JPH0429925A

JPH0429925A - リポソームの製法

Info

Publication number: JPH0429925A
Application number: JP2135395A
Authority: JP
Inventors: Yoshitaka Ogata; 嘉貴緒方
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1990-05-28
Filing date: 1990-05-28
Publication date: 1992-01-31
Anticipated expiration: 2011-01-17
Also published as: JPH082780B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］本発明は、医薬品あるいはその担体として利用されるリ
ポソームの製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、薬剤を内包するリポソーム
の懸濁液を無菌的に製造する方法に関する。［従来の技術および課題フリポソームを水溶性の薬剤の担体として利用する試みが
広く行われている。（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ　ｅＬａ
ｌ、、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、４４６，
３１９（１９８５））。また、リポソームの内水相に酸素運搬体であるヘモグロ
ビンを内包させ、リポソームを人工の赤血球として利用
する試みも行われている（特開昭６２−１７８５２１号
公報）。これらの試みにおいて、リポソームを薬剤の担
体として使用するにあたり、薬剤を内包するリポソーム
の懸濁液を無菌的に製造することは必須の用件である。リポソーム懸濁液を製造するにあたっては、リポソーム
を形成する脂質を均一に混合する工程、および得られた
脂質混合物を水和させる工程を必要とするが、従来、こ
れらの操作は全て開放系で行われていたため、菌の混入
が避けられないものであった。このため、リポソーム懸
濁液を滅菌することを目的として、薬剤に多量の抗生物
質を添加したり、リポソーム懸濁液をフィルター（０゜
２μｍ程度）を用いて濾過滅菌する方法等がとられてい
た。しかしながら、薬剤に抗生物質を多量に添加する方
法においては、リポソーム懸濁液への抗生物質の残留、
あるいはこのようなリポソームを生体に投与した際の生
体に対する悪影響等が危惧されるものであった。また、
リポソーム懸濁液をフィルターを用いて濾過滅菌する方
法では、リポソームがフィルターを通過できるようにリ
ポソームの内径を非常に小さくしなけれはならず、この
ため薬剤のカプセル化効率（リポソームに内包された薬
剤重量に対するリポソーム形成脂質重量の割合で、この
カプセル効率が低いと、単位型量あたりの薬剤を投与す
るのに必要な脂質量が増加し、リポソーム懸濁液の粘性
が上昇するため、安全性において不利である。）が低く
なってしまうという問題があった。また、濾過滅菌によ
る方法においては、リポソームと同等またはそれ以下の
径を有する菌は除去できないという問題があり、安全性
の面から好ましい方法であるとはいえなかった。さらに
は、濾過滅菌による方法は、リポソーム懸濁液を無菌的
に製造するものではなく、あくまで製造されたリポソー
ム懸濁液から除菌するものであるから、リポソームの製
造工程初期に菌が混入した場合には、菌の代謝産物が原
因となる発熱性物質の現出が避けられない等の問題を有
するものであった。また、開放系においてリポソーム形成脂質混合物を水和
させる方法では、処理温度を高温に維持することが難し
いため、水和か不十分であり、このため得られたリポソ
ームが不均一になってしまうという問題があった。［発明が解決しようとする課題］本発明に係るリポソームの製法は、上記の課題を解決す
るもので、リポソームを形成する脂質混合物を十分に水
和させることができ、しかも生体に対して危険性を有す
る物質を使用することなくリポソーム懸濁液を無菌的に
製造することを目的とする。［課題を解決するための手段］上記の課題を解決するため、本発明に係るリポソームの
製法は以下の点を特徴とするものである。（１）密閉系を維持可能な容器内にリポソーム形成脂質
と水とを投入して高圧蒸気滅菌する工程を含むこと特徴
とするリポソームの製法。（２）リポソーム形成脂質に対する水の添加比率が、１
：０．２〜５重量部である前記（１）記載のリポソーム
の製法。（３）前記高圧蒸気滅菌の処理条件は、処理温度Ｉ１５
°Ｃ〜１２６℃、処理時間が１５分〜３０分である前記
（１）または（２）に記載のリポソームの製法。（４）密閉系を維持可能な撹拌容器内にリポソーム形成
脂質と水とを投入して高圧蒸気滅菌し、滅菌された脂質
に薬剤を添加し、次いで当該撹拌容器を用いて内容物を
高速撹拌することにより懸濁処理を行うものである前記
（１）ないしく３）のいずれかに記載のリポソームの製
法。（５）前記薬剤がヘモグロビンである前記（４）記載の
リポソームの製法。本発明において、リポソームに内包される薬剤は、水溶
性のものであれば特に制限はないが、１ｎｖｉｔｒｏま
たはｉｎ　ｖｉｖｏで不安定なもの、体内で徐々に放出
され、あるいは特定の臓器に速やかに分布することが所
望されているものが好適に使用されうる。具体的な例と
しては、ヘモグロビン、インシュリン、ヘパリン、ウロ
キナーゼ、ユビデヵノン、メトトレキセートン、ネオマ
イシン、プレオマイシン、テトラサイクリン、チトクロ
ムｃ１アスパラギナーゼ、シチシンアラビノシド、ログ
ルクロンダーゼ、ヘキソサミンダーゼ、アミノグルコシ
ダーゼ等があげられる。特に薬剤がヘモグロビンである場合には、赤血球を常法
に従い無菌的に洗浄・溶血し、ストローマを除去した後
、分画分子量５万の膜を使用した限外濾過により濃縮し
たものが使用され、その濃度は２５％〜５０％が好まし
い。より好ましくは、４０％〜５０％である。また、このような薬剤のリポソーム懸濁液中の濃度は、
リポソームの用途に応して適宜決定すれはよい。本発明におけるリポソーム形成脂質は特に制限はなく、
リポソームを形成するものであれは天然または合成の脂
質が使用可能である。特にリン脂質か好適に使用され、
その例としては、レシチン、ホスファチジルエタノール
アミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルイノシト−ル、ホ
スファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、カル
シオリピンおよびこれらを常法に従って水素添加したも
のがあげられ、これらを組み合わせて用いることもでき
る。さらにリポソーム形成脂質には、所望により、添加剤と
して、ステロール等の膜構造強化剤、電荷付与物質（例
えば、ホスファチジン酸、ジセチルホスフェートまたは
ステアリン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、リノール酸
、リルン酸等の高級脂肪酸等）、さらにはビタミンＥ等
の抗酸化剤を添加することができる。以下、本発明のリポソームの製造方法を説明する。すなわち、リポソーム形成脂質に所望により前述のよう
な添加剤を添加した粉末状のリポソーム形成脂質混合物
と水とを、密閉系を維持可能な容器内に投入し、加圧加
熱（オートクレーブ）滅菌処理を施すことにより、脂質
混合物の滅菌を行う。このオートクレーブ滅菌処理は、１１５〜１２６°Ｃで
１５〜３０分程度行うことが好ましい。この加圧加熱滅
菌処理を施すことによって、脂質混合物と水とが１１５
〜１２６°Ｃの高温下に保たれるために、該脂質混合物
を十分に水和させることが可能になるものである。ここ
で、リポソーム形成脂質混合物に対する水の添加比率は
、リポソーム形成脂質混合物を十分に滅菌・水和させる
ことが可能ならば特に限定されるものではないが、ｌ：
０．２〜５重量部が好適である。リポソーム形成脂質混合物に滅菌・水和処理を施した後
は、滅菌された脂質混合物に薬剤を添加し、続いて、超
音波照射法、フレンチプレス法、高速撹拌法等の公知の
懸濁処理を施すことにより、薬剤の内包されたリポソー
ム懸濁液を製造することができる。なお、薬剤として、
熱により変成しやすい物質を使用する場合には、オート
クレーブ滅菌された脂質を室温程度まて冷却した後に、
当該脂質に薬剤を添加することが望ましい。ここで、リポソーム懸濁液の無菌状態を確実に維持する
ためには、リポソーム形成脂質混合物の滅菌・水利処理
を行った密閉容器を用いて、当該容器内に薬剤を投入し
、密閉系を維持したまま懸濁処理を行うことが最も望ま
しい。従って、最も好ましい態様は、密閉系を維持可能
な撹拌容器を用いて、該容器内に脂質混合物と水とを投
入してオートクレーブ滅菌処理し、滅菌された脂質に薬
剤を添加し、密閉系を維持したまま内容物を撹拌するこ
とにより、リポソーム懸濁液を形成することである。このような撹拌容器としては、一般には撹拌型細胞破砕
機として知られる、密閉容器内て高速に（１０，００Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ以上）カッター様の撹拌羽を回転させること
で当該密閉容器内の細胞浮遊液を撹拌し、細胞を破壊す
る目的に使用される機械を用いることができる。この撹
拌型細胞破砕機としては、例えば、ワーリング社製：商
品名ワーリングブレンダーをあげることができる。また、この撹拌処理は、５，０００〜３０，０００ｒ、
ｐ、ｍで、１−１０分間程度の処理を、５〜２０回程度
繰り返して行うことが好ましい。しかしながら、リポソーム形成脂質混合物の無菌状態を
維持したまま懸濁処理を行えるものであれば、他の方法
によってもリポソーム懸濁液を形成することができる。かくして得られるリポソーム懸濁液は、常法に従って洗
浄され、例えば５〜ｌＯ万Ｇ程度の超遠心処理等によっ
て精製・採取される。次に実施例および比較例を示して本発明をさらに詳細に
説明する。

【実施例】

水素添加大豆レシチン２０ｇ、コレステロール１０ｇ、
ミリスチン酸２．５ｇの脂質混合物と、これと等量の純
水とを高速撹拌機（ワーリングブレンター：ワーリング
社製）に投入し、オートクレーブ滅菌処理した。処理条
件は、１２１’０，２０分間とした。オー１へクレープ
滅菌された脂質混合物を室温まで冷却した後、５０重量
％ヘモグロビン溶液（無菌）２００ｍｏ、を加え、前記
と同様の高速撹拌機を用いて密閉系を維持したまま１４
０００ｒ、ｐ、ｍで３分間の処理を１０回繰り返した。得られた処理液に、１，０００ｍｆｆの生理食塩水を加
え、６０，０ＯＯＧの遠心加速度で遠心処理を３回行い
、得られたリポソームのペレットに１　０００ｍ１２の
生理食塩水を加え、リポソームを再浮遊させた。このリ
ポソーム浮遊液を、０．４μｍのフィルター（ミリポア
社製）により濾過し、濾液を限外濾過により濃縮し、無
菌状態か維持されたヘモグロビン濃度５重量％のヘモグ
ロビン内包リポソーム３９０ｍ４を得た。本実施例にお
けるヘモグロビン回収率は１９．５％であった。なお器
具類はすべて滅菌後使用した。【比較例〕開放容器に、実施例と同様の脂質混合物と、該脂質混合
物と等量の純水とを投入し、７０°Ｃにて６０分間保持
し、脂質混合物の水利処理を行った。その後、実施例と同様の方法でリポソームを形成し、ヘ
モグロビン洗浄を行った。このリポソーム懸濁液を、実
施例と同様に０，４５μｍ７（ルタ（ミリボア社製）に
より濾過を行ったところ、フィルターの目詰まりが激し
く、ヘモグロビン濃度５重量％のヘモグロビン内包リポ
ソームを２００ｍｇしか得ることができなかった。また
、ヘモグロビンの収率は１０％であった。なお、器具類
はすべて滅菌後使用した。実施例と比較例において調整した高速撹拌処理液を光学
顕微鏡により観察したところ、比較例において調整した
処理液には、フィルターに通らないような粗大な粒子、
特にコレステロールと推察される板状結晶が多く存在し
、これがフィルターを目詰まりさせ、ヘモグロビンの収
率を悪化させていることが判明した。これに対し、実施
例において調整した処理液には、粗大な粒子は存在しな
かった。これは、実施例においては、オートクレーブ処
理することにより脂質混合物が十分に水和したのに対し
、比較例においては水利が不十分であるためである。ま
た、実施例において調整したリポソーム懸濁液中には、
菌が全く存在しなかったのに対し、比較例において調整
したリポソーム懸濁液中には、ｌｃｃ当たり５０個程度
の菌が存在していた。［発明の効果１以上、詳述したように、本発明に係るリボツムの製法は
、密閉系を維持可能な容器内にリポソーム形成脂質と水
とを投入して高圧蒸気滅菌する工程を含むこと特徴し、
このため粗大な粒子が存在することのないリポソーム懸
濁液を無菌的に提供することができる。また、本発明に係るリポソームの製法は、密閉系を維持
可能な撹拌容器内にリポソーム形成脂質と水とを投入し
て高圧蒸気滅菌し、滅菌された脂質に薬剤を添加し、次
いで内容物を高速撹拌することにより懸濁処理を行うも
のであるから、より確実に粗大な粒子が存在することの
ないリボツム懸濁液を無菌的に提供することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）密閉系を維持可能な容器内にリポソーム形成脂質
と水とを投入して高圧蒸気滅菌する工程を含むこと特徴
とするリポソームの製法。
（２）リポソーム形成脂質に対する水の添加比率が、１
：０．２〜５重量部である請求項１記載のリポソームの
製法。
（３）前記高圧蒸気滅菌の処理条件は、処理温度１１５
℃〜１２６℃、処理時間が１５分〜３０分である請求項
１または２に記載のリポソームの製法。
（４）密閉系を維持可能な撹拌容器内にリポソーム形成
脂質と水とを投入して高圧蒸気滅菌し、滅菌された脂質
に薬剤を添加し、次いで当該撹拌容器を用いて内容物を
高速撹拌することにより懸濁処理を行うものである請求
項１ないし３のいずれかに記載のリポソームの製法。
（５）前記薬剤がヘモグロビンである請求項４記載のリ
ポソームの製法。