JPH043948B2 - - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
- A01N25/32—Ingredients for reducing the noxious effect of the active substances to organisms other than pests, e.g. toxicity reducing compositions, self-destructing compositions
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
- B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
- B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
- B09C1/105—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes using fungi or plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
- C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/26—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/874—Pseudomonas
Description
本発明は、ある種の新規な微生物に関するもの
である。 精製工場において、不純物として有機合成生成
物を含有する流出液を、活性汚泥法によつて分解
することは公知である。この方法においては、流
出液を大きな池中で空気にさらすと、その中に、
流出液は、望ましい分解を行なうある種の微生物
に富むようになる。しかしながら、それによつて
得られる微生物組成物から、ある種の生成物を分
解することができる安定な製剤を単離することは
できない。その理由は、これらの微生物組成物の
分解活性は、この分解のために不充分であり、そ
の上、その分解活性は、少なくとも部分的に、仕
上げ処理の間に失なわれるからである。 また、パン酵母は、生パンの調製の間に、殿粉
と砂糖を分解することが公知である。しかしなが
ら、これらのパン酵母を、それらの完全な活性を
保持しながら、永久的な粉末として、たとえば乾
燥酵母粉として、安定ならしめることは困難であ
る。その上、乾燥したパン酵母は、真空中または
不活性ガス雰囲気下にのみ、活性の実質的な低下
なしに、保存することができる（リード（G.
Reed）ら、酵母技術、1973、ウエストポート、
アビパブリケーシヨンカンパニー、参照）。 更にまた、土壌中に生存する微生物が、殺虫剤
として活性な化合物、特に燐酸エステルおよびカ
ルバミン酸エステル類を分解することが知られて
いる（ラベグリア（J.Laveglia）らによる総説文
献、昆虫学のアニユアルレビユー1977、22、483
頁以下、およびその中に記載の参考文献参照）。 微生物の混合培養物は、たとえばパラチオンの
ような、殺虫活性化合物の分解のために適してい
ることもまた、知られている。しかしながら、こ
のような培養物は比較的不活性であり且つ取扱い
が困難である。このような培養物から従来取得さ
れた製剤は、それ自体−18℃において不安定であ
り且つ固体状態で製造することはできなかつた
（ムネツケ（Munnecke）ら、アプライドエンビ
ロンメンタルミクロビオロジー、1976、32、７〜
13頁参照）。 本発明によれば、燐含有活性化合物を分解しう
る安定なプソイドモナス属の菌株プソイドモナス
spec pk6（DSM1192：微工研菌寄第4663号）、
プソイドモナス spec ５（DSM1193：微工研菌
寄第4664号）、プソイドモナス spec ６
（DSM1194：微工研菌寄第4679号）、プソイドモ
ナス spec 11（DSM1195：微工研菌寄第4665
号）、プソイドモナス spec 12（DSM1196：微工
研菌寄第4666号）、プソイドモナス spec 14
（DSM1197：微工研菌寄第4667号）、プソイドモ
ナス spec pk9（DSM1198：微工研菌寄第4668
号）、プソイドモナス spec pk10（DSM1199：
微工研菌寄第4669号）が単離された。 かくして取得する純培養物は、通常の栄養培地
中で培養することができる。分解せしめるべき生
成物は、その際基質中に存在せしめることがで
き、または誘導質として低濃度で基質に加えるこ
とができ、あるいは特別の場合にそれを完全に省
略することができる。 かくして生ずる純培養物から、生活力を持続し
ながら、貯蔵によりその後のバツチのための接種
物を取得すること、また培養液から微生物組成物
を分離し且つ製剤を取得するためにそれを注意深
く乾燥すること、の何れも可能である。その際、
乾燥は、安定化した活性化混合培養物からの製剤
の取得に対して行なうことができる。 純培養物は、前記のように大きな工業的規模に
おいて、バツチ的に培養することもできる。 以下の記述において、例として殺虫活性化合
物、好ましくは燐含有活性化合物、特にパラチオ
ンを分解するための製剤を用いて、本発明を例証
する。 本発明の前記微生物が分解しうる燐含有活性化
合物としては下記に説明する燐酸エステルが挙げ
られる。すなわち、燐酸エステルは、次の一般式
を有するものを包含し、 上式において 記号X′は相互に独立的にＯまたはＳを表わし、 Y′はＯ、Ｓまたは−NH−を表わし、あるいは
中心のＰ原子と基R13の間の直接の結合を表わ
し、 R11およびR12は同一または異なるものであり
且つアルキルまたはアリールを表わし且つR13は
アルキル、アリール、ヘテロ−アリール、アラル
キル、アルケニル、ジオキサニルまたはオキシム
基を表わし、あるいはそれが結合している基と同
一の基を表わす。 特に好適な式（）の燐酸エステルは、その中
で R11およびR12が同一または異なるものであり
且つC1〜4−アルキルまたはフエニルを表わし且つ R13がハロゲン、ヒドロキシル、ニトリル、場
合によつては置換したフエニル、カルボニルアミ
ド、スルホニルアルキル、スルホキシアルキル、
カルボニルアルキル、アルコキシ、アルキルメル
カプトまたはアルコキシカルボニルによつて場合
により置換してある１〜４炭素原子を有するアル
キルを表わし、あるいはハロゲン、場合によつて
はハロゲン置換したフエニルまたはアルコキシカ
ルボニルによつて場合により置換してある４まで
の炭素原子を有するアルケニルを表わし、あるい
は次の一般式のオキシム基を表わし、 ここで R6およびR7は同一または異なるものであり且
つ何れの場合も５までの炭素原子を有するアルキ
ル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、
アルコキシ、アルキルメルカプト、アルコキシカ
ルボニル、カルボニルアミドまたはアルキルメル
カプトアルキル、ニトリル、アリール（特にフエ
ニル）、または場合によつては置換してある複素
環式基を表わし、あるいは複素環式基によつて置
換してあるアルキル基を表わし、あるいは共同し
て場合によりC1〜4アルキル基によつて置換してあ
るジオキソラニルまたはジチオラニル基を表わ
す、R13はそれが結合している基と同一の基を表
わし、あるいは R13はメチル、ニトロ、ニトリル、ハロゲンま
たはメチルチオによつて場合により置換してある
フエニルを表わし、あるいは R13は、C1〜4−アルキルまたはハロゲンによつ
て場合により置換してある、たとえばピリジン、
キノリン、キノキサリン、ピリミジン、ジアジノ
ンおよびベンゾ−１，２，４−トリアジンのよう
な、ヘテロ芳香族基を表わす。 特に以下の燐酸エステル類を挙げることができ
る：Ｏ，Ｏ−ジメチル−およびＯ，Ｏ−ジエチル
−Ｏ−（２，２−ジクロロ−ならびに２，２−ジ
ブロモ−ビニル）−燐酸エステル、Ｏ，Ｏ−ジエ
チル−Ｏ−（４−ニトロ−フエニル）−チオノ燐酸
エステル（＝パラチオン）、Ｏ，Ｏ−ジメチル−
Ｏ−（３−メチル−４メチルチオ）−チオノ燐酸エ
ステル、Ｏ，Ｏ−ジメチル−Ｏ−（３−メチル−
４−ニトロ）−チオノ燐酸エステル、Ｏ−エチル
−Ｓ−ｎ−プロピル−Ｏ−（２，４−ジクロロフ
エニル）−チオノ燐酸エステル、Ｏ−エチル−Ｓ
−ｎ−プロピル−Ｏ−（４−メチルチオ−フエニ
ル）−チオノ燐酸エステル、Ｏ，Ｏ−ジメチル−
Ｓ−［４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジ
ン−３−イル−メチル］−チオノチオール燐酸エ
ステル、Ｏ−メチル−Ｏ−［２−イソ−プロピル
−６−メトキシ−ピリミジン−４−イル］−チオ
ノメタン燐酸エステル、Ｏ，Ｏ−ジエチル−Ｏ−
［２−イソ−プロピル−６−メチル−ピリミジン
−４−イル］−チオノ燐酸エステル、Ｏ，Ｏ−ジ
エチル−Ｏ−［３−クロロ−４−メチル−クマリ
ン−７−イル］−チオノ燐酸エステル、Ｏ，Ｏ−
ジメチル−２，２，２−トリクロロ−１−ヒドロ
キシ−エタン−燐酸エステルおよびＯ，Ｏ−ジメ
チル−Ｓ−（メチンカルバモイルエチル）−チオノ
燐酸エステル。 燐含有活性化合物、特にパラチオンの分解のた
めの混合培養物は公知である（ムネツケら、アプ
ライドミクロビオロジー、1974、28、212〜217頁
参照）。 安定化した活性化混合培養物は、それから、下
記の方法によつて取得することができる。この方
法は、下記の条件下に、少なくとも２代の継代接
種において行なわれる： 温度範囲は20〜35℃、好ましくは24〜30℃、特
に25〜28℃である。 PH範囲は、6.5〜9.0、好ましくは7.5〜7.9、特
に7.5〜7.6である。 分解せしめるべき燐含有活性化合物は、活性化
合物の濃度が約10ppm以上に上らず且つ開裂生成
物ｐ−ニトロフエノールの濃度が30ppm以上に上
らないような具合に、生長に相当するように調節
した不連続的流速で、炭素およびエネルギーの単
一源として、培養物に供給する。これらの基準の
組合わせによつて、混合培養物を、活性化合物の
分解活性を変化させることなく非滅菌条件下に働
らかせることができるように、安定化させる。 このようにして取得する混合培養物は、新しい
発酵のための接種物として使用することができ、
且つ−18℃において長期間にわたり、生活力を失
なうことなく保存することができる。これらの基
準によつて取得しうる活性収率は、パラチオンに
対して、従来の技術により公知の相当する培養物
のそれよりも10〜20倍も大である。かくして得た
混合培養物から、適当な乾燥方法、たとえば凍結
乾燥、によつて製剤を単離するときは、その活性
は、蛋白質１mg当りとして、従来の文献記載のも
のの10倍も大である。驚くべきことに、この種の
製剤は、担体に結合せしめることなしに、室温に
おいてすら、やはり長期にわたつて保存すること
ができる。 燐含有活性化合物、特にパラチオン、を分解す
る純培養物を、かかる混合培養物から単離するこ
とができる。 驚くべきことに、このような純培養物は、通常
の複合栄養培地、たとえば酵母抽出物中で、生長
基質としての付加的な燐含有化合物、および燐含
有活性化合物を開裂する活性化剤なしで、培養す
ることができる。燐含有活性化合物の分解を生じ
させるそれらの活性は、驚くべきほど持続する。 これらの純培養物から、生物質の注意深い乾
燥、たとえば凍結乾燥、によつて、工業的な目的
に対して適する高度に活性な撤布剤を、同様に取
得することができる。従来用いられている酵素溶
液と異なつて、この粉末は、室温においてすら、
数年間は安定である。この製剤の水性懸濁液を、
有機溶剤または洗浄剤を用いて処理することによ
つて、完全に水溶性の酵素製剤を取得することが
できる。有機溶剤または洗浄剤によつて処理する
湿つた細胞を、直接に、可溶性酵素製剤の製造の
ための出発材料として、使用することもできる。 詳細には、パラチオン分解製剤を取得すべき場
合は、前記の公知混合培養物から出発して、次の
ような手順に従がう（前記参照）。 １ 無機窒素含有塩、たとえば（NH4）2SO4、お
よび通常の栄養塩を含有する培地を、公知の混
合培養物の活性化のために使用する。これらの
物質の濃度は広い限界内で変えることができ
る。下記の範囲の濃度が好適である：0.05〜
0.2ｇ／のMgSO4、0.01〜0.05ｇ／の
CaCl2、0.1〜1.0ｇ／の（NH4）2SO4、0.001
〜0.01ｇ／の鉄塩、0.5〜5.0ｇ／の
K2HPO4および0.1〜1.0ｇ／のKH2PO40PH値
を、緩衝液によつて、6.5〜9.0、特に燐酸塩緩
衝液によつて7.5〜7.9に調節する。PH値は、
NaOHの添加によつて、7.6に一定に保つこと
が特に好都合である。このような溶液を、保存
物からの細胞によつて接種する。接種物の量
は、広い範囲内で変えることができる。培養液
10当りに0.1〜5.0ｇ、特に0.5〜1.0ｇの乾燥
細胞物質が最適量である。これらの培養物を20
〜37℃、好ましくは24〜30℃において培養する
が、25〜28℃が特に好適な温度範囲である。 混合培養物を生長させるために、ポンプを用
いてパラチオンを、ニトロフエノール（パラチ
オンの開裂生成物）が全く、または痕跡しか、
醗酵の間に存在することができないような具合
に、連続的に計り入れる。１時間当りに計り入
れる量は、培養物の生長に依存し且つ生体物質
の濃度の増大に従つて、連続的に増大させる。
たとえば、10の培養物に対して最初に１時間
当り0.1mlのパラチオンを、且つ最後に１時間
当り0.75mlのパラチオンを供給し、その間、醗
酵槽中のパラチオン濃度が常に10ppm以下にと
どまるようにする。醗酵時間は５〜７日間、好
ましくは６日間とする。培養基１当り約１ｇ
の乾燥重量という細胞密度が、50mlの純パラチ
オンの消費によつて、達成される。 低い混合速度においてのみ醗酵を遂行するこ
とができる醗酵バツチの場合においては、炭素
源としてパラチオン配合物を用いることが望ま
しく、それによつて醗酵槽内の良孝な分散が達
成される。たとえば、有機溶剤および乳化剤を
含有する配合物を使用することが可能である。
適当な配合物は、たとえば、３部のイソプロパ
ノール、１部のパラチオンおよび0.01部のアル
キルアリールポリグリコールエーテルから成る
ものである。 このように取得した培養液の、燐酸エステルに
対する、開裂活性は、ほぼ同一の醗酵時間とパラ
チオン使用量において、純パラチオンを用いて生
長させる培養物の場合におけるよりも、50〜100
％高い。 通常の複合培地、たとえば、酵母抽出物、酵素
自己溶解物または肉エキス培地、は、純培養物か
ら活性細胞培養物を製造するために用いて最良で
ある。加うるに、たとえば有機酸類、アミノ酸
類、カルボン酸類、たとえばコハク酸、且つまた
ニトロフエノールのような、その他の炭素源を加
えることもまた、可能である。純培養物を用いる
場合には、醗酵時間は、混合培養物および炭素の
有機源としてのパラチオンを用いる醗酵と比較し
て、かなり短かくなり、活性収率は同一またはか
なり増大する。しかしながら、燐酸エステルを開
裂する細胞製剤を製造するための純培養物の使用
は、滅菌操作条件を必要とする。 醗酵の終点は、燐酸エステルに対する培養物の
開裂活性が増大する速度によつて、与えられる。
培養は、活性のそれ以上の顕著な増大を認めるこ
とができなくなつたときに、中止する。 燐酸エステルを開裂する製剤を製造するために
は、微生物組成物を、遠心分離によつて単離す
る。それを、たとえば出発容量の1/10〜1/20の蒸
留水中に取り且つ撹拌によつて均一に分散させ
る。懸濁液を再び遠心分離し、上澄液を廃棄した
のち、沈降物を再び、たとえば出発容量の1/50〜
１／１００の蒸留水中に取る。この懸濁液を凍結した
のち、凍結乾燥する。生ずる乾燥生成物は水に不
溶性であるが、容易に水中に懸濁させることがで
きる。これは、燐酸エステルに対する全開裂活性
を含有している。 より簡単ではあるが、しかし活性の多少の損失
を伴なう乾燥方法は、たとえば、容量で10部（押
固めた細胞容積に対して）の有機溶剤、特にアセ
トンまたはエタノールによる２回の抽出によつ
て、蒸留したH2Oを用いて単離した微生物沈降
物から、水を除去する方法である。脱水した微生
物沈降物を、次いで20mmHgの圧力下の真空乾燥
器中で、20〜30℃において乾燥する。 新鮮な、または凍結し且つ解凍した微生物細胞
の、水または緩衝液（たとえば0.1M、PH６〜９）
中における懸濁液は、乾燥した、しかし水溶性の
酵素製剤の製造のための出発材料として使用し
て、最良である。しかしながら、凍結乾燥した微
生物細胞の適当な懸濁液もまた、使用することが
できる。微生物細胞懸濁液を１〜５％の、たとえ
ば、デオキシコール酸NaまたはトリトンX100の
ような、界面活性物質を用いて、あるいは２〜10
容量％のブタノールを用いて、25〜27℃において
0.5〜８時間培養し、次いでバツチを遠心分離し
たのち、上澄液を、直接に（ブタノールが可溶化
剤である場合）、または蒸留水に対して予め透析
したのちに（界面活性物質を用いる場合）、凍結
乾燥する。かくして取得する試験製剤は、初期活
性の約50％を含有し、それらの比活性は、使用す
る出発材料のそれの２〜３倍も高く、且つそれら
は、水または緩衝液中に溶解して透明な溶液を与
える。 以下の実施例は、本発明の全般的適用性の限定
を意味するものではなく、本発明を例証するため
のものである。試薬は、パラチオン分解微生物を
用いて行なう。 実施例 １ パラチオン分解活性を測定するための試験 0.1Mの燐酸カリウム緩衝液、PH8.2、アリロキ
シポリグリコールエーテルの水中における濃度10
％の溶液およびパラチオンのエタノール中におけ
る濃度１％の溶液を必要とする。基質溶液を調製
するために、0.3mlの乳化剤水溶液を50mlの緩衝
剤溶液中に撹拌しながら加え、次いで２mlのパラ
チオンエタノール溶液を徐々に加える。 試験のために、2.4mlの上記基質溶液を、25℃
に温度調節したセル中に導入する。同じ基質溶液
を、空試験としても使用する。温度を調節したの
ちに、100μの緩衝剤溶液を空試験セル中に導
入し、且つ100μの酵素溶液、懸濁液または培
養液を、後者はトルエンによる予備処理後に（下
記参照）、測定セル中に導入して、410nｍにおけ
る吸光の変化を記録して、生成するパラ−ニトロ
フエノールすなわち開裂したパラチオンのμモル
数に変換する。 １酵素単位（Ｕ）は、上記の試験条件下に、１
分間当りに1μモルのパラチオンの開裂、あるい
は１分間当りに1μモルのパラ−パラチオンの遊
離、として定義する。 培養溶液中の新鮮な細胞または新鮮な細胞懸濁
液を試験するためには、これらを先ず分解しなけ
ればならない。そのために、0.2％のトルエンを、
試験すべき試料に加え且つ混合物を30℃において
30分間撹拌しながら培養する。このように予備処
理した10〜100μの試料を試験する。凍結乾燥
した細胞または凍結したのち解凍した細胞の場合
においては、トルエン処理は不必要であり且つ試
験すべき試料の活性に何らの変化も与えない。 以下の実施例においては、上記のようにして測
定した活性をＵ単位で示す。 実施例 ２ 燐酸エステルを開裂する、従来から公知の混合
培養物からの、活性化した、安定化混合培養物
の製造 活性化した、安定化混合培養物を製造するため
に、先ず以下の原液を調製した： 原液１：1Mの燐酸カリウム乾燥液、PH7.6、 原液２：10.0ｇの硫酸アンモニウム、0.6ｇの塩
化カルシウム、4.0ｇの硫酸マンガンおよび
1000mlの水、 原液３：3.0ｇの硫酸鉄（）および1000mlの水 原液４：微量元素の常用の溶液。 10の水中に、100mlの原液1200mlの原液２お
よび10mlの原液３と４を含有する無機塩培養基
を、培養物の生長のために使用した。 ムネツケらによりアプライドミクロビオロジー
1974、28、212〜217頁中に記されているパラチオ
ン開裂混合培養物を、出発培養物として使用し
た。 すなわち、出発培養物としてプソイドモナス
spec ６（DSM1194；FERM−Ｐ−4679）及びプ
ソイドモナスspec ５（DSM1193；FERM−Ｐ−
4664）を使用した。 この培養物を、９の無機塩培地を含有する10
の醗酵槽中で、生長させた。ムネツケらによつ
て記されているようにして生長させた活性混合培
養物の１ｇの生体物質（乾燥重量に対し）によつ
て、それを接種した。醗酵槽培養物に、25〜28℃
において、１分間当りに10の空気を撹拌（1200
回転／分）しながら通気した。滴定器を使用し、
2.5N NaOHを用いて、PH値を7.5〜7.6に調節し
た。生長基質としてパラチオンを使用した；それ
を、醗酵バツチ中に、醗酵槽中のパラチオン濃度
が生長を限定するような具合に、連続的に加え
た。実際のパラチオン濃度が10ppm以下であり且
つニトロフエノールを全く検出し得ない場合に、
このような条件が存在した。培養を、後続する生
長過程に対する接種物として先行する生長過程の
１を使用して、４代の連続継代接種で、行なつ
た。培養期間は３〜６日であつた。醗酵槽バツチ
中に、活性の僅かな増大しか認められなくなつた
とき、または活性の増大が全く認められなくなつ
たときに、培養を中止して、次の代の培養を開始
させた。 ４代の継代接種にわたる混合培養物の活性の増
大を、第１表に示す。
である。 精製工場において、不純物として有機合成生成
物を含有する流出液を、活性汚泥法によつて分解
することは公知である。この方法においては、流
出液を大きな池中で空気にさらすと、その中に、
流出液は、望ましい分解を行なうある種の微生物
に富むようになる。しかしながら、それによつて
得られる微生物組成物から、ある種の生成物を分
解することができる安定な製剤を単離することは
できない。その理由は、これらの微生物組成物の
分解活性は、この分解のために不充分であり、そ
の上、その分解活性は、少なくとも部分的に、仕
上げ処理の間に失なわれるからである。 また、パン酵母は、生パンの調製の間に、殿粉
と砂糖を分解することが公知である。しかしなが
ら、これらのパン酵母を、それらの完全な活性を
保持しながら、永久的な粉末として、たとえば乾
燥酵母粉として、安定ならしめることは困難であ
る。その上、乾燥したパン酵母は、真空中または
不活性ガス雰囲気下にのみ、活性の実質的な低下
なしに、保存することができる（リード（G.
Reed）ら、酵母技術、1973、ウエストポート、
アビパブリケーシヨンカンパニー、参照）。 更にまた、土壌中に生存する微生物が、殺虫剤
として活性な化合物、特に燐酸エステルおよびカ
ルバミン酸エステル類を分解することが知られて
いる（ラベグリア（J.Laveglia）らによる総説文
献、昆虫学のアニユアルレビユー1977、22、483
頁以下、およびその中に記載の参考文献参照）。 微生物の混合培養物は、たとえばパラチオンの
ような、殺虫活性化合物の分解のために適してい
ることもまた、知られている。しかしながら、こ
のような培養物は比較的不活性であり且つ取扱い
が困難である。このような培養物から従来取得さ
れた製剤は、それ自体−18℃において不安定であ
り且つ固体状態で製造することはできなかつた
（ムネツケ（Munnecke）ら、アプライドエンビ
ロンメンタルミクロビオロジー、1976、32、７〜
13頁参照）。 本発明によれば、燐含有活性化合物を分解しう
る安定なプソイドモナス属の菌株プソイドモナス
spec pk6（DSM1192：微工研菌寄第4663号）、
プソイドモナス spec ５（DSM1193：微工研菌
寄第4664号）、プソイドモナス spec ６
（DSM1194：微工研菌寄第4679号）、プソイドモ
ナス spec 11（DSM1195：微工研菌寄第4665
号）、プソイドモナス spec 12（DSM1196：微工
研菌寄第4666号）、プソイドモナス spec 14
（DSM1197：微工研菌寄第4667号）、プソイドモ
ナス spec pk9（DSM1198：微工研菌寄第4668
号）、プソイドモナス spec pk10（DSM1199：
微工研菌寄第4669号）が単離された。 かくして取得する純培養物は、通常の栄養培地
中で培養することができる。分解せしめるべき生
成物は、その際基質中に存在せしめることがで
き、または誘導質として低濃度で基質に加えるこ
とができ、あるいは特別の場合にそれを完全に省
略することができる。 かくして生ずる純培養物から、生活力を持続し
ながら、貯蔵によりその後のバツチのための接種
物を取得すること、また培養液から微生物組成物
を分離し且つ製剤を取得するためにそれを注意深
く乾燥すること、の何れも可能である。その際、
乾燥は、安定化した活性化混合培養物からの製剤
の取得に対して行なうことができる。 純培養物は、前記のように大きな工業的規模に
おいて、バツチ的に培養することもできる。 以下の記述において、例として殺虫活性化合
物、好ましくは燐含有活性化合物、特にパラチオ
ンを分解するための製剤を用いて、本発明を例証
する。 本発明の前記微生物が分解しうる燐含有活性化
合物としては下記に説明する燐酸エステルが挙げ
られる。すなわち、燐酸エステルは、次の一般式
を有するものを包含し、 上式において 記号X′は相互に独立的にＯまたはＳを表わし、 Y′はＯ、Ｓまたは−NH−を表わし、あるいは
中心のＰ原子と基R13の間の直接の結合を表わ
し、 R11およびR12は同一または異なるものであり
且つアルキルまたはアリールを表わし且つR13は
アルキル、アリール、ヘテロ−アリール、アラル
キル、アルケニル、ジオキサニルまたはオキシム
基を表わし、あるいはそれが結合している基と同
一の基を表わす。 特に好適な式（）の燐酸エステルは、その中
で R11およびR12が同一または異なるものであり
且つC1〜4−アルキルまたはフエニルを表わし且つ R13がハロゲン、ヒドロキシル、ニトリル、場
合によつては置換したフエニル、カルボニルアミ
ド、スルホニルアルキル、スルホキシアルキル、
カルボニルアルキル、アルコキシ、アルキルメル
カプトまたはアルコキシカルボニルによつて場合
により置換してある１〜４炭素原子を有するアル
キルを表わし、あるいはハロゲン、場合によつて
はハロゲン置換したフエニルまたはアルコキシカ
ルボニルによつて場合により置換してある４まで
の炭素原子を有するアルケニルを表わし、あるい
は次の一般式のオキシム基を表わし、 ここで R6およびR7は同一または異なるものであり且
つ何れの場合も５までの炭素原子を有するアルキ
ル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、
アルコキシ、アルキルメルカプト、アルコキシカ
ルボニル、カルボニルアミドまたはアルキルメル
カプトアルキル、ニトリル、アリール（特にフエ
ニル）、または場合によつては置換してある複素
環式基を表わし、あるいは複素環式基によつて置
換してあるアルキル基を表わし、あるいは共同し
て場合によりC1〜4アルキル基によつて置換してあ
るジオキソラニルまたはジチオラニル基を表わ
す、R13はそれが結合している基と同一の基を表
わし、あるいは R13はメチル、ニトロ、ニトリル、ハロゲンま
たはメチルチオによつて場合により置換してある
フエニルを表わし、あるいは R13は、C1〜4−アルキルまたはハロゲンによつ
て場合により置換してある、たとえばピリジン、
キノリン、キノキサリン、ピリミジン、ジアジノ
ンおよびベンゾ−１，２，４−トリアジンのよう
な、ヘテロ芳香族基を表わす。 特に以下の燐酸エステル類を挙げることができ
る：Ｏ，Ｏ−ジメチル−およびＯ，Ｏ−ジエチル
−Ｏ−（２，２−ジクロロ−ならびに２，２−ジ
ブロモ−ビニル）−燐酸エステル、Ｏ，Ｏ−ジエ
チル−Ｏ−（４−ニトロ−フエニル）−チオノ燐酸
エステル（＝パラチオン）、Ｏ，Ｏ−ジメチル−
Ｏ−（３−メチル−４メチルチオ）−チオノ燐酸エ
ステル、Ｏ，Ｏ−ジメチル−Ｏ−（３−メチル−
４−ニトロ）−チオノ燐酸エステル、Ｏ−エチル
−Ｓ−ｎ−プロピル−Ｏ−（２，４−ジクロロフ
エニル）−チオノ燐酸エステル、Ｏ−エチル−Ｓ
−ｎ−プロピル−Ｏ−（４−メチルチオ−フエニ
ル）−チオノ燐酸エステル、Ｏ，Ｏ−ジメチル−
Ｓ−［４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジ
ン−３−イル−メチル］−チオノチオール燐酸エ
ステル、Ｏ−メチル−Ｏ−［２−イソ−プロピル
−６−メトキシ−ピリミジン−４−イル］−チオ
ノメタン燐酸エステル、Ｏ，Ｏ−ジエチル−Ｏ−
［２−イソ−プロピル−６−メチル−ピリミジン
−４−イル］−チオノ燐酸エステル、Ｏ，Ｏ−ジ
エチル−Ｏ−［３−クロロ−４−メチル−クマリ
ン−７−イル］−チオノ燐酸エステル、Ｏ，Ｏ−
ジメチル−２，２，２−トリクロロ−１−ヒドロ
キシ−エタン−燐酸エステルおよびＯ，Ｏ−ジメ
チル−Ｓ−（メチンカルバモイルエチル）−チオノ
燐酸エステル。 燐含有活性化合物、特にパラチオンの分解のた
めの混合培養物は公知である（ムネツケら、アプ
ライドミクロビオロジー、1974、28、212〜217頁
参照）。 安定化した活性化混合培養物は、それから、下
記の方法によつて取得することができる。この方
法は、下記の条件下に、少なくとも２代の継代接
種において行なわれる： 温度範囲は20〜35℃、好ましくは24〜30℃、特
に25〜28℃である。 PH範囲は、6.5〜9.0、好ましくは7.5〜7.9、特
に7.5〜7.6である。 分解せしめるべき燐含有活性化合物は、活性化
合物の濃度が約10ppm以上に上らず且つ開裂生成
物ｐ−ニトロフエノールの濃度が30ppm以上に上
らないような具合に、生長に相当するように調節
した不連続的流速で、炭素およびエネルギーの単
一源として、培養物に供給する。これらの基準の
組合わせによつて、混合培養物を、活性化合物の
分解活性を変化させることなく非滅菌条件下に働
らかせることができるように、安定化させる。 このようにして取得する混合培養物は、新しい
発酵のための接種物として使用することができ、
且つ−18℃において長期間にわたり、生活力を失
なうことなく保存することができる。これらの基
準によつて取得しうる活性収率は、パラチオンに
対して、従来の技術により公知の相当する培養物
のそれよりも10〜20倍も大である。かくして得た
混合培養物から、適当な乾燥方法、たとえば凍結
乾燥、によつて製剤を単離するときは、その活性
は、蛋白質１mg当りとして、従来の文献記載のも
のの10倍も大である。驚くべきことに、この種の
製剤は、担体に結合せしめることなしに、室温に
おいてすら、やはり長期にわたつて保存すること
ができる。 燐含有活性化合物、特にパラチオン、を分解す
る純培養物を、かかる混合培養物から単離するこ
とができる。 驚くべきことに、このような純培養物は、通常
の複合栄養培地、たとえば酵母抽出物中で、生長
基質としての付加的な燐含有化合物、および燐含
有活性化合物を開裂する活性化剤なしで、培養す
ることができる。燐含有活性化合物の分解を生じ
させるそれらの活性は、驚くべきほど持続する。 これらの純培養物から、生物質の注意深い乾
燥、たとえば凍結乾燥、によつて、工業的な目的
に対して適する高度に活性な撤布剤を、同様に取
得することができる。従来用いられている酵素溶
液と異なつて、この粉末は、室温においてすら、
数年間は安定である。この製剤の水性懸濁液を、
有機溶剤または洗浄剤を用いて処理することによ
つて、完全に水溶性の酵素製剤を取得することが
できる。有機溶剤または洗浄剤によつて処理する
湿つた細胞を、直接に、可溶性酵素製剤の製造の
ための出発材料として、使用することもできる。 詳細には、パラチオン分解製剤を取得すべき場
合は、前記の公知混合培養物から出発して、次の
ような手順に従がう（前記参照）。 １ 無機窒素含有塩、たとえば（NH4）2SO4、お
よび通常の栄養塩を含有する培地を、公知の混
合培養物の活性化のために使用する。これらの
物質の濃度は広い限界内で変えることができ
る。下記の範囲の濃度が好適である：0.05〜
0.2ｇ／のMgSO4、0.01〜0.05ｇ／の
CaCl2、0.1〜1.0ｇ／の（NH4）2SO4、0.001
〜0.01ｇ／の鉄塩、0.5〜5.0ｇ／の
K2HPO4および0.1〜1.0ｇ／のKH2PO40PH値
を、緩衝液によつて、6.5〜9.0、特に燐酸塩緩
衝液によつて7.5〜7.9に調節する。PH値は、
NaOHの添加によつて、7.6に一定に保つこと
が特に好都合である。このような溶液を、保存
物からの細胞によつて接種する。接種物の量
は、広い範囲内で変えることができる。培養液
10当りに0.1〜5.0ｇ、特に0.5〜1.0ｇの乾燥
細胞物質が最適量である。これらの培養物を20
〜37℃、好ましくは24〜30℃において培養する
が、25〜28℃が特に好適な温度範囲である。 混合培養物を生長させるために、ポンプを用
いてパラチオンを、ニトロフエノール（パラチ
オンの開裂生成物）が全く、または痕跡しか、
醗酵の間に存在することができないような具合
に、連続的に計り入れる。１時間当りに計り入
れる量は、培養物の生長に依存し且つ生体物質
の濃度の増大に従つて、連続的に増大させる。
たとえば、10の培養物に対して最初に１時間
当り0.1mlのパラチオンを、且つ最後に１時間
当り0.75mlのパラチオンを供給し、その間、醗
酵槽中のパラチオン濃度が常に10ppm以下にと
どまるようにする。醗酵時間は５〜７日間、好
ましくは６日間とする。培養基１当り約１ｇ
の乾燥重量という細胞密度が、50mlの純パラチ
オンの消費によつて、達成される。 低い混合速度においてのみ醗酵を遂行するこ
とができる醗酵バツチの場合においては、炭素
源としてパラチオン配合物を用いることが望ま
しく、それによつて醗酵槽内の良孝な分散が達
成される。たとえば、有機溶剤および乳化剤を
含有する配合物を使用することが可能である。
適当な配合物は、たとえば、３部のイソプロパ
ノール、１部のパラチオンおよび0.01部のアル
キルアリールポリグリコールエーテルから成る
ものである。 このように取得した培養液の、燐酸エステルに
対する、開裂活性は、ほぼ同一の醗酵時間とパラ
チオン使用量において、純パラチオンを用いて生
長させる培養物の場合におけるよりも、50〜100
％高い。 通常の複合培地、たとえば、酵母抽出物、酵素
自己溶解物または肉エキス培地、は、純培養物か
ら活性細胞培養物を製造するために用いて最良で
ある。加うるに、たとえば有機酸類、アミノ酸
類、カルボン酸類、たとえばコハク酸、且つまた
ニトロフエノールのような、その他の炭素源を加
えることもまた、可能である。純培養物を用いる
場合には、醗酵時間は、混合培養物および炭素の
有機源としてのパラチオンを用いる醗酵と比較し
て、かなり短かくなり、活性収率は同一またはか
なり増大する。しかしながら、燐酸エステルを開
裂する細胞製剤を製造するための純培養物の使用
は、滅菌操作条件を必要とする。 醗酵の終点は、燐酸エステルに対する培養物の
開裂活性が増大する速度によつて、与えられる。
培養は、活性のそれ以上の顕著な増大を認めるこ
とができなくなつたときに、中止する。 燐酸エステルを開裂する製剤を製造するために
は、微生物組成物を、遠心分離によつて単離す
る。それを、たとえば出発容量の1/10〜1/20の蒸
留水中に取り且つ撹拌によつて均一に分散させ
る。懸濁液を再び遠心分離し、上澄液を廃棄した
のち、沈降物を再び、たとえば出発容量の1/50〜
１／１００の蒸留水中に取る。この懸濁液を凍結した
のち、凍結乾燥する。生ずる乾燥生成物は水に不
溶性であるが、容易に水中に懸濁させることがで
きる。これは、燐酸エステルに対する全開裂活性
を含有している。 より簡単ではあるが、しかし活性の多少の損失
を伴なう乾燥方法は、たとえば、容量で10部（押
固めた細胞容積に対して）の有機溶剤、特にアセ
トンまたはエタノールによる２回の抽出によつ
て、蒸留したH2Oを用いて単離した微生物沈降
物から、水を除去する方法である。脱水した微生
物沈降物を、次いで20mmHgの圧力下の真空乾燥
器中で、20〜30℃において乾燥する。 新鮮な、または凍結し且つ解凍した微生物細胞
の、水または緩衝液（たとえば0.1M、PH６〜９）
中における懸濁液は、乾燥した、しかし水溶性の
酵素製剤の製造のための出発材料として使用し
て、最良である。しかしながら、凍結乾燥した微
生物細胞の適当な懸濁液もまた、使用することが
できる。微生物細胞懸濁液を１〜５％の、たとえ
ば、デオキシコール酸NaまたはトリトンX100の
ような、界面活性物質を用いて、あるいは２〜10
容量％のブタノールを用いて、25〜27℃において
0.5〜８時間培養し、次いでバツチを遠心分離し
たのち、上澄液を、直接に（ブタノールが可溶化
剤である場合）、または蒸留水に対して予め透析
したのちに（界面活性物質を用いる場合）、凍結
乾燥する。かくして取得する試験製剤は、初期活
性の約50％を含有し、それらの比活性は、使用す
る出発材料のそれの２〜３倍も高く、且つそれら
は、水または緩衝液中に溶解して透明な溶液を与
える。 以下の実施例は、本発明の全般的適用性の限定
を意味するものではなく、本発明を例証するため
のものである。試薬は、パラチオン分解微生物を
用いて行なう。 実施例 １ パラチオン分解活性を測定するための試験 0.1Mの燐酸カリウム緩衝液、PH8.2、アリロキ
シポリグリコールエーテルの水中における濃度10
％の溶液およびパラチオンのエタノール中におけ
る濃度１％の溶液を必要とする。基質溶液を調製
するために、0.3mlの乳化剤水溶液を50mlの緩衝
剤溶液中に撹拌しながら加え、次いで２mlのパラ
チオンエタノール溶液を徐々に加える。 試験のために、2.4mlの上記基質溶液を、25℃
に温度調節したセル中に導入する。同じ基質溶液
を、空試験としても使用する。温度を調節したの
ちに、100μの緩衝剤溶液を空試験セル中に導
入し、且つ100μの酵素溶液、懸濁液または培
養液を、後者はトルエンによる予備処理後に（下
記参照）、測定セル中に導入して、410nｍにおけ
る吸光の変化を記録して、生成するパラ−ニトロ
フエノールすなわち開裂したパラチオンのμモル
数に変換する。 １酵素単位（Ｕ）は、上記の試験条件下に、１
分間当りに1μモルのパラチオンの開裂、あるい
は１分間当りに1μモルのパラ−パラチオンの遊
離、として定義する。 培養溶液中の新鮮な細胞または新鮮な細胞懸濁
液を試験するためには、これらを先ず分解しなけ
ればならない。そのために、0.2％のトルエンを、
試験すべき試料に加え且つ混合物を30℃において
30分間撹拌しながら培養する。このように予備処
理した10〜100μの試料を試験する。凍結乾燥
した細胞または凍結したのち解凍した細胞の場合
においては、トルエン処理は不必要であり且つ試
験すべき試料の活性に何らの変化も与えない。 以下の実施例においては、上記のようにして測
定した活性をＵ単位で示す。 実施例 ２ 燐酸エステルを開裂する、従来から公知の混合
培養物からの、活性化した、安定化混合培養物
の製造 活性化した、安定化混合培養物を製造するため
に、先ず以下の原液を調製した： 原液１：1Mの燐酸カリウム乾燥液、PH7.6、 原液２：10.0ｇの硫酸アンモニウム、0.6ｇの塩
化カルシウム、4.0ｇの硫酸マンガンおよび
1000mlの水、 原液３：3.0ｇの硫酸鉄（）および1000mlの水 原液４：微量元素の常用の溶液。 10の水中に、100mlの原液1200mlの原液２お
よび10mlの原液３と４を含有する無機塩培養基
を、培養物の生長のために使用した。 ムネツケらによりアプライドミクロビオロジー
1974、28、212〜217頁中に記されているパラチオ
ン開裂混合培養物を、出発培養物として使用し
た。 すなわち、出発培養物としてプソイドモナス
spec ６（DSM1194；FERM−Ｐ−4679）及びプ
ソイドモナスspec ５（DSM1193；FERM−Ｐ−
4664）を使用した。 この培養物を、９の無機塩培地を含有する10
の醗酵槽中で、生長させた。ムネツケらによつ
て記されているようにして生長させた活性混合培
養物の１ｇの生体物質（乾燥重量に対し）によつ
て、それを接種した。醗酵槽培養物に、25〜28℃
において、１分間当りに10の空気を撹拌（1200
回転／分）しながら通気した。滴定器を使用し、
2.5N NaOHを用いて、PH値を7.5〜7.6に調節し
た。生長基質としてパラチオンを使用した；それ
を、醗酵バツチ中に、醗酵槽中のパラチオン濃度
が生長を限定するような具合に、連続的に加え
た。実際のパラチオン濃度が10ppm以下であり且
つニトロフエノールを全く検出し得ない場合に、
このような条件が存在した。培養を、後続する生
長過程に対する接種物として先行する生長過程の
１を使用して、４代の連続継代接種で、行なつ
た。培養期間は３〜６日であつた。醗酵槽バツチ
中に、活性の僅かな増大しか認められなくなつた
とき、または活性の増大が全く認められなくなつ
たときに、培養を中止して、次の代の培養を開始
させた。 ４代の継代接種にわたる混合培養物の活性の増
大を、第１表に示す。
【表】
混合培養物を５代目の培養において生長させて
も、それ以上は活性が増大しなかつた。これは第
２表に見ることができるが、第２表中には活性の
増大に加えて、パラチオンの添加量、醗酵中に消
費されたパラチオンの量および生体物質の増大
が、醗酵時間の関数として、示されている。醗酵
時間は123時間とした。１当り4.4mlのパラチオ
ンの全消費量において、培養基１当りに1340U
のパラチオン開裂活性を有する、培養基１当り
480mgの乾燥重量という細胞密度が達成された；
これは、乾燥細胞１ｇ当り2800Uの活性に相当す
る。
も、それ以上は活性が増大しなかつた。これは第
２表に見ることができるが、第２表中には活性の
増大に加えて、パラチオンの添加量、醗酵中に消
費されたパラチオンの量および生体物質の増大
が、醗酵時間の関数として、示されている。醗酵
時間は123時間とした。１当り4.4mlのパラチオ
ンの全消費量において、培養基１当りに1340U
のパラチオン開裂活性を有する、培養基１当り
480mgの乾燥重量という細胞密度が達成された；
これは、乾燥細胞１ｇ当り2800Uの活性に相当す
る。
【表】
このようにして取得した活性化した、安定化混
合培養物を、遠心分離によつて、最初の容量の1/
１０に濃縮して、−18℃において保存した。それを、
その後の醗酵バツチに対する出発培養物として使
用した。 凍結乾燥された後の乾燥酵素調製物の貯蔵安定
性は下記の通りであつた。
合培養物を、遠心分離によつて、最初の容量の1/
１０に濃縮して、−18℃において保存した。それを、
その後の醗酵バツチに対する出発培養物として使
用した。 凍結乾燥された後の乾燥酵素調製物の貯蔵安定
性は下記の通りであつた。
【表】
実施例 ３
パラチオン配合物を使用する活性細胞材料の製
造 培養条件は、大部分は実施例２に記したものと
一致する。しかし純パラチオンの代りに、次の組
成のパラチオン配合物を使用した：150mlのイソ
プロパノール、50mlのパラチオンおよび0.5mlの
アルキルアリールポリグリコールエーテル。 8.5の培地を、実施例２に記した80mlの保存
混合培養物で接種し且つ培養を123時間行なつた。
パラチオン配合物は連続的に導入した。醗酵は非
滅菌条件下に行なつた。 記載の時期に取得した培養液の活性、パラチオ
ンの消費量およびその他の醗酵データを、第３表
に示す。
造 培養条件は、大部分は実施例２に記したものと
一致する。しかし純パラチオンの代りに、次の組
成のパラチオン配合物を使用した：150mlのイソ
プロパノール、50mlのパラチオンおよび0.5mlの
アルキルアリールポリグリコールエーテル。 8.5の培地を、実施例２に記した80mlの保存
混合培養物で接種し且つ培養を123時間行なつた。
パラチオン配合物は連続的に導入した。醗酵は非
滅菌条件下に行なつた。 記載の時期に取得した培養液の活性、パラチオ
ンの消費量およびその他の醗酵データを、第３表
に示す。
【表】
培養基１当り4.2mlの純パラチオンの全消費
において、乾燥細胞１ｇ当り2300Uの比活性が、
パラチオン配合物を用いて、達成された。 実施例 ４ 基質として純パラチオンを使用する、2000規
模においての、活性化混合培養物の製造 1000ｇの（NH4）2SO4、30ｇのCaCl2、200ｇの
MgSO4、3100ｇのK2HPO4、600ｇのKH2PO4、
６ｇのFeCl2および2000mlの微量元素の溶液を、
2000の脱イオン水に加えた。 2000の醗酵バツチを、実施例２に記した保存
培養物から出発して、実施例２に記した培養条件
下に、１、20および200にわたる継代接種
において取得した、200の予備培養物を用いて
接種した。この醗酵バツチを、240回転／分で138
時間撹拌し、次いで350回転／分で醗酵が終了す
るまで撹拌し、且つ１分間当り2000の空気を通
気した。温度は27〜28℃とした。PH値は2.5N
NaOHによつて、7.5〜7.7で一定に保つた。パラ
チオンを表中に示す添加速度で連続的に加えた。
醗酵の経過は、同様に第４表から知ることができ
る。
において、乾燥細胞１ｇ当り2300Uの比活性が、
パラチオン配合物を用いて、達成された。 実施例 ４ 基質として純パラチオンを使用する、2000規
模においての、活性化混合培養物の製造 1000ｇの（NH4）2SO4、30ｇのCaCl2、200ｇの
MgSO4、3100ｇのK2HPO4、600ｇのKH2PO4、
６ｇのFeCl2および2000mlの微量元素の溶液を、
2000の脱イオン水に加えた。 2000の醗酵バツチを、実施例２に記した保存
培養物から出発して、実施例２に記した培養条件
下に、１、20および200にわたる継代接種
において取得した、200の予備培養物を用いて
接種した。この醗酵バツチを、240回転／分で138
時間撹拌し、次いで350回転／分で醗酵が終了す
るまで撹拌し、且つ１分間当り2000の空気を通
気した。温度は27〜28℃とした。PH値は2.5N
NaOHによつて、7.5〜7.7で一定に保つた。パラ
チオンを表中に示す添加速度で連続的に加えた。
醗酵の経過は、同様に第４表から知ることができ
る。
【表】
【表】
培地１当りに3.8mlのパラチオンの消費にお
いて、乾燥細胞１ｇ当り940Uの比活性が達成さ
れた。 実施例 ５ 醗酵槽における低速混合（200回転／分）でイ
ソプロパノール配合物を使用する、活性細胞材
料の製造 −18℃において７日間貯蔵した、実施例２から
の10mlの濃活性化混合培養物によつて、７の醗
酵槽中の５の栄養溶液に接種して、このバツチ
を200回転／分で撹拌し且つ６／分の空気で通
気した。培養温度は27℃とし、PH値は7.6とした。
イソプロパノール中のパラチオンの配合物（組成
は実施例３参照）0.5mlを、最初に不連続的に加
えて、バツチを15時間培養した。然るのち、パラ
チオン配合物を連続的に第５表に示す速度で加え
た。活性の増大および生体物質の乾燥重量を、同
様に第５表に示す。
いて、乾燥細胞１ｇ当り940Uの比活性が達成さ
れた。 実施例 ５ 醗酵槽における低速混合（200回転／分）でイ
ソプロパノール配合物を使用する、活性細胞材
料の製造 −18℃において７日間貯蔵した、実施例２から
の10mlの濃活性化混合培養物によつて、７の醗
酵槽中の５の栄養溶液に接種して、このバツチ
を200回転／分で撹拌し且つ６／分の空気で通
気した。培養温度は27℃とし、PH値は7.6とした。
イソプロパノール中のパラチオンの配合物（組成
は実施例３参照）0.5mlを、最初に不連続的に加
えて、バツチを15時間培養した。然るのち、パラ
チオン配合物を連続的に第５表に示す速度で加え
た。活性の増大および生体物質の乾燥重量を、同
様に第５表に示す。
【表】
培地１当りに3.8mlの純パラチオンの消費に
おいて、乾燥細胞１ｇ当りに880Uの比活性が達
成された。 実施例 ６ 純培養物からの活性細胞材料の製造 １ｇのNaHCO3、８ｇの酵母自己溶解物、３
ｇの肉加水分解物（ダニメツクス）および1000ml
のH2Oの組成を有する複合培地９を、燐酸エ
ステルを開裂する、プソイドモナス単離プソイド
モナス種（DSMゲツチンゲン、1193号）の、複
合培地中で３日間生長させた、予備培養物500ml
で接種し、そのバツチを、28℃において、1000回
転／分で撹拌し、且つ９／分で通気した。PH値
は7.6とした。醗酵時間は21時間であつた。この
時間の後に、醗酵バツチのパラチオン開裂活性
は、培地１当り5200Uであつた。細胞の比活性
は、乾燥重量１ｇ当り1620Uであつた。 実施例 ７ 1193、1195、1196、1197および1194の番号下に
ドイツ微生物収集（Deutschen Sammlung
Mikroorganismen）中に保存されたプソイドモ
ナス菌株を、栄養溶液（デイフコ）中で、振とう
培養物として生長させ、最高の活性に達したのち
に、パラチオン水解酵素活性を測定した。 水解酵素活性を、細胞蛋白質１mg当りのＵ単位
（１）で、第６表中に要約する。 第６表菌株番号（DSM） 比活性Ｕ／mg蛋白質(1) 1193 0.42 1195 0.83 1196 1.21 1197 2.04 1194 0.2 (1) 細胞を超音波によつて分解させた；超音波処
理後に、実施例１に記したようにして試験を行
なつた。 実施例 ８ DSM1192、DSM1198およびDSM1199の番号
下にドイツ微生物収集中に保存されたプソイドモ
ナス菌株を、実施例６に記した複合培地中で、30
℃において２日間撹拌下に培養した。これらの菌
株の培地１当りのパラチオン開裂活性を、第７
表に示す。 第７表菌株番号（DSM） 活性、Ｕ／ 1192 1240 1198 785 1199 520 実施例 ９ 実施例２に記すようにして培養した、890U／
の活性を有する５の活性化混合培養物を、メ
ツサーズヘツチツヒからの冷却遠心分離機中で、
４℃において4000回転／分の速度で、30分間遠心
分離した。不活性な上澄液を流し出し、沈降物に
500mlの蒸留水を加えたのち、混合物を磁気撹拌
機により10分間撹拌した。均一な細胞懸濁液
（550ml、7100U／）を、再び上記のようにして
遠心分離し、不活性な上澄液を捨て、今度は100
mlの蒸留水を沈降物に加えたのち、上記と同様に
撹拌した。生成する130mlの細胞懸濁液
（27300U／）を−18℃で冷凍したのち、凍結乾
燥した。収量：750U／ｇの活性を有する製剤3.3
ｇ。 実施例 10 実施例４に従がい２バツチ中で製造した4000
の培養液の細胞スラリーを、メツサーズウエスト
フアリアからの分解機中で濃縮し（200〜300）、
不活性な透明流出液を捨てた。細胞体をバスケツ
ト遠心分離機中で、2500回転／分で、スラリーか
ら沈降させた。沈降物を300の蒸留水中に取り
且つ撹拌によつて懸濁させた。それを再びバスケ
ツト遠心分離機中で沈降させ、洗浄した細胞沈降
物を30〜40の蒸留水中に取り、懸濁させたの
ち、その懸濁液を−40℃で凍結させ、次いで凍結
乾燥した。収量：700U／ｇの活性を有する製剤
981ｇ。 実施例 11 実施例２に記すようにして製造し、洗浄し、次
いで凍結して−18℃において１月貯蔵した100ml
の細胞懸濁液を解凍して、10000回転／分で、20
分間、４℃において遠心分離した。上澄液
（200U／）を廃棄した。細胞沈降物を100mlの
水中に再懸濁し、その懸濁液を分割した
（6830U／）。半分を直接に凍結乾燥した。収
量：175U／ｇの活性を有する製剤1.25ｇ。 他の半分を再び10000回転／分で遠心分離し、
細菌沈降物を、50mlの分析級アセトンを用いて、
４℃において２回抽出した。アセトン抽出物を廃
棄し、残渣を真空乾燥器中で室温において乾燥し
た。収量：150U／ｇの活性を有する製剤0.9ｇ。 実施例 12 実施例２に従つて製造した、125U／の活性
を有する培養液12を、4000回転／分で30分間遠
心分離し、上澄液を廃棄し、沈降物を500mlの水
中に取つて懸濁させた（3000U／）。それを再
び遠心分離し、上澄液を廃棄し、沈降物を水中に
再懸濁させて120mlとした。この溶液を、実施例
６および７における可溶化実験に対する出発溶液
として使用した。 実施例 13 30mlの0.1M燐酸カリウム緩衝液、PH8.2、を、
実施例４からの懸濁液（試験懸濁液4800U／、
10000ｇの上澄液：Ｕ／＝０）30mlに加えた。
次いで３ｇのデオキシコール酸ナトリウムを加
え、そのバツチを振とう水浴中で30℃において30
分間培養した。次いでこのバツチを10.000ｇで40
℃において30分間遠心分離した。上澄液は
19930U／の活性を有していた。上澄液を透析
管中に導入して、４℃において蒸留水に対して透
析した。それによつて最初に粘稠であつた溶液は
透明になつた。残留する物質を19000回転／分で
遠心分離し、透明上澄液を凍結乾燥した。収量：
320U／ｇの活性を有する水溶性の酵素1.4ｇ。 実施例 14 30mlの0.1M燐酸カリウム、PH8.2、を、30mlの
実施例４からの懸濁液（試験懸濁液4800U／、
10000ｇの上澄液Ｕ／＝０）に加えた。次いで
６mlのｎ−ブタノールを加え、そのバツチを、振
とう水浴中で、30℃において30分間振とうした。
このバツチを、10000ｇ下に30分間遠心分離した。
その上澄液は13700U／の活性を有していた。 25mlの上澄液を直接に凍結乾燥した。収量：
890U／ｇの活性を有する水溶性の製剤300mg。 25mlの上澄液を最初に蒸留水に対して透析し、
次いで凍結乾燥した。収量：1760U／ｇの活性を
有する製剤120mg。 実施例 15 実施例２に記すようにして取得した、120U／
の活性を有する培養液16を、4000回転／分で
遠心分離し、上澄液を廃棄し、沈降物を500mlの
水中に取り、再懸濁させた。懸濁液を再び遠心分
離し、沈降物を100mlの蒸留水中に取つた。100ml
の0.1Mグリシン／NaOH緩衝液、PH8.5、を、こ
の細胞懸濁液に加えたのち、バツチを、ウルトラ
ツラツクスホモジナイザーによつて、短時間均質
化した（試験懸濁液956U／、10000ｇ上澄液
550U／）。次いで15ml（＝7.5容量％）のブタ
ノールをバツチに加え、そのバツチを、撹拌しな
がら、37℃において１時間培養した。次いで４℃
に冷却したのち、19000回転／分で30分間遠心分
離した。上澄液は9150U／の活性を有してい
た。沈降物を100mlの水中に取り、懸濁液を再び
遠心分離した。この第二の上澄液（2860U／）
を第一のもの（280ml、7650U／）と混合した。
190mlのこの溶液を直接凍結乾燥した。収量：
1090U／ｇの活性を有する可溶性製剤1.4ｇ。90
mlのこの溶液を、先ず水に対して透析したのち、
凍結乾燥した。収量：1370U／ｇの活性を有する
可溶性製剤0.5ｇ。 実施例 16 実施例６における醗酵バツチからの６の醗酵
液を、4000回転／分において、40℃で30分間遠心
分離した。沈降物を500mlの水中に再懸濁させ、
その懸濁液を再び上と同様に遠心分離した。上澄
液を廃棄し、このようにして洗浄した沈降物を
100mlの水中に懸濁させ、その懸濁液を凍結し且
つ凍結乾燥した。 実施例 17 容器中のパラチオンの分解 空にしたのち残留汚染物として40〜60ｇのパラ
チオンを含有している、パラチオン貯蔵用の120
の容器中に30の水を導入した；内容物を十分
の混合し且つPH値を8.3に調節した。実施例10に
従つて取得した製剤400mgを使用して、パラチオ
ンの分解を開始させた。１分間当り90〜120mgの
転化速度で、パラチオンの分解が10時間の中に終
了した。 実施例 18 湿つた砂中のパラチオンの酵素による分解 200mlの蒸留水および１ｇの分析級NaHCO3
を、500ｇの砂（140℃における乾燥において0.76
％の減少）に加えた。425.5mgの濃度47％のパラ
チオン配合物を加え、各成分を混合し且つ20mgの
実施例10に従つて製造した製剤を添加した。2.5
時間の混合時間後に、混合物をアルカリ性とし、
濾過したのち、直ちに瀘液中のｐ−ニトロフエノ
ールを光度測定的に定量した。内容物：490ｇ／
のｐ−ニトロフエノール、すなわち、分解は理
論の100％であつた。
おいて、乾燥細胞１ｇ当りに880Uの比活性が達
成された。 実施例 ６ 純培養物からの活性細胞材料の製造 １ｇのNaHCO3、８ｇの酵母自己溶解物、３
ｇの肉加水分解物（ダニメツクス）および1000ml
のH2Oの組成を有する複合培地９を、燐酸エ
ステルを開裂する、プソイドモナス単離プソイド
モナス種（DSMゲツチンゲン、1193号）の、複
合培地中で３日間生長させた、予備培養物500ml
で接種し、そのバツチを、28℃において、1000回
転／分で撹拌し、且つ９／分で通気した。PH値
は7.6とした。醗酵時間は21時間であつた。この
時間の後に、醗酵バツチのパラチオン開裂活性
は、培地１当り5200Uであつた。細胞の比活性
は、乾燥重量１ｇ当り1620Uであつた。 実施例 ７ 1193、1195、1196、1197および1194の番号下に
ドイツ微生物収集（Deutschen Sammlung
Mikroorganismen）中に保存されたプソイドモ
ナス菌株を、栄養溶液（デイフコ）中で、振とう
培養物として生長させ、最高の活性に達したのち
に、パラチオン水解酵素活性を測定した。 水解酵素活性を、細胞蛋白質１mg当りのＵ単位
（１）で、第６表中に要約する。 第６表菌株番号（DSM） 比活性Ｕ／mg蛋白質(1) 1193 0.42 1195 0.83 1196 1.21 1197 2.04 1194 0.2 (1) 細胞を超音波によつて分解させた；超音波処
理後に、実施例１に記したようにして試験を行
なつた。 実施例 ８ DSM1192、DSM1198およびDSM1199の番号
下にドイツ微生物収集中に保存されたプソイドモ
ナス菌株を、実施例６に記した複合培地中で、30
℃において２日間撹拌下に培養した。これらの菌
株の培地１当りのパラチオン開裂活性を、第７
表に示す。 第７表菌株番号（DSM） 活性、Ｕ／ 1192 1240 1198 785 1199 520 実施例 ９ 実施例２に記すようにして培養した、890U／
の活性を有する５の活性化混合培養物を、メ
ツサーズヘツチツヒからの冷却遠心分離機中で、
４℃において4000回転／分の速度で、30分間遠心
分離した。不活性な上澄液を流し出し、沈降物に
500mlの蒸留水を加えたのち、混合物を磁気撹拌
機により10分間撹拌した。均一な細胞懸濁液
（550ml、7100U／）を、再び上記のようにして
遠心分離し、不活性な上澄液を捨て、今度は100
mlの蒸留水を沈降物に加えたのち、上記と同様に
撹拌した。生成する130mlの細胞懸濁液
（27300U／）を−18℃で冷凍したのち、凍結乾
燥した。収量：750U／ｇの活性を有する製剤3.3
ｇ。 実施例 10 実施例４に従がい２バツチ中で製造した4000
の培養液の細胞スラリーを、メツサーズウエスト
フアリアからの分解機中で濃縮し（200〜300）、
不活性な透明流出液を捨てた。細胞体をバスケツ
ト遠心分離機中で、2500回転／分で、スラリーか
ら沈降させた。沈降物を300の蒸留水中に取り
且つ撹拌によつて懸濁させた。それを再びバスケ
ツト遠心分離機中で沈降させ、洗浄した細胞沈降
物を30〜40の蒸留水中に取り、懸濁させたの
ち、その懸濁液を−40℃で凍結させ、次いで凍結
乾燥した。収量：700U／ｇの活性を有する製剤
981ｇ。 実施例 11 実施例２に記すようにして製造し、洗浄し、次
いで凍結して−18℃において１月貯蔵した100ml
の細胞懸濁液を解凍して、10000回転／分で、20
分間、４℃において遠心分離した。上澄液
（200U／）を廃棄した。細胞沈降物を100mlの
水中に再懸濁し、その懸濁液を分割した
（6830U／）。半分を直接に凍結乾燥した。収
量：175U／ｇの活性を有する製剤1.25ｇ。 他の半分を再び10000回転／分で遠心分離し、
細菌沈降物を、50mlの分析級アセトンを用いて、
４℃において２回抽出した。アセトン抽出物を廃
棄し、残渣を真空乾燥器中で室温において乾燥し
た。収量：150U／ｇの活性を有する製剤0.9ｇ。 実施例 12 実施例２に従つて製造した、125U／の活性
を有する培養液12を、4000回転／分で30分間遠
心分離し、上澄液を廃棄し、沈降物を500mlの水
中に取つて懸濁させた（3000U／）。それを再
び遠心分離し、上澄液を廃棄し、沈降物を水中に
再懸濁させて120mlとした。この溶液を、実施例
６および７における可溶化実験に対する出発溶液
として使用した。 実施例 13 30mlの0.1M燐酸カリウム緩衝液、PH8.2、を、
実施例４からの懸濁液（試験懸濁液4800U／、
10000ｇの上澄液：Ｕ／＝０）30mlに加えた。
次いで３ｇのデオキシコール酸ナトリウムを加
え、そのバツチを振とう水浴中で30℃において30
分間培養した。次いでこのバツチを10.000ｇで40
℃において30分間遠心分離した。上澄液は
19930U／の活性を有していた。上澄液を透析
管中に導入して、４℃において蒸留水に対して透
析した。それによつて最初に粘稠であつた溶液は
透明になつた。残留する物質を19000回転／分で
遠心分離し、透明上澄液を凍結乾燥した。収量：
320U／ｇの活性を有する水溶性の酵素1.4ｇ。 実施例 14 30mlの0.1M燐酸カリウム、PH8.2、を、30mlの
実施例４からの懸濁液（試験懸濁液4800U／、
10000ｇの上澄液Ｕ／＝０）に加えた。次いで
６mlのｎ−ブタノールを加え、そのバツチを、振
とう水浴中で、30℃において30分間振とうした。
このバツチを、10000ｇ下に30分間遠心分離した。
その上澄液は13700U／の活性を有していた。 25mlの上澄液を直接に凍結乾燥した。収量：
890U／ｇの活性を有する水溶性の製剤300mg。 25mlの上澄液を最初に蒸留水に対して透析し、
次いで凍結乾燥した。収量：1760U／ｇの活性を
有する製剤120mg。 実施例 15 実施例２に記すようにして取得した、120U／
の活性を有する培養液16を、4000回転／分で
遠心分離し、上澄液を廃棄し、沈降物を500mlの
水中に取り、再懸濁させた。懸濁液を再び遠心分
離し、沈降物を100mlの蒸留水中に取つた。100ml
の0.1Mグリシン／NaOH緩衝液、PH8.5、を、こ
の細胞懸濁液に加えたのち、バツチを、ウルトラ
ツラツクスホモジナイザーによつて、短時間均質
化した（試験懸濁液956U／、10000ｇ上澄液
550U／）。次いで15ml（＝7.5容量％）のブタ
ノールをバツチに加え、そのバツチを、撹拌しな
がら、37℃において１時間培養した。次いで４℃
に冷却したのち、19000回転／分で30分間遠心分
離した。上澄液は9150U／の活性を有してい
た。沈降物を100mlの水中に取り、懸濁液を再び
遠心分離した。この第二の上澄液（2860U／）
を第一のもの（280ml、7650U／）と混合した。
190mlのこの溶液を直接凍結乾燥した。収量：
1090U／ｇの活性を有する可溶性製剤1.4ｇ。90
mlのこの溶液を、先ず水に対して透析したのち、
凍結乾燥した。収量：1370U／ｇの活性を有する
可溶性製剤0.5ｇ。 実施例 16 実施例６における醗酵バツチからの６の醗酵
液を、4000回転／分において、40℃で30分間遠心
分離した。沈降物を500mlの水中に再懸濁させ、
その懸濁液を再び上と同様に遠心分離した。上澄
液を廃棄し、このようにして洗浄した沈降物を
100mlの水中に懸濁させ、その懸濁液を凍結し且
つ凍結乾燥した。 実施例 17 容器中のパラチオンの分解 空にしたのち残留汚染物として40〜60ｇのパラ
チオンを含有している、パラチオン貯蔵用の120
の容器中に30の水を導入した；内容物を十分
の混合し且つPH値を8.3に調節した。実施例10に
従つて取得した製剤400mgを使用して、パラチオ
ンの分解を開始させた。１分間当り90〜120mgの
転化速度で、パラチオンの分解が10時間の中に終
了した。 実施例 18 湿つた砂中のパラチオンの酵素による分解 200mlの蒸留水および１ｇの分析級NaHCO3
を、500ｇの砂（140℃における乾燥において0.76
％の減少）に加えた。425.5mgの濃度47％のパラ
チオン配合物を加え、各成分を混合し且つ20mgの
実施例10に従つて製造した製剤を添加した。2.5
時間の混合時間後に、混合物をアルカリ性とし、
濾過したのち、直ちに瀘液中のｐ−ニトロフエノ
ールを光度測定的に定量した。内容物：490ｇ／
のｐ−ニトロフエノール、すなわち、分解は理
論の100％であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ プソイドモナス spec pk6（DSM1192：微
工研菌寄第4663号）、 プソイドモナス spec ５（DSM1193：微工研
菌寄第4664号）、 プソイドモナス spec ６（DSM1194：微工研
菌寄第4679号）、 プソイドモナス spec 11（DSM1195：微工研
菌寄第4665号）、 プソイドモナス spec 12（DSM1196：微工研
菌寄第4666号）、 プソイドモナス spec 14（DSM1197：微工研
菌寄第4667号）、 プソイドモナス spec pk9（DSM1198：微工
研菌寄第4668号）および プソイドモナス spec pk10（DSM1199：微工
研菌寄第4669号） から選ばれた、燐含有活性化合物に対して安定し
た分解活性を有するプソイドモナス属の微生物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2756032.3 | 1977-12-15 | ||
| DE19772756032 DE2756032A1 (de) | 1977-12-15 | 1977-12-15 | Neue praeparationen von mikroorganismen |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12275878A Division JPS5484084A (en) | 1977-12-15 | 1978-10-06 | Storage stabilizing agent of microorganism and production and use thereof |
Publications (2)
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|---|---|
| JPH02299581A JPH02299581A (ja) | 1990-12-11 |
| JPH043948B2 true JPH043948B2 (ja) | 1992-01-24 |
Family
ID=6026263
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12275878A Granted JPS5484084A (en) | 1977-12-15 | 1978-10-06 | Storage stabilizing agent of microorganism and production and use thereof |
| JP2099442A Granted JPH02299581A (ja) | 1977-12-15 | 1990-04-17 | 微生物 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12275878A Granted JPS5484084A (en) | 1977-12-15 | 1978-10-06 | Storage stabilizing agent of microorganism and production and use thereof |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4391887A (ja) |
| JP (2) | JPS5484084A (ja) |
| BE (1) | BE870359A (ja) |
| CH (1) | CH645919A5 (ja) |
| DE (1) | DE2756032A1 (ja) |
| DK (1) | DK349978A (ja) |
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| GB (1) | GB2010327B (ja) |
| IL (1) | IL55421A (ja) |
| IT (1) | IT1098059B (ja) |
| NL (1) | NL7808586A (ja) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4540666A (en) * | 1981-08-13 | 1985-09-10 | Matsushita Electric Industrial Company, Limited | Methane fermentation |
| US4493895A (en) * | 1981-09-24 | 1985-01-15 | Occidental Chemical Corporation | Microbial degradation of obnoxious organic wastes into innocuous materials |
| US4477570A (en) * | 1981-09-24 | 1984-10-16 | Occidental Chemical Corporation | Microbial degradation of obnoxious organic wastes into innocucous materials |
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