JP2907474B2

JP2907474B2 - 共有結合で連結した２つ以上のＦｃ領域を有する抗体複合体

Info

Publication number: JP2907474B2
Application number: JP1511518A
Authority: JP
Inventors: スティーヴンソン、ジョージ、テルフォード
Original assignee: 3 AI RISAACHI EKUSUPUROITEESHON Ltd
Current assignee: 3 AI RISAACHI EKUSUPUROITEESHON Ltd
Priority date: 1988-10-24
Filing date: 1989-10-23
Publication date: 1999-06-21
Anticipated expiration: 2014-06-21
Also published as: EP0439540A1; GB8824869D0; JPH04501417A; DE68923291D1; EP0439540B1; DE68923291T2; WO1990004413A1; ATE124266T1

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、複数のFc領域を有する抗体誘導体であっ
て、例えばヒトの癌療法、または哺乳動物細胞の殺傷が
望まれる他の状態の処置において、Fc活性の増強を必要
とする際の有効性の改良を意図した抗体誘導体に関す
る。

モノクローナル抗体を使う技術では、腫瘍の分化抗原
に対する特異性をもった数多くの抗体が利用されるよう
になった。Ｂリンパ球性腫瘍（各種のリンパ腫および白
血病）では、Ｂ細胞分化の様々な段階で典型的にみられ
る多様な抗原が分かってきた。これを補足するに、表面
免疫グロブリン（Ig）のイディオタイプ（Id）、すなわ
ち、全体としての特異性が基本的には個々の腫瘍に特異
的であると見なし得る一連のエピトープを有するイディ
オタイプに関する進んだ研究がある。

この明細書では以降、特記しない限り、「抗体」と
「免疫グロブリン」とは同義語として扱う。

抗体を使って新生物を排除することは、同時に損傷を
受ける正常抗原を保有する組織が抗原陰性の前駆体から
再生し得る場合や、正常組織が全く損傷を受けないで済
む場合には、許容し得る治療手段となることは疑いな
い。そういった基準によれば、表面イディオタイプ（I
d）および多数の他のＢリンパ球分化抗原は、抗体療法
における有望な標的である。なお、微生物を処理する目
的で作製された抗体が、単純に哺乳動物細胞に対する優
れた殺傷抗体とはならないという大きな問題がある。そ
れで今日まで、Ｂリンパ球性新生物に侵された患者であ
って、抗イディオタイプ抗体で治療を受けた患者の大部
分は、担癌量が部分的かつ一時的な減少を示すだけであ
った。標的細胞へ抗体の効果が及ばなくなる明らかな因
子として、抗体によりエフェクターの漸増が不充分とな
ること、抗原性の変更、表面イディオタイプに影響を与
える突然変異、および患者の抗−抗体免疫応答能の変化
が挙げられる。

抗体の細胞障害効果を高めるための１つの方法とし
て、キメラ誘導体の作製があり、これは、異種の抗体
（通常、マウスのモノクローナルIgG）に由来する抗体
部位とヒト正常IgGに由来するFc領域を配列したもので
ある。キメラ抗体では、囓歯類のIgG抗体における抗原
結合（Fab）領域が、チオール結合によって、ヒトIgGま
たはヒトIgGのFcγ領域に連結されている。このような
キメラ抗体の調製は以前から報告されてきた。こういっ
たキメラは、モノクローナル抗イディオタイプから大量
に調製され、ヒトのリンパ腫の治療に使用されてきた
［ハンブリンら,Blood,42,495（1987）］。この化学的
誘導されたキメラで、囓歯類のFcγヒトのFcγで置換す
ることから期待される長所は、エフェクター（補体およ
びFcγ受容体としての性質を示す様々な細胞）の良好な
漸増、代謝に対する高い生存率、および低い免疫原性で
ある。この分野における研究の総説は、「キャンサー・
サーベイズ（Cancer Surveys）、４巻、１号、（1985
年）、スチーブンソンおよびグレニー」に記載されてい
る。

抗体が結合した細胞に対する少なくとも２つの重要な
エフェクター機能の漸増は、適度な固有の会合定数をと
もなう相互作用に依存し、複数の結合によって簡単に強
化される。Clqの先端とＣγ２との相互作用は、古典的
な補体経路を開始させるが、そのK_A値は1.8ないし5.8×
10^4M-1と推定されている。結合を確実なものにし、Clq
へ立体配座シグナルを与えるためには、Clqの２つ以上
の標的細胞上で隣接するIgG分子と会合することが必要
である。Fcγ受容体III型（FcRIII）とFcγとの相互作
用は、大顆粒性リンパ球によって影響される抗体依存性
細胞障害（ADCC）にとって必要であって、その相互作用
のＫAは約1.1×107M-1である。受容体は、同時複数結合
を可能とする完全な状態のFcγによってのみ有効に占有
される。したがって、リンパ球のADCCは、IgGの凝集体
によって阻害されることはあっても、IgGモノマーによ
って阻害されることはない。

この発明の目的は、例えば、エフェクター漸増の面で
Fc活性が改善された抗体誘導体を提供することである。
そういった誘導体は、哺乳動物細胞の殺傷を必要とする
一連の状態における処置、例えば、ヒトの癌治療または
Fc機能の増強が有益である他の状態への利用に有望であ
る。

この発明によれば、共有結合によって連結された少な
くとも２つのFc領域（以下に定義するとおり）を含み、
いかなるFab断片（以下に定義するとおり）の存在数もF
c領域の存在数を上回らない合成抗体誘導体が提供され
る。

共有結合は、少なくとも１つの化学合成されたリンカ
ーを含むことが好ましい。

この発明は、既知の天然の構造体を含むものと解釈す
べきではなく、特定の構造体はこの発明の概念を利用し
て得られ、それらの製造においては種々の調製法を用い
ることもできる。

この明細書および請求の範囲で使用される「Fc領域」
は、２本のペプチド鎖からなる典型的な免除グロブリン
のFc構造を有する。

Fc領域は、いかなるクラスまたは種類の免疫グロブリ
ン由来のものであってもよいが、ヒトへの適用を目的と
した場合、ヒト免疫グロブリン、例えば、IgGまたはIgG
1からのものが好ましい。ポリクローナル抗体またはモ
ノクローナル抗体起源のものも使用可能である。

ここでの「合成」とは、IgMなどの天然に存在する構
造体と区別するために使用するが、特記しない限り狭義
に解釈すべきではない。Fc領域間の共有結合は、合成さ
れたものが好ましいが、天然に存在する型の結合を必ず
しも除外して解釈すべきではない。天然の型は、切断さ
れて再結合されたものでもよく、また例えば、組換えDN
Aを用いた遺伝子工学の手法によって得られる種々の構
造をとるものでも良い。

この発明の一態様によれば、共有結合には、化学合成
されたリンカーも含まれる。この連結とは直接的なも
の、すなわち合成のリンカーからなる連結を含む場合も
あり、間接的すなわち介在成分を含むリンカー、例えば
Fab領域などの抗体型活性を有するものであってもよ
い。

この発明の抗体誘導体は、通常、少なくとも１つのFa
b領域を有するが、発明性は必ずしもこれに限定される
わけではない。複数のFc領域は、例えば、さらに複雑な
構造を構築するためにそれ自体出発物質として使用する
こともできる。

どのような場合でも、Fab領域の選択は、発明性に本
質的なものではなく、標的細胞に対する目的とする特異
性を提供することのできる免疫グロブリンのFab領域を
選択して用いることができる。また、２本のペプチド鎖
からなる典型的な構造を有する完全なFab領域を、目的
とする抗原結合特性または受容体に対する特性を有する
部分構造または活性断片などに置き換えることも可能で
ある。例えば、標的細胞上で炭化水素鎖成分を特異的に
認識するレクチンを使用することもできる。

したがって一般に、この明細書および請求の範囲で使
用されるFab領域として利用できるものには、標的細胞
に対する特異性を有するもの、およびFab領域に類似の
機能的特性を有するものが含まれると理解することもで
きる。

Fab領域はモノクローナル抗体に由来することが好ま
しいが、適切なポリクローナル抗体を使用することもで
きる。

適切なモノクローナル抗体には、ヒトの細胞に反応性
を示すもの、およびマウスのアイソタイプIgG1またはIg
G2aが含まれる。これらを、例えばペプシン等で消化す
ることにより、還元によって必要なスルフヒドリル基
（sulphydryl group）を含むFab′γ断片を産生する断
片を得ることが好ましい。

一般に、一の構造中に、あるいは１つの方法において
Fc領域、Fab領域または化学合成のリンカーの２つ以上
が生じる場合、これらは、製造上あるいは用途に関して
特に指定されない限り、同一のものでも異なるものでも
良い。

この発明のさらに別の態様によれば、 Fab(A)-R-[-Fc-R-]_m-Fab(B) ［式中、Fab（Ａ）は、第１の抗体Ａ由来のFab領域、Ｒは、化学合成のリンカー、 Fcは、Fc領域、ｍは、２以上の整数であって、 Fab（Ｂ）は、抗体Ａと同種でも異種でも良く、使用
条件下では機能的に不活性であり得る抗体Ｂに由来する
必要に応じて用いられるFab領域である］が提供され
る。

Fab（Ｂ）を欠く場合、リンカーはその代わりに、例
えばアルキル化されていることもある。

しかし、この発明は、一般に、複数のFc領域を有する
合成抗体を産生することを可能にするが、この発明の抗
体としては、ヒト免疫グロブリンＧ（IgG）に由来する
２つのFc領域を有するものが好ましく、IgG1がもっとも
好ましい。

上式では、Ｒはそれぞれ、チオエーテル結合を介し
て、リンカーの一端でFab領域またはFc領域のシステイ
ン残基と、その他端でFc領域のシステイン残基に連結す
るリンカーであることが好ましい。以下のような理由か
ら、Ｒは、２価リンカー分子の残基であることが多い。
しかし、Ｒが３価リンカー分子の残基となる場合もあ
る。また、特に−Fc−Ｒ−Fc−成分中でのＲは、式−
Ｒ′−Ｘ−Ｒ′− ［式中、Ｒ′は２価リンカーであって、Ｘは、タンパク
またはペプチドなどの相対的に大きな分子、例えば血漿
アルブミンである］で示される基であっても良い。

Fab領域は、ヒンジ領域で約11個以下のシステイン残
基を含んでも良い。代表的なFab領域には、ヒンジ領域
に３つのシステイン残基を有する。この発明の合成抗体
では、Fab領域のシステイン残基のうち２つが２価のＲ
基によって分子内で結合することが可能であって、第３
のシステイン残基は２価の基Ｒによって隣接のFc領域に
結合する。ヒンジ領域に唯一のシステイン残基を有する
Fab領域を使用すると、２価のＲ基を用いて、それに隣
接するFc領域にFab領域を連結させることができる。し
かし、Fab領域がヒンジ領域で２つのシステイン残基を
持てば（例えば、マウスIgG3からのFab領域）、３価の
Ｒ基を用いて、隣接するFc領域とFab領域を連結するこ
とが好ましく、この場合、３価のＲ基の原子価のうちの
２つはFab領域のヒンジ領域で２つのシステイン残基に
それぞれ連結し、第３の原子価はFc領域のシステイン残
基に連結する。

Fc領域同士は、２価のＲ基によって互いに連結される
ことが好ましい。Ｒ基は、２価のリンカー分子の残基で
あっても、また−Ｒ′−Ｘ−Ｒ′−（式中の記号は上述
のとおり）で示される基であってもよい。

さらに、この発明の合成抗体誘導体の例を、ビスFabF
cを以下の第１図（ここで、Ｓはイオウ原子である）に
示す。

２価のＲリンカーの好ましい例として、２価のビスマ
レイミド残基が挙げられる。３価のＲリンカーの例とし
て、トリス−（２−クロロエチル）アミン残基が挙げら
れる。

−Ｒ′−Ｘ−Ｒ′−で表わせる基において、２価の
Ｒ′基は、例えば、一端がチオエーテル結合によってタ
ンパクＸのシステイン残基に、他端がチオエーテル結合
によって、例えばFc領域のシステイン残基に結合され得
る。

この発明のこの態様における合成抗体は、一方のFab
鎖が標的細胞に対するもので、他方のFab鎖が抗体特異
性のない、すなわち、標的細胞に関して機能的に不活性
である１価ものであってもよい。また、この発明の合成
抗体は、２つのFab鎖が同一の活性を有する２価のもの
であるか、標的細胞の異なったエピトープにそれぞれ対
するFab鎖を有する２種の特異性を示すものでも良い。

この発明はまた、以下の工程を含む合成抗体の調製法
を提供する。

（ａ）単離された（Fab）_２抗体断片を選択的（部分
的）に還元して、そのヒンジ領域中に１つ以上の遊離ス
ルフヒドリル基を含むFab断片を形成する工程、（ｂ）遊離スルフヒドリル基と反応し得る第１の化学合
成リンカーの残基を導入することによってFab領域を修
飾して、スルフヒドリル基となお反応し得る修飾型Fab
領域を形成する工程、（ｃ）上記の修飾型Fab領域を、同一または異種の抗体
から回収された過剰モルのヒンジ領域にスルフヒドリル
基を有するFc領域と反応させ、１つのFc領域、１本のFc
鎖に結合した１つのFab領域、および別のFc鎖のヒンジ
領域にある遊離スルフヒドリル基を有する生産物（FabF
c）を形成する工程、（ｄ）上記のFabFc産物をチオール−ジスルフィド交換
反応にかける工程、（ｅ）第２の化学合成リンカーの残基を導入することに
よって、チオール−ジスルフィド交換したFabFc産物を
修飾する工程、および（ｆ）修飾されたチオール−ジスルフィド交換FabFc産
物を、同種または異種の抗体から上記の工程（ａ）ない
し（ｄ）によって調製され、ヒンジ領域にスルフヒドリ
ル基を有するFabFcと連結させて、抗原結合鎖のFabが同
一または異なった特異性をもつようなビスFabFcを形成
する工程。

Fab領域とFc領域はそれぞれ個別に、ペプシンまたは
パパインを用いた抗体の消化によって調製することがで
き、選択的（部分的）還元はジチオスレイトールを用い
た処理によって行うこともできる。

修飾は、遊離のスルフヒドリル基と反応可能な少なく
とも２つの官能基を有する少なくとも２価のリンカーと
遊離スルフヒドリル基との反応によって行なうことがで
きる。こういった官能基の例として、マレイミド基およ
び塩素原子が挙げられる。一般にそのようなリンカー分
子は、上記のような官能基の２つを含むが、上述のよう
に、特にFab領域がヒンジ領域に２つのシステイン残基
をもつ場合、Fab領域を３機能性リンカー分子で修飾す
ることが好ましい。

修飾工程（ｅ）では、工程（ｅ）で得られるチオール
−ジスルフィド交換されたFabFc産物が更に血清アルブ
ミンなどの不活性タンパクに結合されても良い。不活性
タンパクが遊離のスルフヒドリル基を含んでいない場合
は、スルフヒドリル基を、例えばイミノチオラン（imin
othiolane）または３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（SPDP）
を用いた反応によって導入することができる。この不活
性タンパク上のスルフヒドリル基、工程（ｅ）で得られ
るチオール−ジスルフィド交換されたFabFc産物との結
合は、架橋分子との反応により行なうことができる。

続いて、工程（ｆ）では、不活性タンパク残基と第２
のFabFc成分の上にあるそれぞれの遊離スルフヒドリル
基とリンカー分子との反応によって、第２のFabFc成分
に不活性タンパクを連結させることができる。

各工程（ｂ）および（ｅ）での修飾は、所望とする遊
離のスルフヒドリル基と反応し得る官能基の数（通常２
官能基）を有するリンカー分子との反応によって行われ
ることが好ましい場合が多い。

特に好ましい型のリンカー分子は、下式［式中、Ｒ″は、２価の有機基、例えば、任意に置換し
得る２価アリール基または任意に置換し得る２価脂肪酸
基である］で示されるジマレイミドである。こういった
リンカー分子には、N,N′−ｏ−フェニレンジマレイミ
ドおよびN,N′−ビス（３−マレイミドプロピオニル）
−２−ヒドロキシ−1,3−プロパンジアミンが含まれ
る。

特に特定の型のFab領域を隣接するFc領域と連結させ
るために挙げられる他のリンカー分子は、トリス−
（２′−クロロエチル）アミンである。

チオール−ジスルフィド交換反応は、2,2′−ジピリ
ジルジスルフィドを用いた処理によって行うことができ
る。

サブユニットであるFabFcは、適当な条件下で、この
キメラに含まれるもとの抗体を凌ぐ改良点、すなわち、
優れたエフェクター漸増、代謝に対する良好な抵抗性、
免疫原性の低下を付与することもある。これらのサブユ
ニットは、いかなるモノクローナル抗体からも高い収率
で調製され得る。このモノクナロール抗体の消化によ
り、共通のマウスアイソタイプIgG1およびIgG2を含む群
のＦ（ab′γ）_２に断片を得ることができる。FabFc誘
導体は、そのままで使用するか、特異性のいかなる組み
合わせも可能な２量体として使用することもでき、後者
からは本発明のビスFabFcが得られる。機能面で改良可
能な点として、さらに以下の点を期待することができ
る。

（１）誘導体が機能的に１価、すなわち、標的細胞に対
してただ１つのFab鎖を持つ状態であれば、細胞のエピ
トープ１個あたりのFc鎖の数は２倍となり、Fc鎖の対合
によって、エフェクターの協同的結合が生じる。

（２）誘導体が２価であれば、Fc鎖の対合に伴って標的
細胞に対する親和性の増加が見られる。

（３）２種の特異性を有するビスFabFcでは、これが２
つの標的エピトープに同時に結合することから、親和性
の増加が生じる。標的細胞における抗原の構造的分布が
最低限にあるか、抗原に影響を与える突然変異が生じる
ために起こる標的細胞の抗体からの逃避は、非常に難し
くなる。なぜならば、２つの抗原がこれらの基準を同時
に満たさねばならないからである。細胞外の抗原による
抗体の不活性化は、標的エピトープの一方だけが分泌さ
れる場合、より困難になる。当然、Fc鎖が対合するとき
の利点は、明らかである。

この発明の別の態様によれば、抗体誘導体は、下式Fc
-R-Fab(-R-Fc)_n ［式中、Fcは、Fc領域を、Ｒは、化学合成リンカーを、 Fabは、Fab領域を、ｎは、１以上の整数を示す。

そして、Fcは、追加の基（−Ｒ−Fc）によってさらに
伸長させることも可能である］で示され得る。

また、こういった誘導体はと表すこともできるが、これは、１つのFab領域をはさ
む２つのFc基の間における共有結合の間接的な結合構造
を示す。

こうして得られた、いわゆる「平行」的なFcの幾何学
的配列から、以下のような潜在的な長所が得られる。

1.平行Fc配列は、エフェクターの協同的漸増のために、
標的細胞上でFcの規則的配列を形成するのに非常に都合
がよい。

2.その調製が簡単となり、最終産物におけるFabの収率
が改善される。

3.Fcヒンジ領域では、開鎖または閉鎖立体配置（以下に
定義するような）が容易に得られる。後者の場合、誘導
体は補体を活性化しない。そのことは、活性化されるこ
とで毒性を生じる可能性がある場合には、利点となり得
る。特に、抗体が循環する可溶性抗原の表面に融合され
る場合、上記のことがいえる。

「閉鎖」とは、Fc領域を含むペプチド鎖が、ヒンジ領
域中またはその近傍で共有結合によって連結されている
ことをいう。これらは、添付の図面、第6Aないし6C図に
示し、以降でさらに詳述する。

共有結合は、どちらかの鎖の末端にシステイン残基を
持ち、適切な化学合成リンカーを取り込むジスルフィド
連結またはチオエーテル連結からなり得る。

それとは対照的に「開鎖」とは、上記のような共有結
合が存在しないことをいう。

この発明の抗体誘導体および得られた構造体を調製す
る方法の詳しい説明は、以下の実施例で行う。

この発明の抗体誘導体は、Fc活性の増強を必要とする
適用範囲において有用と見られる。これらは、処置のタ
イプまたは投与の形態に応じて、薬理学的に許容性のあ
る希釈剤または担体を配合した製剤中での活性成分とし
て用いることができる。

これら誘導体は、微生物などの標的領域に対して有用
とみられるが、例えば、細胞がこの発明の誘導体のFab
領域に認識され得る抗原を発現するような状態の治療に
おいて哺乳動物細胞の殺傷が必要なとき、誘導体は特に
有用と考えられる。

こういった顕著な適用例には、担癌状態、ウイルスも
しくは他の細胞内微生物に感染した細胞、または自己免
疫疾患を引き起こす異常リンパ球クローンなどの紅斑性
自己免疫細胞に対する使用が含まれる。

さらに可能な適用例には、夾雑細胞を骨髄から除去す
る処置、および移植を受けた患者の免疫抑制が含まれ
る。

したがって、例えば、複数のFc領域を有する合成抗体
誘導体は、その適用形態に規定されるタイプの構造を含
むものとされる。この際、Fab領域は、一定の標的細胞
上の表面分子に対する特異的な親和性を有する別の成分
によって置き換えられる。例えば、ヒトの免疫不全ウイ
ルスに感染し、細胞表面にウイルスタンパクgp120を発
現している標的細胞は、（CD4）Fc_２、すなわち、FabFc
_２の変異体によって標的とされ得る。この場合、Fab
は、ウイルスgp120が強力な親和性をもつことになるヒ
トの正常タンパクで置換される。合成抗体産物を調製す
るには、CD4に、化学的または遺伝子組換え技術によっ
て、そのＣ末端近傍に少なくとも２つのスルフヒドリル
基が付与されねばならない。

したがって、この発明による誘導体は、AIDSの治療に
有用であり得る。

この発明の誘導体はまた、Fc受容体を有する標的細胞
にも効力をもつ可能性もあり、この場合、Fab領域は、
標的（例えば、毒素）に到達すべき分子と結合して、利
用される。

さらに、誘導体は、診断用の試験およびキットへの応
用面を見いだしても良い。

実施例ここで、添付の図面を参照にして、この発明の実施例
を記載する。

第１図は、Fc領域間で直接の共有結合をもつ合成抗体
誘導体を示す図である。

第２図は、第１図の誘導体の調製法を表す。

第３図は、この発明の誘導体と他の誘導体とを比較す
る、補体による細胞障害を示すグラフである。

第４図は、この発明の誘導体の活性と他の誘導体の活
性とを比較するグラフであって、4Aは補体による細胞障
害を示し、4Bは抗体依存性細胞障害（ADCC）を示す。

第５図は、Fc領域間で間接的な共有結合を有する合成
抗体を示す図である。

第６図は、Fab領域に関する開鎖立体配置および閉鎖
立体配置の詳細を示す。

第７図は、中間構造体を産生するために用いられるサ
ブルーチン操作を示す。

第８図は、別のサブルーチン操作の一部を示す。

第９図は、第５図の誘導体の調製法を示す。

第10図は、この発明の誘導体によるリンパ球の殺傷
を、他の２つの誘導体との比較によって示すグラフであ
る。

共有結合による連結を有する抗体誘導体第１図で、白ぬきの部分は、化学合成のＲリンカーに
よって互いに直接共有結合した２つのFc領域を示す。こ
こで、Ｒリンカーの末端は、Fc領域の鎖の一部を形成す
るシステイン残基のイオウ原子に結合している。このFc
領域の立体配置は閉鎖しており、それぞれの領域の個々
の鎖は、鎖中にあるシステイン残基から形成されるジス
ルフィド結合を介して直接共有結合している。

それぞれのFc領域をさらに、モノクローナル抗体Ａお
よびＢ（同種のことも異種のこともある）由来のFab領
域（図中の黒ぬり）に−Ｓ−Ｒ−Ｓ−類似結合によって
共有結合している。ここで完全な形の合成抗体誘導体を
ビスFabFc（A/B）と表す。第１図に示されるような誘導
体の調製および試験を以下に詳述する。

材料シグマ社（Sigma Chemical Company）から入手したジ
チオスレイトール（DTT）およびブリディシュ・ドラッ
グ・ハウス社（Buritish Drug Houses）から入手した２
−メルカプトエタノールは、精製せずにそのまま使用し
た。アルドリッチ社（Aldrich Chemical Company）から
入手した2,2′−ジピリジルジスルフィド（Py−SS−P
y）は、ジメチルスルホアミド（DMF）／水から再結晶化
した。

ビス−マレイミドの架橋剤である、N,N′−ｏ−フェ
ニレンジマレイミド（PDM）およびN,N′−ビス（３−マ
レイミドプロピオニル）−２−ヒドロキシ−1,3−プロ
パンジアミン（BMP）はそれぞれ、滴定によって予想値
の90％を上回るマレイミド活性を有することが分かり、
精製せずに使用した。それぞれの化合物を、初めにDMF
中に溶解し、マレイミド環の加水分解を最小限に抑え、
使用直前に水溶性緩衝液で所定の範囲に希釈した。

アフィニティーゲルのプロテインＡセファロースCl-4
Bは、ファルマシア社から入手した。カチオン交換体の
ホスホウルトロゲルA6R（Phospho-Ultrogel A6R）は、
バイオテクニクス社（Villeneuve la Grrenne, Franc
e）から入手した。

ペプシン（ブタの胃の粘膜からのもの、製品番号P688
7,Sigma）は、精製せずにそのまま使用した。パパイン
は、pH7.7で10mMの２−メルカプトエタノールおよび5mM
のEDTAを添加して15分間37℃でのインキュベーションに
よって活性化した。続いて、これを、0.1M酢酸ナトリウ
ム、pH4.0、1mM EDTA、、5.5mM 2−メルカプトエタノー
ルで平衡化したセファデックスG-50（ファルマシア社）
に20℃で通過させた。主要なタンパクのピーク中心部を
回収し、使用時まで分割して凍結保存した。

Fc断片の調製ヒト正常IgGは、血液銀行で余剰となった血漿から調
製した。まず、一組の原料として血漿タンパクを、40mM
トリスアセテート（pH6.0）を溶離液とするカチオン交
換体、PS-Trisacryl（IBF バイオテクニクス社）に結合
させたものを調製した。それを溶出させ、その緩衝液を
他のものと交換したのち、この溶出物を、50mM Tris-HC
l（pH8.0）を溶離液とするDEAEセファロースFF（ファル
マシア社）にかけ、そこで保持されずに溶出したIgGを
回収した。この手順によれば、主要なIgG群の半分が回
収されるが、これらIgG分子の特性は、FabおよびFc断片
がイオン交換クロマトグラフィーによって容易に分離さ
れる点である。

Fcγ断片を調製するために、上記のIgG（18mg/ml）
を、pH6.6で0.5mM 2−メルカプトエタノールの存在下、
37℃で30分間パパイン（0.05mg/ml）によって消化し
た。消化は、Ｎ−エチルマレイミド（22mM/DMF）を濃度
2mMまで添加して停止させた。チオールがこういった条
件にさらされても、IgG中の特徴的なジスルフィド結合
は減少しない（滴定によれば0.05残基／分子未満であ
る）。Fcγ断片は、セファデックスG-50、DEAE-セファ
ロースFF、およびセファクリルS-200HR（すべてファル
マシア社から入手）の一連のクロマトグラフィーに連続
的にかけることによって分離した。セファデックスG-50
に通過されると、パパインから生じたIgGとIgGからの断
片が分離され、これらをイオン交換用の25mM Tris-HCl
（pH8.0）に移した。DEAEセファロースのカラムには、F
cγ断片および若干の未消化IgGは保持されたが、Fabγ
断片は保持されなかった。保持された物質は、0.5M塩化
ナトリウム＋0.1M Tris-HCl（pH8.0）で溶出され、直接
セファクリルのカラムにこれをかけて、IgGとFcγ断片
に分離した。こうして得られたFcγ断片は、基本的には
すべてIgG1由来であった。IgG2は上記の消化条件に対し
て相対的に抵抗性を示し、IgG3からはセファクリルで大
量のFcγ断片が生じた。そして、IgG4は原料IgG中に有
意な量では存在していない。

Fab断片の調製マウスのモノクローナル抗体を３種類使用した。抗イ
ディオタイプ（Ｌ_２Ｃ）抗体は、エリオットら［Journa
l of immunology, 138, 981（1987）］およびスティー
ブンソンら［Br. J. Cancer （1984） 50, 407-413］に
よって抗イディオタイプ−１抗体として詳細に記載され
たものであって、モルモットのＬ_２Ｃ白血病細胞上の表
面免疫グロブリンのイディオタイプに特異的である。試
料は、サザンプトン大学リンパ腫研究室、サザンプトン
総合病院テノバス研究室［Tremona Road, Southampton,
S09 4XY, UK］のM.J.グレニー博士より供与されたもの
である。抗μ抗体は、ヒトIgMのＨ鎖に対して特異的で
あって、研究室で作製されていたが、現在ではAmershoa
m International plc［Little Chalfont, HP7 9NA, U
K］から入手されている。抗CD19抗体は、ヒトＢリンパ
球上のCD19（p95）分化抗原に対して特異的であって、
ロイヤルフリー病院免疫学部門［Pond Street, London,
NW3 2QG, UK］で作製され、そこから入手したものであ
る。

マウスIgG1から得られたＦ（ab′γ）_２は、パパイン
による制限消化によって調製された。この消化方法は、
Zorbax GF250 （Dupont）上での経時的サンプリングを
行なったサンプルのクロマトグラフィーによってモニタ
ーされた。18mg/mlのIgG＋0.3mg/ml（pH4.1）のペプシ
ンを用いれば、この消化は一般に、37℃で８時間以内に
ほぼ完了するが、この反応にはpHの調節が支配的であ
る。Ｆ（ab′γ）_２は、セファクリルS-200HRのクロマ
トグラフィーに繰り返しかけることによって分離した。
なお、セファクリルS-200HRは、0.5M塩化ナトリウム、
0.02M Tris-HCl（pH8.0）で平衡化したものである。

FabFcおよびビスFabFcの調製第２図を参照にして、FabFcおよびビスFabFcの調製に
かかわる工程を総括する。

まず、マウスのIgG1抗体から得られたＦ（ab′γ）_２
を還元して、ヒンジ領域に遊離スルフヒドリル（SH）基
を有するFab′γを産生させる。これらのSH基は、過剰
のビスマレイミドリンカー（PDM）と反応して、ヒンジ
領域に結合した遊離マレイミド基を生じる。こうして得
た、Fab′γ（mal）は、ヒンジ領域に遊離スルフヒドリ
ル基を有するヒトの還元型Fcγ−１と反応するが、この
際、Fcは、１分子以上のFab′と組み合わせるほどの過
剰モル比で存在する。生じたFabFcはゲルクロマトグラ
フィーによって分離され、プロテインＡに結合される。
そのエフェクター機能を容易に引き出すために、Fc領域
のヒンジ部分をチオール−ジスルフィド交換によって結
合させると、ジスルフィド（SS）結合が再形成される。
これを生じさせるシステイン残基は、Fab′とのチオエ
ーテル結合に関与しないものである。この結果、孤立し
たシステイン残基が生じ、これがさらにリンカー（PDM
または長いBMP）と反応してFabFc（mal）となり、FabFc
（SH）との結合を起こす。様々なFabFcを調製し、保存
し、それぞれの形で使用することができる。またこれら
に別の処理を行っても良く、各種の特異性の組み合わせ
を有するビスFabFcとする２量体化を行なうことも可能
である。

選択的（部分的）に還元されたFab′γ マウスIgG抗体のペプシン消化によって得られたＦ（a
b′γ）２断片を、pH8.0にてDTTで還元し、pH5.0にて2,
2′−ジピリジルスルフィドとチオール−ジスルフィド
交換を行わせて、pH5.0にてDTTで再び還元した。得られ
たタンパクをセファデックスG-25を通過させた後、滴定
によって1kDあたり2.9残基のSH基が存在すること、セフ
ァクリルS200のゲル濾過では94％がモノマーの位置に６
％がダイマーの位置に移動すること、およびSDS-PAGEで
はFd′γとＬ鎖成分への分離はほとんど認められないこ
とが分かった。最も頻度の高い（90％を越える）種類
は、γＬ鎖のSS結合は完全であるが、３つのSH基が還元
型分子間γ鎖結合から誘導されたモノマーのFab′γで
あった。

Fab′γの修飾 20mM酢酸ナトリウム＋1mM EDTA（pH5.3）を用いてセ
ファデックスG-25に通したあと、Fab′γ（SH）を５℃
で30分間2mMのPDMと同じpHで反応さた。DMFは20容量％
で存在していた。インキュベーションの最後に、1/5容
量の冷酢酸を添加して、pHを4.6に調節した。PDMを除
き、タンパクを濃縮するために、この溶液をホスホウル
トロゲルA6Rにかけ、10％DMF/90％Na2EDTAで５℃で溶出
した。洗浄後、Fab′γ（mal）を0.5M酢酸ナトリウム
（pH5.3）で逆流溶出させ、窒素下で氷浴に回収した。
ホスホウルトロゲルの長所はpH5.3で速い溶出が得られ
る点にあるので、他のカチオン交換体で必要とされる高
いpHにおけるマレイミド基の加水分解率の上昇を防ぐこ
とができる。

タンパクは、４ないし8mg/mlの濃度で回収された。そ
の少量のサンプルのセファクリルS-200HRのクロマトグ
ラフィーにより、ダイマー含有量が５％未満であって、
一般には分離不能な高分子量凝集体を伴うことが分かっ
た。４回の測定で、１分子あたりのマレイミド含有量は
0.84から1.05の範囲でばらつくが、近似値はほぼ１であ
る。PY-SS-pYを用いた場合に、残存SH基は検出されなか
った。これらの所見によれば、ヒンジ領域のSH基のうち
の２つは、リンカーとともに環化されており、第３のSH
基が末端と反応していることがわかる。Fab′ヒンジに
結合した１残基以上のマレイミド基の存在は、Fab′が
ヒトFcγと反応するときに、高次凝集体の形成傾向を増
大させるので、こういった結果は極めて有用である。

BMPリンカーは長いものほど、PDMより安定性が増すと
いう長所があり、マレイミド基は、アリール連結という
よりもアルキル連結の状態にあるので、より安定性が増
す。しかし、上記のプロトコルを2mMで行った場合、Fa
b′の架橋傾向が増大し、ダイマー含有量が15％を上回
る結果が得られる。BMPの濃度を4mMに上げた場合、形成
されるダイマー量は小さくなるが、1Fab′あたり1.3な
いし1.6のマレイミド単位が得られ、PDMを使用した場合
よりも、Fab′‐Fc相互作用における凝集体の生成量の
増大が認められた。BMPに関するこれら両方の問題は、
その存在がPDMほど３つのSH基のうちの２つの分子内架
橋を生じさせる可能性が低いということに基づいて説明
ができる。

FabFcの形成ヒトFcγは、37℃で15分間6mM DTT（pH8.0）と反応さ
せることによって還元され、これを0.5M酢酸ナトリウム
（pH5.3）でセファデックスG-25に通し、窒素下で氷浴
に回収した。SH基の滴定では、その理論値は１分子あた
り4.0であるが、実測値は3.2ないし3.6の範囲であっ
た。SDS-PAGEで調べたところ、50kDの位置にタンパク分
子が見られないので、ヒンジ領域にSH基は存在していな
いことがわかった。相対的に低い滴定値から、ヒンジ領
域がタンパク分解によって失われる分子もあることが示
唆された。

調製直後のFab′γ（mal）を、連続撹拌しながらFc
（SH）にFab:Fc＝1:2.5のモル比で添加した。この混合
物を、最低タンパク濃度7mg/mlで２時間室温でインキュ
ベーションした。Fcが多いモル比では、いかなる還元
も、凝集体の産生量を増大させた。なお、この凝集体と
は、１分子のFcあたりのFabが１分子以上ついたものと
解釈される。経済面から見た廃棄量についての問題は、
抗体FabよりFcのほうで軽視できるので、過剰のFcは一
般には回収されない。

FabFcは、５℃で0.5M酢酸ナトリウム＋5mM EDTA（pH
5.8）でのセファクリルS200HRのクロマトグラフィーを
繰り返すことによって、凝集体および過剰のFcから分離
された。２−メルカプトエタノールが存在しないとFcが
酸化された２量体の生じる傾向があるので、これを2mM
添加して２量体の形成量を抑制した。分離された凝集体
の代表的な量は、FabFc（100kD）のピーク画分に存在す
るタンパクの約10％に相当した。プロテインＡセファロ
ースのカラムに、FabFcは結合するが、挟雑Ｆ（ab′
γ）_２は結合しないので、FabFcを上記のセファクリル
のカラムかけた後、プロテインＡセファロースカラムに
かけた。

Fcヒンジ領域を閉鎖するためのチオール−ジスルフィ
ド交換反応はpH5.3で行ったが、FabFcは上記のプロテイ
ンＡカラムに結合したままで残された。２−メルカプト
エタノールを洗い流した後、５％DMFに溶かした0.1mM P
y−SS−Py溶液を５℃で30分間このカラムに通した。２
−チオピリリドンの急速な放出が生じたが、これはPy−
SS−Pyが溶出を開始する時点で見られた。この放出量
は、これがそれに続くタンパクの溶出量と関連させてみ
たところ、FabFc1分子あたり2.3ないし2.8のSH基（理論
値3.0）が反応することを示していた。

この段階で、２−ピリジルジスルフィドとして存在す
る非連結ヒンジ領域システインとともに、FabFcは、即
座の使用またはその後のビスFabFcへの取込みのために
溶出し得る。これがビスFabFcへ直ちに反応させるため
に使用されるなら、このタンパクを後の操作のためにカ
ラムに残しておくこともできる。

最初に使用されるＦ（ab′γ）_２に関して、FabFcに
対するFab′の回収率は約65％である。

ビスFabFcの形成同一または異なる抗体特異性をもつ２つのFabFcが、
それぞれ別々のプロテインＡカラムで分離された。一方
では非連結システインがSH型に戻り、他方のでは非連結
システインがビスマレイミドリンカーとの反応によって
マレイミド基になった。このリンカーは一般にはBMPで
あって、これが選ばれた理由は、長いアルキル鎖が２つ
のFcの分離をPDMの場合に比べて容易にし、その結果各F
cへのエフェクター分子の同時結合がより容易になる点
にある。しかし、分子間連結する２つのFcの位置を比較
しても、エフェクターの漸増における明らかな利点を示
すことはできなかった。したがって、BMPは一般に、溶
解度が高いために使用された。FabFcの量をモル比でFab
Fc（SH）:FabFc（mal）＝1:1.1に調節して、マレイミド
基の影響をある程度増大させた。

詳述すると、両方のプロテインＡカラムでFabFcの非
連結ヒンジ領域システイン（２−ピリジルジスルフィド
として存在）は、0.7mM DTT（pH5.3）を流すことによっ
て、選択的（部分的）に還元された。溶離液のDTTに
は、１分子のFabFcあたり0.80ないし0.92分子の２−チ
オピリドンを添加した。この数値のとき、Py−SS−Pyと
の初期反応によって、Fcヒンジ領域にある一対のシステ
イン残基間のSS結合が再構築されたはずである。FabFc
（mal）を調製するために、調製物の１方を、12.5％DMF
＋20mM酢酸ナトリウム（pH5.3）に溶解させ8mM BMPと反
応させ、５℃で30分間カラムに通した。

カラムに残った過剰の試薬を洗浄したのち、直列につ
ないだカラムに0.1M塩酸グリシンを通過させることによ
って、FabFc（SH）およびFabFc（mal）を１つの溶液中
に溶出させた。酢酸ナトリウムを用いてpHを5.5に調節
し、20℃で16時間この溶液をインキュベーションした。
溶出量は、カラムの形態に留意して最低に保たれた。チ
オエーテル結合はマレイミドの加水分解と拮抗するの
で、タンパク濃度は10mg/mlを上回ることが望ましい。

インキュベーションの最後に、セファクリルS200上で
その少量のサンプルをクロマトグラフィーにかけると、
77％までのタンパクが200kDに相当する位置に移動した
ことが分かった。高次量凝集体が少量存在する以外、残
りの部分は100kDの成分として挙動した。オクタロニー
法でのプレートを調べたところ、その200kD成分は１分
子上にマウスのFabおよびヒトFabエピトープを含むこ
と、ならびにただ１種類のエピトープからなる分子は存
在しないことが分かった。したがって、200kDの画分は
基本的にすべてビスFabFcとみなされた。100kDの画分に
は、主成分としてFabエピトープとFcエピトープの両方
を有する分子、すなわちFabFcが含まれていたが、Fc2は
含まれているとしても少量であった。

必要であれば、調製物全体をクロマトグラフィーにか
けて、ビスFabFc成分とFabFc成分に分離することもでき
る。しかし、治療に使用する場合、少量のFabFcが存在
しても全くの不都合とはならないので、そのような分離
を必要としない。治療用製剤にとって必要な追加の工程
は、発熱物質の除去処理である。すなわち、調製物を多
段階の排除工程にかけた後、ポリミキシンカラムのクロ
マトグラフィーを行って発熱物質を完全または部分的に
排除して、細菌フィルター（0.22μｍ）を通過させた直
後に滅菌ずみ容器に集める。

ビスFabFcのエフェクター機能以下の特徴を有する３つの調製物を調べた。

（ａ）モルモットL2C細胞上の表面Idに対して作製され
た両鎖を有するもの（抗Id）／抗（Id）、（ｂ）１本の抗イディオタイプ（Ｌ_２Ｃ）鎖および１本
の無関係な鎖（ヒトの腫瘍に対して作製されたIgG1抗体
Idとは関係ない）を有し、L2C細胞に対して１価として
有効なもの（抗Id/0）、（ｃ）ヒトのリンパ系細胞上の指標抗原に対して作製さ
れたもの（抗μ／抗CD19）。

調製物（ａ）および（ｂ）はＬ_２Ｃ細胞に対してテス
トされ、調製物（ｃ）はＢリンパ芽球細胞系のダウディ
（Daudi）に対してテストされた。もとのマウスIgG1抗
体のどれも、これらの標的に対する補体の溶解またはリ
ンパ球の抗体依存細胞性細胞障害（ADCC）の測定におい
ていかなる活性も示さなかった。

第３図では、補体の溶解性に関して、ビスFabFc（抗I
d/0）はもとのFabFcに比べて重量基準で約２倍の力価を
もち、活性抗体部位のモル濃度で約４倍の力価をもつこ
とが示されている。２つの要因、すなわち、細胞上のFc
数の増加および一対のFcの対合性によって、このような
優れた性質が生まれるのであろう。しかし、現在のとこ
ろ、これらの要因を個別に評価することはできない。

ビスFabFc（抗Id/抗Id）は、図が重量基準によるもの
（第３図）か活性抗体部位のモル濃度基準によるものか
にかかわらず、１価のビス誘導体より優れた機能を持っ
ている。この改善は、２価の結合が関与した親和性の増
大に起因するにちがいないが、これには２価の誘導体が
表面IgGの抗原変調を誘導する［ゴールドンとスティー
ブンソン、immunology, 42, 13（1981）］というネガテ
ィブな面もある。実際には、流動サイトフルオリメトリ
ーでは、30分間を越える処理でもビスFabFc（抗Id/抗I
d）によるＬ_２Ｃ細胞へのいかなる変調の誘導も認めら
れなかった。これは、FabFc間の連結が長くしなやかで
あること、またはもとのIgG1抗イディオタイプがそれ自
体、表面IgGと一対一の結合様式をもつ弱い変調因子で
あること［エリオットら、Journal of Immunology 138,
981（1987）］に関連していると考えられる。

第４図は、ビスFabFc（抗μ／抗CD19）の機能を、も
との２つのFabFcの機能と比較したものである。ADCCで
は、ビス誘導体の力価は、もとの分子の力価の約16倍で
あった。補体の殺傷力は全体的に低かったが、ビス誘導
体が勝っていることは明らかである。しかし、これらの
評価は、複数の要因（結合親和性、１細胞あたりのFc
数、Fcの配向性、および初期に起こり得る変調）を考慮
すると簡単に下すことはできない。

補体溶解の検定法において、ビスFabFcの抗補体活性
を示唆するプロゾーンの形成はみられなかった。

抗体誘起性細胞障害 ₅₁Cr標識抗体でコートした細胞の補体介在性殺傷を、
常法によって行った。補体源として、正常ウサギまたは
モルモットの新鮮な血清を最終希釈率1:5で使用した。A
DCCは、正常ヒト血液から分離したての新鮮なリンパ球
エフェクターを、エフェクター：標的細胞＝50:1の比で
用いて行った。10％のヒトAB型血清（不活性型）を添加
した。溶解の程度を3.5時間後に読み取った。

細胞障害のパーセントは、２回の測定の平均値であっ
て、常法で以下の式から計算した。

第５図を参照すると、白ヌキの部分は、中間に位置す
る１つのFab領域（黒ヌリ部）を含む共有結合による連
結部により互いに間接的に連結された２つのFc領域を示
す。２つの領域間の連結部は各領域における個々の鎖の
システイン基のイオウ原子で末端が結合する化学合成さ
れたリンカーＲを含む。図示されるように、Fab領域の
両方の鎖は、一本のFc鎖とそれぞれ結合している。しか
しながら、十分な個数の反応し得る基があれば、両方の
Fc領域を一本の鎖に結合させることも可能である。全部
そろった形のものをFabFc2と略称する。

開鎖または開鎖のの立体配置を有するFc領域をさらに
詳しく第６図に示す。図中、6A〜6Cは閉鎖立体配置を、
6Dは開鎖立体配置を示す。FabFc_２（閉鎖）におけるヒ
ンジ領域は、そのジスルフィド結合の一つを再構築する
こと、あるいは、Ｒ′基で区分された直列のチオエーテ
ル結合［相同的（第6A図）または非相同的（第6B図）連
結］を介することによって閉鎖されている。

Ｓ●は、アルキル化、その他の手段によって不活性化
されたチオール基を示す。

その化学合成におけるランダムな要素とは、Fab上の
５つのＳ原子のうちのいずれか２つがFcへの連結に関与
し得ること、さらには、Fcヒンジ領域における４つのＳ
原子のうちのいずれか１つがFabへの連結に関与し得る
ことにある（第９図における最終的構造式を参照）。

第５図に例示したタイプの抗体誘導体を調製する方法
を以下に詳述する。

原理 1.基本的な調製工程は、ヒンジ領域に単一のマレイミド
基を有するFcγ、すなわち、Fc（mal）と遊離のSH基を
有するFabとの反応がを含む。（第９図）。FabのSH基
は、すべての鎖間SH基の還元によって生じ、ほとんどの
場合（マウスのモノクローナルIgG1またはIgG2に由来す
るFab′での場合）、こういったFabは５つのSH基を有す
るものといえる［Fab（SH基）_５］。その他の場合、基
の数は３（例えば、マウスIgG3）ないし６（例えば、マ
ウスIgG2b）をとり得るが、こういった変形例は、この
調製法に対して若干の変更を加えたものに過ぎないとい
えよう。

2.モル比Fc:Fab≧３でのFc（mal）とFab（SH）５との反
応では、主産物としてFabFc2が得られることが分かる
（第９図）。

3.副産物はFabFc_３およびFabFcであって、これらを除去
することも可能であるが、産物の収率を改善するために
FabFc2と一緒にこれらの副産物を残したままでも問題の
生じる懸念はない。

4.反応混合物がモル比Fc:Fab≧３となるときでさえ、Fa
bFc_２が主産物となる理由は、FabFc2の形成後、立体障
害によってFc（mal）がSH基へ接近しにくくなる点にあ
る。

5.Fc（mal）の調製には、保存のための中間産物Fab−SS
−Fc（犠牲FabFc）としてFcγを残すサブルーチン処理
を伴う。Fab成分（ここではヒツジFab′γ）を捨て去る
が、リサイクルも可能である。このサブルーチン処理に
よって、Fcが１価の結合型として利用できるようにな
る。すなわち、この処理により最終の（Fab＋Fc）反応
での産物を単純化し、特に１つ以上のFabとの反応によ
る各種の分子の生成を妨げられる。

6.犠牲FabFcでは、ヒツジFab′γは、Fcヒンジ領域の１
つのシステイン残基をブロックする。これにより、２つ
の経路の１方で、Fc上に１つのマレイミド基の置換が可
能となる。

a.サブルーチン（１）：これは、開鎖ヒンジを有するFc
（mal）とチオエーテル結合ヒンジを有するFc（mal）と
の両方を調製するために使用される。ヒツジFab′γが
固定されシステイン残基は、結果的にマレイミド基を保
有するものである。

b.サブルーチン（２）：これは、ジスルフィド結合ヒン
ジ領域を有するFc（mal）の調製のために使用される。
マレイミド基を保持するシステイン残基は、ヒツジFa
b′γを保持する残基と背中合せの向きをとる。

犠牲FabFcのためのサブルーチン（１）［第７図］ 1.ヒツジの正常ポリクローナルIgGのペプシン消化から
得られたＦ（ab′γ）_２断片は、pH8.0にてジチオスレ
イトール（DTT）で還元され、4,4′−ジピリジルジスル
フィドを用いてチオール−ジスルフィド交換反応に供さ
れる。これは、前記のマウスFab′γのところで記載し
たとおりに行われる（原理１）。産物（Fab−SS−Py）
は、前者の分子間Fabジスルフィド結合の部位に単一の
混合ピリジルジスルフィド基をもつ。

2.ヒトFcγの鎖間ジスルフィド結合は、上記のとおりDT
Tとの反応によって還元される。（原理１） 3.等モルのFabとFcを用いると、Fab−SS−PyおよびFc
（SH）４に、25℃でpH4.4にてジスルフィド交換反応が
進行する。このpHでは、ピリジルジスルフィドが単独で
ジスルフィド交換反応につながるチオール基による求核
攻撃を受けやすくなる。これとは対照的に、SH基がアル
キル化によって不活化される前は、FabとFc間で形成さ
れるジスルフィド結合は、タンパクのSH基が近傍（第７
図）しているにもかかわらず、酸性pHでの分解をほとん
ど起こさない。生成するジスルフィド結合の産物は、Fa
bFc（主要産物）およびFab_２Fc（副次的産物）であっ
て、これらより大型産物は極めて稀である。総タンパク
濃度は5mg/ml以上であって、この反応時間は30分で十分
である。

4.Fcヒンジ領域を開鎖型とする必要があれば、pH5.0で
Ｎ−エチルマレイミド基を用いてアルキル化を停止す
る。

5.Fcヒンジ領域を閉鎖型とする必要があれば、２価リン
カーのｏ−フェニレンジマレイミド基を用いてアルキル
化を行う（第７図）。このリンカーが残存する３つのSH
基を３通りの方法で架橋することができ、そのうちの２
つが架橋されれば、ヒンジ領域は閉鎖される。この論拠
と合致して、Fab−SS−Fc分子の大部分はアルキル化さ
れるので、解離溶媒中での電気泳動によってFc成分の半
分が共有結合されたことが分かる。架橋されていないSH
基は、リンカーと反応して遊離のマレイミド基を残すこ
とになるが、このマレイミド基は、pH5.0で２−メツカ
プトエタノールに短時間さらすことによって不活化が可
能である。

6.犠牲FabFcは、セファクリルS200HR（ファルマシア
社）のゲルクロマトグラフィーによって、その他の反応
産物および残存する反応体と分離される。

7.犠牲FabFcは、使用時まで必要に応じて５℃で保存さ
れ、これらの条件下で少なくとも３カ月は安定であるこ
とが確かめられた。

犠牲FabFcのためのサブルーチン（２）［第８図］ 1.上記のサブルーチン（１）と同様。

2.上記のサブルーチン（１）と同様。

3.上記のサブルーチン（１）と同様。

4.ジピリジルジスルフィドを0.2mMまで加えて、25℃で
ジスルフィド交換反応をさらに30分間進行させる。その
結果、両方のシステイン残基が利用可能なヒンジ領域の
ジスルフィド残基は、閉鎖状態となる［こういった交換
反応によるタンパクのジスルフィド結合の閉鎖機構に関
する考察は文献（１）を参照］。そして、他のシステイ
ン残基は、混合ジスルフィドタンパク−SS−Pyに転化さ
れる。

5.ここで、犠牲FabFcは、Fab−SS−Fc−SS−Pyのジスル
フィド立体配置（第８図）をもつ安定な型で存在する
が、セファクリルS200HRのゲルクロマトグラフィーによ
って分離されて、使用時まで５℃で保存される。

主反応主反応は、マウスのFab′γとヒトのFcとを連結する
ことであって、その主な特徴を第９図に記載する。その
際の犠牲FabFcが、サブルーチン（１）に由来するもの
か、サブルーチン（２）に由来するものかに応じて、詳
細面で差異の生じることもある。

第９図を参照すると、マウスFab′γ部分とヒトFc_１
部分との結合が示されているが、これはFabFc_２の全て
の変化形を示すのに十分なものである。その変化形とし
ては、例えば開鎖ヒンジ領域型、チオエーテル結合され
たヒンジ領域を有する型、ジスルフィド結合されたヒン
ジ領域を有する型がある。ヒンジ領域がジスルフィド結
合されたものの調製においては、Fcが抗体Fab′γと結
合した後はマレイシド基の反対側にヒツジFab′γがFc
に結合された状態で残される。

A.サブルーチン（１）から得られる犠牲FabFcの使用 1.F（ab′γ）_２は、マウスモノクローナルIgG抗体のペ
プシン消化から生じるものであって、これを25℃（pH8.
0）で3mM DTTによって還元すると、Fab（SH）_５が得ら
れる。続いて、このpHを5.0に下げて、イオン強度を0.0
2以下にして［希酸の添加、またはpH5.0の0.02M酢酸緩
衝液で平衡化したセファデックスG-25（ファルマシア
社）を通すことによって］、タンパクをカチオン交換体
ホスホウルトロゲル6B（I.B.F. Biotehcnics）のカラム
にかけて結合させる。

2.犠牲FabFcを、Fcγに高い親和性をもつプロテインＡ
アガロースのカラムにかける。pH8.0の6mM DTT緩衝液を
５℃でこのカラムに通過させると、サブユニット間のジ
スルフィド結合が還元されて、カラムの溶出液中にヒツ
ジのFab′γが放出される。このFab′γは再利用のため
に集めることもできる。

3.ここで、0.1Mグリシン−HCl（pH3.0）によってカラム
からFc（SH）を溶出させ、ビスマレイミドのリンカーと
反応させる。用いたリンカーは、2mMのN,N′−ｏ−フェ
ニレンジマレイミド、および5mMのN,N′−ビス（３−マ
レイミドプロピオニル）−２−ヒドロキシ−1,3−プロ
パンジアミンである。これらのリンカーは、これをタン
パク溶液に加える前に、ジメチルホルムアミドに溶解さ
せる。リンカーとの結合（のための）最終条件は、Fc濃
度0.25mM、リンカー濃度２または5mM、ジメチルホルム
アミド濃度20容量％以下、pH5.3、温度５℃である。30
分が経過したところで、Fc（mal）型となったのタンパ
クを、リンカーから分離し、0.5M酢酸緩衝液（pH5.3）
中に移して、５℃でセファデックスG-25（ファルマシア
社）のカラムにかける。

長さおよび堅さの増したリンカー、例えば、２つのマ
レイミド基を有するペプチドの使用が考慮されることも
ある。

4.Fc（mal）含有溶液を、セファデックスカラムから溶
出させる同時に、ホスホウルトロゲル6Bのカラムにかけ
る。これによって、結合抗体Fab（SH）５が溶出し、一
つの濃縮された両タンパクを含む溶液が得られる（総タ
ンパク濃度は約10mg/ml）。Fc/Fabのモル比は３であ
る。

5.Fab（SH）５＋Fc（mal）の反応は、pH5.3で20℃にて1
6時間行わせる。続いて、Ｎ−エチル−マレイミドとの
アルキル化によってSH基を除去する。最後に、産物は、
セファクリルS200HR（ファルマシア社）のクロマトグラ
フィーを繰り返すことによって、大きさに従って分離さ
れる。

B.サブルーチン（２）から得られる犠牲FabFcの使用。

ここでの方法は、ヒツジのFab′γをFcから除去する
前に、Fc（mal）を調製して、これを抗体Fab（SH）５に
連結させるものである。工程２および３では、Fcのシス
テイン残基における還元およびマレイミド化を示すが、
この残基の反対側はヒツジのFab′γに結合している。
このときの反応では、Fab′γの結合のためのジスルフ
ィド結合またはヒンジ領域のジスルフィド結合の還元を
避けるために、pHが低く（4.0）抑えられる。

1.Aでの工程と同じ。

2.犠牲FabFcは、Fab−SS−Fc−SS−Pyの形態にあるが、
これをpH4.0、５℃で１時間ジチオスレイトール（0.5m
M）と反応させる。これによって、Fab−SS−Fc−SHに転
化され、これをpH4.0の緩衝液で平衡化したセファデッ
クスG-25にかけることによって分離する。

3.ここで、FabFcは、0.1M酢酸塩溶液（pH4.0）に溶けた
3nm o−フェニレンジマレイミド＋25容量％のジメチル
ホルムアミドと５℃で２時間反応させる。これによっ
て、FabFcはFab−SS−Fc（mal）に転化され、これは、
ホスホウルトロゲル6Bカラムへの結合によって分離、濃
縮される。

4.2本のホスホウルトロゲル6Bのカラム（工程１および
３からのもの）を、0.5M酢酸塩緩衝液（pH5.3）で連続
的に溶出させる。Fab−SS−Fc（mal）およびFab（SH）
_５を、モル比3:1にて25℃で16時間反応させて、濃縮液
（12mg/mlの総タンパク濃度）とする。主産物は、（Fab
−SS−Fc）_２Fabである。

5.pHを6.0に上げ、タンパクをプロテインＡアガロース
のカラムにかけると、これにヒトのFc成分を含むすべて
の分子が結合する。ここで、pH6.0のカラムに30分間2mM
のメルカプトエタノールを通過させると、ヒツジのFa
b′γは結合状態から開放される。最後に、2mMのシスタ
ミンをpH7.0でカラムに30分間通過させることによっ
て、還元されても良いヒンジ領域のあらゆるジスルフィ
ドの再形成を促進させ、ヒツジのFab′γの放出後に残
存するシステインのSH基をブロックする。

6.最後に、FabFc2と、その他の産物は、分子量の差に基
づいたセファクリルS200HR（ファルマシア社）のクロマ
トグラフィーを繰り返すことによって、分離される。

文献 1.G.T.スティーヴンソン、A.ピンダー、C.J.スレード、
「IgGヒンジ領域の操作によって調製された２つのFc領
域（ビスFabFc）を有するキメラ抗体」、Anti-Cancer D
rug Design 3:219-230,1989。

2.K.ブロックレハースト、「チオールの特異的共有結合
修飾−酵素、その他の生体分子の研究における応用」、
Internat. J. Biochem. 10:259-274 作用平行なFc部分を有するFabFc2の作用の予備的評価を、
第10図を参照にして説明する。なお、この図は、ヒトエ
フェクター（正常のリンパ球）の存在下、（エフェクタ
ー：標的細胞＝50）で１価のキメラ抗体誘導体（特異
性、抗CD19抗体）３種類によるヒトリンパ球（ダウディ
（Daudi）系、放射性クロムで標識）の殺傷をプロット
したグラフである。細胞障害の測定は、37℃で3.5時間
後に行った。この抗体依存細胞性細胞障害（ADCC）の短
時間試験で、FabFc（開鎖ヒンジ）およびFabFc（閉鎖ヒ
ンジ）の場合とFabFc_２（開鎖ヒンジ）の場合を比較し
た。この試験は、生体内における抗体の標的細胞殺傷能
を予想するために、生体外で利用し得る最も優れた方法
といえよう。FabFc_２は、この試験で活性を示し、Fc部
分を１つしか含まないその類似体より優れたものと考え
られる。

また、Fab領域が以下のような特徴を有するモノクロ
ーナル抗体に由来する抗体誘導体も作製した。

・クローン:WR17（Wessex Immunology Service, Southa
mpton, UKから入手可能）・アイソタイプ：ネズミのIgG2a ・融合の詳細：白血病患者の細胞で免疫したBalb/c系マ
ウスから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞系NS-Oを
用いた、従来のコーラー・ミルシュタイン型の融合・特異性:WR17は、抗CD37試薬であって、発生の初期と
後期を除いてＢリンパ球に強く発現した40〜50kDの糖タ
ンパクと反応する。また、この抗原は、顆粒球およびマ
クロファージにも弱く発現し、場合によってはＴ細胞リ
ンパ腫にも発現する。

・適用:WR17は、懸濁物および凍結切片中のCD37＋ve細
胞を検出するための第１抗体として用いられる。

この型のFabFc2誘導体の活性が現れる徴候は以下のと
おりである。

1.サイトフルオリメトリ（cytofluorimetry）によっ
て、FabFc2が、正常血液から調製したヒトＢリンパ球、
およびＢリンパ細胞系のナマルバ（Damalwa）およびダ
ウディ（Daudi）に結合することが認められている。

2.FabFc2によって、ダウディ細胞が異種（モルモット）
の補体による被溶解性を獲得し、抗体濃度が1.6μg/ml
のときに殺傷プラトー（plateau killing）の50％に達
する。

3.FabFc2によって、ダウディ細胞がヒト血液のリンパ球
によるADCC能を獲得し、抗体濃度が50ng/mlのときに殺
傷プラトーの50％に達する。

さらに、連続した立体配置をとるFc部分を有するFabF
c_２誘導体で別の試験を行い、活性をFabFc誘導体と比較
した。それぞれの場合、マウスのFab′γおよびヒトのF
cを使用した。試験の詳細は以下のとおりである。

この試験は、モルモットの移植可能なＢリンパ性白血
病（L2C）の抗体療法に関連したものである。０日に３
群（１群は８匹からなる）の動物に、10_５個の細胞を腹
腔内移植した。２つの群には、抗イディオタイプ特異性
を有する抗体誘導体0.2mgを24時間後に腹腔内に注射し
た。対照群の動物には、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）
を与えた。腫瘍細胞の倍加時間は約19時間であるため、
単純な反応速度論に基づくと、腫瘍の大きさが半分であ
れば、さらに19時間延命できることになる。

移植後の日数に対して生存動物数をプロットしたグラ
フでは、以下のようなことが示された。

1.PBS群:12日から曲線の勾配が急激に下がり、14日以降
生存する動物はいない。

2.FabFc群:15日から曲線の勾配が下がり、20日以降生存
する動物はいない。

3.FabFc_２群:15日から曲線の勾配が徐々に下がり、６匹
が20日以降も生存した。その後、勾配は急激に低下し
て、21日まで生き残った１匹は24日以降も生存してい
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 33/563 33/563 33/577 33/577 Ｂ (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 16/46 C12P 21/08 A61K 39/395 G01N 33/531 - 33/577 ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】共有結合によって連結された少なくとも２
つのFc領域を含み、該Fc領域は２本のペプチド鎖からな
り、かつ、いかなるFab領域の存在数もFc領域の存在数
を上回らないことを特徴とする合成抗体誘導体。
【請求項２】上記の共有結合が少なくとも１つの化学合
成リンカーを含む請求項１に記載の合成抗体誘導体。
【請求項３】Fc領域間の共有結合の少なくとも一部が基
本的に直接結合である請求項１または２に記載の合成抗
体誘導体。
【請求項４】少なくとも１つのFab領域を有する請求項
１〜３のいずれかに記載の合成抗体誘導体。
【請求項５】下記式： Fab(A)-R-[-Fc-R-]_m-Fab(B) ［式中、Fab（Ａ）は、第１の抗体Ａに由来するFab領域
であって、Ｒは、化学合成のリンカーを示し、 Fcは、Fc領域を示し、ｍは、２以上の整数であって、 Fab（Ｂ）は、抗体Ａと同種のことも異種のこともあり
得、使用条件下で機能的に不活性となり得る抗体Ｂに由
来する所望により存在可能なFab領域である］で示される請求項１〜４のいずれかに記載の合成抗体誘
導体。
【請求項６】Fab（Ａ）が、ヒトIgMのＨ鎖に特異的なマ
ウスのモノクローナル抗体である抗μからのFab領域で
あり、Ｒが、ビスマレイミドリンカーに由来し、 Fcが、ヒト免疫グリブリンIgGに由来するFc領域であ
り、ｍが、２であって、 Fab（Ｂ）がヒトＢリンパ球上のCD19分化抗原に特異的
なマウスのモノクローナル抗体である抗CD19からのFab
領域である請求項５に記載の合成抗体誘導体。
【請求項７】２つのFc領域間の共有結合による連結の少
なくとも１つが、Fab領域を介して２つのFc領域が結合
する間接結合である請求項１〜６のいずれかに記載の合
成抗体誘導体。
【請求項８】下記式： Fc-R-Fab(-R-Fc)_n ［式中、Fcは、Fc領域を示し、Ｒは、化学合成のリンカーを示し、 Fabは、Fab領域を示し、ｎは、１以上の整数であって、 Fcが追加の基（−Ｒ−Fc）でさらに伸長させ得る］で示される請求項７に記載の合成抗体誘導体。
【請求項９】Fcが、ヒト免疫グロブリンIgGに由来するF
c領域であり、Ｒがビスマレイミドリンカーに由来し、F
abが、ヒトＢリンパ球上のCD37分化抗原に特異的なマウ
スモノクローナル抗体に由来するFab領域であって、ｎ
が１である請求項８に記載の合成抗体誘導体。
【請求項１０】開鎖立体配置をとる少なくとも１つのFc
領域を有する請求項１〜９のいずれかに記載の合成抗体
誘導体。
【請求項１１】閉鎖立体配置をとる少なくとも１つのFc
領域を有する請求項１〜10のいずれかに記載の合成抗体
誘導体。
【請求項１２】上記の立体配置が、化学合成リンカーを
含む結合を介した閉鎖型である請求項11に記載の合成抗
体誘導体。
【請求項１３】上記の立体配置が、各末端がシステイン
残基に結合するジスルフィド結合を介した閉鎖型である
請求項11に記載の合成抗体誘導体。
【請求項１４】Fc領域の遊離スルフヒドリル基が、不活
性化されている請求項10〜13のいずれかに記載の合成抗
体誘導体。
【請求項１５】不活性化がアルキル化によって行われる
請求項14に記載の合成抗体誘導体。
【請求項１６】Fab断片とFc領域との間の少なくとも１
つの連結を含み、該連結が化学合成リンカーを含む請求
項１〜15のいずれかに記載の合成抗体誘導体。
【請求項１７】少なくとも１つのFc領域が、ヒトの免疫
グロブリンに由来する請求項１〜16のいずれかに記載の
合成抗体誘導体。
【請求項１８】前記ヒトの免疫グロブリンが、IgGまた
はIgG1である請求項17に記載の合成抗体誘導体。
【請求項１９】少なくともヒト以外の免疫グロブリンに
由来する部分を有するFab領域を持つ請求項１〜18のい
ずれかに記載の合成抗体誘導体。
【請求項２０】モノクローナル抗体に由来するFab領域
を少なくとも一つ有する請求項１〜19のいずれかに記載
の合成抗体誘導体。
【請求項２１】チオエーテル結合を介して、一端がFab
領域またはFc領域のシステイン残基に、他端がFc領域の
システイン残基に連結した化学合成リンカーを少なくと
も一つ有する請求項１〜20のいずれかに記載の合成抗体
誘導体。
【請求項２２】２価または３価のリンカー分子の残基を
含む化学合成リンカーを少なくとも一つ有する請求項１
〜21のいずれかに記載の合成抗体誘導体。
【請求項２３】前記リンカー分子の残基が２価のビスマ
レイミド基である請求項22に記載の合成抗体誘導体。
【請求項２４】前記ビスマレイミド基が、下記式：［式中、Ｒ″は、２価の有機基である］で示されるジマレイミド基である請求項23に記載の合成
抗体誘導体。
【請求項２５】前記２価の有機基が、所望により置換し
得るアリール基またはアルキル基である請求項24に記載
の合成抗体誘導体。
【請求項２６】前記リンカー分子の残基が、２つのシス
テイン残基を有するFab領域にFc領域を連結する３価の
リンカー分子の残基である請求項22に記載の合成抗体誘
導体。
【請求項２７】前記リンカー分子の残基が、トリス−
（２−クロロエチル）アミンの残基である請求項26に記
載の合成抗体誘導体。
【請求項２８】抗体の連結部分間の距離を増加させる比
較的大きなスペーサー分子を含む化学合成リンカーを少
なくとも１つ有する請求項１〜27のいずれかに記載の合
成抗体誘導体。
【請求項２９】前記スペーサー分子が、不活性タンパク
に由来する請求項28に記載の合成抗体誘導体。
【請求項３０】前記不活性タンパクが、血漿アルブミで
ある請求項29に記載の合成抗体誘導体。
【請求項３１】請求項１〜30のいずれかに記載の合成抗
体誘導体を有効成分として含有し、担癌状態の治療また
は予防用、哺乳動物細胞または紅斑性自己免疫細胞の殺
傷用、骨髄からの所望としない細胞の除去用または移植
を受けた患者の免疫機能の抑制用であることを特徴とす
る製剤。
【請求項３２】前記哺乳動物細胞が、ウイルスもしくは
他の細胞内微生物に感染した細胞である請求項31に記載
の製剤。
【請求項３３】前記紅斑性自己免疫細胞が、自己免疫疾
患を引き起こす異常リンパ球クローンである請求項31に
記載の製剤。
【請求項３４】薬理学的に許容性のある希釈剤または担
体を更に含む請求項31〜33のいずれかに記載の薬剤。
【請求項３５】請求項１〜30のいずれかに記載の合成抗
体誘導体を含むことを特徴とする診断用キット。
【請求項３６】請求項１〜30のいずれかに記載の合成抗
体誘導体の調整法であって、以下の工程：ａ）第１のFc領域を処理して、該領域上に反応性部位を
付与する工程、およびｂ）該Fc領域を、直接に、または介在性のFab領域を介
して、少なくとも１つの別のFc領域と反応させる工程を含むことを特徴とする合成抗体誘導体の調整法。
【請求項３７】前記反応性部位が、化学合成リンカーの
残基である請求項36に記載の合成抗体誘導体の調整法。
【請求項３８】前記第１のFc領域が、ヒンジ領域に遊離
スルフヒドリル基をもつ開鎖ヒンジFc領域を含む中間産
物をチオール−ジスルフィド交換反応にかけることによ
って生じるFabFc構成体の一部である請求項36または37
に記載の合成抗体誘導体の調整法。
【請求項３９】以下の工程：（ａ）抗体から単離したFab領域を選択的に還元して、
そのヒンジ領域に１つ以上の遊離スルフヒドリル基を作
製する工程、（ｂ）遊離スルフヒドリル基と反応し得る第１の化学合
成リンカーの残基を導入することによってFab領域を誘
導体化して、スルフヒドリル基となお反応し得る誘導体
化されたFab領域を作製する工程、（ｃ）誘導体化されたFab領域を同種または異種の抗体
から回収した過剰モルのヒンジ領域に一つのスルフヒド
リル基を有するFc領域を反応させ、１つのFc領域、１本
のFc鎖に結合した１つのFab領域、および別のFc鎖のヒ
ンジ領域の遊離スルフヒドリル基を有する産物（FabF
c）を作製する工程、（ｄ）該FabFc産物をチオール−ジスルフィド交換反応
にかける工程、（ｅ）第２の化学合成リンカーの残基を導入することに
よって、チオール−ジスルフィド交換したFabFc産物を
誘導体化する工程、および（ｆ）チオール−ジスルフィド交換され、誘導体化され
たFabFc産物を、同種または異種の抗体から上記の工程
（ａ）ないし（ｄ）の方法によって調製してヒンジ領域
にスルフヒドリル基を有するFabFcと連結させて、抗原
結合鎖のFabが同一または異なった特異性をもつビスFab
Fcを作製する工程、を含む請求項38に記載の合成抗体誘導体の調製法。
【請求項４０】上記のFabおよびFc領域が、出発物質の
抗体をペプシンおよびパパインでそれぞれ消化すること
によって調製される請求項39に記載の合成抗体誘導体の
調製法。
【請求項４１】工程（ａ）の選択的還元がジチオスレイ
トールでの処理によって行われる請求項39または40に記
載の合成抗体誘導体の調製法。
【請求項４２】１つ以上の反応性部位を有するFab領域
を過剰モルのFc領域と反応させて、Fab領域を介して連
結した２つ以上のFc領域を有する抗体誘導体を形成させ
る請求項36または37に記載の合成抗体誘導体の調製法。
【請求項４３】以下の工程：ａ）抗体をペプシンで消化する工程、ｂ）該ペプシン消化産物を還元して、抗体断片のスルフ
ヒドリル化された誘導体を産生する工程、ｃ）該誘導体をマレイミド化Fc領域と反応させる工程、
およびｄ）残りのスルフヒドリル基を不活性化する工程を含む請求項42に記載の合成抗体誘導体の調製法。
【請求項４４】請求項36〜43のいずれかに記載の合成抗
体誘導体の調製法で使用するFc領域の前駆体を調製する
方法であって、以下の工程：ａ）遊離スルフヒドリル基を有するFc領域および混合型
ピリジルジスルフィド基を有するFab領域をジスルフィ
ド交換反応にかける工程、ならびにｂ）あらゆるスルフヒドリル基を不活性化する工程を含むことを特徴とするFc領域の前駆体の調製法。
【請求項４５】前記不活性化がアルキル化により行われ
る請求項44に記載の前駆体の調製法。
【請求項４６】前記工程ｂ）が適切なアルキル化試薬で
行われることによって、開鎖立体配置のFc領域が得られ
る請求項45に記載のFc領域の前駆体の調製法。
【請求項４７】前記アルキル化試薬が、Ｎ−エチルマレ
イミドである請求項46に記載の前駆体の調製法。
【請求項４８】前記工程ｂ）が適切なアルキル化試薬で
行われることによって、閉鎖立体配置のFc領域が得られ
る請求項45に記載のFc領域の前駆体の調製法。
【請求項４９】前記アルキル化試薬が、２価のリンカー
である請求項48に記載の前駆体の調製法。
【請求項５０】前記アルキル化試薬が、ｏ−フェニレン
ジマレイミドである請求項49に記載の前駆体の調製法。
【請求項５１】請求項36〜43のいずれかに記載の合成抗
体誘導体の調製法、あるいは請求項44〜50のいずれかに
記載のFc領域の前駆体の調製法で使用される第１のFc領
域の前駆体であって、ジスルフィド結合を介して１つの
Fc領域に連結したFab領域を有し、該Fc領域の残りのス
ルフヒドリル基も適切な化学的処理によって不活性化さ
れていることを特徴とするFc領域の前駆体。
【請求項５２】前記不活性化がアルキル化である請求項
51に記載の前駆体。
【請求項５３】開鎖立体配置のFc領域を有する請求項51
または52に記載のFc領域の前駆体。
【請求項５４】閉鎖立体配置のFc領域を有する請求項51
または52に記載のFc領域の前駆体。
【請求項５５】請求項36〜43のいずれかに記載の合成抗
体誘導体の調製法で使用するFc領域の調製法であって、
以下の工程：ａ）請求項44〜50のいずれかに記載のFc領域の前駆体の
調製法からの産物、または請求項51〜54のいずれかに記
載のFc領域の前駆体を還元して、目的とするFc領域を産
生する工程、およびｂ）生じた還元産物を、２価リンカーと反応させる工程を含むことを特徴とするFc領域の調製法。
【請求項５６】前記２価リンカーが、ビスマレイミドで
ある請求項55に記載の調製法。
【請求項５７】１）第１の抗体をペプシンで消化する工
程、２）工程１）からのFab領域を還元する工程、３）該還元型Fab領域をチオール−ジスルフィド交換反
応にかけて、請求項44の工程ａ）で必要となるようにFa
b領域に混合型ピリジルジスルフィド基を導入する工
程、これら工程１）、２）および３）とともに、４）第２の抗体をパパインで消化する工程、ならびに５）工程４）の産物を還元して、請求項44に記載の工程
ａ）で必要となる遊離スルフヒドリル基をもつFc領域が
得られる工程、を含む請求項44〜50のいずれかに記載のFc領域の前駆体
の調製法。
【請求項５８】前記第１の抗体が、ヒト以外の免疫グロ
ブリンである請求項57に記載の前駆体の調製法。
【請求項５９】前記第２の抗体がヒト免疫グロブリンで
ある請求項57に記載の前駆体の調製法。
【請求項６０】スルフヒドリル基と反応し得る少なくと
も２つの官能基を含む化学合成リンカーからなる基から
なる反応性部位が供給される請求項36〜50及び55〜59の
いずれかに記載の方法。
【請求項６１】前記化学合成リンカーが、マレイミドま
たは塩素基である請求項60に記載の方法。
【請求項６２】前記化学合成リンカーが、３つの官能基
を持ち、ヒンジ領域に２つだけのシステイン残基を有す
るFab領域の連結のために用いられる請求項60または61
に記載の方法。
【請求項６３】残基が、比較的大きなスペーサー分子を
取り込んでいる少なくとも１つの化学合成リンカーから
供給される請求項36〜50及び55〜59のいずれかに記載の
方法。
【請求項６４】前記スペーサーが、不活性タンパクであ
る請求項63に記載の方法。
【請求項６５】前記スペーサーが、血漿アルブミンであ
る請求項64に記載の方法。
【請求項６６】残基が、下記式：［式中、Ｒ″は、２価の有機基である］で示されるジマレイミドである少なくとも１つの化学合
成リンカーから供給される請求項36〜50及び55〜59のい
ずれかに記載の方法。
【請求項６７】前記２価の有機基が、任意に置換し得る
アリールまたは脂肪族基である請求項66に記載の方法。
【請求項６８】前記２価の有機基が、N,N′−ｏ−フェ
ニレンジマレイミドまたはN,N′−ビス（３−マレイミ
ドプロピオニル）−２−ヒドロキシ−1,3−プロパンジ
アミンである請求項67に記載の方法。