JPH0421627A - リポソームの精製方法 - Google Patents
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- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
[産業上の利用分野]
本発明は、医薬品あるいはその担体等として利用される
リポソームの精製方法に関する。 さらに詳しくは、本発明は、リポソーム製造過程におい
て、該リポソームに保持されなかった薬剤を効率よく分
離・除去し、薬剤を内包するリポソームを精製する方法
に関する。 [従来の技術および課題] リポソームを水溶性の薬剤の担体として利用する試みが
広く行われてし)る。(Gregoriadis et
al、、Ann、N、Y、Acad、Sci、、446
.319(1985))。 また、リポソームの内水相に酸素運搬体であるヘモグロ
ビンを内包させ、リポソームを人工の赤血球として利用
する試みも行われている(特開昭62−178521号
公報)。これらの試みにおいて、リポソームを薬剤の担
体として使用するにあたり、薬剤の水溶液中において内
水相に薬剤を内包するIJ態におき、その後リポソーム
に内包されなかった薬剤を分離・除去する必要がある。 従来、リポソームに内包されなかった薬剤を分離するた
めには、リポソーム懸濁液を遠心処理して薬剤を内包す
るリポソームを沈降させ、リポソームに取り込まれなか
った薬剤を分離・除去するかあるいは限外濾過により薬
剤を内包するリポソームを濃縮・精製する等の手法がと
られてきた。しかしながら、遠心処理を用いた方法では
、リポソームを完全に沈降させるためには5万〜lO万
G程度の非常に強い遠心加速度が必要であり、製造工程
上のスケールアップが困難であった。また、限外濾過を
用いた方法では、リポソームに内包させる薬剤の分子量
が大きい場合には精製効率が悪く、また滅菌が困難であ
ること等の点から工業的生産には適していなかった。 [発明が解決しようとする課題] 従って、本発明は、薬剤を内包するリポソームを精製す
る過程において、リポソームに内包されなかった薬剤を
分離・除去するにあたり、スケールアップが容易で、し
かも精製効率の良好なリポソームの精製方法を提供する
ことを目的とする。 [課題を解決するだめの手段] 上記の課題を解決するため、本発明は、以下の構成を有
する。 (1)薬剤を内包するリポソームと、該リポソームに取
り込まれなかった遊離の薬剤とを含有するリポソーム懸
濁液に、該リポソームを凝集させ得る物質を添加してリ
ポソームを凝集させた後、凝集したリポソームを沈降さ
せ、上清成分を分離・除去し、沈降したリポソームを溶
媒に希釈して分散させることを特徴とするリポソームの
精製方法。 (2)リポソームを凝集させ得る物質が、デキストラン
またはヒドロキシエチルスターチである前記(1)記載
のリポソームの精製方法。 (3)前記物質の平均分子量が1万〜20万である前記
(2)記載のリポソームの精製方法。 (4)リポソームを凝集させ得る物質が、平均分子量3
万〜4万のヒドロキシエチルスターチである前記(1)
記載のリポソームの精製方法。 (5)薬剤がヘモグロビンである前記(1)ないしく4
)のいずれかに記載のリポソームの精製方法。 本発明において、リポソームに内包される薬剤は、水溶
性のものであれば特に制限はないか、1nvitroま
たはin vivoで不安定なもの、体内で徐々に放出
され、あるいは特定の臓器に速やかに分布することか所
望されているものが好適に使用されうる。具体的な例と
しては、ヘモグロビン、インンユリン、ヘパリン、ウロ
キナーゼ、ユビデカノン、メトトレキセートン、ネオマ
インン、プレオマイVン、テトラサイクリン、チトクロ
ムC1アスパラギナーゼ、シチシンアラビノシド、Ωグ
ルクロンダーゼ、ヘキソサミンダーゼ、アミノグルコン
ダーゼ等があげられる。 このような薬剤の濃度は、リポソームの用途に応じて適
宜決定すればよい。 本発明におけるリポソーム形成脂質は特に制限はなく、
リポソームを形成するものであれば天然または合成の脂
質が使用可能である。特にリン脂質が好適に使用され、
その例としては、レシチン、ホスファチジルエタノール
アミン、ホスファチジン酸、ホス7アチジルコリン、ホ
スファチジルセリン、ホス7アチジルイノシトール、ホ
ス7アチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、カル
シオリピンおよびこれらを常法に従って水素添加したも
のがあげられ、これらを組み合わせて用いることもでき
る。 さらにリポソーム形成脂質には、所望によりステロール
等の膜構造強化剤、電荷付与物質(例えば、ホスファチ
ジン酸、ジセチルホス7エートまたはステアリン酸、オ
レイン酸、ミリスチン酸、リノール酸、リルン酸等の高
級脂肪酸等)、さらにはビタミンE等の抗酸化剤を添加
することができる。 薬剤を内包するリポソームの懸濁液を得るには、上述の
リポソーム形成脂質に所望により前述のような膜構造強
化剤等を添加・混合し、混合物をクロロホルム、エーテ
ル等の適当な有機溶媒に溶解し、得られた溶液からエバ
ポレーンヨン等の手法により有機溶媒を除去し、脂質膜
を形成する。得られた脂質膜に薬剤の水溶液を加えて混
合し、混合物に7レンチプレス、超音波照射あるいは高
速撹拌等の公知の処理を施すことにより、薬剤を内包す
るリポソームの懸濁液を得ることができる。 得られたリポソーム懸濁液には、リポソームを凝集させ
得る物質(リポソーム凝集剤)を添加する。このような
リポソーム凝集剤としては、マンナン、マンニトール等
の多糖類、アルブミン、グロブリン等の蛋白質、あるい
はアカシアゴム、修飾ゼラチン、ポリビニルピロリドン
、デキストラン、ポリエチレングリコール、カルボキシ
メチルセルロース、ヒドロキシエチルスターチ等の水溶
性高分子化合物があげられ、特に、デキストラン、ヒド
ロキシエチルスターチが好適に使用される。 ここで、リポソーム凝集剤としてデキストランを使用す
る場合には、その平均分子量は1万〜20万が好ましく
、より好ましくは3万〜lO万である。このような範囲
に設定することにより、懸濁液中のリポソームが十分に
凝集し、よってリポソームの沈降処理が効率良く行える
。 マタ、ヒドロキシエチルスターチを使用する場合には、
その平均分子量は1万〜20万が好ましく、より好まし
くは3万〜4万である。このような範囲に設定すること
により、懸濁液中のリポソームが十分に凝集し、よって
リポソームの沈降処理が効率良く行える。またその置換
度は、0.1〜11より好ましくは0.5〜0.6であ
る。特に、平均分子量3万〜4万のヒドロキシエチルス
ターチを使用した場合には、粒径の小さなリポソーム(
5nm=15nm)は沈降せず、遊離の薬剤とともに上
清成分として分離・除去される。従って、回収すべきリ
ポソームの粒径の分布をより狭めることができる。この
ような粒径の小さなリポソームは、薬剤のカプセル化効
率が低く、しかも膜構造が不安定なために融合して巨大
なリポソームを形成しやすい。従って、このような粒径
の小さなリポソームを分離・除去することにより、より
安全性を高めることができる。 リポソーム懸濁液中のリポソーム凝集剤の濃度は、1%
〜20重量%が好ましい。より好ましくは3%〜20%
である。このような範囲に設定することにより、懸濁液
中のリポソームが十分に凝集し、よってリポソームの沈
降処理が効率良く行える。 上述のような操作でリポソームを凝集させた後は、リポ
ソーム懸濁液に遠心処理を施すことにより凝集したリポ
ソームを沈降させ、上溝をデカンテーシヨン等の方法に
て分離・除去する。この場合の遠心処理1こおいては、
従来のように遠心加速度50,000〜100,0OO
G程度の強力な遠心処理を施す必要はなく、50,0O
OG未満、好ましくは15.000G以下の緩やかな遠
心処理を施してやれば十分である。また、遠心処理に比
べると、処理時間が延長されるが、自然沈降によっても
十分法こりボソームを沈降させることができる。なお、
この分離・除去処理は2回〜4回繰り返して行うことが
好ましい。その後、沈降したギソー/l−,+揮会嶺★
尊の謙惠か分117蒼蜆して分散することでリポソーム
凝集は消失する。 この場合、リポソームの再凝集を防止するために、分散
媒中のリポソーム凝集剤の濃度は0.5%以下に調整す
ることが好ましい。 なお、特に薬剤としてヘモグロビンを用いる場合には、
赤血球を常法に従い洗浄、溶血し、ストローマを除去し
た後、分画分子量5万の膜を使用した限外濾過により濃
縮したものが使用され、その濃度は25%〜50%が好
ましい。より好ましくは、40%〜50%である。 次に実施例および比較例を示して本発明をさらに詳細に
説明する。
リポソームの精製方法に関する。 さらに詳しくは、本発明は、リポソーム製造過程におい
て、該リポソームに保持されなかった薬剤を効率よく分
離・除去し、薬剤を内包するリポソームを精製する方法
に関する。 [従来の技術および課題] リポソームを水溶性の薬剤の担体として利用する試みが
広く行われてし)る。(Gregoriadis et
al、、Ann、N、Y、Acad、Sci、、446
.319(1985))。 また、リポソームの内水相に酸素運搬体であるヘモグロ
ビンを内包させ、リポソームを人工の赤血球として利用
する試みも行われている(特開昭62−178521号
公報)。これらの試みにおいて、リポソームを薬剤の担
体として使用するにあたり、薬剤の水溶液中において内
水相に薬剤を内包するIJ態におき、その後リポソーム
に内包されなかった薬剤を分離・除去する必要がある。 従来、リポソームに内包されなかった薬剤を分離するた
めには、リポソーム懸濁液を遠心処理して薬剤を内包す
るリポソームを沈降させ、リポソームに取り込まれなか
った薬剤を分離・除去するかあるいは限外濾過により薬
剤を内包するリポソームを濃縮・精製する等の手法がと
られてきた。しかしながら、遠心処理を用いた方法では
、リポソームを完全に沈降させるためには5万〜lO万
G程度の非常に強い遠心加速度が必要であり、製造工程
上のスケールアップが困難であった。また、限外濾過を
用いた方法では、リポソームに内包させる薬剤の分子量
が大きい場合には精製効率が悪く、また滅菌が困難であ
ること等の点から工業的生産には適していなかった。 [発明が解決しようとする課題] 従って、本発明は、薬剤を内包するリポソームを精製す
る過程において、リポソームに内包されなかった薬剤を
分離・除去するにあたり、スケールアップが容易で、し
かも精製効率の良好なリポソームの精製方法を提供する
ことを目的とする。 [課題を解決するだめの手段] 上記の課題を解決するため、本発明は、以下の構成を有
する。 (1)薬剤を内包するリポソームと、該リポソームに取
り込まれなかった遊離の薬剤とを含有するリポソーム懸
濁液に、該リポソームを凝集させ得る物質を添加してリ
ポソームを凝集させた後、凝集したリポソームを沈降さ
せ、上清成分を分離・除去し、沈降したリポソームを溶
媒に希釈して分散させることを特徴とするリポソームの
精製方法。 (2)リポソームを凝集させ得る物質が、デキストラン
またはヒドロキシエチルスターチである前記(1)記載
のリポソームの精製方法。 (3)前記物質の平均分子量が1万〜20万である前記
(2)記載のリポソームの精製方法。 (4)リポソームを凝集させ得る物質が、平均分子量3
万〜4万のヒドロキシエチルスターチである前記(1)
記載のリポソームの精製方法。 (5)薬剤がヘモグロビンである前記(1)ないしく4
)のいずれかに記載のリポソームの精製方法。 本発明において、リポソームに内包される薬剤は、水溶
性のものであれば特に制限はないか、1nvitroま
たはin vivoで不安定なもの、体内で徐々に放出
され、あるいは特定の臓器に速やかに分布することか所
望されているものが好適に使用されうる。具体的な例と
しては、ヘモグロビン、インンユリン、ヘパリン、ウロ
キナーゼ、ユビデカノン、メトトレキセートン、ネオマ
インン、プレオマイVン、テトラサイクリン、チトクロ
ムC1アスパラギナーゼ、シチシンアラビノシド、Ωグ
ルクロンダーゼ、ヘキソサミンダーゼ、アミノグルコン
ダーゼ等があげられる。 このような薬剤の濃度は、リポソームの用途に応じて適
宜決定すればよい。 本発明におけるリポソーム形成脂質は特に制限はなく、
リポソームを形成するものであれば天然または合成の脂
質が使用可能である。特にリン脂質が好適に使用され、
その例としては、レシチン、ホスファチジルエタノール
アミン、ホスファチジン酸、ホス7アチジルコリン、ホ
スファチジルセリン、ホス7アチジルイノシトール、ホ
ス7アチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、カル
シオリピンおよびこれらを常法に従って水素添加したも
のがあげられ、これらを組み合わせて用いることもでき
る。 さらにリポソーム形成脂質には、所望によりステロール
等の膜構造強化剤、電荷付与物質(例えば、ホスファチ
ジン酸、ジセチルホス7エートまたはステアリン酸、オ
レイン酸、ミリスチン酸、リノール酸、リルン酸等の高
級脂肪酸等)、さらにはビタミンE等の抗酸化剤を添加
することができる。 薬剤を内包するリポソームの懸濁液を得るには、上述の
リポソーム形成脂質に所望により前述のような膜構造強
化剤等を添加・混合し、混合物をクロロホルム、エーテ
ル等の適当な有機溶媒に溶解し、得られた溶液からエバ
ポレーンヨン等の手法により有機溶媒を除去し、脂質膜
を形成する。得られた脂質膜に薬剤の水溶液を加えて混
合し、混合物に7レンチプレス、超音波照射あるいは高
速撹拌等の公知の処理を施すことにより、薬剤を内包す
るリポソームの懸濁液を得ることができる。 得られたリポソーム懸濁液には、リポソームを凝集させ
得る物質(リポソーム凝集剤)を添加する。このような
リポソーム凝集剤としては、マンナン、マンニトール等
の多糖類、アルブミン、グロブリン等の蛋白質、あるい
はアカシアゴム、修飾ゼラチン、ポリビニルピロリドン
、デキストラン、ポリエチレングリコール、カルボキシ
メチルセルロース、ヒドロキシエチルスターチ等の水溶
性高分子化合物があげられ、特に、デキストラン、ヒド
ロキシエチルスターチが好適に使用される。 ここで、リポソーム凝集剤としてデキストランを使用す
る場合には、その平均分子量は1万〜20万が好ましく
、より好ましくは3万〜lO万である。このような範囲
に設定することにより、懸濁液中のリポソームが十分に
凝集し、よってリポソームの沈降処理が効率良く行える
。 マタ、ヒドロキシエチルスターチを使用する場合には、
その平均分子量は1万〜20万が好ましく、より好まし
くは3万〜4万である。このような範囲に設定すること
により、懸濁液中のリポソームが十分に凝集し、よって
リポソームの沈降処理が効率良く行える。またその置換
度は、0.1〜11より好ましくは0.5〜0.6であ
る。特に、平均分子量3万〜4万のヒドロキシエチルス
ターチを使用した場合には、粒径の小さなリポソーム(
5nm=15nm)は沈降せず、遊離の薬剤とともに上
清成分として分離・除去される。従って、回収すべきリ
ポソームの粒径の分布をより狭めることができる。この
ような粒径の小さなリポソームは、薬剤のカプセル化効
率が低く、しかも膜構造が不安定なために融合して巨大
なリポソームを形成しやすい。従って、このような粒径
の小さなリポソームを分離・除去することにより、より
安全性を高めることができる。 リポソーム懸濁液中のリポソーム凝集剤の濃度は、1%
〜20重量%が好ましい。より好ましくは3%〜20%
である。このような範囲に設定することにより、懸濁液
中のリポソームが十分に凝集し、よってリポソームの沈
降処理が効率良く行える。 上述のような操作でリポソームを凝集させた後は、リポ
ソーム懸濁液に遠心処理を施すことにより凝集したリポ
ソームを沈降させ、上溝をデカンテーシヨン等の方法に
て分離・除去する。この場合の遠心処理1こおいては、
従来のように遠心加速度50,000〜100,0OO
G程度の強力な遠心処理を施す必要はなく、50,0O
OG未満、好ましくは15.000G以下の緩やかな遠
心処理を施してやれば十分である。また、遠心処理に比
べると、処理時間が延長されるが、自然沈降によっても
十分法こりボソームを沈降させることができる。なお、
この分離・除去処理は2回〜4回繰り返して行うことが
好ましい。その後、沈降したギソー/l−,+揮会嶺★
尊の謙惠か分117蒼蜆して分散することでリポソーム
凝集は消失する。 この場合、リポソームの再凝集を防止するために、分散
媒中のリポソーム凝集剤の濃度は0.5%以下に調整す
ることが好ましい。 なお、特に薬剤としてヘモグロビンを用いる場合には、
赤血球を常法に従い洗浄、溶血し、ストローマを除去し
た後、分画分子量5万の膜を使用した限外濾過により濃
縮したものが使用され、その濃度は25%〜50%が好
ましい。より好ましくは、40%〜50%である。 次に実施例および比較例を示して本発明をさらに詳細に
説明する。
水素添加大豆レシチン20g、コレステロール10g1
ミリスチンjl!2.5gをジクロロメタン100m
<7に溶解し、エバボレー/:lンによりジクロロメタ
ンを除去した。得られた脂質混合物Jこ50重量%ヘモ
グロビン水溶液200m12を加え、ワーリング社製)
にて14.00Orpmで3分間の撹拌処理を10回繰
り返した。得られた処理液に、1.ooomffの6%
重量ヒトaキ7エチルスターチ加生理食塩水(平均分子
量40,000、置換度0,50〜0.55)を加え、
12,000Gの遠心加速度で30分間遠心した。遠心
後デカンテーションにより上清成分を分離・除去し、こ
れに先はどと同量のヒドロキンエチルスターチ加生理食
塩水を加えてリポソームを再浮遊させた後同様の条件で
遠心した。この処理を3回繰り返した後、得られI;リ
ポソーム沈澱物に生理食塩水を1.000m(2加え希
釈し分散させた。このリポソーム懸濁液を0.45μm
のフィルターCミリポア社製)Jこより濾過し、濾液を
限外濾過により濃縮し、ヘモグロビン濃度5重量%のヘ
モグロビン内包リポソーム400mQを得た。この濃縮
液中のヒドロキシエチルスターチ濃度は0.2重量%で
あった。また、濃縮液中に存在するヘモグロビン内包リ
ポソームの平均粒径を動的光散乱粒径測定装置(火爆電
子製)により求めたところ210nmであり、リポソー
ムに内包されていない遊離のヘモグロビンは1重量%以
下であった。また電子顕微鏡写真Iこより測定したヘモ
グロビン内包リポソームの粒径分布を第1図に示す・
ミリスチンjl!2.5gをジクロロメタン100m
<7に溶解し、エバボレー/:lンによりジクロロメタ
ンを除去した。得られた脂質混合物Jこ50重量%ヘモ
グロビン水溶液200m12を加え、ワーリング社製)
にて14.00Orpmで3分間の撹拌処理を10回繰
り返した。得られた処理液に、1.ooomffの6%
重量ヒトaキ7エチルスターチ加生理食塩水(平均分子
量40,000、置換度0,50〜0.55)を加え、
12,000Gの遠心加速度で30分間遠心した。遠心
後デカンテーションにより上清成分を分離・除去し、こ
れに先はどと同量のヒドロキンエチルスターチ加生理食
塩水を加えてリポソームを再浮遊させた後同様の条件で
遠心した。この処理を3回繰り返した後、得られI;リ
ポソーム沈澱物に生理食塩水を1.000m(2加え希
釈し分散させた。このリポソーム懸濁液を0.45μm
のフィルターCミリポア社製)Jこより濾過し、濾液を
限外濾過により濃縮し、ヘモグロビン濃度5重量%のヘ
モグロビン内包リポソーム400mQを得た。この濃縮
液中のヒドロキシエチルスターチ濃度は0.2重量%で
あった。また、濃縮液中に存在するヘモグロビン内包リ
ポソームの平均粒径を動的光散乱粒径測定装置(火爆電
子製)により求めたところ210nmであり、リポソー
ムに内包されていない遊離のヘモグロビンは1重量%以
下であった。また電子顕微鏡写真Iこより測定したヘモ
グロビン内包リポソームの粒径分布を第1図に示す・
実施例と同様の方法により得られた処理液に、1.00
0m12の生理食塩水を加え、分画分子量IO万の限外
濾過膜を用いて限外濾過を行った。処理液が約300m
Qとなったところで、さらにl。 000m(2の生理食塩水を加えるという方法を10回
繰り返し、遊離のヘモグロビンを分離・除去した。この
リポソーム懸濁液を実施例と同様の方法で濾過・濃縮し
、ヘモグロビン濃度5重量%のヘモグロビン内包リポソ
ーム450 mQヲ?1+f:。 この濃縮液中のへモグロヒン内包リポソームの平均粒径
は190nm、遊離のヘモグロビンは5重量%であった
。また実施例と同様に電子M微鏡により測定した粒径分
布を第1図に示す。 第1図にて明らかなように、実施例において調整したヘ
モグロビン内包リポソームは、比較例において調整した
リポソームより粒径の小さなリポソーム(5〜15nm
)の含有量が少なく、より狭い粒径分布を示した。 また、実施例および比較例において調整したヘモグロビ
ン内包リポソームを4°Cにて1ケ月間保存した後、光
学顕微鏡により観察したところ、実施例において調整し
たヘモグロビン内包リポソームでは、調整直後とほとん
ど変化が観察されなかったのに対し、比較例において調
整したヘモグロビン内包リポソームでは、粒径の小さい
不安定なリポソームが融合して生成したと考えられる1
μ以上の巨大なリポソームか多数観察された。これらの
巨大なリポソームは、生体に投与した際lこ、抹消の毛
細血管で栓塞することが考えられ、安全性において問題
がある。また、実施例において遠心分離を使用せず、ヘ
モグロビン内包リポソームを自然沈降させた場合、沈降
には6〜8時間の時間かかかり、さらに沈降・再浮遊処
理を5〜6回程度繰り返す必要かあったか、得られたヘ
モグロビ等変化かなかった。また、実施例においてヒド
ロキノエチルスターチをデキストラン(平均分子量70
.000)に代える以外は同様にしてリボツムの精製を
行ったきころ実施例よりやや広い粒径分布を示したが、
巨大なリポソームは観察されなかった。さらに、実施例
においてヒドロキノエチルスターチをマンナン、アルブ
ミンに代える以外は同様にしてリポソームの精製を行っ
たところ、いずれの場合もデキストランを用いた場合と
ほぼ同様の結果を示した。 [発明の効果] 以上、詳述したように、本発明に係るリポソームの精製
方法によれは、リポソーム懸濁液に、該リポソームを凝
集させ得る物質を添加してリポソームを凝集させた後に
、凝集したリポソームを沈降させるt:めに、この沈降
処理に際して、従来のような強力な遠心処理を必要とせ
ず、自然沈降させるか、あるいは緩やかな遠心処理を施
すことによって、リポソームを沈降させることができる
。 ある。 また、本発明のリポソームの精製方法によれば、リポソ
ームを凝集させ得る物質が、平均分子量3〜4万のヒド
ロキシエチルスターチであるので、遊離の薬剤とともに
、構造的lこ不安定であって融合しゃすい粒径の小さな
リポソームを分離・除去することができるため、安全性
において優れている。
0m12の生理食塩水を加え、分画分子量IO万の限外
濾過膜を用いて限外濾過を行った。処理液が約300m
Qとなったところで、さらにl。 000m(2の生理食塩水を加えるという方法を10回
繰り返し、遊離のヘモグロビンを分離・除去した。この
リポソーム懸濁液を実施例と同様の方法で濾過・濃縮し
、ヘモグロビン濃度5重量%のヘモグロビン内包リポソ
ーム450 mQヲ?1+f:。 この濃縮液中のへモグロヒン内包リポソームの平均粒径
は190nm、遊離のヘモグロビンは5重量%であった
。また実施例と同様に電子M微鏡により測定した粒径分
布を第1図に示す。 第1図にて明らかなように、実施例において調整したヘ
モグロビン内包リポソームは、比較例において調整した
リポソームより粒径の小さなリポソーム(5〜15nm
)の含有量が少なく、より狭い粒径分布を示した。 また、実施例および比較例において調整したヘモグロビ
ン内包リポソームを4°Cにて1ケ月間保存した後、光
学顕微鏡により観察したところ、実施例において調整し
たヘモグロビン内包リポソームでは、調整直後とほとん
ど変化が観察されなかったのに対し、比較例において調
整したヘモグロビン内包リポソームでは、粒径の小さい
不安定なリポソームが融合して生成したと考えられる1
μ以上の巨大なリポソームか多数観察された。これらの
巨大なリポソームは、生体に投与した際lこ、抹消の毛
細血管で栓塞することが考えられ、安全性において問題
がある。また、実施例において遠心分離を使用せず、ヘ
モグロビン内包リポソームを自然沈降させた場合、沈降
には6〜8時間の時間かかかり、さらに沈降・再浮遊処
理を5〜6回程度繰り返す必要かあったか、得られたヘ
モグロビ等変化かなかった。また、実施例においてヒド
ロキノエチルスターチをデキストラン(平均分子量70
.000)に代える以外は同様にしてリボツムの精製を
行ったきころ実施例よりやや広い粒径分布を示したが、
巨大なリポソームは観察されなかった。さらに、実施例
においてヒドロキノエチルスターチをマンナン、アルブ
ミンに代える以外は同様にしてリポソームの精製を行っ
たところ、いずれの場合もデキストランを用いた場合と
ほぼ同様の結果を示した。 [発明の効果] 以上、詳述したように、本発明に係るリポソームの精製
方法によれは、リポソーム懸濁液に、該リポソームを凝
集させ得る物質を添加してリポソームを凝集させた後に
、凝集したリポソームを沈降させるt:めに、この沈降
処理に際して、従来のような強力な遠心処理を必要とせ
ず、自然沈降させるか、あるいは緩やかな遠心処理を施
すことによって、リポソームを沈降させることができる
。 ある。 また、本発明のリポソームの精製方法によれば、リポソ
ームを凝集させ得る物質が、平均分子量3〜4万のヒド
ロキシエチルスターチであるので、遊離の薬剤とともに
、構造的lこ不安定であって融合しゃすい粒径の小さな
リポソームを分離・除去することができるため、安全性
において優れている。
第1図は実施例および比較例において精製したヘモグロ
ビン内包リポソームの粒径分布を示す図である。
ビン内包リポソームの粒径分布を示す図である。
Claims (5)
- (1)薬剤を内包するリポソームと、該リポソームに取
り込まれなかった遊離の薬剤とを含有するリポソーム懸
濁液に、該リポソームを凝集させ得る物質を添加してリ
ポソームを凝集させた後、凝集したリポソームを沈降さ
せ、上清成分を分離・除去し、沈降したリポソームを溶
媒に希釈して分散させることを特徴とするリポソームの
精製方法。 - (2)リポソームを凝集させ得る物質が、デキストラン
またはヒドロキシエチルスターチである請求項1記載の
リポソームの精製方法。 - (3)前記物質の平均分子量が1万〜20万である請求
項2記載のリポソームの精製方法。 - (4)リポソームを凝集させ得る物質が、平均分子量3
万〜4万のヒドロキシエチルスターチである請求項1記
載のリポソームの精製方法。 - (5)薬剤がヘモグロビンである請求項1ないし4のい
ずれかに記載のリポソームの精製方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2125535A JPH082779B2 (ja) | 1990-05-17 | 1990-05-17 | リポソームの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2125535A JPH082779B2 (ja) | 1990-05-17 | 1990-05-17 | リポソームの精製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0421627A true JPH0421627A (ja) | 1992-01-24 |
JPH082779B2 JPH082779B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=14912597
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2125535A Expired - Fee Related JPH082779B2 (ja) | 1990-05-17 | 1990-05-17 | リポソームの精製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH082779B2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009535384A (ja) * | 2006-05-03 | 2009-10-01 | サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク(セエヌエールエス) | リポソームの即時的および可逆的濃縮のための方法 |
US7754445B2 (en) * | 2001-05-31 | 2010-07-13 | Tmi Europe | Method for the enzymatic production of a curing agent and its fluid state |
EP2541335A2 (en) | 2011-06-29 | 2013-01-02 | Ricoh Company, Ltd. | Developing device, image forming apparatus, and process cartridge |
-
1990
- 1990-05-17 JP JP2125535A patent/JPH082779B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7754445B2 (en) * | 2001-05-31 | 2010-07-13 | Tmi Europe | Method for the enzymatic production of a curing agent and its fluid state |
JP2009535384A (ja) * | 2006-05-03 | 2009-10-01 | サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク(セエヌエールエス) | リポソームの即時的および可逆的濃縮のための方法 |
US9895298B2 (en) | 2006-05-03 | 2018-02-20 | Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) | Method for extemporaneous and reversible concentration of liposomes |
EP2541335A2 (en) | 2011-06-29 | 2013-01-02 | Ricoh Company, Ltd. | Developing device, image forming apparatus, and process cartridge |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH082779B2 (ja) | 1996-01-17 |
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