JPH04501253A

JPH04501253A - 抗腫瘍剤として有用なホスホラミド

Info

Publication number: JPH04501253A
Application number: JP1506400A
Authority: JP
Inventors: ボーチ，リチヤード　エフ; カナツト，グレゴリー　ダブリユー; バレント，ロナルド　アール
Original assignee: リサーチ　コーポレーシヨン　テクノロジーズ　インコーポレーテツド
Priority date: 1988-05-25
Filing date: 1989-05-25
Publication date: 1992-03-05
Also published as: EP0418292A1; WO1989011484A1; EP0418292A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ｔ２１１、−臂゛本発明は有効な薬理特性をもち抗１１ｗＩ剤として有用な新規ホスホラミドに間する。

シクロホスホラミド（シトキサンとしても知られている）は世界で最も広く使われている抗Ｉ！瘍剤である。これは種々の血液性及び固体抗腫を治療する多くの他の薬剤と組合わせて投与されている。しかしこれには薬効に悪影響を及ぼしうるいくつかの特定がある。第１に肝臓内の代謝活性化を必要としガン細胞に対し毒性のある代謝系を生ずる。第２にこの薬剤は特に膀胱に対し毒性がありまた抗Ｉ！瘍剤のアルキル化剤系に典型的な骨髄毒性を示す。

第３に、シクロホスファミドはガンの治療に用いる投与量で免疫系の抑制剤としての作用をもっており、それらの疾病で既に衰弱している患者の感染抵抗性を弱める。最後にシクロホスファミドの反復使用は愚者のガン細胞中にこの薬剤に対する耐性を生ぜしめ薬効が示されなくなる。

本発明はこれらの問題の１又は２以上に有効な新規ホスアミド化合物を提供する０本発明の化合物はシクロホスファミド自身に対する耐性の出ている動物の腫瘍の治療に有効である。またこれらの化合物はシクロホスファミドで示された膀胱毒性をもたない。

本発明は抗腫瘍活性を有する又は抗ｍ瘍活性を有することのできる新規ホスホラミドに間する。この化合物類は酸素欠乏（即ち低酸素症）細胞の還元環境にさらすとホスホラミドマスタード（シクロホスファミドから誘導された細胞毒代謝物質）を遊離することができる。

本発明の化合物は式％式％）但しＲ１及びＲ２は同一でも異なってもよく、水素又はハロゲン、ヒドロキシ又は低級アルコキシでモノ置換した低級アルキル（但し置換基はα炭素上にはない）；又はＲ１及びＲ２は窒素と結合してモルフォリノ環を形成している；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素、電子引き抜き性基、又は非置換又は低級アルキルもしくは水素引き抜き性基でモノ置換した主鎖の炭素原子が６以下で全炭素原子が１０以下のアルキル基てあり；Ｒはアリール又は、ニトロ基でモノ置換した窒素、硫黄又は酸素含有へテロ芳香族基である、アルキル基である、で示される化合物及びその製薬上許容される塩である。

ここで低級アルキル基は単独で又は他の基との組合わせで６以下の炭素原子をもち、直鎖状でも枝分かれしていてもよく、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、５ｅＣ−ブチル、イソブチル、アミル、ペンチル、ヘキシル等かある。好ましいアルキル基は炭素原子１〜３のものである。

ここで低級アルケニル基とは２〜６の炭素原子と少なくとも１の二重結合をもち３以上の二重結合をもたないものである。これらの基は直鎖状でも枝分かれしていてもよく、エチニル、ブテニル、イソブテニル等がある。

ここでアルキニルとは２〜６の炭素原子と三重結合をもつヒドロカルビル基である。これらの基は直鎖状でも枝分かれ状でもよい。これらの基としてはエチニル、ブチニル、ヘキシニル等がある。

アリール基は６〜１０の環炭素原子をもつ芳香族環である。アリール基にはフェニル、α−ナフチル、β−ナフチル等がある。

好ましいアリール基はフェニルである。

ここで「窒素、硫黄又は酸素へテロ環」とは少なくとも１の硫黄、窒素又は酸素環原子をもち、それら原子の１又は数個を有しうるヘテロ環である。この語はまた飽和及び不飽和へテロ環とへテロ芳香族環を含む。これらの基はへテロ環部に５〜１０の環原子をもつ０代表的なヘテロ環にはフラン、チオフェン、ビロール、ピリジン、ピラゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、オキサゾール、イミダゾール、キノリン、イソキノリン、インドール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンゾキサゾール、ピペラジン、テトラヒドロフラン等がある。好ましいヘテロ芳香族はピリジルである。

また用語アリール及び窒素、硫黄又は酸素へテロ環はアルキル置換したアリール及びヘテロ環も含む、たとえばトルエン、エチルベンゼン、アルキルイミダゾール、Ｎ−アルキルイミダゾール、メチルキノリンのようなアルキルキノリン等がある。

Ｒ基はニトロ置換したアリール又はへテロ芳香族である。ニトロ基はアリール基又はヘテロ芳香族環のいづれの位置に置換してもよい、好ましいＲ基はニトロフェニル、たと太ば２−ニトロ又は４−ニトロフェニル、ニトロピリジル、たとえば４−ニトロ−２−ピリジル又は５−ニトロ−２−ピリジル及びニトロビロール、ニトロイミダゾール及びニトロキノリンである。

好ましいニトロイミダゾールは低級アルキル置換ニトロイミダゾールである。ここで低級アルキルは炭素原子１〜６を有する。

特に好ましい低級アルキルイミダゾールはＮ−低級アルキルイミダゾールである。また好ましいＮ−アルキルイミダゾールは次式％式％ここでＲ５は低級アルキルである。

好ましいニトロキノリンは式ここでニトロ基はキノリンの２．３．又は４−位置にある、　−をもつ。

好ましいＲ＋及びＲ２は水素又は主鎖に炭素数１〜３をもつアルキルであるｅＲ＋とＲ２は共にハロゲン、低級アルキル又はヒドロキシでα−位以外の位置（即ちホスホラミドの窒素に隣接する炭素）にモノ置換されていてもよい、アルキル基はオメガ炭素即ち窒素から最もはなれた鏡上の炭素上が置換していることが好ましい。好ましい置換基はクロロ、ヒドロキシ又はエトキシである。好ましいＲ１とＲ２は水素、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ１゜ＣＨ２ＣＨ２０Ｈ及びＣＨ２Ｃ）Ｉ２０ＣＨ２ＣＨ３である。またＲ１とＲ２は同じことが好ましい。

また上に定義したようにＲ１とＲ２は窒素と結合していっしょになってモルホリノ環を形成してもよい、これはＲ＋とＲ２の好ましい態様である。

Ｒ３とＲ４は独立に水素原子又はアルキル基であり、このアルキル基は非置換又はアルキル基又は電子引き抜き性基で置換されている。電子引き抜き基は、それが分子中の同じ位置を占めた場合水素、よりもそれ自身に電子を引きよせる能力をもつ基である。

Ｊｅｒｒｙ　Ｍａｒｃｈ、　ｒＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　ＣＦｌｅｌｌｌＳｊｒ／Ｊ＋第２１！＋　ＭｃＧｒａｗＨ１１１ニューヨーク、２１頁（１９７７）参照、電子引き抜き性基には低級アルコキシ、低級アルカノイル、ホルミル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヒドロキシ、メルカプト、低級チオアルキル、カルボキシ、低級カルバルコキシ、アリーロキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、低級トリアルキルアミノ等がある。電子引き抜き性基の機能はＲａ　ＣＨ−Ｒ３上の水素を酸性にすること、皿ち塩基により容易に除去しうる。電子引き抜き性基が存在する場合は、Ｒ３又はＲ４のα 炭素上即ちＲ３又はＲ４鎖の第１の炭素原子上にあることが好ましい。

好ましいＲ３基は水素、カルバルコキシ、特にカルポットキシＣＯＯＣＨ３である。好ましいＲ−置換基は水素である。

本発明の化合物は当業者に認められた技術を利用してつくることができる。

例示的な方法の概要を下記する。

Ｇ　２．　ＲＩＲ２ＮＨ０ＣＨＲ ■ ＩＩ　１式■のアルコキシドをＮ、Ｎ−ビス（２−クロロエチル）ホスホラミドジクロリドと反応させ次いでアミンＲＩＲ２ＮＨを加えて式Ｉの化合物をつくる０反応はジオキサン、テトラヒドロフラン、ヘキサン等の不活性有機溶媒中で行なうことが好ましい。反応は溶媒の沸点からりフラックス温度の間でも行なうことができるが、約−６０℃で室温で行なうことが好ましい。

式■のアルコキシドは対応するアルコールＲＣＨ−ＣＨ（Ｒ３）（Ｒム）をアルカリ金属、その水酸化物又はＨアミド等の強塩基、又はアルコキシド、アルキルアミド等の強有機塩基又は金属アルキル、たとえばＮ−ブチルリチウム、ナトリウムメチレート等の金属化合物と、当業者に知られた方法で反応させてつくることができる。

式■のアルコキシドをつくる別法は式ＲＣＩ（Ｏのアルデヒドを（ＣＨＲｚ　Ｒａ　）部分をもつ有機金属試薬とカップリングさせる方法である。たとえば有機金属としてはアルカリ金属系、たとえばＬｊ　（ＣＨＲ３Ｒ４）又はグリニヤ試薬、たとえばＣＨＲｓＲａＭｇＸ　（Ｘはハロゲン）等がある。アルカリ土類金属は公知の方法でつくりうる。たとえばグリニヤ試薬はＭｇを式反応させてつくりうる。また電子引き抜き性基がＲ３又はＲ４上にある場合は、ＣＨＲｓＲａ　を活性金属、たとえばアルカリ金属で金属化条件下に金属化してＭＣＨＲ３ＲＪ（Ｍはリチウムビス（トリメチルシリル）アミド等の金属化試薬で用いた金属）を形成しうる＊　Ｊｅｒｒｙ　Ｍａｒｃｈ、　ｒＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＪ、　２編。

ＭｃＧｒａｗ　ＨｉｌＬ　ニューヨーク、５５５頁（１９７７）参照、たとえばメチルアセテートをテトラヒドロフラン中でＬ　ｉ　Ｎ　（Ｓ　ｉＭｅ３）　２　で−７８℃で処理メチルリチウムチオアセテートＬｉＬｉＣＨ２Ｃ０Ｏに変換しうる。

本発明の塩基性窒素を含有する新規化合物は酸と反応させて塩を形成しうる。これら酸塩のすべてが本発明に包含されるが、特に製薬上許容される酸、たとえば塩酸、硫酸、硝酸、トルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、酒石酸、リンゴ酸その使分業者に周知の酸、の塩が好ましい。またヒドロカルビルハライド又はサルフェート、たとえばメチル、エチル、ベンジル、プロピル又はアリルハライド又はサルフェート等を用いる通常のアルキル化方法を利用して第４級塩をつくることもできる。

本発明の化合物は選ばれた投与ルート、即ち、経口、非経口、筋肉内又は皮下ルート、に適合する種々の形で宿主に投与しろる。

たとえば不活性稀釈剤又は消化性可食キャリヤと共に経口投与できるし、硬質又は軟質シェルゲラチンにつつんだり、錠剤に圧縮したり、ダイエツト食品に加えること等もできる。経口投与では、賦型剤といっしょに用いたり、摂取性錠剤；ブッカル錠剤、シロップ、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウェハー等の形で用いることもできる。これらの組成物は活性化合物を少なくとも０．１％含有すべきである０組成物の％はもちろん変えうるが、単位重量の約２〜約６０％の間が通常好ましい。このように治療に有効な組成物中の活性化合物の量は適切な投与量を与える量である。本発明に従った組成物は経口投与ユニット形で活性化合物を約１００■〜約５ｇの量含有するようにつくられる。好ましい投与量は活性化合物約５０〜約１０００−ｇである。特に好ましくは約１００〜約５００ａＩｇである。

錠剤、トローチ、ビル、カプセル等はまた次のようなものを含有しうる：ガムトラガカンス、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン等のバインダー、シカルシウムホスフェート等の賦型剤、コーンデンプン、じゃがいもデンプン、アルギン酸等の崩解剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、蔗糖、ラクトース、サッカリン等の甘味剤、ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリーフレーバー等の香料等も加えうる。投与ユニット形がカプセルの場合は、上記のような物質以外に液状キャリヤも含有させうる。被覆その他投与ユニットの物理形を変性するための種々の他の物質を存在させうる。たとえば錠剤、ビル、カプセルはシェラツク、砂境又はその両者で被覆しうる。シロップ又はエリフサ−は活性化合物と、甘味剤としての蔗糖、防腐剤としてのメチル及びプロピルパラベン、チェリー又はオレンジフレーバー等の染料及び香料を含有しうる。もちろん、いづれの投与ユニット形をつくる際に用いる物質も製薬的に純粋で用いる量において非毒性であるべきである。また活性化合物は除放性組成物に加えることもできる。

またこの活性化合物は非経口的又は膀胱内にも投与しつる。活性化合物の遊離又は製薬上許容される塩の形での溶液を適宜にヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤を混合した水を用いてつくることができる０分散液もグリコール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物及びオイルを用いてつくることができる０通常の保存及び使用条件下で微生物の生長をさけるための防腐剤を含有させつる。

注射用に適する製薬形としては無菌注射溶液又は分散液をその場で調合できるよう無菌水溶液又は分散液及び無菌粉がある。いづれの場合もこれらは無菌である必要があると共に、注射器に入れやすいよう流動性がある必要がある。製造及び保存条件下て安定であるへきであり、細菌等の微生物の汚染作用に対し促謹される必要がある。キャリヤはたとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物及び植物油等を含有する溶媒又は分散媒体でありうる。適切な流動性はたとえば、レシチンの使用や、分散体の場合の所望の粒子径の維持や、さらには界面活性剤の使用によって保持できる。微生物の活動の防止は、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロザール等の種々の抗菌剤によって行ないうる。多くの場合、たとえば砂糖又は塩化ナトリウム等の等張剤を含ませることが好ましい。注射性組成物の吸収を長くするにはたとえばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチン等の吸収遅延剤を組成物中に加えることによフて行ないつる。

無菌注射性溶液は本発明の活性物質の所望量を適宜の溶媒中に、所望により前記したような他の成分と共に加え、濾過滅菌することによって製造しうる。通常、分散液は種々の滅菌した活性成分を塩基性分散媒体と所望の他の成分を含有する無菌ビヒクル中に加えることによって製造しうる。無菌注射性溶液製造用の無菌粉末の場合は、真空乾燥と凍結技術により、活性成分と前記の追加の所望成分との無菌濾過溶液からそれらの粉末を製造することが好ましい。

次の実施例は本発明を更に例証するものである。

例」− ＩＣＩ　−Ｐ−Ｎ　（ＣＨ２ＣＨ２ＣＩ　）２Ｃｌ −−ロロエ　ル　７．７、−責′ぐ゛　口’ｌ−゛告オキシ塩化リン（１５，３３ｇ、０．１０モ／Ｌ、）　（ＤＣＨＰＣＩ　２（８０ｍｌ）溶液をＯ″に冷却した。ビス−（２−クロロエチル）アミン塩酸塩（１７，８５ｇ、０．１０モルを直接加えた。トリエチルアミン（３０，６６ｍ１．０．２２モル）を、ＮａＣＨＯ３の水溶液を流して励起する窒素流で０°で一定撹拌しつつ、滴加した９次いで反応系を、水浴を放置してとかすことにより室温まであたためた。３４時間撹拌後、１０％のＫ　Ｈ２Ｐ　Ｏａ水溶液（６０ｍｌ）を加えた。コノ溶液をＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ２（３Ｘ３０で抽出し、有機抽出液を合体して１０％のＫ　Ｈ２Ｐ　Ｏａ水溶液（３Ｘ２０ｍｌ）で繰返し洗い、次いでＭ　ｇ　Ｓ　Ｏａ上で乾燥した。減圧にして溶媒を除くと粗面体が得られた。これを蒸留（ｂ、　ｐ、１２１−１２２℃、０．５ｍ）すると白色固体の純粋な生成物（１９，３ｇ、８４％）を得た：Ｒ＋＝０．８７　（ＥｔＯＡｃ　：ヘキサン１：２）；ｍ、ｐ、５７−５９℃。

３１Ｐ　ＮＭＲ（ＣＨＣＩｓ）ａ＝−７，１４ｐｐｍ隨λ ＨｅＮ−Ｐ−Ｎ（Ｃ）１２ＣＨ２Ｃ１）２Ｉｍ＝　ロベゝ・１　し　−−コロニ　ル７、昌ロー゛Ｚユｊシコ上ｍ道２−ニトロベンジルアルコール（３，０３ｇ、１９．８ミリモル）のＴＨＦ１２５ｍｌ溶液を窒素雰囲気下に置きＯｏに冷却した。ｎ−ブチルリチウム（１３ｍｌ、２０．８ミリモル）のヘキサン溶液を滴加した。生成したアルコキシド溶液をＮ、Ｎ−ビス（２−クロロエチル）ホスホラミドジクロリド（５，１９ｇ、２０．０ミリモル〉のＴＨＦ２５０ｍｌ撹拌溶液に１時間かけて加えた。０°でさらに１時間撹拌してからアンモニアガスを反応混合物中にバブルさせた。０℃で１時間撹拌を続け、反応混合物をケイソウ土床を通して濾過し、真空中で蒸発乾固した。粗生成物をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル、その後メタノール）で精製し、淡黄色油として生成物１．８ｇ（２６％）を得た。

肘旦ル　−　−二　口　エニル　−−Ｎ−−（，１−コロニ　し　１、７、口ぐ　々゛　口　、−゛告すチウムビス（トリメチルシリル）アミドの溶液（ＩＭ、０２０ｍ１２０ミリモル）を−７８℃に冷却し、酢酸メチル（１，５ｇ、２０ミリモル）を加え、生成溶［−１５分間撹拌した。Ｎ−ニトロベンズアルデヒド（３，０ｇ、２０ミリモル）をＴＨＦの最小量に加え、生成溶液を加え、さらに１５分撹拌した。

生成アルコキシド溶液を一４０″で、Ｎ、Ｎ−ビス（２−クロロエチル）ホスホアミドジクロリド（１０，４ｇ、４０ミリモル）のＴＨＦ１００ｍｌ溶液に加えた。添加終了時、さらに１５分撹拌を続け、混合物を放置しＯ′″にした。アンモニアガスを１５分間溶液を通してバブルし、生成混合物をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル）で精製し、油として生成物３．０ｇ　（３５％）を得た。

同様に、上記した方法と適宜の出発物質を用いて次の化合物を製造できる：メチル３−（２−ニトロフェニル）−３−（Ｎ、Ｎ−ビス（２−クロロエチル）ホスホロジアミド）プロピオネート。

メチル３−（４−ニトロフェニル）−３−（Ｎ、Ｎ、Ｎ’　。

Ｎ′−テトラキス−（２−クロロエチル）ホスホロアミド）プロピオネート。

これらの化合物の設計ストラチジーは酸素欠乏（即ち低酸素症）細胞に対して向けられる選択的細胞キルのコンセプトに基づいている。腫瘍中の低酸素細胞は一般に照射及び化学療法に対し耐性があり、絶滅することが極めて困難な一群の細胞といえる。はとんどの踊乳動物細胞は酸素過剰条件下で働いており酸化的代謝を利用している。しかし低酸素細胞は還元性環境を示し、もしプロトラッグをこれら細胞内の還元環境によって活性化されるようデザインすると、それが腫＊＊胞に特異的な細胞毒種をプリバーする機構を示しその結果治療効果を示す０本発明の化合物は低酸素細胞の還元環境にさらされるとホスホラミドマスタード（シクロホスホラミドから誘導される細胞毒代謝産物）を出すプロドラッグである。

本発明の化合物は酸化（ＯＸ　１ｃ）条件下で非細胞毒性であり低酸素細胞の存在下で高い細胞毒性を示す。

抗ｌ！瘍活性は次のように調べられる：本発明の代表的化合物のインビトロ細胞毒活性は次のように調べる：Ｃｈｕ及びＦｉｓｃｈｅｒ、ｉ　ｃｈ　ｔａ、　Ｐ　ａｒ＋ｎ　ｏ　＋　Ｘｌ、　７５３−７６７（１９６Ｂ）の方法に従った。

軟質寒天コロニー形成アッセイを用い、必要に応じモディファイした。マサチューセッツ州ワーチェスター、テゴーモアバンク、ＥＧ＆Ｇ　メーソン　リサーチ　インスチチュートから培養したマウスＬ１２１０及びＰ３８８感応性細胞を購入した。アラバマ州バーミンガムのサザン　リサーチ　インスチチュートのロバート　ストラック博士から培養したシクロホスファミド抵抗性Ｌ１２１０及びＰ３８８細胞を入手した。典型的には、指数的に生長しフィッシャー培地にューヨーク州グランドアイランドのＧｉｂｃｏ　Ｌａｂ、）　６　、５ｍ　ｌに懸濁した所望の細胞（２〜３Ｘ１０６細胞／ｍｌ）を、１ｍｌ中に等しい数の細胞を含有する６個の群（１個は対照で５個は処理した群）に分けた。これらの細胞を種々のドースの薬（媒体又は２０％エタノール−水中のパーヒドロオキサジンの溶液）で処理し、３７℃で１時間培養した。これらの細胞を３１の追加のフィッシャー培地（１０％の馬血清を含有）で３回洗い、遠心処理（８００ｘｇ）Ｌ／、吸引して媒体を除き、このペレットを培地（５ｍｌ）に再懸濁した５１ｍ１部分なＣｏｕｌｔｅｒカウンターを用い細胞数を調べるのに用いた。残りから、細胞の５ｍｌ懸濁液を１０５細胞／ｍｌの密度でつくり、１０２と１０５間の細胞を軟質寒天上に置き３７℃で培養した。１０日後にコロニーをカウントした。生存フラクションのｌｏｇを薬濃度に対してプロットし、このプロットからＬ（，９９をめた。

（ＬＣｓｓ値は９９％の細胞を殺すに有効な薬濃度を示す。〉細胞毒性の検討結果を次表に示す：表」− シクロホスファミド感応性（１０）及び同抵抗性（ＣＰ）Ｌ１２１０及びＰ３８８ネズミ血漿病細胞に刻する新規化合物のインビトロ細胞毒性評Ｗ：１ＩＲＩＲ２Ｎ−Ｐ−Ｎ　（ＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ　）２−ＣＨＲＨＲｓＲａＰｈ　ＨＣＯＯＣＨ３３５０ＮＯ３００ＮＤ２−ＮＯ２Ｐｈ　ＨＣ００ＣＨａ　１７２　ＮＤ　１３４　ＮＯ４−Ｎ０２Ｐｈ　ＨＣ００ＣＨｉ　１３８　＋５２　８２　７７ｉＮＯ２Ｐｈ　ＨＣＯＯＣＨ３１２３ＮＤ　１０５　ＮＤネＮＤ　評価せず本発明の化合物によって示される低酸素細胞選択性を次のように評価した：゛　ロ　コールＫＨＴ／ｉｖ細胞をロチニスター大学、Ｄｉｅｔｍａｒ　Ｓｉｅｗ＋ａｎｎによるマウスＫＨＴ肉腫から細胞培養用に用いた。全ての実験用に細胞をイーグル低部培地及び１０％の牛胎児の血清に保持した。指数的生長細胞を単層培地からトリプシン化し、ガス密封シリンジ中で３７℃で１５分間１〜２Ｘ１０？細胞／ｍｌの密度で撹拌してお互いを分けた。これらの細胞を撹拌下のガス密封バイアル中に含有させたＨＥＰＥＳ−バッファイーグル培地中で最終密度２×１０７細胞／ｍｌで再懸濁させた。細胞又は薬を添加する前にバイアルを空気：ＣＯ２比が９５＝５の湿潤ガスで好気的処理用に、又は窒素：００２比９５：５湿潤ガスで低酸素処理用に予備平衡化した。低酸素媒地の酸素張力は平衡化期間の後約ｉ　００ｐｐｍだった。薬を、培地中の最終エタノール濃度が１％になるような量のエタノールに溶かした。細胞を薬と共に好気的又は低酸素条件下３７℃で４時間培養した６次いで細胞をバイアルから取り出し、薬を含まない培地で洗い、カウントし、標準クローン原生アッセイを用い細胞生存用に置いた。細胞生存フラクションを薬濃度に対してプロットし、ＬＣ＊ＪＩを最小スクエア式から得た。

表λ ＩＨ２Ｎ−Ｐ−Ｎ　（ＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ　）　ｔｌ　ＬＣｓｅ（μＭ）対ＯＫＨＴ肉履ＣＨ２２−ニトロ　７００　２３０４−ニトロ　３２０　１２０ −一　こつい　コ　ゝこのアッセイにおいて、ＬＣｓｅの小さい値はより活性の高い薬及び／又は条件に相当するがこれは当量（９９％）の細胞死はより少ない薬を要することによる。それ故酸素欠乏条件下の腫瘍細胞死の選択性が上記から裏付けられる。

データに示すように本発明の化合物はＫ　ＨＴ肉腫及び腺ガン細胞ラインで少なくとも３の選択ファクターを示す。換言すれば、本発明の化合物は低酸素条件下でこれらの腫瘍ラインに対し通常の酸化性（オキシツク）条件下の同等細胞に比し少なくとも３倍の毒性をもつ。それ故酸素欠乏条件下のｌｌ！瘍細胞の選択的が裏付けられる。

上記の好ましい態様と例は本発明の前記の例示である。これらの態様及び例は当業者に他の態様と例も明らかにするであろう。

これらの態様と例も本発明に含まれる。従って本発明は請求の範囲によってのみ制限されるへきである。

手続補正書（方式）％式％１、事件の表示２、発明の名称抗腫瘍剤として有用なホスホラミド３、補正をする者事件との関係　特許出願人名称　リサーチ　コーポレーシミン　テクノロジーズインコーポレーテッド４、代理人６、補正の対象７、補正の内容（１）別紙の通り、但し明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 但しＲ１及びＲ２は同一でも異なってもよく、水素又はハロゲン、ヒドロキシ又は低級アルコキシでモノ置換した低級アルキル（但し置換基はα炭素上にはない）；又はＲ１及びＲ２は窒素と結合してモルフォリノ環を形成している；Ｒはニトロ置換アリール又はニトロ置換の窒素、硫黄又は酸素含有ヘテロ芳香族基であり；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素、電子引き抜き性基、又は非置換又は低級アルキルもしくは水素引き抜き性基でモノ置換した低級アルキル基である、で示される化合物又はその製薬上許容される塩。
２．Ｒ３及びＲ４が独立に水素、電子引き抜き性基、又は非置換又は電子引き抜き性基で置換した低級アルキルであり、電子引き抜き性基はＲ３又はＲ４のα炭素上にある請求項１記載の化合物。
３．電子引き抜き性基が低級アルコキシ、低級アルカノイル、ホルミル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリール、ヒドロキシ、メルカプト、低級チオアルキル、カルボキシ、アリーロキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノ又は低級アルキルアミノからなる群から選ばれる請求項１又は２記載の化合物。
４．Ｒ３が水素又は電子引き抜き性基であり、Ｒ４が水素である請求項１〜３のいづれか１記載の化合物。
５．Ｒ３が水素又は低級カルバルコキシであり、Ｒ４が水素である請求項４記載の化合物。
６．Ｒがニトロフェニル、ニトロビリジル、ニトロビロリル、ニトロキノリル又はニトロイミダゾールである請求項１〜５のいづれか１記載の化合物。
７．Ｒが２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、４−ニトロ−２−ビリジル、５−ニトロ−２−ピリジル、２−ニトロキノリル、３−ニトロキノリル、４− ニトロキノリル又は▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、ここでＲ５は低級アルキルである、である請求項６記載の化合物。
８．Ｒ１及びＲ２が各々水素又はハロゲン、ヒドロキシもしくは低級アルコキシでモノ置換したアルキルであり、該置換基がオメガ炭素上にあるか又はＲ１及びＲ２は窒素と結合してモノホリノ環を形成している請求項１〜７のいづれか１記載の化合物。
９．Ｒ１及びＲ２は各々独立に水素、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３又は−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであるか又はＲ１及びＲ２は窒素と結合してモノホリノ環を形成している請求項８記載の化合物。
１０．Ｒ１及びＲ２は同じか又はＲ１及びＲ２は窒素と結合してモノホリノ環を形成している請求項１〜９のいづれか１記載の化合物。
１１．２−ニトロベンジルＮ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）ホスホロジアミデート、メチル３−（４−ニトロフェニル）−３−（Ｎ，Ｎ−ビス−（２−クロロエチル）ホスホロアミド）ブロピオネート、メチル３−（２−ニトロフェニル） −３−（Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）ホスホラミド）ブロピオネート又はメチル３−（４−ニトロフェニル）−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス− （２−クロロエチル）ホスホロアミド）ブロピオネートである請求項１記載の化合物。
１２．請求項１〜１１のいづれか１記載の化合物の製薬有効量と製薬キャリヤーからなる製薬組成物。
１３．腫瘍を治療する際に有用な組成物を製造するための請求項１〜１１のいづれか１記載の化合物。