JP2781980B2 - 測定電極並びに該電極を用いた過酸化物濃度の測定方法及び基質又は有機物濃度の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、被検液中における過酸化水素等の過酸化物
濃度や、グルコース，グルタミン酸，アスコルビン酸等
の酸化酵素と反応する基質又は微生物が資化する有機物
の濃度を測定することができ、半導体産業、食品産業、
臨床分析等の広い分野で利用することができる測定電極
並びに該電極を用いた過酸化物の測定方法及び基質又は
有機物濃度の測定方法に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕

過酸化水素の定量技術は応用分野が広く、例えば半導
体産業におけるシリコンウェハーの処理液等に由来する
排液の管理、食品の過酸化水素処理後の残留分のチェッ
クなどに用いられている。また、酸素反応には過酸化水
素を発生する系が多いため、酸素反応を利用した分析手
段の最終検知物質として過酸化水素の定量を行なうこと
が広範に行なわれている。

過酸化水素の測定方法としては、古くから電位差滴定
法（過マンガン酸カリウム法、ヨウ素法）や吸光光度法
が知られているが、これらの方法では、高感度測定を行
なうことが難しい。また、μＭオーダー（ppbオーダ
ー）の高感度測定を行なう場合には比色法として改良４
−アミノアンチピリン法があるが、この方法では測定に
約３時間という長時間を要する。更に、ホモワニリン酸
や２′,7′−ジクロロフルオロスチン−二酢酸塩を用い
る方法はより高感度に測定を行なうことが可能である
が、上記試薬は極めて不安定であり、取り扱いが面倒で
あるという問題を有する。また、ルミノールを用いた化
学発光法も過酸化水素の高感度定量法として知られてい
るが、この方法は測定に特別な光学系を要する。そし
て、上記各方法を自動化ないし装置化する場合の最大の
問題点は、これらの方法が不安定な試薬を用いるという
ことである。

一方、自動化ないし装置化に適した過酸化水素の測定
手段として、過酸化水素の電気化学的な活性を利用した
ものが知られており、例えば一定の支持電解質の存在下
で一定の直流電圧を印加して過酸化水素を電解酸化させ
る方法（特公昭45−35360号公報）、同じく電気化学的
な原理でアルカリ電解液を用いて印加電圧を加えずにガ
ルバニックな電流を測定する方法（特開昭59−26049号
公報）、上記特開昭59−26049号の検出原理に基づき、
疎水性隔膜で外界と電極内部とを仕切った過酸化水素電
極（特開昭63−32363号公報）等が提案されている。

しかし、これらの電気化学的な方法は、簡易に測定系
を構成できる利点を有する反面、測定感度に限界があ
る。例えば、特開昭63−32363号の電極では、4mmφの検
知極及び平均孔径1.2μｍの疎水性ガス透過膜を用いた
ときには1ppmの過酸化水素に対して得られる電流値は40
nA程度であり、S/N比が悪い。また、塩化カリウム等の
中性塩を支持電解質とし、印加電圧をかけて過酸化水素
を直接電解酸化する方法（特公昭45−35360号公報）で
は、4mmφの検知極を用いた1ppmの過酸化水素に対する
電流値は10〜30nAであり、やはりS/N比が悪い。従っ
て、これらの方法では1ppm以下の濃度の過酸化水素の測
定はS/N比の点で困難である。更に、これらの過酸化水
素を直接電解するタイプの測定手段のもう１つの問題点
は、サンプル中に共存する電気化学的に活性な化学物質
の影響を受けて選択性に欠ける点でなる。

これに対し、過酸化水素を特異的に高い選択性で簡易
なセンサにより測定し得る手段として、被検液中にカタ
ラーゼ等の過酸化水素分解剤を添加し、増加する溶存酸
素の量を酸素電極で測定する方法が公知である（特公昭
50−25840号公報）。しかし、この方法は飽和溶存酸素
レベルからの電流増加を測定するので、飽和溶存酸素量
の微小な変動が誤差の要因となり、このため1ppm以下の
過酸化水素の測定が困難である。

そこで、従来より酸素電極の酸素透過膜上にカタラー
ゼ固定化膜を装着した過酸化水素電極が提案されてい
る。この電極によって微量過酸化水素の測定を行なう場
合、検出端を基礎液中に浸漬し、基礎液中に窒素ガス等
の不活性ガスを吹き込み、溶存酸素を除去して下地電極
である酸素電極のベース電流値を下げると共に、過酸化
水素を含む被検液中の溶存酸素を除去し、この被検液を
上記基礎液に添加することによって、上記カタラーゼ固
定化膜による過酸化水素の分解に起因する酸素電極の微
量の出力増加を検知するものである（特公昭62−59774
号公報）。この手段では1ppm以下の過酸化水素の定量も
可能となる上、過酸化水素分解剤であるカタラーゼを固
定化して用いているので、測定の都度カタラーゼを測定
系に添加する繁雑さを避けることができる。

しかしながら、上記の酸素電極の検出端にカタラーゼ
固定化膜を装着した電極によって微量過酸化水素の測定
を行なう場合、上述したように下地電極である酸素電極
のベース電流値を下げる目的で窒素ガス等の不活性ガス
を基礎液中にバブリングしたり、更に測定しようとする
被検液中の溶存酸素も予め除去しておかなければならな
いという面倒がある。このため、被検液に予め不活性ガ
スを通したり、真空吸引して前処理した後、再び大気中
の酸素が溶け込まないように被検液を保存しておく必要
があり、また基礎液と被検液との混合も大気中の酸素の
溶け込みがないよう瞬時に行なう必要があるなど、測定
作業が著しく繁雑になる。

更に、窒素ガス等の不活性ガスを用いて基礎液や被検
液中の溶存酸素を短時間で除去する場合、例えば500ml/
min程度の大きい速度で不活性ガスを基礎液等にバブリ
ングする必要があるが、この間にバブリングによって液
が飛散し、液量が減少するおそれがある。また、食品等
の固体サンプルの場合サンプル中に残留している酸素の
除去は極めて難しい。

このように、不活性ガスをバブリングして基礎液中の
溶存酸素を除去することにより下地電極のベース電流値
を下げる方法は、実際の操作上は上記のような繁雑さを
ともなっており、このためより簡易に過酸化水素を高感
度測定し得る手段が望まれているのが現状である。

本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、下地電極
である酸素電極のベース電流値を安定的に下げ、過酸化
物の分解による酸素増加にともなう微小な電流を高感度
かつ安定に測定することができる測定電極及び該電極を
用いた過酸化物の測定方法を提供することを第１の目的
とする。

一方、固定化酵素を用いた酵素電極は、自然界や生体
系に関連した物質のうち、これらを基質として分解し得
る酵素が存在するものの測定用として構成することが可
能である。中でも、酸化酵素は、基質を酸化する際に酵
素膜近傍の酸素を消費すると共に、多くの場合反応生成
物として過酸化水素を発生するため、酸素電極や過酸化
水素電極といった比較的安定な電極を下地電極として用
いることができ、従って酸化酵素固定化膜を用いた酸素
電極は臨床分析や食品分析等の種々の分野で実用化され
ている。

ところで、上記酸化酵素固定化膜を用いた酵素電極に
おいて、下地電極に酸素電極を使用するか過酸化水素電
極を使用するかについては一長一短がある。即ち、酸素
電極は酸素ガスのみを透過するガス透過膜で検知部が仕
切られているので、サンプル中の共存成分の影響を受け
にくく、安定性に優れているが、酸素電極を下地電極に
した場合、基礎液中の飽和溶存酸素レベルに対応した酸
素電極の電流値からの、酸素膜近傍での酸素反応による
酸素の消費に伴なう電流値の減少分を信号として取り扱
う一種の減少法によって測定を行なうため、測定時に下
地の酸素電極の出力電流がゼロ付近にまで低下すると、
それ以上の測定は不可能であり、従って測定可能な基質
濃度の上限が存在し、測定可能な濃度範囲が限定される
という欠点がある。この場合、サンプル中のおおよその
基質濃度が予測できるときにはサンプルを予め適当に希
釈しておくことによって上記欠点に対処することができ
るが、例えば食品サンプル等のようにサンプル中の基質
濃度が千差万別で、広い濃度範囲にわたっている場合に
は、上述した予めサンプルを希釈する方法を採用するこ
とは困難である。

また、過酸化水素電極を下地電極とした場合には、酸
素反応によって生成した過酸化水素を下地電極によって
測定する方式であるため、酸素電極を用いた場合のよう
な測定範囲の限界はないが、サンプル中に共存する酸化
還元活物質も過酸化水素と同様に酸化還元電流を発する
ので、共存物質の影響を受け易く、測定値が不安定にな
るという問題がある。

従って、固定化酸化酸素を用いた酸素電極において
は、酸素電極及び過酸化水素電極の長所、短所を考慮し
た上で、目的に応じて両電極のいずれかを下地電極とし
て選択しているのが実情であった。

また、酸素電極の検出端に特定の有機物を資化して酸
素を消費する微生物固定化膜を装着した微生物電極を用
い、被検液中における有機物濃度を測定する場合にも、
上述した酸素電極の問題と同じ問題が生じるものであっ
た。

本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、下地電極
である酸素電極のベース電流値を上昇させ、酸化酵素固
定化膜の酸化酵素と反応する基質や微生物固定化膜の微
生物が資化する有機物の濃度を広範囲かつ高感度に測定
することが可能な測定電極及び該電極を用いた基質又は
有機物濃度の測定方法を提供することを第２の目的とす
る。

〔課題を解決するための手段及び作用〕

本発明者は、上記第１の目的を達成するために鋭意検
討を行なった結果、酸素電極の検出端にカタラーゼ固定
化膜を装着した酵素電極を用いて過酸化水素の測定を行
なうに際し、基質を分解するときに酸素を消費する酸化
酵素を固定化した酸化酵素固定化膜を下地電極とカタラ
ーゼ固定化膜との間に介在させると共に、基礎液に上記
基質を添加することにより、基礎液中の溶存酸素が酸化
酵素によって電極の検出端近傍において消費され、下地
電極のベース電流値が低下することを見い出した。即
ち、酸素電極を下地電極とし、これに酸化酵素固定化膜
を介してカタラーゼ固定化膜を装着した場合、下記式
（１）に示すように、基質Ｓを含む基礎液中において、
酸化酵素が酸化酵素膜近傍の基質Ｓを酸化し、同時に膜
近傍の溶存酸素を消費して多くの場合過酸化水素を発生
する。

この結果、下地電極の酸素電極のベース出力は酸化酵
素膜近傍の溶存酸素量の低下に従って低下し、基質濃度
が一定以上に達するとベース電流値は殆どゼロとなる。
この場合、上記式（１）の反応は酸化酵素膜の近傍での
み生じるので、基礎液を入れたセルの容量と基礎液中の
基質濃度が適当であれば酸化酵素膜は経時的に近傍に拡
散してくる基質を連続的に分解し、溶存酸素を消費しつ
づけるので、基質濃度に対応した低溶存酸素状態にとも
なう酸素電極の低出力状態を長期にわたって維持するこ
とができるものである。また、上述したように酸素電極
の検出端とカタラーゼ固定化膜との間に酸化酵素固定化
膜を介装しても過酸化水素の測定に何ら支障を生じず、
また基礎液や被検液中に酸化酵素に対応する基質が存在
してもやはり測定に支障が生じないことを本発明者は確
認した。

また、本発明者は、上記第２の目的を達成するために
種々検討を行なった結果、酸素電極の検出端に酸化酵素
固定化膜を装着した酸素電極を用いて該酸化酵素と反応
する基質の測定を行なうに際し、上記酸化酵素固定化膜
上に更にカタラーゼ固定化膜を装着すると共に、基礎液
中に過酸化物を添加することにより、基礎液中の過酸化
物がカタラーゼによって電極の検出端近傍において分解
され、下地電極のベース電流値が上昇することを見い出
した。即ち、酸素電極を下地電極とし、これに酸化酵素
固定化膜及びカタラーゼ固定化膜を順次装着した場合、
過酸化物を含む基礎液中において、カタラーゼがカタラ
ーゼ固定化膜近傍の過酸化物を分解し、発生期の酸素を
発生する。この結果、下地電極のベース出力はカタラー
ゼ固定化膜近傍の酸素量の上昇に従って上昇し、従って
基礎液中に所定濃度の過酸化物を添加しておくことによ
り、下地電極のベース電流値を所望の値まで上昇させる
ことができるものである。この場合、上記反応はカタラ
ーゼ固定化膜の近傍でのみ生じるので、カタラーゼ固定
化膜は近傍に拡散してくる過酸化物を連続的に分解し、
酸素を発生しつづけるため、過酸化物濃度に対応した酸
素電極のベース電流値を長時間にわたって維持すること
ができる。また、本発明者は、酸化酵素固定化膜上にカ
タラーゼ固定化膜を装着しても基質の測定には何ら支障
を生じないこと、及び基礎液中に過酸化物を共存させて
もやはり測定に支障が生じないことを確認すると共に、
このように基礎液中に過酸化物を加えた場合、意外にも
酸素電極の感度や見かけ上の酵素活性が増大し、基質濃
度を高感度に測定できることを見い出した。

更に、本発明者は、上述した酸素電極の酸化酵素固定
化膜に代えて、特定の有機物を資化して酸素を消費する
微生物を固定化した微生物固定化膜を用いた微生物電極
においても、上記と同様の作用効果が得られることを知
見した。

従って、本発明は、酸素電極の検出端に、基質と反応
して酸素を消費する酸化酵素を固定化した酸化酵素固定
化膜又は有機物を資化して酸素を消費する微生物を固定
化した微生物固定化膜と、カタラーゼ固定化膜とを順次
装着してなることを特徴とする測定電極を提供する。

また、本発明は、上記測定電極の検出端を該電極に設
けた酸化酵素固定化膜の酸化酵素と反応する基質又は微
生物固定化膜の微生物が資化する有機物を含む基礎液に
浸漬した後、上記基礎液に過酸化物を含む被検液を加え
て、基礎液に浸漬したときの酸素電極の出力と基礎液に
被検液を加えたときの酸素電極の出力との差から被検液
中の過酸化物濃度を検出するようにしたことを特徴する
過酸化物濃度の測定方法を提供する。

酸化酵素固定化膜を用いた本発明測定電極を使用し、
本発明過酸化物の測定方法によって例えば過酸化水素の
測定を行なう場合、基礎液中に過酸化水素を含む被検液
を添加すると、カタラーゼ膜は膜表面で過酸化水素を分
解し、酸素ガスを発生し、このガスが酸素電極の検出端
に到達する。この酸素ガスは、酸素電極に被検液中の過
酸化水素濃度に対応した電流出力の増加をもたらすの
で、この出力増加を検知することにより過酸化水素濃度
を測定することができる。また、本発明においては、基
質を酸化するときに酸素を消費する酸化酵素を固定した
酸化酵素膜を酸素電極の検出端に装着すると共に、基礎
液中に上記酸化酵素と反応する基質を加えたことによ
り、酸化酵素膜が膜近傍の基質を酸化し、溶存酸素を消
費するので、基礎液や被検液中の溶存酸素を予め除去し
ておかなくても酸素電極のベース電流値を下げることが
でき、微量過酸化水素の測定を安定に行なうことができ
るものである。

この場合、本発明においては、酸素電極の検出端とカ
タラーゼ固定化膜との間に酸化酵素膜を介在させたこと
により、カタラーゼが上記式（１）の反応で発生した過
酸化水素を下記式（２）、即ち に示すように水と酸素ガスとに分解し、酸化酵素膜に酸
素を補給する役割を果たす。従って、酸化酵素と基質と
の反応にともなう膜近傍での溶存酸素量の低下を軽減す
るが、基質が適当な濃度であればベース電流値を必要な
レベルに下げることが可能である。一方、カタラーゼ膜
は、（１）式の反応で発生する過酸化水素を常に除去す
るので、その後でサンプルを投入してその中に含まれる
過酸化水素を測定するための予備的な処理を行なってい
ることになる。

更に、本発明は、上記測定電極の検出端を過酸化物を
含む基礎液に浸漬した後、この基礎液に上記測定電極に
設けた酸化酵素固定化膜の酸化酵素と反応する基質又は
微生物固定化膜の微生物が資化する有機物を含む被検液
を加えて、基礎液に浸漬したときの酸素電極の出力と基
礎液に被検液を加えたときの酸素電極の出力との差から
被検液中の上記基質又は有機物の濃度を検出するように
したことを特徴とする基質又は有機物濃度の測定方法を
提供する。

酸化酸素固定化膜を用いた本発明測定電極を使用し、
本発明基質又は有機物の測定方法によって例えば基質濃
度の測定を行なう場合、基礎液中に基質を含む被検液を
添加すると、酸化酵素固定化膜は膜表面で基質を分解
し、酸素ガスを消費する。この酸素ガスの減少は、酸素
電極に被検液中の基質濃度に対応した電流出力の減少を
もたらすので、ベース電流値からの出力減少分を検知す
ることにより基質濃度を測定することができる。この場
合、本発明においては、基礎液中に過酸化物を加えたこ
とにより、カタラーゼ膜が膜近傍の過酸化物を分解し、
酸素を発生するので、この発生期の酸素が下地の酸素電
極に作用してその出力電流を増大させる。従って、基礎
液中に所定濃度の過酸化物を添加しておくことにより、
ベース電流値を通常の飽和溶存酸素濃度で定まるベース
電流値から任意に上昇させることができ、それ故測定可
能な基質の濃度範囲を所望の範囲に広げることができ
る。

更に、微生物固定化膜を用いた本発明測定電極を使用
し、上記方法によって過酸化物や有機物を測定する場合
においても、上述した作用効果と同じ作用効果を奏する
ものである。

以下、図面を参照して本発明を更に詳しく説明する。

本発明の測定電極は、上述したように酸素電極の検出
端に酸化酵素固定化膜又は微生物固定化膜とカタラーゼ
固定化膜とを順次装着したものである。

この場合、本発明電極の好適な実施態様としては、例
えば第１図に示すものを挙げることができる。即ち、こ
の電極１は、支持管２の先端開口部を覆って酸素ガス透
過膜３を配設し、かつ支持管２内に内部液４、検知極
５、対極６を封入することにより形成した酸素電極７の
上記酸素ガス透過膜３上に酸化酵素固定化膜8a又は微生
物固定化膜8b及びカタラーゼ固定化膜９を順次積層する
と共に、これらの膜8a,8b,9をネットホルダー10によっ
て保持したものである。

本発明電極を過酸化水素やその他の過酸化物の測定に
使用する場合、酸化酸素膜に固定化する酸化酸素の種類
に特に制限はなく、基質と反応する際に酸素を消費する
ものであればいずれのものも使用し得るが、具体的に
は、例えばグルコースオキシダーゼ、Ｌ−グルタミン酸
オキシダーゼ、Ｌ−アスコルビン酸オキシダーゼ、Ｌ−
乳酸オキシダーゼ、プトレシンオキシダーゼ、サルコシ
ンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、しゅう酸オ
キシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロール
オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ウリカーゼ、
リジンオキシダーゼ等を挙げることができる。この場
合、酸素の長期安定性、所定単位の基質濃度に対する安
定性の点でグルコースオキシダーゼ、Ｌ−グルタミン酸
オキシダーゼを用いることが特に好ましい。

また、微生物膜に固定化する微生物の種類にも制限は
なく、有機物を資化するときに酵素を消費するものであ
ればいずれのものも使用し得るが、具体的には、トリコ
スポロン・ブラシカエやトリコスポロン・クタニウム等
を挙げることができる。

また、本発明電極を基質又は有機物の測定に使用する
場合は、酸化酵素、微生物として測定すべき基質又は有
機物に対応するものを使用するものである。

なお、酸化酵素固定化膜、微生物固定化膜及びカタラ
ーゼ固定化膜の作成手段に限定はなく、例えば酸化酵素
膜の場合、共有結合法、包括法等の公知の方法によって
作成することができる。また、下地電極である酸素電極
の構成、酸素電極への両酵素膜の装着手段等も上記第１
図の例に限られず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種
々変更して差支えない。

本発明の過酸化物の測定方法は、第１図に示すよう
に、上記電極１の検出端を酸化酵素固定化膜8aの酸化酵
素と反応する基質又は微生物固定化膜8bの微生物が資化
する有機物を含む基礎液11aに浸漬し、上記基礎液11aに
過酸化物を含む被検液を加えるものである。この場合、
本発明によれば過酸化水素の他に種々の過酸化物を測定
し得る。なお、図中12は基礎液を入れたセルであり、こ
の基礎液としてはpH緩衝液等の公知のものを使用し得
る。

また、基礎液に加える基質の種類に制限はなく、上記
酸化酵素固定化膜の酸化酵素と脱酸素的な酸化反応を行
なうものであればいずれのものでも使用し得るが、具体
的には、上記酸化酵素と対応するグルコース、Ｌ−グル
タミン酸、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−乳酸、プトレシ
ン、サルコシン、キサンチン、しゅう酸、ピルビン酸、
コレステロール、アルコール、尿酸、リジン等を挙げる
ことができる。更に、基礎液に加える有機物の種類も制
限されず、上記微生物膜の微生物が資化して酸素を消費
するものであればいずれものも使用できる。具体的には
上記微生物と対応するアルコール、グルコースなどを挙
げることができる。

この場合、基礎液に加える基質や有機物の濃度はその
種類等に応じて適宜選定されるが、酸素電極のベース電
流値を長時間に亘って安定に低くすることができるよう
な濃度に設定することが好ましい。即ち、基質や有機物
がどの程度の濃度で存在すれば酸素電極の出力電流の減
少がどの位になるかを予め調べておき、この濃度と出力
電流の減少との対応に応じて添加量を決定することが望
ましい。この濃度は、具体的には、例えば基質がグルコ
ースやＬ−グルタミン酸であれば200〜400mg/程度で
ある。

なお、基礎液に加える被検液の量は、試料の種類や過
酸化物の濃度によって変動するが、添加する被検液の量
が多いと基礎液が希釈され、基礎液中の基質や有機物の
濃度が必要濃度以下になってベース電流値に影響を与え
ることが考えられ、従って、このようなときには被検液
に予め基質又は有機物を添加しておくこと、特に被検液
添加前及び添加後における基礎液中の基質又は有機物濃
度が互いに等しくなるように被検液に基質又は有機物を
加えておくことが好ましく、これにより酸化酸素が基質
と反応するときや微生物が有機物を資化するときに消費
する溶存酸素量が変化することを防止し得、それ故ベー
ス電流値に変化を与えずにゼロ点を安定に保つことがで
きる。

更に、被検液中に測定に用いる基質や有機物が含まれ
ていることが概念される場合は、予め試料の成分分析を
行なっておき、その基質や有機物の濃度が測定に影響を
与えるような濃度であるときには他種の基質及び酸化酵
素又は有機物及び微生物を選択することができ、これに
よりベース電流値を安定に低下させることが可能とな
る。

また、本発明の基質又は有機物濃度の特定方法は、第
１図に示すように、電極１の検出端を所定濃度の過酸化
物を含む基礎液11bに浸漬し、上記基礎液11bに測定対象
である基質又は有機物を含む被検液を加えるものであ
る。なお、基礎液としては上記と同様のものを用いるこ
とができる。

この場合、基礎液に加える過酸化物の種類に制限はな
いが、過酸化水素や過ほう酸ナトリウム、過炭酸ナトリ
ウム等の過酸化物塩などが好適に使用される。

また、基礎液に加える過酸化物の濃度に限定はなく、
ベース電流値をどの程度の高さにするかに応じて適宜設
定できる。即ち、過酸化物がどの程度の濃度で存在すれ
ば酸素電極の出力がどの位になるかを予め調べておき、
この濃度と出力電流の増加との対応に応じて添加量を決
定することが望ましい。この濃度は通常過酸化水素を用
いた場合は100〜1000mg/、過ほう酸ナトリウムを用い
た場合は300〜3000mg/程度とすることが好適である。

本発明の基質又は有機物濃度の測定方法によれば、酸
化酸素膜の酵素と反応する基質又は微生物膜の微生物が
資化する有機物の濃度を良好に測定できるものであり、
この場合測定対象である基質又は有機物の種類に限定は
ないが、例えばグルコース、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ア
スコルビン酸、Ｌ−乳酸、プトレシン、サルコシン、キ
サンチン、しゅう酸、ピルビン酸、コレステロール、ア
ルコール、尿素、リジン等を測定することが可能であ
る。なお、本発明で用いる酸化酵素膜又は微生物膜は単
一構造のものに限られず、例えばインベルターゼ、ムタ
ロターゼ及びグルコースオキシダーゼを固定化した酸化
酵素を含む複合酵素膜を用いることにより、しょ糖濃度
を測定することが可能となる。

次に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本
発明は下記実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕 まず、下記材料を用いて第１図に示したものと同様の
本発明測定電極を構成した。

酸素電極 ポーラロ式隔膜酸素電極を用いた。

検 知 極：金円板 対 極：銀線 内部電解液:1M KCl ガス透過膜：フッ素化エチレンプロピレン共重合体（厚
さ±25μｍ） 印加電圧 ：検知極側に−0.6V 酸化酵素固定化膜 固定化法：共有結合法 膜材料 ：アセチルセルロース（厚さ60μm,3mmφ） 酸化酵素：グルコースオキシダーゼ又はＬ−グルタミン
酸オキシダーゼ カタラーゼ固定化膜 固定化法及び膜材料：同上 基礎液 0.1Mのリン酸緩衝液（pH6.8） 基 質 グルコース（グルコースオキシダーゼを酸化酵素とし
た場合） Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを
酸化酵素とした場合） 次に、第２図に示すように、基礎液11を注入したセル
12に電極１の検出端を浸漬すると共に、この電極１に定
電圧発生装置13、電流計14及び記録計を連結し、下記に
示す測定を行なった。

測 定 測定電極１を浸漬したセル（10mlのビーカー）12に基
礎液（0.1Mのりん酸緩衝液）11を5ml入れ、マグネティ
ックスターラで撹拌しておく。なお、電極１の酸化酵素
膜８としてはＬ−グルタミン酸オキシダーゼ膜を用い
た。この状態では電極１の出力は約0.8μＡオーダーで
ある。

ここで、0.6％過酸化水素水溶液8.3μを基礎液11に
添加して基礎液11の過酸化水素濃度を1ppmとし、このと
きの電流増加を０〜１μＡフルスケールの電流計で測定
すると第３図（Ａ）のような増加となる。

次に、同様にビーカー12に基礎液11を入れ、0.8μＡ
オーダーの初期電流を確認した後、基礎液11に10％Ｌ−
グルタミン酸ナトリウム水溶液140μＡを添加し、基礎
液11に280mg/のＬ−グルタミン酸ナトリウムが含まれ
るようにする。すると、出力電流は第３図に示すように
0.01μＡオーダーに低下し、安定する。そこで、電流計
のフルスケールを０〜200nAとし、上記と同様に過酸化
水素水溶液を添加して基礎液11の過酸化水素濃度を1ppm
としたところ、第３図（Ｂ）のように出力の変化を大き
く拡大してよむことができた。

また、基礎液11中に予め280mg/のＬ−グルタミン酸
ナトリウムを添加しておくと、出力は第４図に示すよう
に最初から0.01μＡオーダーの低い電流状態となる。そ
こで、電流計のフルスケールを０〜500nAにしておい
て、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを予め添加した基礎液
11に0.6％過酸化水素水溶液を8.3μずつ間欠的に添加
したところ、第４図に示すように基礎液11の過酸化水素
濃度が約1ppmずつ増加するにつれて出力電流が約45nAず
つ安定的に増加することが認められた。

更に、被検液の過酸化水素濃度が低い場合を示す。基
礎液11の条件は上記と同じである。被検液としては0.4,
0.8,1.2,1.6ppmの過酸化水素標準液をそれぞれ用い、こ
れらに１％Ｌ−グルタミン酸ナトリウム水溶液を加えて
各被検液中のＬ−グルタミン酸ナトリウム濃度を基礎液
11と同様に280mg/とする。

次に、基礎液11中での電極１の出力が低値で安定した
ときに電流計のフルスケールを０〜100nAに切り換え、
被検液を基礎液11に加える。この操作を順次各被検液に
ついて行ない、電流増加ピークを測定する。このように
して得た過酸化水素濃度と電流値とによる検量線は第５
図のようになった。

以上の結果より、本発明によれば1ppmレベルの過酸化
水素を簡便かつ安定に測定し得ることが認められ、本発
明は食品中に残留する過酸化水素のチェック等にも十分
適用できることが知見された。また、酸化酵素膜として
グルコースオキシダーゼ、基質としてグルコースを用い
た場合も同様の結果が得られた。

なお、比較のため、酸素電極のガス透過膜上にカタラ
ーゼ膜を直接装着した過酸化水素電極を用い、基礎液中
に不活性ガスをバブリングして測定を行なう方法（特公
昭62−59774号）による結果を第６図に示すが、この方
法は操作が繁雑で実用性に乏しい上、本発明方法に比べ
るとゼロ点が高く、微量過酸化水素の安定な測定が困難
であることが認められる。

〔実施例２〕 実施例１で用いた測定電極、測定装置を用い、下記に
示す測定を行なった。

測 定 過酸化物への酸素電極の応答 0.1Mりん酸緩衝液50ml中に電極１を浸漬し、最終濃度
が100mg/ずつ増えるように過ほう酸ナトリウム溶液を
添加した結果を第７図に示す。飽和溶存酸素濃度レベル
が１μＡ以下（約0.8μＡ）であるのに対して過ほう酸
ナトリウム濃度が増すに応じて出力は増加し、過酸化物
センサーとしての特性を示す。しかもカタラーゼの酵素
活性は通常の酵素と比べても特に強いので、過酸化物に
対する直線性は出力が10〜50μＡオーダーまでのびる。
このことは、例えば酸化酵素にグルコースオキシダーゼ
を用いたグルコース電極としてみた場合、このグルコー
ス電極の上限電流が0.8μＡオーダーから共存する過酸
化物濃度に応じて10〜50μＡオーダーにもち上げられた
ことを意味する。

グルタミン酸濃度への応答 次に、酸化酵素膜にＬ−グルタミン酸オキシダーゼを
用いてＬ−グルタミン酸電極とする。pH7.0のりん酸緩
衝液下でグルタミン酸に対する信号変化は第８図（Ａ）
の如くに20mg/ごとのＬ−グルタミン酸（最終濃度）
の添加によって約0.06μＡずつ変化し、180mg/で電極
の出力は０μＡ近くに至る。従って通常の状態ではこの
Ｌ−グルタミン酸電極の直線性範囲は０〜180mg/とい
うことになる。次に第８図（Ｂ）においてはこのベース
液に過ほう酸ナトリウムを150mg/添加して上限電流を
約２倍にもち上げている。この状態で20mg/ずつＬ−
グルタミン酸を添加してゆくと20mg/当りの感度はや
や増大し、しかも上限電流がひろがっているので、電極
出力が０μＡ程度になるところまでグルタミン酸を添加
することができ、この場合０〜320mg/まで測定範囲を
拡大できることがわかる。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明の測定電極によれば、被
検液中の過酸化物濃度や基質、有機物の濃度を良好に測
定することができる。この場合、本発明の過酸化物濃度
の測定方法によれば、酸化酵素固定化膜又は微生物固定
化膜によって酸素電極の検出端近傍の溶存酵素を除去
し、ベース電流値を安定に低下させることができるた
め、微量の過酸化水素を正確かつ安定に測定することが
できる。更に、本発明の過酸化物濃度の測定方法によれ
ば、従来公知である不活性ガスを基礎液及び被検液にバ
ブリングして溶存酸素のレベルを下げる方法と比べ、特
別のシリンダーガスの準備、操作中の大気からの遮断、
被検液の脱酸素操作等が不要となり、定量の工程、操作
をはるかに簡略化することができる。また、本発明の基
質又は有機物濃度の測定方法によれば、カタラーゼ膜に
よって酸素電極の検出端近傍の酸素量を上昇させ、ベー
ス電流値を任意に上昇させて測定可能範囲を拡大するこ
とができるため、被検液中の基質や有機物の濃度を被検
液の希釈等を行なうことなく広範囲にわたって測定でき
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例に係る測定電極及びその使用
状態を示す断面図、第２図は同電極を用いた測定装置を
示す概略図、第３図及び第４図はそれぞれ同装置で過酸
化水素濃度の測定を行なったときの電極出力の一例を示
すグラフ、第５図は同装置で過酸化水素濃度の測定を行
なったときの検量線の一例を示すグラフ、第６図は従来
法（特公昭62−59774号）で過酸化水素濃度の測定を行
なったときの電極出力の一例を示すグラフ、第７図は第
２図の装置の基礎液中に過ほう酸ナトリウム溶液を添加
したときの電極出力の一例を示すグラフ、第８図は同装
置でＬ−グルタミン酸濃度を測定したときの電極出力の
一例を示すグラフである。 １……過酸化水素電極、３……酸素ガス透過膜 ７……酸素電極、8a……酸化酵素固定化膜 8b……微生物固定化膜、９……カタラーゼ固定化膜 11a,11b……基礎液

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酸素電極の検出端に、基質と反応して酸素
   を消費する酸化酵素を固定化した酸化酵素固定化膜又は
   有機物を資化して酸素を消費する微生物を固定化した微
   生物固定化膜と、カタラーゼ固定化膜とを順次装着して
   なることを特徴とする測定電極。
2. 【請求項２】請求項１記載の測定電極の検出端を該電極
   に設けた酸化酵素固定化膜の酸化酵素と反応する基質又
   は微生物固定化膜の微生物が資化する有機物を含む基礎
   液に浸漬した後、上記基礎液に過酸化物を含む被検液を
   加えて、基礎液に浸漬したときの酸素電極の出力と基礎
   液に被検液を加えたときの酸素電極の出力との差から被
   検液中の過酸化物濃度を検出するようにしたことを特徴
   とする過酸化物濃度の測定方法。
3. 【請求項３】請求項１記載の測定電極の検出端を過酸化
   物を含む基礎液に浸漬した後、この基礎液に上記測定電
   極に設けた酸化酵素固定化膜の酸化酵素と反応する基質
   又は微生物固定化膜の微生物が資化する有機物を含む被
   検液を加えて、基礎液に浸漬したときの酸素電極の出力
   と基礎液に被検液を加えたときの酸素電極の出力との差
   から被検液中の上記基質又は有機物の濃度を検出するよ
   うにしたことを特徴とする基質又は有機物濃度の測定方
   法。