JPH04295755A - バイオセンサおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は種々の微量の生体試料中
の特定成分について、試料液を希釈することなく迅速か
つ簡便に定量することのできるバイオセンサおよびその
製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】試料液の希釈や撹拌などを行なうことな
く、血液などの生体試料中の特定成分について簡易に定
量しうる方式として、以下のようなバイオセンサを既に
提案している（特願平１−２７４１９４号参照）。

【０００３】このバイオセンサは絶縁性の基板上にスク
リ−ン印刷等の方法で電極系を形成し、上記電極系上に
親水性高分子と酸化還元酵素を含む層、親水性高分子層
および電子受容体を含む層を順に形成したものである。 試料液を酵素反応層上へ滴下すると反応層が溶解し、試
料液中の基質との間で酵素反応が進行し、電子受容体が
還元される。酵素反応終了後、この還元された電子受容
体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値
から試料液中の基質濃度を求めるものである。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】このような従来の構成
では、センサを作製した時点で酸化還元酵素が電極表面
に吸着すること等によって有効な電極面積が減少し、安
定なセンサ応答が得られないことがあった。また、セン
サ製造工程において酸化還元酵素を含む層を形成した後
は酵素活性に影響があるような温度条件下に置くことが
できなかった。

【０００５】本発明は上記課題を解決するもので、広い
温度条件下でも製造可能で、安定した高精度のセンサを
提供することを目的としている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は上記目的を達成
するために、絶縁性の基板上に少くとも測定極と対極か
らなる電極系を設け、この電極系上に親水性高分子と電
子受容体を含む第１の層と親水性高分子からなる第２の
層および酸化還元酵素を含む第３の層を主体とする反応
層を設けてなるものである。

【０００７】さらに、絶縁性の基板上に少くとも測定極
と対極からなる電極系を設けた後、前記電極系上に親水
性高分子と電子受容体を含む第１の層を形成し、次に親
水性高分子の有機溶媒溶液を前記第１の層上に展開して
親水性高分子からなる第２の層を形成し、さらに酸化還
元酵素の水溶液を第２の層上に展開して酸化還元酵素を
含む第３の層を形成することによりバイオセンサを製造
するものである。

【０００８】

【作用】この型のバイオセンサにおいては、まず最初に
試料液中の特定成分と酸化還元酵素による酵素反応が進
行する。上記した本発明の構成によると、酸化還元酵素
が反応層表面近くに位置しているため、反応層全体が溶
解する前に酸化還元酵素部分が溶解した段階で酵素反応
が開始し、その結果、測定に要する時間を従来のセンサ
より短かくすることができる。また、酸化還元酵素が電
極表面と接触していないため、酸化還元酵素やそれに含
まれる不純物等が電極表面を不活性化することを防ぐこ
とができる。これによって非常に精度の高いバイオセン
サが得られる。

【０００９】さらに、酸化還元酵素は一般に温度数十℃
以上で取り扱うとその活性が著しく低下するものが多い
が、本発明の製造法によると酸化還元酵素を含む層の作
製工程以前においては目的に応じて加温操作をすること
が可能となる。すなわち、親水性高分子と電子受容体を
含む層や親水性高分子層を加温して短時間に作製するこ
とや、温度制御によって反応層の性状を制御することが
できる。

【００１０】

【実施例】以下、本発明の一実施例について図１および
図２を参照しながら説明する。バイオセンサの一例とし
て　グルコ−スセンサについて説明する。図１は本発明
のバイオセンサの一実施例として作製したグルコ−スセ
ンサのカバ−及びスペ−サを除いたものの断面図であり
、図２は同じく本発明の一実施例における反応層を除い
たグルコ−スセンサの分解斜視図である。

【００１１】図１において、ポリエチレンテレフタレ−
トからなる絶縁性の基板１上に、スクリ−ン印刷法によ
って銀ペ−ストを印刷しリ−ド電極２，３を形成した。 次に、樹脂バインダ−を含む導電性カ−ボンペ−ストを
印刷し、加熱乾燥することにより、測定極４、対極５か
らなる電極系を形成した。さらに、電極系を部分的に覆
い、電極の露出部分の面積を一定とし、かつリ−ド電極
２、３の不要部を覆うように絶縁性ペ−ストを印刷し、
加熱処理をして絶縁層６を形成した。

【００１２】次に、測定極４および対極５の露出部分を
研磨後、空気中で１００℃にて４時間熱処理を施した。 このようにして電極部分を構成した後、親水性高分子と
して、カルボキシメチルセルロ−ス（以下、ＣＭＣとい
う）の０．５ｗｔ％水溶液を電極上へ展開、乾燥させて
ＣＭＣ層を形成した。次に、このＣＭＣ層上へ電子受容
体としてフェリシアン化カリウムの水溶液を滴下、加熱
乾燥させてＣＭＣ−フェリシアン化カリウム層７を形成
した。

【００１３】このときの加熱温度によって乾燥に要する
時間が変化し、その結果フェリシアン化カリウムの結晶
粒径を制御することができる。乾燥時間を短くすると結
晶粒径は小さくなり、試料液への溶解速度が高められる
。よってセンサ応答速度を速くすることが可能である。 従来は酸化還元酵素が存在していたためにこのような加
熱は不可能であった。加温はその酵素活性に影響を与え
るからである。一方、ＣＭＣを含む溶液は粘性が高いた
めに、あまりに温度を上げて乾燥時間を短くすると溶液
中の気体成分が十分抜けず、泡を含んだ層が形成される
。これはセンサ応答に大きな影響を与えるために避けな
ければならない。したがって、このＣＭＣ−フェリシア
ン化カリウム層７の作製温度は２０℃〜１００℃の範囲
であることが望ましい。

【００１４】このＣＭＣ−フェリシアン化カリウム層７
上を完全に覆うようにして、ポリビニルピロリドン（以
下、ＰＶＰという）の１％エタノ−ル溶液を展開し、乾
燥させ、ＰＶＰ層８を形成した。ＰＶＰ層８を設けるこ
とによって、全血など固形成分を含む試料液に対するセ
ンサ応答度の低下を最小限にすることができる。さらに
、フェリシアン化カリウムと後述の酸化還元酵素を分離
することで、センサの保存特性を著しく向上させること
ができる。

【００１５】このＰＶＰ層８上へ、酵素としてグルコ−
スオキシダ−ゼ（以下、ＧＯＤという）の水溶液を展開
し、乾燥させ、ＧＯＤ層９を形成した。この場合、ＰＶ
Ｐが親水性高分子であるために、ＧＯＤ層９は部分的に
ＰＶＰ層８と混合された状態で薄膜状となっているが、
撹拌等を伴わないためマクロ的には分離した層としてみ
ることができる。

【００１６】さらに、界面活性剤であるレシチンの１％
トルエン溶液を滴下、図２に示すセンサの試料供給孔１
３に相当する基板先端部分から反応層上に至るまで展開
し、乾燥させることによってレシチン層１０を形成した
。ここでレシチンは試料液を円滑に反応層上へ導入する
役割を果たす。

【００１７】レシチン層１０を形成する際の溶媒として
本実施例ではトルエンを用いたが、このように反応層が
難溶性を示す溶媒を用いることによって、反応層を乱す
ことなく一様に広げることが可能である。

【００１８】上記のようにして反応層を作製した後、図
２に示すようにカバ−１２およびスペ−サ−１１を図２
中一点鎖線で示すような位置関係をもって接着した。カ
バ−およびスペ−サ−１１に透明な高分子材料を用いる
と、反応層の状態や試料液の導入状況を外部から極めて
容易に判断することも可能である。カバ−１２を装着す
ることによって、試料液をセンサ先端の試料供給孔１３
に接触させるだけの簡易操作で容易に試料液が反応層部
分へ導入される。試料液の供給量はカバ−１２とスペ−
サ−１１によって生じる空間の容積に依存するため予め
定量する必要もない。さらに、測定中の試料液の蒸発を
最小限に抑えることができ、精度の高い測定が可能とな
る。

【００１９】こうして作製したグルコ−スセンサに試料
液としてグルコ−ス標準液３μｌを試料供給孔より供給
し、４０秒後に対極を基準にして測定極にアノ−ド方向
へ＋０．５Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電流値を
測定した。試料液が反応層へ到達すると、ＧＯＤ層、Ｐ
ＶＰ層、ＣＭＣ−フェリシアン化カリウム層が順次試料
液に溶解する。試料液中のグルコ−スはＧＯＤによって
酸化され、そこで移動した電子によってフェリシアン化
カリウムがフェロシアン化カリウムに還元される。つぎ
に、上記のパルス電圧の印加により、生成したフェロシ
アン化カリウムの濃度に基づく酸化電流が得られ、この
電流値は基質であるグルコ−スの濃度に対応した。

【００２０】上記グルコ−スセンサの測定域は、９００
ｍｇ／ｄｌ（０．０５モル／ｌ）以上という高濃度まで
良好な直線関係が得られた。さらに、上記グルコ−スセ
ンサに全血試料を３μｌ供給して４０秒後の応答電流を
測定したところ４５０ｍｇ／ｄｌ（０．０２５モル／ｌ
）以上までの直線関係が得られ、同一全血試料について
センサ３０個を用いたときの変動係数も３％以下と非常
に再現性のよい応答が得られた。　　なお、上記実施例
ではグルコ−スセンサについて示したが、本発明はアル
コ−ルセンサや乳酸センサ、コレステロ−ルセンサなど
酸化還元酵素の関与する反応系に広く用いることができ
る。

【００２１】上記実施例では親水性高分子としてＣＭＣ
およびＰＶＰを用いたが、これらに限定されることはな
く、ビニルアルコ−ル系、セルロ−ス系、ビニルピロリ
ドン系、ゼラチン系、アクリル酸塩系、デンプン系、無
水マレイン酸系、アクリルアミド系、メタクリレ−ト樹
脂などをそれぞれ用いても同様の効果が得られた。これ
らの親水性高分子を適当な濃度の溶液にしたものを塗布
、乾燥することにより、必要な膜厚の親水性高分子層を
電極上に形成することができる。

【００２２】また、上記実施例では、測定極と対極のみ
の二極電極系について述べたが、参照極を加えた三電極
方式にすれば、より正確な測定が可能である。

【００２３】一方、電子受容体としては、上記実施例に
示したフェリシアン化カリウム以外に、ｐ−ベンゾキノ
ン、フェナジンメトサルフェ−ト、フェロセンなども使
用できる。

【００２４】さらに、酸化還元酵素としてはグルコ−ス
オキシダ−ゼ以外に、アルコ−ルオキシダ−ゼ、乳酸オ
キシダ−ゼ、コレステロ−ルオキシダ−ゼ、キサンチン
オキシダ−ゼ、アミノ酸オキシダ−ゼ等も用いることが
できる。

【００２５】

【発明の効果】以上の実施例から明らかなように本発明
によれば、従来より短い時間で高精度測定のできるバイ
オセンサを提供することができる。さらに、本発明の製
造法によると親水性高分子と電子受容体を含む層などを
加温して短時間に作製することや、温度制御によって反
応層の性状を制御することができ、高精度バイオセンサ
を高歩留まりで効率よく製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例のバイオセンサのカバ−およ
びスペ−サを除いた断面図

【図２】本発明の一実施例のバイオセンサの反応層を除
いた分解斜視図

【符号の説明】

１　　絶縁性の基板 ４　　測定極 ５　　対極 ７　　ＣＭＣ−フェリシアン化カリウム層（第１の層）
８　　ＰＶＰ層（第２の層） ９　　ＧＯＤ層（第３の層）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】絶縁性の基板上に形成した少なくとも測定
   極と対極からなる電極系と、前記電極系上に設けた反応
   層からなり、前記反応層が親水性高分子と電子受容体を
   含む第１の層、親水性高分子からなる第２の層および酸
   化還元酵素を含む第３の層の少なくとも３層からなるこ
   とを特徴とするバイオセンサ。
2. 【請求項２】絶縁性の基板上に少なくとも測定極と対極
   からなる電極系を設けた後、前記電極系上に親水性高分
   子と電子受容体を含む第１の層を形成し、次に親水性高
   分子の有機溶媒溶液を前記第１の層上に展開して親水性
   高分子からなる第２の層を形成し、さらに酸化還元酵素
   の水溶液を第２の層上に展開して電子受容体を含む第３
   の層を形成することを特徴とするバイオセンサの製造法
   。