歯類のＦｃγヒトの Ｆｃ下で置換することから期待される長所は、エフェクター（補体およびＦｃγ 受容体としての性質を示す様々な細胞）の良好な漸増、代謝に対する高い生存率 、および低い免疫原性である。この分野における研究の総説は、「キャンサー・ サーベイズ（Ｃａｎｃｅｒ　５ｕｒｖｅｙｓ）、４巻・　１号・（１９８５年） 、スチーブンソンおよびブレニー」に記載されている。

抗体が結合した細胞に対する少なくとも２つの重要なエフェクター機能の漸増は 、適度な固有の会合定数をともなう相互作用に依存し、複数の結合によって簡単 に強化される。Ｃ１ｑの先端とＣ７０との相互作用は、古典的な補体径路を開始 させるが、そのＫＡ値は１．８ないし５．８Ｘ１０４Ｍ−１と推定されている。

結合を確実なものにし、Ｃ１ｑへ立体配座シグナルを与えるためには、Ｃ１ｑの ２つ以上の標的細胞上で隣接するＩｇＧ分子と会合する二とが必要である。Ｆｃ γ受容体ＩＩＩ型（Ｆ　ｃ　ＲＩＩＩ）とＦｃ下との相互作用は、大顆粒性リン パ球によって影響される抗体依存性細胞障害（、ＡＤＣ：Ｃ）にとって必要であ って、その相互作用のＫＡは約１．ｌ　Ｘ　１０７Ｍ−１である。受容体は、同 時複数の結合を可能とする完全な状態のＦｃ下によってのみ、有効に占有される 。したがって、リンパ球のＡＤＣＣは、ＩｇＧの凝集体によって阻害されること はあっても、ＩｇＧモノマーによって阻害されることはない。

二の発明の目的は、例えば、エフェクター漸増の面でＦｃ活性が改善された抗体 誘導体を提供する二とである。そういった誘導体は、噴孔動物細胞の殺傷を必要 とする一連の状態における処置、例えば、ヒトの癌治療またはＦｃ機能の増強が 有益である他の状態への利用に有望である。

この発明によれば、少なくとも２つのＦｃ領域が共有結合した合成抗体誘導体が 提供される。

共有結合は、少なくとも１つの化学合成されたリンカ−を含む二とが好ましい。

この発明は、既知の天然の構造体を含むものと解釈すべきではなく、特定の構造 体はこの発明の概念を利用して得られ、それらの製造においては種々の調製法を 用いることもできる。

この明細書および請求の範囲で使用されるｒＦｃ領域」には、例えば、２本のペ プチド鎖からなる典型的な免疫グロブリンのＦｃ構造のほかに、Ｆｃ活性（例え ば、エフェクター機能の漸増またはＩｇＧの輸送および代謝面での関与）を保持 した部分構造、活性断片なども含まれるものとする。

Ｆｃ領域は、いかなるクラスまたは種類の免疫グロブリン由来のものであっても よいが、ヒトへの適用を目的とした場合５．ヒト免疫グロブリン、例えば、ｒｇ ＧまたはＩ　ｇＧ　１からのものが好ましい、ポリクローナル抗体またはモノク ローナル抗体起源のものも使用可能である。

ここでの「合成」とは、Ｉ　ｇＭなどの天然に存在する構造体と区別するために 使用するが、特記しない限り狭義に解釈すべきではない、Ｆｃ領域間の共有結合 は、合成されたものが好ましいが、天然に存在する型の結合を必ずしも除外して 解釈すべきではない、天然の型は、切断されて再結合されたものでもよく、また 例えば１組換えＤＮＡを用いた遺伝子工学の手法によって得られる種々の構造を とるものでも良い。

この発明の一態様によれば、共有結合には、化学合成されたリンカ−も含まれる 。この連結とは直接的なもの、すなわち合成のリンカ・−からなる連結を含む場 合もあり、間接的すなわち介在成分を含むリンカ−５例えばＦａｂ領域などの抗 体型活性を有するものであ−３てもよい。

この発明の抗体誘導体は、通常、少なくとも１つのＦａｂ領塘を有するが、発明 性は必ずし２ちこれに限定されるわけではない、？！数のＦｃ領域は、例えば、 さらに複雑な構造を構築するためにそれ自体出発物質としで使用することもでき る。

どのような場合でも、Ｆａｂ領域の選択は、発明性に本質的な％ｉのではなく、 標的細胞に対する目的とする特異性を提供することのできる免疫グロブリンのＦ ａ、　ｂ領域を選択しで用いることができる。また、２本のペプチド鎖からなる 典型的な構造を有する完全なＦａｂ領域を、目的とする抗原結合特性または受容 体に対する特性を有する部分構造または活性断片などに置き換えることも可能で ある９例えば、標的細胞上で炭化水素鎖成分を特異的に認識するレクチンを使用 することもできる。

したがって一般に、この明細書および請求の範囲で使用されるＦａｂ領域として 利用できるものには、標的細胞に対する特異性を有するもの、およびＦａｂ領域 に類似の機能的特性を有するものが含まれると理解することもできる。

Ｆａｂ領域はモノクローナル抗体に由来することが好ましいが、適切なポリクロ ーナル抗体を使用することもできる。

適切なモノクローナル抗体には、ヒトの細胞に反応性を示すもの、およびマウス のアイソタイプＩ　ｇＧ　１またはＩ　ｇＧ　２　ａが含まれる、これらを、例 えばペプシン等で消化することにより、還元によって必要なスルフヒドリル基（ ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ　ｇｒｏｕｐ）を含むＦａｂ’ｙ断片を産生ずる断片を得 ることが好ましい。

一般に、−の構造中に、あるいは１つの方法においてＦｃ領域、Ｆａｂ領域また は化学合成のリンカ−の２つ以上が生じる場合、これらは、製造上あるいは用途 に関して特に指定されない限り、同一のものでも異なるものでも良い。

この発明のさらに別の態様によれば、 Ｆａｂ（Ａ）−Ｒ−［−Ｆｃ−Ｒ−］ＩＩＩ−Ｆａ、ｂ（Ｂ）［式中、Ｆａｂ＜ Ａ＞は、第１の抗体Ａ由来のＦａｂ領域、 Ｒは、化学合成のリンカ−１ Ｆ　ｃは、Ｆｃ領域、 ｍは、２以上の整数であって、 Ｆ’ａｂ（Ｂ）は、抗体Ａと同種でも異種でも良く、使用条件ドでは機能的に不 活性であり得る抗体Ｂに由来する必要に応じて用いられるＦ　ａ、　ｂ領域であ るコが提供される。

Ｆａｂ（Ｂ）を欠く場合、リンカ−はその代わりに、例えばアルキル化されてい ることもある。

しかし、この発明は、一般に、複数のＦｃ領域を有する合成抗体を産生すること を可能にするが、この発明の抗体としでは、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に 由来する２つのＦｃ領域を有するものが好ましく、ＩｇＧ１がもっとも好ましい 。

上式では、Ｒはそれぞれ、チオエーテル結合を介して、リンカ−の一端でＦａｂ 領域またはＦｃ領域のシスティン残基と、その他端でＦｃ領域のシスティン残基 に連結するリンカ−であることが好ましい、以下のような理由から、Ｒは、２価 リンカ−分子の残基であることが多い、しかし、Ｒが３価リンカ−分子の残基と なる場合もある。また、特に−Ｆｃ−Ｒ，’−Ｆｃ−成分中でのＲは、式−・Ｒ ’　−Ｘ−Ｒ’　−［式中、Ｒ′は２価リンカ−であって、Ｘは、タンパクまた はペプチドなどの相対的に大きな分子、例えば血漿アルブミンである］受承され る基であっても良い。

Ｆａｂ領域は、ヒンジ領域で約１１個以下のシスティン残基を含んでも良い８代 表的なＦａｂ領域には、ヒンジ領域に３つのシスティン残基を有する。この発明 の合成抗体では、Ｆａｂ領域のシスティン残基のうち２つが２価のＲ基によって 分子内で結合することが可能であって、第３のシスティン残基は２価の基Ｒによ って隣接のＦｃ領域に結合する。ヒンジ領域に唯一のシスティン残基を有するＦ ａｂ領域を使用すると、２価のＲ基を用いて、それに隣接するＦｃ領域にＦａｂ 領域を連結させることができる。しかし、Ｆａｂ領域がヒンジ領域で２つのシス ティン残基を持てば（例えば、マウスＩ　ｇＧ　３からのＦａｂ領域）、３価の Ｒ基を用いて、隣接するＦｃ領域とＦａｂ領域を連結することが好ましく、この 場合、３価のＲ基の原子価のうちの２つはＦａｂ領域のヒンジ領域で２つのシス ティン残基にそれぞれ連結し、第３の原子価はＦｃ領域のシスティン残基に連結 する。

Ｆｃ領域同士は、２価のＲ基によって互いに連結されることが好ましい、Ｒ基は 、２価のリンカ−分子の残基であっても、またーＲ’　−Ｘ−Ｒ’　−（式中の 記号は上述のとおり）で示される基であってもよい。

さらに、この発明の合成抗体誘導体の例を、ビスＦａｂＦｃを以下の第１図（こ こで、Ｓはイオウ原子である）に示す。

２価のＲリンカ−の好ましい例として、２価のビスマレイミド残基が挙げられる 。３価のＲリンカ−の例として、トリス−（２−クロロエチル）アミン残基が挙 げられる。

−Ｒ’　−Ｘ−Ｒ″−で表わせる基において、２価のＲ″基は、例えば、一端が チオエーテル結合によってタンパクＸのシスティン残基に、他端がチオエーテル 結合によって、例えばＦＣ領域のシスティン残基に結合され得る。

この発明のこの態様における合成抗体は、一方のＦａｂ鎖が標的細胞に対するも ので、他方のＦａｂ鎖が抗体特異性のない、すなわち、標的細胞に関して機能的 に不活性である１価ものであってもよい、また、この発明の合成抗体は、２つの Ｆａｂｌｌが同一の活性を有する２価のものであるか、標的細胞の異なったエピ トープにそれぞれ対するＦａｂ＠を有する２種の特異性を示すものでも良い。

この発明はまた、以下の工程を含む合成抗体の調製法を提供する。

（１）単離された（Ｆａｂ）２抗体断片を選択的（部分的）に還元して、そのヒ ンジ領域中に１つ以上の遊離スルフヒドリル基を含むＦａｂ断片を形成する工程 、（ｂ）遊離スルフヒドリル基と反応し得る第１の化学合成リンカ−の残基を導 入することによってＦａｂ領域を修飾して、スルフヒドリル基となお反応し得る 修飾型Ｆａｂ領域を形成する工程。

（ｅ）上記の修飾型Ｆａｂ領域を、同一または異種の抗体から回収された過剰モ ルのヒンジ領域にスルフヒドリル基を有するＦｃ領域と反応させ、１つのＦｃ領 域、］本のＦｃＭに結合した１つのＦａｂ領域、および別のＦｃ鎖のヒンジ領域 にある遊離スルフヒドリル基を有する生産物（ＦａｂＦｃ）を形成する工程、（ ｄ）上記のＦａｂＦｃ産物をチオ・−ルージスルフィド交換反応にかける工程、 （ｅ）第２の化学合成リンカ−の残基を導入することによって、チオール−ジス ルフィド交換したＦａｂＦＣ産物を修飾する工程、および （ｆ）修飾されたチオール−ジスルフィド交換ＦａｂＦＣ産物を、同種または異 種の抗体から上記の工程（ａ）ないしくｄ）によって調製され、ヒンジ領域にス ルフヒドリル基を有するＦａｂＦｃと連結させて、抗原結合鎖のＦａｂが同一ま たは異なった特異性をもつようなビスＦａｂＦｃを形成する工程。

Ｆａｂ領域とＦｃ領域はそれぞれ個別に、ペプシンまたはパパインを用いた抗体 の消化によって調製することができ、選択的（部分的）還元はジチオスレイトー ルを用いた処理によって行うこともできる。

修飾は、遊離のスルフヒドリル基と反応可能な少なくとも２つの官能基を有する 少なくとも２価のリンカ−と遊離スルフヒドリル基との反応によって行なうこと ができる。こういった官能基の例として、マレイミド基および塩素原子が挙げら れる。一般にそのようなリンカ−分子は、上記のような官能基の２つを含むが、 上述のように、特にＦａｂ領域がヒンジ領域に２つのシスティン残基をもつ場合 、Ｆａｂ領域を３機能性リンカー分子で修飾することが好ましい。

修飾工程（ｅ）では、工程（ｅ）で得られるチオール−ジスルフィド交換された ＦａｂＦｃ産物が更に血清アルブミンなどの不活性タンパクに結合されても良い 、不活性タンパクが遊離のスルフヒドリル基を含んでいない場合は、スルフヒド リル基を、例えばイミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）または３−（ ２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓ ＰＤＰ）を用いた反応によって導入することができる。この不活性タンパク上の スルフヒドリル基と、工程（ｅ）で得られるチオール−ジスルフィド交換された ＦａｂＦｃ産物との結合は、架橋分子との反応により行なうことができる。

続いて、工程（ｆ）では、不活性タンパク残基と第２のＦａｂＦｃ成分の上にあ るそれぞれの遊離スルフヒドリル基とリンカ−分子との反応によって、第２のＦ ａｂＦｃ成分に不活性タンパクを連結させることができる。

各工程（ｂ）および（ｅ）での修飾は、所望とする遊離のスルフヒドリル基と反 応し得る官能基の数（通常２官能基）を有するリンカ−分子との反応によって行 われる二とが好ましい場合が多い。

特に好ましい型のリンカ−分子は、下式［式中、Ｒ″（よ、２価の有機基、例え ば、任意に置換し得る２価アリール基または任意に置換し得る２価脂肪酸基であ る］で示されるシマレイミドである。こういったリンカ−分子には、Ｎ、Ｎ’　 −ｏ−フェニレンジマレイミドおよびＮ、Ｎ’−ビス（３−マレイミドプロピオ ニル）−２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジアミンが含まれる。

特に特定の型のＦａｂ領域を隣接するＦｃ領域と連結させるために挙げられる他 のリンカ−分子は、トリス−（２′−クロロエチル）アミンである。

チオール−ジスルフィド交換反応は、２，２′−ジピリジルジスルフィドを用い た処理によって行うことができる。

サブユニットであるＦａｂｌｅは、適当な条件下で、このキメラに含まれるもと の抗体を凌ぐ改良点、′すなわち、優れたエフェクター漸増、代謝に対する良好 な抵抗性、免疫原性の低下を付与することもある。これらのサブユニットは、い かなるモノクローナル抗体からも高い収率で調製され得る。このモノクローナル 抗体の消化により、共通のマウスアイソタイプＩ　ｇＧ　１およびＩ　ｇｃ；　 ２を含む群のＦ　（ａｂ’　γ）２に断片を得ることができる。ＦａｂＦｃ誘導 体は、そのままで使用するか、特異性のいかなる組み合わせも可能な２量体とし て使用することもでき、後者からは本発明のビスＦａｂＦｃが得られる１機能面 で改良可能な点として、さらに以下の点を期待することができる。

（１）誘導体が機能的に１価、すなわち、標的細胞に対してただ１つのＦａｂ［ を持っ状態であれば、細胞のエピトープ１個あたりのＦｃｆｉの数は２倍となり 、ＦＣＭの対合によって、エフェクターの協同的結合が生じる。

（２）誘導体が２価であれば、Ｆｃ鎖の対合に伴って標的細胞に対する親和性の 増加が見られる。

（３）２種の特異性を有するビスＦ　ａ、　ｂ　Ｆ　ｃでは、これが２−）の標 的エピトープに同時に結合することから、親和性の増加が生じる。標的細胞にお ける抗原の構造的分布が最低限にあるか、抗原に影響を与える突然変異が生じる ために起こる標的細胞の抗体からの逃避は、非常に難しくなる。なぜならば、２ つの抗原がこれらの基準を同時に満たさねばならないからである。細胞外の抗原 による抗体の不活性化は、標的エピトープの一方だけが分泌される場合、より困 難になる。当然、ＦＣＭが対合するときの利点は、明らかである。

この発明の別の態様によれば、抗体誘導体は、下式％式％） ［式中、Ｆｃは、Ｆｃ領域を、 Ｒは、化学合成リンカ−を、 Ｆａｂは、Ｆａｂ領域を。

Ｉｎは、１以上の整数を示す。

そして、Ｆｃは、追加の基（−Ｒ−Ｆｃ）によってさらに伸長させることも可能 である］で示され得る。

また、こういった誘導体は と表すこともできるが、これは、１つのＦａｂ領域をはさむ２つのＦｃ基の間に おける共有結合の間接的な結合構造を示す。

こうし、て得られた、いわゆる「平行」的なＦｃの幾何学的配列から、以下のよ うな潜在的な長所が得られる。

１、平行Ｆｃ配列は、エフェクターの協同的漸増のために、標的細胞上でＦｃの 規則的配列を形成するのに非常に都合がよい。

２、その調製が簡単となり、最終産物におけるＦ　ａ　ｌ）のＩ８？率が改善さ れる。

３、Ｆｃヒンジ領域では、開鎖または閉鎖立体配置（以下に定義するよ・）な） が容易に得られる。後者の場か、誘導体は補体を活イ１．化しない、そのことは 、活性化されることｒ前件を生じる可能性がある場合には、利点となり得る。特 に、抗体が循環ｒる可溶性抗原の表面に融合される場合、１−記の二とがいえる 。

「閉鎖」とは、Ｆ「−、領域を含むペプチド鎖が、ヒンジ領域中またはその近傍 で共有結合によって連結されていることをい）９これらは、添付の図面、第６Ａ ないし６Ｃｉｌに示し、以降でさらに詳述する。

共有結合は、どちらかの鎖の末端にシスティン残基を待ち、適切な化学合成リン カ−・を取り込むジスルフィド連結またはチオエーテル連結からなり得る。

それとは対照的に「開鎖」とは、上記のような共有結合が存在しないことをいう 。

、′二の発明の抗体誘導体および得られた構造体を調製する方法の詳しい説明は 、以下の実施例で行う。

この発明の抗体誘導体は、Ｆｃ活性の増強を必要とする適用範囲において有用と 見られる。これらは、処置のタイプまたは役牛の形態に応じて、薬理学的に許容 性のある希釈剤または担体を配合し、た製剤中での活性成分として用いることが できる。

これら誘導体は、微生物などの標的領域に対して有用とみられるが、例えば、細 胞がこの発明の誘導体のＦａｂ領域に認識され得る抗原を発現するような状態の 治療において哺乳動物細胞の殺傷が必要なとき、誘導体は特に有用と考えられる 。

二ついった顕著な適用例には、担癌状態、ウィルスもしくは他の細胞内微生物に 感染した細胞、または自己免疫疾患を引き起こす異常リンパ球クローンなどの紅 斑性自己免疫細胞に対する使用が含まれる。

さらに可能な適用例には、夾雑細胞を骨髄から除去する処置、および移植を受け た患者の免疫抑制が舎よれる。

したがっで、例えば、複数のＦＣ領域を有する合成抗体誘導体は、その適用形態 に規定されるタイプの構造を含むものとされる。この際、Ｆａｂ領域は、一定の 標的細胞上の表面分子に対する特異的な親和性を有する別の成分によって置き換 えられる０例えば、ヒトの免疫不全ウィルスに感染し、細胞表面にウィルスタン パクｇｐ１２０を発現している標的細胞は、（ＣＤ４）Ｆｃｐ、すなわち、Ｆａ ｔ）Ｆｃ２の変異体によって標的とされ得る。この場合、Ｆａｂは、ウィルスｇ ｐ１２０が強力な親和性をもつことになるヒトの正常タンパクで置換される０合 成抗体産物を調製するには、ＣＤ４に、化学的または遺伝子組換え技術によって 、そのＣ末端近傍に少なくとも２つのスルフヒドリル基が付与されねばならない 。

したがって、この発明による誘導体は、ＡＩＤＳの治療に有用であり得る。

この発明の誘導体はまた、Ｆｃ受容体を有する標的細胞にも効力をもつ可能性も あり、この場合、Ｆａｂ領域は、標的（例えば、毒素）に到達すべき分子と結合 して、利用される。

さらに、誘導体は、診断用の試験およびキットへの応用面を見いだしても良い。

炎五１ ここで、添付の図面を参照にして、この発明の実施例を記載する。

第１図は、Ｆｃ領域間で直接の共有結合をもつ合成抗体誘導体を示す図である。

第２図は、第１図の誘導体の調製法を表す。

第３図は、この発明の誘導体と他の誘導体とを比較する、補体による細胞障害を 示すグラフである。

第４図は、この発明の誘導体の活性と他の誘導体の活性とを比較するグラフであ って、４Ａは補体による細胞障害を示し、４Ｂは抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ ）を示す。

第５図は、Ｆｃ領域間で間接的な共有結合を有する合成抗体を示す図である。

第６図は、Ｆａｂ領域に関する開鎖立体配置および閉鎖立体配置の詳細を示す。

第７図は、中間構造体を産生ずるために用いられるサブルーチン操作を示す。

第８図は、別のサブルーチン操作の一部を示す・第９図は・第５図の誘導体の調 製法を示す。

第１０図は、この発明の誘導体によるリンパ球の殺傷を、他の２つの誘導体との 比較によって示すグラフである。

皿旦する 第１図で、白ぬきの部分は、化学合成のＲリンカ−によって互いに直接共有結合 した２つのＦｃ領域を示す、ここで、Ｒリンカ−の末端は、ＦＣ領域の鎖の一部 を形成するシスティン残基のイオウ原子に結合している。このＦｃ領域の立体配 置は閉鎖しており、それぞれの領域の個々の鎖は、鎖中にあるシスティン残基か ら形成されるジスルフィド結合を介して直接共有結合している。

それぞれのＦｃ領域はさらに、モノクローナル抗体ＡおよびＢ（同種のことも異 種の二ともある）由来のＦａｂ領域（図中の黒ぬり）に−３−Ｒ−３−類似結合 によって共有結合している。ここで完全な形の合成抗体誘導体をビスＦａｂＦｃ （Ａ／Ｂ）と表す、第１図に示されるような誘導体の調製および試験を以下に詳 述する。

材料 シグマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手したジチ オスレイトール（ＤＴＴ）およびプリティシュ・ドラ′グ°″ウス社（Ｂｕｒｉ ｔｉｓｈ　Ｄｒｕｇ　Ｈｏｕｓｅｓ）力翫ら入手した２−メルカプトエタノール は・精製せずにそ０まま使用した。アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃ。

ｍｐａｎｙ）から入手した２、２′−ジピリジルジスルフィド（Ｐｙ−８Ｓ−Ｐ ｙ）は、ジメチルスルホアミド（ＤＭＦ）／水から再結晶化した。

ビス−マレイミドの架橋側である、Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド（Ｐ ＤＭ）およびＮ、Ｎ’　−ビス（３−マレイミドプロピオニル）−２−ヒドロキ シ−１，３−プロパンジアミン（ＢＭＰ）はそれぞれ、滴定によって予想値の９ ０％を上回るマレイミド活性を有することが分かり、精製せずに使用した。それ ぞれの化合物を、初めにＤＭＦ中に溶解し、マレイミド環の加水分解を最小限に 抑え、使用直前に水溶性緩衝液で所定の範囲に希釈した。

アフィニティーゲルのプロティンＡセファロースＣｌ−４Ｂは、ファルマシア社 から入手した。カチオン交換体のホスホウルトロゲルＡ　６　Ｒ（Ｐｈｏｓｐｈ ｏ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　Ａ６Ｒ）は、バイオテクニクス社（Ｖｊ！Ｉｅｎｅｕｖ ｅ　ｌａ　Ｇｒｒｅｎｎｅ、　Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。

ペプシン（ブタの胃の粘膜からのもの、製品番号Ｐ６８８７、　Ｓｉｇｍａ）は 、精製せずにそのまま使用した。パパインは、ｐＨ７，７でｌＯＬＩＩＭの２− メルカプトエタノールおよび５ｍＭのＥＤＴＡを添加して１５分間３７℃でのイ ンキュベーションによって活性化した。続いて、これを、０．１Ｍ酢酸ナトリウ ム、ｐＨ４，０，１ｍＭＥＤＴＡ、５．５ｍＭ２−メルカプトエタノールで平衡 化したセファデックスＧ−５０（ファルマシア社）に２０℃で通過させた。主要 なタンパクのピーク中心部を回収し、使用時まで分割して凍結保存した。

Ｆｃの ヒト正常１ｇＧは、血液銀行で余剰となった血漿から調製した。まず、−組の原 料としての血漿タンパクを、４０ｍＭ　トリスアセテート（ｐＨ６，０）を溶離 液とするカチオン交換体、Ｐ　Ｓ　−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　（ＩＢＦバイオテク ニクス社）に結合させたものを調製した。それを溶出させ、その緩衝液を他のも のと交換したのち、この溶出物を、５００１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８， ０）を溶離液とするＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシア社）にかけ、そこ で保持されずに溶出したＩｇＧを回収した。この手順によれば、主要なＩｇＧ群 の半分が回収されるが、これら１ｇ０分子の特性は、ＦａｂおよびＦｃ断片がイ オン交換クロマトグラフィーによって容易に分離される点である。

Ｆｃγ断片を調製するために、上記のＩｇＧ（１８ｍｇ／ｍｌ）を、ｐＨ６，６ で０．５ｍＭ２−メルカプトエタノールの存在下、３７℃で３０分間パパイン（ ０゜０５　ｍｇ／ｍりによって消化した。消化は、Ｎ−エチルマレイミド（２２ ｍＭ／ＤＭＦ）を濃度２ｍＭまで添加して停止させた。チオールがこういった条 件にさらされても、ＩｇＧ中の特徴的なジスルフィド結合は減少しない（滴定に よれば０．０５残基／分子未満である）、Ｆａｙ断片は、セフ７デツクスＧ−５ ０、ＤＥＡＥ−セファロースＦ　Ｆ、およびセファクリル５−２００８Ｒ（すべ てファルマシア社から入手）の一連のクロマトグラフィーに連続的にかけること によって分離し、た、セファデックスＧ−５０に通過されると、パパインから生 じ＆ＩｇＧとＩｇＧからの断片が分管され、こλ１らをイオン交換用の２５ｍＭ 　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８゜０）に移しノニ、ＤＥＡＥセファロースのカラ ムには、Ｆｃγ断片および若干の未消化ＴｇＧは保持されたが、Ｆ　ａ　ｂγ断 片は保持されなかった。保持された物質は、０．５Ｍ塩化ナトリウム十〇　、Ｉ 　Ｍ　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣｌ　＜　ｐＨ８，０）で溶出され、直接セ７ノ・グリル のカラムにこれをかげて、ＩｇＧとＦｃγ断片に分離した。こうし２で得られた Ｆ　ｃγ断片は、基本的にはすべてＩｇＧ１由来であった。工に（ン２は上記の 消化条件に対し、て相対的に抵抗性を示し、Ｉ　ｇＧ　３からはセファクリルで 大量のＦｃ７１ｆｉ片が生じた。そしで、ＩｇＧ４は原料ＩｇＧ中に有意な量で は存在していない。

Ｆａｂ断片の調製 マウスのモノクローナル抗体を３種類使用した。抗イデイオタイプ（Ｌ２Ｇ）抗 体は、エリオツドら［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇＬ　１３８． ９８１（１９８７）］および］スティープンソら　［Ｉｌｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃ ｅｒ　（１９８４）　５０．４０７−４１３１によって抗イデイオタイプ−１抗 体として詳細に記載されたものであって、モルモットのＬ２Ｃ白血病細胞上の表 面免疫グロブリンのイディオタイプに特異的である。試料は、サザンプトン大学 リンパ腫研究室、サザンブトン総合病院テノバス研究所［Ｔｒｅ＋ｎｏｎａ　Ｒ ｏａｄ。

Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、　ＳＯ９４ＸＹ、　ＵＫ］のＭ、　Ｊ、ブレ二−博士 より供与されたものである。抗μ抗体は、ヒトＩｇＭのＨ頗に対して特異的であ って、研究室で作製されていたが、現在ではＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ　ｐｉｃ　［ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、　ＨＦ２９ＮＡ、　 ＵＫ］から入手されている。抗ＣＤ１９抗体は、ヒトＢリンパ球上のＣＤ１９　 （ｐ９５）分化抗原に対して特異的であって、ロイヤルフリー病院免疫学部門［ Ｐｏｎｃ！　５ｔｒｅｅｔ、　１．ｏｎｄｏｎ、　ＮＷ３２ＱＧ、　ＵＫコで作 製され、そこから入手したものである６マウスＩ　ｇＧ　１から得られたＦ（ａ ｂ’　γ）２は、パパインによる制限消化によって調製された。この消化方法は 、Ｚｏｒｂａｘ　ＧＦ２５０　（Ｄｕｐｏｎｔ）上テノ経時的サンプリングを行 なったサンプルのクロマトグラフィーによっ゛℃モニターされた。１８　ｍｇ／ ｍｌのＩ　ｇＧ　＋　０　、　３　ｖａｇ／ｍｌ　（ｐＨ４，１）のペプシンを 用いれば、この消化は一般に、３７℃で８時間以内にほぼ完了するが、この反応 にはｐ　Ｈの調節が支配的である。Ｆ　（ａｂ’　γ）２は、セファクリルＳ− ２００８Ｈのクロマトグラフィーに繰り返しかけることによって分離した。なお 、セファクリルＳ−２００ＨＲは、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０゜０２Ｍ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）で平衡化したものである。

ＦａｂＦｃおよびビスＦａｂＦｃの調製第２図を参照にして、ＦａｂＦｅおよび ビスＦ　ａ、　ｂＩ−Ｃの調製にかかわる］−程を総括する。

まず、マウスのＩｇＧ１抗体から得られたＦ（ａｂ’γ）２を還元して、ヒンジ 領域に遊離スルフヒドリル（ＳＨ）基を有するＦａｂ’　γを産生させる。これ らのＳＨ基は、過剰のビスマレイミドリンカ−（ＰＤＭ）と反応；７て、ヒンジ 領域に結合した遊離マレイミド基を生じる。、：うして得た、Ｆ　ａ　ｂ　’　 γ（ｍａｔ）は、ヒンジ領域に遊離スルフヒドリル基を有するヒトの還元型Ｆｅ γ−１と反応するが、この際、Ｆｃは、１分子以上のＦａｂ’　と組み合わさる ほどの過剰モル比で存在する。生じたＦ　ａ　ｂ　Ｆ　ｃはゲルクロマトグラフ ィーによって分離され、プロティンＡに結合される。そのエフェクター機能を容 易に引き出すために、Ｆｃ領域のヒンジ部分をチオール−ジスルフィド交換によ って結合させると、ジスルフィド（ＳＳ）結合が再形成される。これを生じさせ るシスティン残基は、Ｆａｂ’とのチオエーテル結合に関与しないものである。

この結果、孤立したシスティン残基が生じ、これがさらにｂＦｃ（ｍａｔ）とな り、ＦａｂＦｃ　（ＳＨ）との結合を起こす、様々なＦａｂＦｃを調製し、保存 し、それぞれの形で使用することができる。またこれらに別の処理を行っても良 く、各種の特異性の組み合わせを有するビスＦａｂＦｅとする２量体化を行なう ことも可能である。

渇」（的−Ｌ　ｒ　＋＝’、ｓされたＦａｂ’マウスＩｇＧ抗体のペプシン消化 によって得られたＦ　（ａｂ’　ｙ）２断片を、ｐＨ８，０にてＤＴＴで還元し 、ｐＨ５，０にて２，２′−ジピリジルスルフィドとチオール−ジスルフィド交 換を行わせて、ｐＨ５゜０にてＤＴＴで再び還元した。得られたタンパクをセフ ァデックスＧ−２５を通過させた後、滴定によって］ｋＤあたり２．９残基のＳ Ｈ基が存在すること、セファクリル５２００のゲル濾過では９４％がモノマーの 位置に６％がダイマーの位置に移動すること、および５ＤＳ−ＰＡＧＥではＦｄ ’　γとＬ鎖成分への分離はほとんど認めらないことが分かった。最も頻度の高 い（９０％を越える）種類は、γＬ鎖のＳＳ結合は完全であるが、３つのＳＨ基 が還元型分子間γ鎖結合から誘導されたモノマーのＦａｂ’　γであった。

Ｆａｂ’の ２０、ｍＭ酢酸ナトリウム＋１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ５゜３）を用いてセファ デックスＧ−２５に通したあと。

Ｆａｂ’　７　（ＳＨ）を５℃で３０分間２ｍＭのＰＤＭと同じｐ　Ｈで反応さ せた。ＤＭＦは２０容量％で存在゛していた。インキュベーションの最後に、１ １５Ｓ量の冷酢酸を添加して、ｐＨを４，６に調節した。ＰＤＭを除き、タンパ クを濃縮するために、この溶液をホスホウルトロゲルＡ６Ｒにかけ、１０％ＤＭ Ｆ／９０％Ｎａ２ＥＤＴＡで５℃で溶出した。洗浄後、Ｆａｂ’ｙ（ｍ２Ｌ＋） を０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｉ４５．３）で逆流溶出させ、窒素下で水浴に回 収した。ホスホウルトロゲルの長所はｐＨ５，３で速い溶出が得られる点にある ので、他のカチオン交換体で必要とされる高いｐ　Ｈにおけるマレイミド基の加 水分解率の上昇を防ぐことができる。

タンパクは、４ないし８　ｍｇ／ｍｌの濃度で回収された。

その少量のサンプルのセファクリルＳ−２００ＨＲのクロマトグラフィーにより 、ダイマー含有量が５％未満であって、一般には分離不能な高分子量凝集体を伴 うことが分かった。４回の測定で、１分子あたりのマレイミド含有量は０．８４ から１．０５の範囲でばらつくが、近似値はほぼ１である。ｐｙ−ｓｓ−ｐｙを 用いた場合に、残存ＳＨ基は検出されなかった。これらの所見によれば、ヒンジ 領域のＳ　Ｈ基のうちの２つは、リンカ−とともに環化されており、第３のＳＨ 基が末端と反応していることがわかる。Ｆａｂ’　ヒンジに結合した１残基以上 のマレイミド基の存在は、Ｆａｂ′がヒトＦｃγと反応するときに、高次凝集体 の形成傾向を増大させるので、こういった結果は極めて有用である。

ＢＭＰリンカ−は長いものほど、Ｐ　Ｄ　Ｍより安定性が増すという長所があり 、マレイミド基は、アリール連結というよりもアルキル連結の状態にあるので、 より安定性が増す、しかし、上記のプロトコルを２ｍＭで行った場合、Ｆａｂ’ 　の架橋傾向が増大し、ダイマー含有量が１５％を上回る結果が得られる。ＢＭ Ｐの濃度を４ｍＭに上げた場合、形成されるダイマー量は小さくなるが、ＩＦａ ｂ’　あたり１．３ないし１．６のマレイミド単位が得られ、ＰＤＭを使用した 場合よりも、Ｆａｂ’　−Ｆｃ相互作用における凝集体の生成量の増大が認めら れた。ＢＭＰに関するこれら両方の問題は、その存在がＰＤＭはど３つのＳ　Ｈ 基のうちの２つの分子内架橋を生じさせる可能性が低いということに基づいて説 明ができる。

旦ニー【ヱーー辺」ｉ滅 ヒトＦ　ｃ−／は、３７℃で１５分間６ｍＭＤＴＴ（１）Ｈ８，Ｏ）と反応させ ることによって還元され、これを０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，３）でセフ ァデックスＧ−２５に通し、窒素下で水浴に回収した。ＳＨ基の滴定では、その 理論値は１分子あたり４．０であるが、実測値は３．２ないし３．６の範囲であ った。

５ＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ、５０ｋＤの位置にタンパク分子が見られない ので、ヒンジ領域にＳＨ基は存在していないことがわかった。相対的に低い滴定 値から、ヒンジ領域がタンパク分解によって失われる分子もあることが示唆され た。

調製直後のＦａｂ’　γ（ｍａｌ）を、連続撹拌しながらＦｃ　（ＳＨ）にＦａ ｂ：Ｆｃｗｌ：２，５（１）モル比で添加した。二の混合物を、最低タンパク濃 度７ｍｇ／ｍｌで２時間室温でインキュベーションした。Ｆｃが多いモル比では 、いかなる還元も、凝集体の産生量を増大させた。なお、この凝集体とは、１分 子のＦｃあたりのＦａｂが１分子以上ついたものと解釈される。

経済面から見た廃棄量についての問題は、抗体ＦａｂよりＦｃのほうで軽視でき るので、過剰のＦｃは一般には回収されない。

ＦａｂＦｃは、５℃で０．５Ｍ酢酸ナトリウム＋５ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ５， ８）でのセファクリル３２０Ｑ　ＨＲのクロマトグラフィーを繰り返す二とによ って、凝集体および過剰のＦＣから分離された。２−メルカプトエタノールが存 在しないとＦｃが酸化された２量体の生じる傾向があるので、これを２ｍＭ添加 して２量体の形成量を抑制した０分離された凝集体の代表的な量は、Ｆａｂｌｅ 　（１００ｋＤ）のピーク画分に存在するタンパクの約１０％に相当した。プロ ティンＡセファロースのカラムに、ＦａｂＦｃは結合するが、挟体Ｆ　（ａｂ’ 　Ｙ）２は結合しないので、ＦａｂＦｃを上記のセファクリルのカラムかけた後 、プロティンＡセファロースカラムにかけた。

Ｆｃヒンジ領域を閉鎖するためのチオール−ジスルフィド交換反応はｐＨ５，３ で行ったが、ＦａｂＦｃは上記のプロティンＡカラムに結合したままで残された 。２−メルカプトエタノールを洗い流した後、５％ＤＭＦに溶かした０　、１　 ｍＭ　Ｐ　ｙ　−Ｓ　Ｓ　−Ｐ　ｙ溶液を５℃で３０分間二のカラムに通した。

２−チオビリリドンの急速な放出が生じたが、これはｐｙ−ｓｓ−ｐｙが溶出を 開始する時点で見られた。この放出量は、これがそれに続くタンパクの溶出量と 関連させてみたところ、ＦａｂＦｃ　１分子あたり２．３ないし２．８のＳＨ基 （理論値３．０）が反応することを示していた。

この段階で、２−ピリジルジスルフィドとして存在する非連結ヒンジ領域システ ィンとともに、ＦａｂＦＣは、即座の使用またはその後のビスＦａｂＦｃへの取 込みのために溶出し得る。これがビスＦａｂＦｃへ直ちに反応させるために使用 されるなら、このタンパクを後の操作のためにカラムに残しておくこともできる 。

最初に使用されるＦ（ａｂ’　γ）２に関して、ＦａｂＦｃに対するＦａｂ’　 の回収率は約６５％である。

ビスＦａｂＦｃの！ 同一または異なる抗体特異性をもつ２つのＦａｂＦＣが、それぞれ別々のプロテ ィンＡカラムで分離された。一方では非連結システィンがＳＨ型に戻り、他方の では非連結システィンがビスマレイミドリンカ−との反応によってマレイミド基 になった。このリンカ−は一般にはＢＭＰであって、これが選ばれた理由は、長 いアルキル鎖が２つのＦｃの分離をＰＤＭの場合に比べて容易にし、その結果各 Ｆｃへのエフェクター分子の同時結合がより容易になる点にある。しかし、分子 間連結する２つのＰｃの位置を比較しても、エフェクターの漸増における明らか な利点を示すことはできなかった。したがって、ＢＭＰは一般に、溶解度が高い ために使用された。ＦａｂＦｃの量をモル比でＦａｂＦｃ　（Ｓ）（）：Ｆａｂ Ｆｃ　（ｍａｌ）＝１　：　１．１に調節し”〔、マレイミド基の影響をある程 度増大させた。

詳述すると、両方のプロティンＡカラムでＦ　ａ　’ｂ　ＦＣの非連結ヒンジ領 域システィン（２−ピリジルジスルフィドとして存在）は、０　、　７　ｍＭ　 Ｄ　Ｔ　Ｔ　（ｐ　Ｈ５。

３）を流すことによって、選択的（部分的）に還元された。溶層液のＩ）　Ｔ　 Ｔには、１分子のＦａｂＦｃあた１ＩＯ１８０ないし０．９２分子の２−チオピ リドンを添加した。この数値のとき、Ｐｙ−３Ｓ−Ｐｙとの初期反応によ）て、 Ｆｃヒ：ノジ領域にある一対のシスティン残基間のＳＳ結合が再構築されたはず である。Ｉ？ａｂＦｅ（ｍａｔ）を調製するために、調製物の１カを、１２，５ ％ＤＭＦ＋２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，３）に溶解させ８ｍＭＢＭＢ二と 反応させ、５℃で３０分間カラムに通した。

カラムに残った過剰の試薬を洗浄したのち、直列につないだカラムに０．１Ｍ塩 酸グリシンを通過させることによって、ＦａｂＦｃ　（ＳＨ）およびＦａｂＦｃ （ｍａｔ）を１つの溶液中に溶出させた。酢酸ナトリウムを用いてｐＨを５．５ に調節し、２０℃で１６時間この溶液をインキュベーションした。溶出量は、カ ラムの形態に留意して最低に保たれた。　チオエーテル結合はマレイミドの加水 分解と拮抗するので、タンパク濃度は１０　ｍｇ／ａｌｌ　を上回ることが望ま しい。

インキュベーションの最後に、セファクリル５２００上でその少量のサンプルを クロマトグラフィーにかけると、７７％までのタンパクが２００ｋＤに相当する 位置に移動したことが分かった。高次量適集体が少量存在する以外、残りの部分 は１００ｋＤの成分として挙動した。オフタロニー法でのプレートを調べたとこ ろ、その２００ｋＤ成分は１分子上にマウスのＦａｂおよびヒトＦａｂエピトー プを含むこと、ならびにただ１種類のエピトープからなる分子は存在しないこと が分かった。したがって、２００ｋＤの両分は基本的にすべてビスＦａｂＦｃと みなされた。１００ｋＤの両分には、主成分としてＦａｂエピトープとＦｃエピ トープの両方を有する分子、すなわちＦａｂＦｃが含まれていたが、Ｆｃ２は含 まれているとしても少量であ一ノた。

必要であれば、調製物全体をクロマトグラフィーにかけて、ビスＦ　ａ、　ｂ　 Ｆ　ｃ成分とＦ　ａ　Ｉ）　Ｆ　ｃ成分に分離１゛ることもできる。シ、かＬ７ 、治療に使用する場合、少量のＦａｂＦｃが存在しても全くの不都合とはならな いので、そのような分離を必要としない、治療用製剤Ｇ：、とって必要な追加の 工程は、発熱物質の除去処理である。すなわち、調製物を多段階の排除工程にか けた後、ポリミキシンカラムのクロマトグラフィーを行って発熱物質を完全また は部分的に排除して、細菌フィルター（０，２２μｍ）を通過させた直後に滅菌 ずみ容器に集める。

４（：！　７．　Ｆ　−ａ　−ｂ　Ｉ江旦エユに先久二Ｕ以下の特徴を有する３ つの調製物を調べた。

（ａ）モルモットＬ２ＣｗＢ胞上の表面１ｄに対して作製された両鎮を有するも の（抗１ｄ）／抗（Ｉ　ｄ）、（ｂ）１本の抗イデイオタイプ（Ｌ２Ｃ）ｆｆｌ および１本の無関係な鎖（ヒトの腫瘍に対して作製されたＩｇＧ１抗体Ｉｄとは 関係ない）を有し、Ｌ２Ｇ細胞に対して１価として有効なもの（抗Ｉ　ｄｌｏ） 、（Ｃ）ヒトのリンパ系細胞上の指標抗原に対して作製されたもの（抗μ／抗Ｃ Ｄ　１９）　。

調製物（ａ）および（ｂ）はＬ２Ｃ細胞に対してテストされ、調製物（Ｃ）はＢ リンパ芽球細胞系のダウＧ１抗体のどれも、これらの標的に対する補体の溶解ま たはリンパ球の抗体依存細胞性細胞障害（ＡＤＣＣ）の測定においていかなる活 性も示さなかった。

第３図では、補体の溶解性に関して、ビスＦａｂＦＣ（抗Ｉ　ｄｌｏ）はもとの ＦａｂＦｅに比べて重量基準で約２倍の力価をもち、活性抗体部位のモル濃度で 約４倍の力価をもつことが示されている。２つの要因、すなわち、細胞上のＦｃ 数の増加および一対のＦｃの対合性によって、このような優れた性質が生まれる のであろう、しかし、現在のところ、これらの要因を個別に評価することはでき ない。

ビスＦａｂＦｃ　（抗Ｉｄ／抗１ｄ）は、図が重量基準によるもの（第３図）か 活性抗体部位のモル濃度基準によるものかにかかわらず、１価のビス誘導体より 優れた機能を持っている。この改善は、２価の結合が関与した親和性の増大に起 因するにちがいないが、これには２価の誘導体が表面ＩｇＧの抗原変調を誘導す る［ゴールトンとステイーブンソン、ｉｍｍｕｒ＋ｏｌｏｇｙ、　４２、１３　 （１９８１）］というネガティブな面もある。実際には、流動サイトフルオリメ トリーでは、３０分間を越える処理でもビスＦａｂＦｃ　（抗Ｉｄ／抗Ｉｄ）に よるＬ２Ｃ細胞へのいかなる変調の誘導も認められなかった。これは、ＦａｂＦ ｃ間の連結が長くしなやかであること、またはもとのＩ　ｇＧ　１抗イデイオタ イプがそれ自体、表面１ｇＧと一対一の結合様式をもつ弱い変調因子であること ［エリオツドら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｍｌ１＋ｊｎｏｌｏｇｙ　１３８． ９８１（１９８７）］に関連しテいると考エラレる。

第４図は、ビスＦａｂＦ’ｃ（抗μ／抗ＣＤ　ｉ　９）　（ｙ）機能を、もとの ２つのＦ２ＬｂＦｅの機能と比較したちのである。ＡＤＣＣでは、ビス誘導体の 力価は、もどの分子の力価の約１６倍であった。補体の殺傷力は全体的に低かっ たが、ビス誘導体が勝っていることは明らかである。しかし、これらの評価は、 複数の要因（結合親和性、ｌ細胞あたりのＦｃ数、Ｆｃの配向性。

および初期に起こり得る変ｒ１４）を考慮すると簡単に下すことはできない。

補体溶解の検定法において、ビスＦａｂＦｃの抗補体活性を示唆するプロゾーン の形成はみられなかった。

５１Ｃｒ標識抗体でコートした細胞の補体介在性殺傷を、常法によって行った。

補体源として、正常ウサギまたはモルモットの新鮮な血清を最終希釈率１：５で 使用した。ＡＤＣＣは、正常ヒト血液から分離したでの新鮮なリンパ球エフェク ターを、エフェクター：標的細胞＝５０：１の比で用いて行った。１０％のヒト ＡＢ型血清（不活性型）を添加した。溶解の程度を３゜５時間後に読み取った。

細胞障害のパーセントは、２回の測定の平均値であって、常法で以下の式から計 算した。

（抗体での放出量）−（正常ＴｇＧでの放出量）（界面活性剖（での）放出量） −（正常ＩｇＧ（での）放出量）第５図を参照すると、白ヌキの部分は、中間に 位置する１つのＦａｂ領域（黒ヌリ部）を含む共有結合による連結部により互い に間接的に連結された２−っのＦｃ領域を示す。２つの領域間の連結部は各領域 における個々の鎖のシスティン基のイオウ原子で末端が結合する化学合成された リンカ−Ｒを含む０図示されるように、Ｆａｂ領域の両方の鎖は、一本のＦｃ鎖 とそれぞれ結合している。しかしながら、十分な個数の反応し得る基があれば、 両方のＦｃ領域を一本の鎖に結合させることも可能である。全部そろった形のも のをＦａｂＦｃ２と略称する。

開鎖または開鎖のの立体配置を有するＦｅ領域をさらに詳しく第６図に示す。図 中、６Ａ〜６Ｃは閉鎖立体配置を、６Ｄは開鎖立体配置を示す、　Ｆ　ａ　ｂ　 Ｆ　ｃ２（閉鎖）におけるヒンジ領域は、そのジスルフィド結合の一つを再構築 すること、あるいは、Ｒ′基で区分された直列のチオエーテル結合［相同的（第 ６Ａ図）または非相同的（第６Ｂ図）連結］を介することによって閉鎖されてい る。

Ｓ・は、アルキル化、その他の手段によって不活性化されたチオール基を示す。

その化学合成におけるランダムな要素とは、Ｆａｂ上の５つのＳ原子のうちのい ずれか２つがＦｃへの連結に関与し得ること、さらには、ＦＣヒンジ領域におけ る４つのＳ原子のうちのいずれか１つがＦａｂへの連結に関与し得ることにある （第９図における最終的構造式を参照）。

第５図に例示したタイプの抗体誘導体を調製する方法を以下に詳述する。

１、基本的な調製工程は、ヒンジ領域に単一のマレイミド基を有するＦＣγ、す なわち、Ｆｃ（ｍａｌ）と遊離のＳＨ基を有するＦａｂとの反応がを含む、（第 ９図）、ＦａｂのＳＨ基は、すべての鎖間ＳＨ基の還元によって生じ、はとんど の場合（マウスのモノクローナルＩ　ｇＧ　１またはＩ　ｇＧ　２に由来するＦ ａｂ’　での場合）、こういったＦａｂは５つのＳＨ基を有するものといえる［ Ｆａｂ（ＳＨ基）５コ、その他の場合、基の数は３（例えば、マウスＩ　ｇＧ　 ３　）ないし６（例えば、マウスＩｇＧ２ｂ）をとり得るが、こういった変形例 は、この調製法に対して若干の変更を加えたものに過ぎないといえよう。

２、モル比Ｆｃ　：　Ｆａｂ≧３でのＦｃ（ｍａｌ）とＦａｂ（ＳＨ）５との反 応では、主産物としてＦａｂＦｃ２が得られることが分かる（第９図）。

３、副産物はＦ　ａ　ｂ　Ｆ　ｃ３およびＦａｂＦｃであって、これらを除去す ることも可能であるが、産物の収率を改善するためにＦａｂＦｃ２と一緒にこれ らの副産物を残したままでも問題の生じる懸念はない。

４、反応混合物がモル比Ｆｃ　：　Ｆａｂ≧３となるときでさえ、Ｆ　ａ　ｂ　 Ｆ　ｃ２が主産物となる理由は、ＦａｂＦｃ２の形成後、立体障害によってＦｃ （ｍａｔ）がＳＨ基へ接近しにくくなる点にある。

５、Ｆｃ　（ｍａｔ）の調製には、保存のための中間産物Ｆａｂ−３８−Ｆｃ　 （犠牲ＦａｂＦｃ）としてＦｃ下を残すサブルーチン処理を伴う、Ｆａｂ成分（ ここではヒツジＦａｂ″　γ）を捨て去るが、リサイクルも可能である。このサ ブルーチン処理によって、Ｆｃが−Ｌ」１ヱとＪｉＪ二型として利用できるよう になる。すなわち、この処理により最終の（Ｆａｂ＋Ｆｃ）反応での産物を単純 化し、特に１つ以上のＦａｂとの反応による各種の分子の生成を妨げられる。

６、犠牲Ｆ　ａ　’ｂ　Ｆ　ｃでは、ヒツジＦａｂ’ｙは、Ｆｃヒンジ領域の１ つのシスティン残基をブロックする。

これにより、２つの経路の１方で、Ｆｃ上に１つのマレイミド基の置換が可能と なる。

ａ、サブルーチン（１）：これは、開鎖ヒンジを有するＦｃ（ｍａｉ）とチオエ ーテル結合ヒンジを有するＦｅ（ｍａｌ）との両方を調製するために使用される 、ヒツジＦａｂ’　γが固定されシスティン残基は、結果的にマレイミド基を保 有するものである。

ｂ、サブルーチン（２）：これは、ジスルフィド結合ヒンジ領域を有するＦｃ（ ｍａｌ）の調製のために使用される。マレイミド基を保持するシスティン残基は 、ヒツジＦ　ａ　ｌ）　’　γを保持する残基と背中合せの向きを１、ヒツジの 正常ポリクローナルＩｇＧのペプシン消化から得られたＦ　（ａｂ’　Ｙ）２断 片は、ｐＨ８，０にてジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元され、４゜４′−ジ ピリジルジスルフィドを用いてチオール−ジスルフィド交換反応に供される。こ れは、前記のマウスＦａｂ’　γのところで記載したとおりに行われる（原理１ ）、産物（Ｆａｂ−３Ｓ−Ｐｙ）ｌ！、前者ノ分子間Ｆａｂジスルフィド結合の 部位に単一の混合ピリジルジスルフィド基をもつ。

２、ヒトＦｃγの鎖間ジスルフィド結合は、上記のとおりＤＴＴとの反応によっ て還元される６　（原理１）３、等モルのＦａｂとＦＣを用いると、Ｆａｂ−３ Ｓ−ｐｙおよびＦｃ（ＳＨ）４に、２５℃でｐＨ４，４にてジスルフィド交換反 応が進行する。このｐＨでは、ピリジルジスルフィドが単独でジスルフィド交換 反応につながるチオール基による核攻撃を受けやすくなる。これとは対照的に、 ＳＨ基がアルキル化によって不活化される前は、ＦａｂとＦｃ間で形成されるジ スルフィド結合は、タンパクのＳ　Ｈ基が近接（第７図）しているにもかかわら ず、酸性ｐＨでの分解をほとんど起こさない、生成するジスルフィド結合の産物 は、ＦａｂＦｃ　（主要産物）およびＦａｂ２Ｆｃ（１１次的産物）であって、 これらより大型産物は極めて稀である。総タンパク濃度は５　Ｂ／ｍ１以上であ って、この反応時間は３０分で十分である。

４、Ｆｃヒンジ領域を開鎖型とする必要があれば、ｐＨ５，０でＮ−エチルマレ イミド基を用いてアルキル化を停止する。

５、Ｆｃヒンジ領域を閉鎖型とする必要があれば、２価リンカ−の０−フェニレ ンジマレイミド基を用いてアルキル化を行う（第７図）、このリンカ−が残存す る３つのＳＨ基を３通りの方法で架橋することができ、そのうちの２つが架橋さ れれば、ヒンジ領域は閉鎖される。この論拠と合致して、Ｆａｂ−３Ｓ−Ｆｃ分 子の大部分はアルキル化されるので、解離溶媒中での電気泳動によってＦｃ成分 の半分が共有結合されたことが分かる。架橋されていないＳＨ基は、リンカ−と 反応して遊離のマレイミド基を残すことになるが、このマレイミド基は、ｐＨ５ ，０で２−メルカプトエタノールに短時間さらすことによって不活化が可能であ る。

６、犠牲ＦａｂＦｃは、セフ７クリル５２００ＨＲ（ファルマシア社）のゲルク ロマトグラフィーによって、その他の反応産物および残存する反応体と分離され る。

７、犠牲ＦａｂＦｃは、使用時まで必要に応じて５℃で保存され、これらの条件 下で少なくとも３力月は安定であることが確かめられた。

ＦａｂＦｃのためへ九ＬＬ二しン−」−λ」−［第８図コ１、上記のサブルーチ ン（１）と同様。

２、上記のサブルーチン（１）と同様。

３、上記のザブルーチン（１）と同様。

４、ジピリジルジスルフィドを０．２ｍＭまで加えて、２５℃でジスルフィド交 換反応をさらに３０分間進行させる。その結果、両方のシスティン残基が利用可 能なヒンジ領域のジスルフィド残基は、閉鎖状態となる［こういった交換反応に よるタンパクのジスルフィド結合の閉鎖機構に関する考察は文献（１）を参照］ 。

そして、他のシスティン残基は、混合ジスルフィドタンパク−５ｓ−ｐｙに転化 される。

５、ここで、犠牲ＦａｂＦｃは、Ｆ　ａ　ｂ　−Ｓ　Ｓ　−Ｆ　ｃ−３Ｓ−Ｐｙ のジスルフィド立体配ｆｉ！（第８図）をもつ安定な型で存在するが、セファク リル５２００ＨＲのゲルクロマトグラフィーによって分離されて、使用時まで５ ℃で保存される。

主反応 主反応は、マウスのＦａｂ’　γとヒトのＦｃとを連結することであって、その 主な特徴を第９図に記載する。その際の犠牲ＦａｂＦｃが、サブルーチン（１） に由来するものか、サブルーチン（２）に由来するものかに応じて、詳細面で差 異の生じることもある。

第９図を参照すると、マウスＦａｂ’　γ部分とヒトＦｃ１部分との結合が示さ れているが、これはＦａｂＦｃ２の全ての変化形を示すのに十分なものである。

その変化形としては、例えば開鎖ヒンジ領−型、チオエーテル結合されたヒンジ 領域を有する型、ジスルフィド結合されたヒンジ領域を有する型がある。ヒンジ 領域がジスルフィド結合されたものの調製においては、Ｆｃが抗体Ｆａｂ’　γ と結合した後はマレインド基の反対側にヒツジＦａｂ’　γがＦｃに結合された 状態で残される。

Ａ、ルー　ン　１　か−′　゛れる　ＦａｂＦｃ度菜Ｊ １、Ｆ　（ａｂ″　γ）２は、マウスモノクローナルエｇＧ抗体のペプシン消化 から生じるものであって、これを２５℃（ｐＨ８，０）で３ｍＭＤＴＴによって 還元すると、Ｆａｂ（ＳＨ）５が得られる。続いて、このｐＨを５，０に下げて 、イオン強度を０．０２以下にして［希酸の添加、またはｐＨ５，０の０．０２ Ｍ酢酸緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−２５（ファルマシア社）を通すこ とによって］、タンパクをカチオン交換体ホスホウルトロゲル６　Ｂ　（Ｔ、Ｂ 、Ｆ、　Ｂｆｏｔｅｈｃｎｉｃｓ）のカラムにかけて結合させる。

２、犠牲ＦａｂＦｃを、Ｆｅ下に高い親和性をも・っプロティンＡアガロースの カラムにかける。ｐ）（ｓ、０の６ｍＭＤＴＴ緩衝液を５℃でこのカラムに通過 させると、サブユニット間のジスルフィド結合が還元されて、カラムの溶出液中 にヒツジのＦａｂ’　γが放出される。二のＦａｂ″　γは再利用のために集め ることもできる。

３、ここで、Ｏ，１Ｍグリシン−ＨＣｌ　（ｐＨ３，０）によってカラムからＦ ｃ　（ＳＨ）を溶出させ、ビスマレイミドのリンカ−と反応させる。用いたリン カ−は、２ｍＭのＮ、Ｎ’−ｏ−フニーレンジマレイミド、および５ｍＭのＮ、 Ｎ’−ビス（３−マレイミドプロピオニル）−２−ヒドロキシ−１，３−プロパ ンジアミンである。これらのリンカ−は、これをタンパク溶液に加える前に、ジ メチルホルムアミドに溶解させる。

リンカ−との結合（のための）最終条件は、Ｆｃ濃度０．２５ｍＭ、リンカ−濃 度２または５ｍＭ、ジメチルホルムアミド濃度２０容量％以下、ｐＨ５，３、温 度５℃である。３０分が経過したところで、Ｆｃ（ｍａｌ）型となったのタンパ クを、リンカ−から分離し、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，３）中に移して、５ ℃でセファデックスＧ−２５（ファルマシア社）のカラムにかける。

長さおよび堅さの増したリンカ−１例えば、２つのマレイミド基を有するペプチ ドの使用が考慮される二ともある。

４、Ｆｃ　（ｍａｔ）含有溶液を、セファデックスカラムから溶出させる同時に 、ホスホウルトロゲル６Ｂのカラムにかける。これによって、結合抗体Ｆａｂ　 （ＳＨ）５が溶出し、一つの濃縮された両タンパクを含む溶液が得られる（総タ ンパク濃度は約１０　ａ＋ｇ／＋Ｉ　）　。

Ｆ　ｃ　／　Ｆ　ａ　ｂのモル比は３である。

５、Ｆａｂ　（ＳＨ）５＋Ｆｃ　（ｍａ　ｌ）の反応は、ｐＨ５，３で２０℃に て１６時間行わせる。続いて、Ｎ−エチル−マレイミドとのアルキル化によって ＳＨ基を除去する。最後に、産物は、セファクリル５２００ＨＲ（ファルマシア 社）のクロマトグラフィーを繰り返すことによって、大きさに従って分離される 。

ここでの方法は、ヒツジのＦａｂ’　γをＦｃから除去する前に、Ｆｃ（ｍａｔ ）を調製して、これを抗体Ｆ　ａ　ｂ　（Ｓ　Ｈ）　５に連結させるものである 。工程２および３では、Ｆｃのシスティン残基における還元およびマレイミド化 を示すが、この残基の反対側はヒツジのＦａｂ’　γに結合している。このとき の反応では、Ｆａｂ’　γの結合のためのジスルフィド結合またはヒンジ領域の ジスルフィド結合の還元を避けるために、ｐＨが低く　（４，０）抑えられる。

１、Ａでの工程と同じ。

２、犠牲ＦａｂＦｃは、Ｆａｂ−３Ｓ−Ｆｃ−８Ｓ−Ｐｙの形態にあるが、これ をｐＨ４，０，５℃で１時間ジヂオスレイトール（０，５ｍＭ）と反応させる。

これによって、Ｆａｂ−３Ｓ−Ｆｃ−３Ｈに転化され。

これをｐＨ４，０の緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−２５にかけることに よって分離する。

３、ここで、ＦａｂＦｃば、０．１Ｍ酢酸塩溶液（ｐＨ４，０）に溶けた３ｎｍ ｏ−フェニレンジマレイミド＋２５容量％のジメチルホルムアミドと５℃で２時 間反応させる。これによって、ＦａｂＦｃはＦａｂ−３Ｓ−Ｆｃ　（ｍａｌ）に 転化され、これは、ホスボウルトロゲル６Ｂカラムへの結合によって分離、濃縮 される。

４．２本のホスホウルトロゲル６Ｂのカラム（工程１および３からのもの）を、 ０．５Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５，３）で連続的に溶出させる。Ｆａ、ｂ−８Ｓ− Ｆｃ（ｍａｌ）およびＦａｂ　（ＳＨ）５を、モル比３：１にて２５℃で１６時 間反応させて、濃縮液（１２Ｂ／ｍｌの総タンパク濃度）とする、主産物は、（ Ｆ　ａ　ｂ−８ｓ−Ｆｅ）２Ｆａｂである。

５、ｐＨを６．０に」−げ、タンパクをプロティンＡアガロースのカラムにかけ ると、これにヒトのＦｃ成分を含むすべての分子が結合する。ニーで、ｐＨ６， ０のカラムに３０分間２ｍＭのメルカプトエタノールを通過させると、ヒツジの Ｆ’　ａ　ｂ　’　γは結合状態から開放される。Ｊ＆後に、２ｍＭのシスタミ ンをｐＨ７，０でカラムに３０分間通過させることによって、還元されても良い ヒンジ領域のあらゆるジスルフィドの再形成を促進させ、ヒツジのＦ　ａ、　ｂ 　’　γの放出後に残存するシスティンのＳＨ基をブロックする。

６、最後に、ＦａｂＦｃ２と、その他の産物は、分子量の差に基づいたセファク リル５２００ＨＲ（ファルマシア社）のクロマトグラフィーを繰り返すことによ って５分離される。

又１ １、Ｇ、Ｔ、スティーヴンソン、Ａ、ビンダー、仁Ｊ、スレート、ｒ　１　ｇＧ 上ヒンジ域の操作によって調製された２つのＦｃ領域（ビスＦａｂＦｃ）を有す るキメラ抗体Ｊ　、　ＡｎＴｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇ＋＋　３ ：　２１９−２３０、１９８９゜ ２、に、ブロックレバースト、［チオールの特異的共有結合修飾−酵素、その他 の生体分子の研究における応用Ｊ　、　Ｉｎｔｅｒｎａｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　１０：　２５９−２７４平行なＦｃ部分を有するＦａｂＦｃ２の作用の 予備的評価を、第１０図を参照にして説明する。なお、この図は、ヒトエフェク ター（正常のリンパ球）の存在下、（ニブエフター：標的細胞＝５０）で１価の キメラ抗体誘導体（特異性、抗ＣＤ１９抗体）３種類によるヒトリンパ球（ダウ ディ（Ｄａｕｄｉ）系、放射性クロムで標識）の殺傷をプロットしたグラフであ る。細胞障害の測定は、３７℃で３．５時間後に行った。この抗゛体依存細胞性 細胞障害（ＡＤＣＣ）の短時間試験で、ＦａｂＦｃ　（開鎖ヒンジ）およびＦａ ｂＦｃ　（閉鎖ヒンジ）の場合とＦａｂＦ’ｃ２（開鎖ヒンジ）の場合を比較し た。この試験は、生体内における抗体の標的細胞殺傷能を予想するために、生体 外で利用し得る最も優れた方法といえよう、　Ｆ　ａ　ｂ　Ｆ　ｃ２は、この試 験で活性を示し、Ｆｃ部分を１つしか含まないその類似体より優れたものと考え られる。

また、Ｆａｂ領域が以下のような特徴を有するモノクローナル抗体に由来する抗 体誘導体も作製した。

・りＯ−ン：　Ｗ　Ｒ１７（Ｗｅｓｓｅｘ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　５ｅｒｖ４ ｅｅ。

Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、　ＵＫから入手可能）・アイソタイプ：ネズミのＩｇ Ｇ２ａ ・融合の詳細：白血病患者の細胞で免疫したＢａ１ｂ／ｃ系マウスから得られた 牌細胞とマウスの骨髄腫細胞系ＮＳ−〇を用いた、従来のコーラ−・ミルシュタ イン型の融合 ・特異性：ＷＲ１７は、抗ＣＤ３７試薬であって、発生の初期と後期を除いてＢ リンパ球に強く発現した４０〜５０ｋＤの糖タンパクと反応する。また、この抗 原は、顆粒球およびマクロファージにも弱く発現し、場合によってはＴ細胞リン パ腫にも発現する。

・適用：ＷＲ１７は、懸濁物および凍結切片中のＣＤ２７＋ｖｅ細胞を検出する ための第１抗体として用いられる。

この型のＦａｂＦｃ２誘導体の活性が現れる徴候は以下のとおりである。

１、サイトフルオリメトリ（ｅｙｔｏｆ　１ｕｏｒ　ｔｍｅｔｒｙ）によって、 ＦａｂＦｃ２が、正常血液から調製したヒトＢリンパ球、およびＢリンパ球細胞 系のナマルバ（Ｄａｍａｌｗａ）およびダウディ（Ｎａｕｄｉ）に結合すること が認められている。

２、ＦａｂＦｃ２によって、ダウディ細胞が異種（モルモット）の補体による被 溶解性を獲得し、抗体濃度が１．６μｇ／ｍｌのときに殺傷プラトー（ｐｌａｔ ｅａｕ　ｋｊ’ｌｌｉｎｇ）の５０％に達する。

３、ＦａｂＦｃ２によって、ダウディ細胞がヒト血液のリンパ球によるＡＤＣＣ 能を獲得し、抗体濃度が５Ｑ　ｎｇ／ｍｌのとぎに殺傷プラトーの５０％に達す る。

さらに、連続した立体配置をとるＦｃ部分を有するＦ　ａ　ｂ　Ｆ　ｃ　２誘導 体で別の試験を行い、活性をＦａｂＦｃ誘導体と比較した。それぞれの場合、マ ウスのＦａｂ’　γおよびヒトのＦｃを使用した。試験の詳細は以下のとおりで ある。

この試験は、モルモットの移植可能なりリンパ性白血病（Ｌ　２Ｃ）の抗体療法 に関連したものである。０日に３群（１群は８匹からなる）の動物に、１０５個 の細胞を腹腔内移植した。２つの群には、抗イデイオタイプ特異性を有する抗体 誘導体０．２ｍｇを２４時間後に腹腔内に注射した。対照群の動物には、リン酸 緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を与えた。腫瘍細胞の倍加時間は約１９時間であるた め、単純な反応速度論に基づくと、腫瘍の大きさが半分Ｃあれば、さらに１９時 間延命できることになる。

移植後の日数に対して生存動物数をプロットしたグラフでは、以下のような二と が示された。

１、ＰＢＳ群：１２日から曲線の勾配が急激に下がり、１４日以降生存する動物 はいない。

２、ＦａｂＦｃ群＝１５日から曲線の勾配が下がり、２０日以降生存する動物は いない。

３、ＦａｂＦｃ２群：１５日から曲線の勾配が徐々に下がり、６匹が２０日以降 も生存した。その後、勾配は急激に低下して、２１日まで生き残った１匹は２４ 日以降も生存している。

訃’ａ＋□　ｋ’−”ｈ叱理宴 ＹＬＦＡ図 ８０ｊ　＃Ｌ彬誠・械Ｉ 箔す図 相ｍ的辻諾　外相ｎ６！７速Ｕ Ｍ僅ヒ〉シＦｃ−則祿ヒンジＦａ 特表平４−５０１４１７　（１７） 平成３年４月２４日

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．共有結合によって連結された少なくとも２つのＦｃ領域（先に定義したとお り）を有する合成抗体、誘導体
2. ２．上記の共有結合が少なくとも１つの化学合成リンカーを含む、請求項１記載 の抗体誘導体。
3. ３．少なくともＦｃ領域間の−部の共有結合の一つが基本的に直接結合である、 上記請求項のいずれか１項に記載の抗体誘導体。
4. ４．少なくとも１つのＦａｂ領域（先に定義したとおり）を有する、上記請求項 のいずれか１項に記載の抗体誘電体。
5. ５．下式 Ｆａｂ（Ａ）−Ｒ−［−Ｆｃ−Ｒ−］ｍ−Ｆａｂ（Ｂ）［式中、Ｆａｂ（Ａ）は 、第１の抗体Ａに由来するＦａｂ領域であって、 Ｒは、化学合成のリンカーを示し、 Ｆｃは、Ｆｃ領域を示し、 ｍは、２以上の整数であって、 Ｆａｂ（Ｂ）は、抗体Ａと同種のことも異種のこともあり符、使用条件下で機能 的に不活性となり得る抗体Ｂに由来する所望により存在可能なＦａｂ領域である ］で示される、上記請求項のいずれか１項に記載の抗体、誘導体
6. ６．Ｆａｂ（Ａ）が、ヒトＩｇＭのＨ鎖に特異的なマウスのモノクローナル抗体 （先に抗μと称したもの）からのＦａｂ領域であり、 Ｒが、ビスマレイミドリンカーに由来し、Ｆｃが、ヒト免疫グロブリンＩｇＧに 由来するＦｃ領域であり、 ｍが、２であって、 Ｆａｂ（Ｂ）が、先に抗ＣＤ１８と称された、ヒトＢリンパ球上のＣＤ１９分化 抗原に特異的なマウスのモノクローナル抗体からのＦａｂ領域である、請求項５ 記載の抗体誘導体。
7. ７．少なくとも共有結合の一つがは、それがＦａｂ断片を含むという点で間接的 である、上記請求項のいずれか１項に記載の抗体誘導体。
8. ８．下式 Ｆｃ−Ｒ−Ｆａｂ（−Ｒ−Ｆｃ）ｎ 〔式中、Ｆｃは、Ｆｃ領域を示し、 Ｒは、化学合成のリンカーを示し、 Ｆａｂは、Ｆａｂ領域を示し、 ｎは、１以上の整数であって、 Ｆｃが追加の基（−Ｒ−Ｆｃ）でさらに伸長させ得る］で示される、請求項７記 載の抗体誘導体。
9. ９．Ｆｃが、ヒト免疫グロブリンＩｇＧに由来するＦｃ領域であり、Ｒがビスマ レイミドリンカーに由来し、Ｆａｂが、ヒトＢリンパ球上のＣＤ３７分化抗原に 特異的なマウスモノクローナル抗体に由来するＦａｂ領域であって、ｎが１であ る、請求項８記載の抗体誘導体。
10. １０．開鎖立体配置（先に定義したとおり）をとる少なくとも１つのＦｃ領域を 有する、上記請求項のいずれか１項に記載の抗体誘導体。
11. １１．閉鎖立体配置（先に定義したとおり）をとる少なくとも１つのＦｃ領域を 有する、上記請求項のいずれか１項に記載の抗体誘導体。
12. １２．上記の立体配置が、化学合成リンカーを含む結合を介した閉鎖型である、 請求項１１記載の抗体誘導体。
13. １３．上記の立体配置が、各末端がシステイン残基に結合するジスルフィド結合 を介した閉鎖型である、請求項１１記載の抗体誘導体。
14. １４．Ｆｃ領域の遊離スルフヒドリル基が、例えばアルキル化によって不活性化 されている、請求項１０ないし１３のいずれか１項に記載の抗体誘導体。
15. １５．Ｆａｂ断片とＦｃ領域との間の少なくとも１つの連結を含み、該連結が化 学合成リンカーを含む、上記請求項のいずれか１項に記載の抗体誘導体。
16. １６．少なくとも１つのＦｃ領域が、ヒトの免疫グロブリン、例えばＩｇＧまた はＩｇＧ１に由来する、上記請求項のいずれか１項に記載の抗体誘導体。
17. １７．Ｆａｂ領域の一つが少なくともヒト以外の免疫グロブリンに由来する、上 記請求項のいずれか１項に記載の抗体誘導体。
18. １８．モノクローナル抗体に由来するＦａｂ領域を少なくとも１つ有する、上記 請求項のいずれか１項に記載の抗体誘導体。
19. １９．チオエーテル結合を介して、一端がＦａｂ領域またはＦｃ領域のシステイ ン残基に、他端がＦｃ領域のシステイン残基に連結した化学合成リンカーを少な くとも１つ有する、上記請求項のいずれか１項に記載の抗体誘導体。
20. ２０．２価または３価のリンカー分子の残基を含む化学合成リンカーを少なくと も１つ有する、上記請求項のいずれか１項に記載の抗体誘導体。
21. ２１．上記の残基が２価のビスマレイミド基である、請求項２０記載の抗体誘導 体。
22. ２２．上記のビスマレイミド基が、下式▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ′′は、２価の有機基、例えば、所望により置換し得るアリールまた はアルキル基である］で示されるジマレイミド基である、請求項２１記載の抗体 誘導体。
23. ２３．上記の残基が、２つのシステイン残基を有するＦａｂ領域にＦｃ領域を連 結する３価のリンカー分子の残基である、請求項２０記載の抗体誘導体。
24. ２４．上記の残基が、トリスー（２−クロロエチル）アミンの残基である、請求 項２３記載の抗体誘導体。
25. ２５．抗体の連結部分間の距離を増加させる比較的大きなスペーサー分子を含む 化学合成リンカーを少なくとも１つ有する、上記請求項のいずれか１項に記載の 抗体誘導体。
26. ２６．上記のスペーサー分子が、不活性タンパク、例えば血漿アルブミンに由来 する、請求項２５記載の抗体誘導体。
27. ２７．薬理学的に許容性のある希釈剤または担体とともに、有効成分として上記 請求項のいずれか１項に記載された抗体誘導体を含む製剤。
28. ２８．担癌状態を治療または予防する薬剤を調製するための、請求項１ないし２ ６のいずれか１項に記載の抗体誘導体の使用法。
29. ２９．哺乳動物細胞、例えば、ウイルスもしくは他の細胞内微生物に感染した細 胞、または自己免疫疾患を引き起こす異常リンパ球クローンなどの紅斑性自己免 疫細胞を殺傷する試薬を調製するための、請求項１ないし２６のいずれか１項に 記載の抗体誘導体の使用法。
30. ３０．骨髄から夾雑細胞を除去する試薬を調製するための、請求項１ないし２６ のいずれか１項に記載の抗体誘導体の使用法。
31. ３１．移植を受けた患者の免疫機能を抑制する試薬を調製するための、請求項１ ないし２６のいずれか１項に記載の抗体誘導体の使用法。
32. ３２．　診断用キットまたは試験における、請求項１ないし２６のいずれか１項 に記載の抗体誘導体の使用法。
33. ３３．上記請求項１ないし２６のいずれか１項に記載の抗体誘導体の調製法であ って、以下の工程、ａ）第１のＦｃ領域を処理して、該領域上に反応性部位、例 えば化学合成リンカーの残基を付与する工程、および ｂ）該Ｆｃ領域を、直接にまたは介在性のＦａｂ領域を介して、少なくとも１つ の別のＦｃ領域と反応させる工程を含む調製法。
34. ３４．上記第１のＦｃ領域が、ヒンジ領域に遊離スルフヒドリル基をもつ閉鎖Ｆ ｃヒンジ領域を含む中間産物をチオールージスルフィド交換反応にかけることに よって生じるＦａｂＦｃ構成体の一部である、請求項３３記載の調製法。
35. ３５．以下の工程、 （ａ）抗体から単離したＦａｂ領域を選択的に還元して、そのヒンジ領域に１つ 以上の遊離スルフヒドリル基を作製する工程、 （ｂ）遊離スルフヒドリル基と反応し得る第１の化学合成リンカーの残基を導入 することによってＦａｂ領域を修飾して、スルフヒドリル基となお反応し得る修 飾型Ｆａｂ領域を作製する工程、 （ｃ）該修飾Ｆａｂ領域を同種または異種の抗体から回収した過剰モルのヒンジ 領域に１つのスルフヒドリル基を有するＦｃ領域と反応させ、１つのＦｃ領域、 １本のＦｃ鎖に結合した１つのＦａｂ領域、および別のＦｃ鎖のヒンジ領域の遊 離スルフヒドリル基を有する産物（ＦａｂＦｃ）を作製する工程、（ｄ）該Ｆａ ｂＦｃ産物をチオールージスルフィド交換反応にかける工程、 （ｅ）第２の化学合成リンカーの残基を導入することによって、チオールージス ルフィド交換したＦａｂＦｃ産物を修飾する工程、および （ｆ）チオールージスルフィド交換された修飾ＦａｂＦｃ産物を、同種または異 種の抗体から上記の工程（ａ）ないし（ｄ）の方法によって調製してヒンジ領域 にスルフヒドリル基を有するＦａｂＦｃと連結させて、抗原結合鎖のＦａｂが同 一または異なった特異性をもつビスＦａｂＦｃを作製する工程、 を含む、請求項３４記載の調製法。
36. ３６．ＦａｂおよびＦｃ領域が、出発物質の抗体をペプシンおよびババインでそ れぞれ消化することによって調製される、請求項３５記載の調製法。
37. ３７．請求項３５の工程（ａ）の選択的還元がジチオスレイトールでの処理によ って行われる、請求項３５または３６に記載の調製法。
38. ３８．１つ以上の反応性部位を有するＦａｂ領域を過剰モルのＦｃ領域と反応さ せて、Ｆａｂ領域を介して連結した２つ以上のＦｃ領域を有する抗体誘導体を形 成させる、請求項３３記載の調製法。
39. ３９．以下の工程、 ａ）抗体をペプシンで消化する工程、 ｂ）該産物を還元して、スルフヒドリル基を有する抗体断片誘導体を産生する工 程、 ｃ）該誘導体をマレイミド化Ｆｃ領域と反応させる工程、および ｄ）スルフヒドリル残基を不活性化する工程を含む、請求項３８記載の調製法。
40. ４０．上記請求項３３、３８または３９のいずれか１項に記載の方法で使用する Ｆｃ領域の前駆体を調製する方法であって、以下の工程、 ａ）遊離スルフヒドリル基を有するＦｃ領域および混合型ビリジルジスルフィド 基を有するＦａｂ領域をジスルフィド交換反応にかける工程、ならびにｂ）例え ばアルキル化によって、あらゆるスルフヒドリル基を不活性化する工程 を含む調製法。
41. ４１．上記請求項３３、３８、３９または４０のいずれか１項に記載の方法で使 用される、第１のＦｃ領域の前駆体であって、ジスルフィド結合を介して１つの Ｆｃ領域に連結したＦａｂ領域を有し、該Ｆｃ領域のいかなるスルフとドリル残 基も適切な化学的処理、例えばアルキル化によつて不活性化されている前駆体。
42. ４２．上記の工程ｂ）が適切なアルキル化試薬、例えばＮ−エチルマレイミドで 行われることによって、開鎖立体配置のＦｃ領域が得られる、請求項４０記載の 方法。
43. ４３．開鎖立体配置のＦｃ領域を有する、請求項４１記載の前駆体。
44. ４４．上記の工程ｂ）が適切なアルキル化試薬、例えばｏ−フェニレンジマレイ ミドなどの２価リンカーを用いて行われることによって、閉鎖立体配置のＦｃ領 域が得られる、請求項４０記載の調製法。
45. ４５．閉鎖立体配置のＦｃ領域を有する、請求項４１記載の前駆体。
46. ４６．上記請求項３３、３８または３９のいずれか１項に記載の方法で使用する Ｆｃ領域の調製法であって、以下の工程 ａ）請求項４０、４２もしくは４４のいずれか１項に記載の方法からの産物、ま たは請求項４１、４３もしくは４５のいずれか１項に記載の前駆体を還元して、 目的とするＦｃ領域を産生する工程、およびｂ）生じた還元産物を、２価リンカ ー、例えばビスマレイミドと反応させる工程、 を含む調製法。
47. ４７．１）第１の抗体、例えばヒト以外の免疫グロブリンをペプシンで消化する 工程、 ２）工程１）からのＦａｂ領域を還元する工程、３）該還元型Ｆａｂ領域をチオ ールージスルフィド交換反応にかけて、請求項４０記載の工程ａ）で必要となる Ｆａｂ領域に混合型ビリジルスルフィド基を導入する工程、 該工程１）、２）および３）とともに、４）第２の抗体、例えばヒト免疫グロブ リンをパパインで消化する工程、ならびに ５）工程４）の産物を還元して、請求項４０記載の工程ａ）で必要となる遊離ス ルフヒドリル基をもつＦｃ領域が得られる工程 を含む前工程を含む、請求項４０、４２または４４のいずれか１項に記載の方法 。
48. ４８．化学合成リンカーが、例えばマレイミドまたは塩素基のようなスルフヒド リル基と反応し得る少なくとも２つの官能基を含む、上記方法について請求項の いずれか１項に記載の方法。
49. ４９．上記の化学合成リンカーが、３つの官能基を持ち、ヒンジ領域に２つだけ のシステイン残基を有するＦａｂ領域の連結のために用いられる、請求項４８記 載の方法。