JPH043822B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 この発明は、溶液中のグルコース濃度の測定方
法に関する。さらに詳細には、この発明は臨床検
査、食品製造、発酵プロセスなどの分野で利用さ
れ、広範囲のグルコース濃度の測定が可能である
とともに感度および応答性に優れた、溶液中のグ
ルコース濃度の測定方法に関する。

〈従来の技術および発明が解決しようとする問題
点〉 近年、臨床検査等の分野で溶液中、例えば、血
液中のグルコース濃度を測定する方法として、グ
ルコースセンサーが汎用されている。グルコース
センサーとしては、種々のタイプが知られている
が、一般的には、酸素電極または過酸化水素電極
上に、酵素グルコースオキシダーゼ（以下、
GODと略記する）が固定化された膜（以下、
GOD固定化膜と略記する）を積層したものが使
用され、その原理は次の反応式で示される酵素反
応を利用するものである。

グルコース＋O₂＋H₂OGOD ――――→ グルコン酸＋H₂O₂ すなわち、GOD存在下、グルコースが溶存酸
素により酸化され、グルコン酸に変化する際の溶
存酸素消費量または過酸化水素発生量を、上記の
酸素電極または過酸化水素電極で電流値の変化量
として測定し、その値よりグルコース濃度を求め
るものである。従来、この種のグルコースセンサ
ーでは、電流値の変化量をもつて測定するので、
電極からの出力電流値がほぼ安定するまで、通常
３分間程度の測定時間が必要であり、分析に時間
がかかり処理検体数の増加が図れない問題があ
る。

また、上記の反応式から明らかなように、グル
コース濃度の測定限界は、溶存酸素量により決ま
つてしまい、溶存酸素量が充分な場合には、電極
からの出力電流値の変化量はグルコース濃度に比
例するが、血液のように溶存酸素量が少ない試料
の場合、このセンサーを使用して血糖値を測定す
ると、糖尿病患者のような高血糖血液はもとより
正常値である100mg／dlのグルコース濃度までも
測定できない問題がある。

そのため、血液中のグルコース濃度を測定する
方法として、試料の血液を緩衝液で定率希釈する
方法が用いられている。しかし、この方法では、
操作が煩雑となり、また測定を自動化する場合に
も複雑な機構を必要とする。

かかる欠点から、血液のように溶存酸素量が不
足した試料溶液中のグルコース濃度を測定する方
法として、前記グルコースセンサーのGOD固定
化膜上に、直径10〜100μmの孔径と10〜10000
ケ／cm²の孔数を有するグルコース制限透過膜を積
層し、通液量を制限することにより、GOD固定
化膜に到達するグルコース量を制限する方法が提
案されている（特開昭59−22620号公報）。しか
し、この方法では、グルコースが低濃度の場合
に、GOD固定化膜に到達するグルコース量が少
なく、電極からの出力電流値の変化量が極めて少
なくなり測定値の信頼性に欠けるとともに応答時
間が長くなる。さらに、特定の孔径と孔数を有す
る膜を使用するので、膜の作製に特殊な技術を必
要とし、また作製された膜の良否がセンサー機能
に大きく影響するなど種々の問題がある。また、
グルコースの酸化反応により生成される過酸化水
素の量に対応する電流を過酸化水素電極から出力
し、出力電流を微分して微分値に基づいてグルコ
ース濃度を得ることが提案されている（特開昭57
−172242号公報）。

したがつて、上記グルコース制限透過膜を過酸
化水素電極の表面に設けたGOD固定化膜の溶液
側に積層し、過酸化水素電極からの出力電流を微
分する方法を用いてグルコース濃度の測定を行な
えば、出力電流が飽和するまで待つ必要がなくな
るので測定所要時間を短縮できる。

しかし、この方法を採用した場合であつても、
グルコース制限透過膜を通して拡散透過するグル
コースの量が著しく多く、グルコースの酸化反応
に必須の酸素の必要量が多くなる。この結果、グ
ルコースの酸化反応により生成される物質の量も
多くなり、過酸化水素電極の表面に多量の反応生
成物質が残留するとともに、酸素量が著しく少な
くなり、そのままでは次のグルコース濃度の測定
を行なうことができない。即ち、グルコース濃度
の連続測定を行なうことができない。また、グル
コース濃度の測定を１回行なう毎に多量の反応生
成物質を除去するとともにグルコースの酸化反応
に十分な量の酸素を補給すべく過酸化水素電極の
表面を洗浄する作業等が必須になり、全体として
作業が繁雑化する。また、反応生成物質の量を少
なくしようとすれば測定対象溶液を希釈しなけれ
ばならず、やはり作業が繁雑化するとともに、希
釈作業が介在することに伴なつて連続測定を行な
うことが不可能になるなど種々の問題が生じる。

〈発明の目的〉 この発明は、上記の問題点に鑑みなされたもの
で、希釈などの操作を必要とせずに、グルコース
濃度の広範囲の測定ができるとともに感度および
応答性に優れ、しかも連続測定が可能であるとと
もに測定に必要な作業が簡素化できる溶液中のグ
ルコース濃度の測定方法を提供することを目的と
する。

〈問題を解決するための手段〉 上記の問題点を解決すべくなされた、この発明
のグルコース濃度の測定方法は、電極上にGOD
固定化膜が積層されたグルコースセンサーを用い
て溶液中のグルコース濃度を測定する方法におい
て、該グルコースセンサーのGOD固定化膜の溶
液側面上にグルコースの拡散透過を制限するため
の、孔径が0.001〜．2μmの細孔を有する膜が形
成されるとともに該電極からの出力電流の時間に
対する微分値の最大値または最小値を検出し、そ
の値より溶液中のグルコース濃度を測定すること
を特徴とするものである。

この発明で使用されるグルコースセンサーの電
極としては、上記の酵素反応において、測定対象
とされる物質により異なるが、例えば、溶存酸素
の減少量を測定する場合には酸素電極、過酸化水
素の発生量を測定する場合には過酸化水素電極が
使用される。また、ヨウ素イオンの存在下、発生
した過酸化水素を酵素や無機触媒［Mo（IV）な
ど］で分解し、発生するヨウ素を電極反応で測定
する方法などを採用する場合にあつては、その被
検物質に合せた電極を選択すればよい。これらの
電極は、いずれも分析化学などで汎用される電極
で、周知のものである。

また、上記の電極上に積層されるGOD固定化
膜も慣用の方法で形成され、例えば、ジアゾ法、
グルタルアルデヒド法、臭化シアン法などの共有
結合法で、GODを高分子担体に結合させて形成
された膜、アクリルアミドゲルなどを使用した包
括法で、GODを高分子担体中に包括させて形成
された膜などが挙げられる。

上記のGOD固定化膜上に設けられるグルコー
スの拡散透過を制限するための膜としては、親水
性の膜が用いられ、例えば、限外濾過膜として使
用されているセルロースアセテート膜、ポリカー
ボネート膜、セルロースナイトレート膜などが挙
げられ、またアクリル系共重合体フイルター、セ
ロフアン等でもよい。これらの膜は、膜厚が10〜
200μmの範囲が好ましい。膜厚が10μm未満であ
ると機械的強度が弱く、取扱が困難であり、
200μmを越えると応答時間が長くなるとともに出
力が小さくなり、好ましくない。また、孔径が
0.001μm未満であるとグルコースが透過せず、
2μmを越えると高グルコース濃度で出力が飽和す
るので適当でない。

この発明にあつて、グルコース濃度は、上記の
電極からの出力電流の時間に対する微分値を用い
て算出される。すなわち、電極からの出力電流値
の１次微分値（di／dt）または２次微分値
（d²i／dt²）の最大値または最小値（前記の酵素
反応において、被検物質が生成物質の場合には最
大値、被検物質が消費物質の場合には最小値）が
溶液中のグルコース濃度と比例することに基づ
き、該電極からの出力電流値の前記の微分最大ま
たは最小値を求め、あらかじめ作成した検量線か
ら、溶液中のグルコース濃度を測定するものであ
る。

〈作 用〉 この発明は、上記の構成よりなり、GOD固定
化膜の溶液側面上にグルコースの拡散透過を制限
するための膜が形成され、試料溶液中のグルコー
スは該膜を拡散透過してGOD固定化膜に到達し、
前記の酵素反応が進行する。GOD固定化膜に到
達するグルコース量は溶液中のグルコース濃度と
相関するが、到達グルコース量は溶液中のグルコ
ース量に比べて著しく少ないので、GOD固定化
膜中の溶存酸素が充分に存在する条件下に酵素反
応が進行する。従つて、高グルコース濃度の溶液
にあつても、希釈などの操作を必要とせずにグル
コース濃度の測定が可能となる。また、例えば、
血液中の蛋白などの妨害物質の透過が阻止される
ので、GOD固定化膜および電極の汚染が防止さ
れ、センサーの安定性が向上する。

さらに、電極からの出力電流の微分値の最大値
または最小値を用いて、グルコース濃度を測定す
るので、応答時間が極めて速く、またグルコース
濃度が低い試料溶液にあつても出力信号が大き
く、測定精度の向上を図ることができる。以上か
ら明らかなように、到達グルコース量が著しく少
なく、しかも到達グルコースの酸化反応による電
極からの出力電流が飽和するまで待つ必要がない
のであるから、反応生成物質の量が余り増加せ
ず、かつ酸素が余り消費されない時点でグルコー
ス濃度の測定が完了する。したがつて、従来のよ
うに長時間を要する洗浄作業などが不要になり、
グルコース濃度の連続測定を行なうことができ、
しかも全体として作業の簡素化を達成することが
できる。

〈実施例〉 以下、図面に基づき、この発明をより詳細に説
明する。

第１ａ図および第１ｂ図は、この発明にかかる
グルコース濃度の測定方法の概略を示すブロツク
図であり、第１ａ図中、１はフローセル５にその
検知部を露出してなるグルコースセンサー、２は
グルコースセンサー１の電極からの出力電流を時
間で微分する微分回路、３は微分回路２からの微
分出力の最大値または最小値を求めるピーク検出
回路、４は記録計、６はフローセル５を介してグ
ルコースセンサー１の検知部に供給されるグルコ
ースを含有する試料溶液である。フローセルを用
いることにより、試料溶液中のグルコース濃度
を、連続的、経時的に測定することができる。

また、上記の例において、フローセルを使用す
ることなく、カツプ等に入れられた試料溶液に、
グルコースセンサーの検知部を直接浸漬し、グル
コース濃度を測定することもできる。

第１ｂ図は、第１ａ図に示したものにおいて、
試料溶液６の供給をフローセルを用いることな
く、直接、グルコースセンサー５の検知部に滴下
するようになした例を示す。この例では、サンプ
ルが少量でよく、また操作が簡便である。

第２図は、この発明に使用されるグルコースセ
ンサーの一例を示す概略断面図である。この例で
は、電極として慣用の過酸化水素電極が使用され
ており、白金アノード７および銀カソード８から
構成され、該白金アノード７上にGOD固定化膜
９が設けられ、また該GOD固定化膜９上に、グ
ルコースの拡散透過を制限するための膜１０が積
層され、該GOD固定化膜９およびグルコースの
拡散透過を制限するための膜１０は固定具１１で
本体に固定されている。白金アノード７および銀
カソード８からのリード線１３ａおよび１３ｂは
絶縁物１４で絶縁されている。

次に、この発明にかかるグルコース濃度の測定
方法を、第１ａ図を参照して、上記の過酸化水素
電極を使用したグルコースセンサーを用いた例を
もつて具体的に説明する。まず、血液などのグル
コースを含有する試料溶液６をフローセル５を介
して供給する。グルコースセンサー１において、
前記の酵素反応に基づいて過酸化水素が発生し、
その過酸化水素量に応じて生じた過酸化水素電極
からの出力電流は微分回路２に入力され、その１
次微分値または２次微分値に変換される。微分回
路２からの上記微分出力はピーク検出回路３に
て、その最大値が求められる。得られた微分最大
値は、あらかじめ作成した検量線と比較し、溶液
中のグルコース濃度が算出される。

なお、この発明は、上記の実施例に限定される
ものではなく、例えば、過酸化水素電極の代り
に、酸素電極やその変形型電極を使用すること、
電極とGOD固定化膜との間に、使用される電極
の種類に応じて酸素透過膜、過酸化水素透過膜な
どを設け妨害物質を除去すること、検量線をあら
かじめ記憶させたマイクロコンピユータを使用し
て、電極からの出力を微分処理した出力信号に基
づきグルコース濃度を表示させることなど、この
発明の要旨を逸脱しない範囲で適宜変更できる。

次に、実験例および比較例をもつて、この発明
をより詳細に説明する。

実験例 １ 過酸化水素電極の表面にGOD固定化膜（市販
品）が積層されたグルコースセンサー（以下、従
来型グルコースセンサーという）のGOD固定化
膜上に普通セロハン300番を積層し、本発明のグ
ルコースセンサーを作製した。このグルコースセ
ンサーに、種々のグルコース濃度水溶液を供給
し、電極からの出力電流の１次微分の最大値を測
定し、グルコース濃度に対する応答性を調べた。

実験例 ２ 実験例１で用いた従来型グルコースセンサーの
GOD固定化膜上に、セルロースナイトレート膜
（膜厚90μm、孔径0.01μm）を積層し、本発明の
グルコースセンサーを作製した。以下、実験例１
と同様に応答性を調べた。

実験例 ３ 実験例１で用いた従来型グルコースセンサーの
GOD固定化膜上に、不織ナイロンで裏打ちされ
たアクリル系共重合体フイルター［ゲルマン サ
イエンス社（Gelman Science Inc.USA）製、
品番66394、膜厚約100μm、孔径1.2μm］の不織
ナイロン面を外側にして積層し、本発明のグルコ
ースセンサーを作製した。以下、実験例１と同様
に応答性を調べた。

上記の実験例１〜３のグルコースセンサーの応
答性試験結果を第３図に示す。

比較例 １ 実験例１で用いた従来型のグルコースセンサー
のGOD固定化膜上に、アクリル系共重合体フイ
ルター［ゲルマン サイエンス社（Gelman
Science Inc.USA）製、品番66387、膜厚約
100μm、孔径3μm］を積層したセンサーを作製し
た。以下、実験例１と同様に応答性を調べた。

比較例 ２ 実験例１で用いた従来型のグルコースセンサー
のGOD固定化膜上に、濾紙（東洋濾紙製、東洋
濾紙No.２、膜厚260μm）を積層したセンサーを作
製した。以下、実験例１と同様に応答性を調べ
た。

上記の比較例１および２のセンサーの応答性試
験結果を第４図に示す。

第３図から明らかなように、この発明のグルコ
ースセンサーは、グルコース濃度が500mg／dlま
で測定が可能であり、また、応答時間はいずれも
５〜20秒以内であり、非常に速やかであつた。

一方、第４図から明らかなように、比較例１の
センサーは、グルコース濃度が高い溶液では出力
が飽和するため、高グルコース濃度溶液まで測定
ができず、また、比較例２のセンサーは、応答時
間が長くかつ高グルコース濃度溶液でも出力が小
さく、いずれも実用には適さない。

〈効果〉 以上のように、この発明の測定方法によれば、
高グルコース濃度溶液にあつても、到達グルコー
ス量を著しく少なくできるので、試料溶液を希釈
することなく直接測定でき、グルコースの酸化反
応により生成される反応生成物質の量および酸素
の消費量を著しく少なくできるのでグルコース濃
度の連続測定を簡単に達成でき、しかも全体とし
て操作が簡素化でき、ひいては自動化装置の作製
も容易となる。さらに、応答時間が速く測定時間
が短縮されるので、処理能力の向上に寄与すると
ともにグルコースの低濃度溶液においても充分な
出力を得ることができ、測定精度の向上が図れる
という特有の効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図および第１ｂ図は、この発明にかかる
グルコース濃度の測定方法の概略を示すブロツク
図、第２図は、この発明にかかるグルコース濃度
の測定方法に使用されるグルコースセンサーの概
略断面図、第３図は、グルコース濃度と実験例１
〜３のセンサーにおける電極からの出力電流の１
次微分最大値との関係を示す図、第４図は、グル
コース濃度と比較例１および２のセンサーにおけ
る電極からの出力電流の１次微分最大値との関係
を示す図である。 １…グルコースセンサー、２…微分回路、３…
ピーク検出回路、４…記録計、５…フローセル、
６…試料溶液、７…白金アノード、８…銀カソー
ド、９…GOD固定化膜、１０…グルコースの拡
散透過を制限するための膜、１１…固定具、１２
…電解液、１３ａ，１３ｂ…リード線、１４…絶
縁物。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 電極上にグルコースオキシダーゼ固定化膜が
   積層されたグルコースセンサーを用いて溶液中の
   グルコース濃度を測定する方法において、該グル
   コースセンサーのグルコースオキシダーゼ固定化
   膜の溶液側の面上にグルコースの拡散透過を制限
   するための、孔径0.001〜2μmの細孔を有する膜
   が形成されているとともに該電極からの出力電流
   の時間に対する微分値の最大値または最小値を検
   出し、その値より溶液中のグルコース濃度を測定
   することを特徴とする溶液中のグルコース濃度の
   測定方法。 ２ グルコースの拡散透過を制限するための膜の
   膜厚が10〜200μmである上記特許請求の範囲第１
   記載の溶液中のグルコース濃度の測定方法。 ３ 電極が過酸化水素電極である上記特許請求の
   範囲第１項または第２項記載の溶液中のグルコー
   ス濃度の測定方法。 ４ 電極が酸素電極である上記特許請求の範囲第
   １項または第２項記載の溶液中のグルコース濃度
   の測定方法。 ５ 電極からの出力電流の時間に対する微分値
   が、１次微分値である上記特許請求の範囲第１項
   ないし第４項のいずれかに記載の溶液中のグルコ
   ース濃度の測定方法。