JPH04265838A - 細胞判別装置および粒子の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は微小粒子の形状判別装置
に係り、特に、細胞融合や遺伝子導入に用いる植物細胞
のプロトプラストの正常か否かの判別や、分級の判別等
を細胞の形状から行うのに適した細胞判別装置に関し、
特に、懸濁液中の細胞粒子の流れる流線の位置を検出す
る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】特開平１−２９６１３６号公報や特開平
２−１１８４３６号公報に記載しているように、細胞の
懸濁液を流路中に流し、その拡大像をスリットで走査し
て細胞の形状を判別する装置がある。これは、流路内を
一定速度で流れている細胞の拡大像を相対的に、流れの
方向に対して複数の角度で走査して、検出信号の時間幅
と速度から細胞の外形を測長し、複数の方向における測
長寸法の直線の先端を結んだ包絡線の形から細胞の形状
を推定するものである。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術では、流
路を流れる細胞の移動速度が一定であることを前提とし
ている。ところが、細い管内の流れは、層流や乱流に係
らず、流路の壁面近傍と流れの中心とでは流速が異なっ
ている。特に、層流の場合にはその流れは流体力学のハ
ーゲン・ポアズイユの法則として知られているように、
断面が円形の管路の場合、その速度分布は放物面となる
。壁面での速度ゼロから、平均流速の２倍の値となる中
心の軸上の最大流速へというように速度分布が変化する
。従って、管路の中のどの流線に沿って細胞が流れるか
によって、すなわち、細胞の流れの中心軸からの偏り具
合によって細胞の移動速度が異なるため、細胞の外形の
測長結果に誤差が生じるという課題があった。また、検
出光学系の光軸上の結像点からずれた位置に細胞が流れ
ると、デフォーカスにより像のサイズが変わり細胞の径
の計測誤差となる問題があった。さらに、細胞の移動速
度が変動した場合の流線の偏り具合を計測することが困
難であった。従って、細胞流れの流線が基準流線から少
ない偏り量で安定に流れているか否かの判定技術の確立
が必要とされていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
、管路内の基準流線を含む平面を光学的に結像する位置
に、基準流線の方向に対して垂直、および交差する配置
で設けた複数のスリットを通して得られる、検出信号の
間隔から粒子の流れの基準流線からの偏差量を算出する
演算回路手段を備えた細胞の判別装置および粒子の検出
方法を発明した。

【０００５】

【作用】管路内の基準流線の方向に垂直な第１のスリッ
トと第２のスリットを用いて、管路内を流れる細胞の拡
大像の光信号を検出し、その信号の発生時間間隔を測定
すれば、第１と第２のスリットの間隔が既知であるので
、細胞の移動速度が求められる。一方、基準流線の方向
に対して所定の角度をなす第３のスリットと上記第１の
スリットとから検出される信号の時間間隔を測定すると
該角度が既知であるので、上記の移動速度とから細胞の
流れる流線の位置を算出できる。

【０００６】

【実施例】本発明の第１の実施例を図１から図３を用い
て説明する。

【０００７】図１は本発明の実施例の細胞の判別装置の
主要構成図である。細胞を懸濁した懸濁液を流す流路２
，流路内の細胞１を照明する半導体レーザを用いた光源
３，細胞１の像を拡大し結像する対物レンズ４，結像面
位置に設置されたスリット６，７，８を有するスリット
板９、スリットを通過した像の光量を検出する光検出器
１０、光検出器からの信号を増幅し、検出信号の時間間
隔から細胞流れの位置を換算する処理回路１１から構成
される。

【０００８】細胞像からの光信号のＳＮ比を高めるため
に、対物レンズ４内に０次光を遮る機能のブロッカー５
を設け、細胞の散乱光像のみを拡大し結像させるように
構成されている。流路２は、細胞懸濁液をシース液で包
むようにしてシースフローを形成する機能のある公知の
フローセルの先端部の流路の一部を示している。また、
光源３からのレーザ光の通過する流路２の壁面はガラス
等の透光性の材料からなり、像歪を最小にする目的で、
光学的に互いに平行なガラス構造となっている。シース
フローの主流に乗った細胞は移動速度ｖで移動し、その
拡大像はスリット板９に投影され、像の輝度に応じた光
がスリット６，８，７の順に順次、細胞の移動速度に応
じて光検出器１０に取り込まれる。

【０００９】図２は、スリット板９上のスリットの拡大
図である。スリット１６，１８，１７と基準流線２１上
を移動する細胞の拡大像２２の関係を示す。スリット１
６と１７は距離Ｌで互いに平行で、かつ基準流線２１に
対して垂直な位置に配置されている。スリット１８は基
準流線２１に対して角度θで配置されている。スリット
の幅ｂは細胞の拡大像の平均直径より十分に小さい寸法
に設計されている。本発明では直径５μｍから１００μ
ｍの細胞を対象とし、拡大倍率４０倍の対物レンズで直
径２００μｍから４０００μｍの像に拡大し、この拡大
像を幅ｂが４０μｍのスリットで相対的に走査する。

【００１０】拡大像２２の移動速度をｖとし、拡大像２
２がスリット１６を通過し始めてから、スリット１８を
通過し始めるまでに要する時間をｔ１　、さらにスリッ
ト１７を通過し始めるまでに要する時間をｔ２　とする
。座標系を図示したように、基準流線の方向をｙ、それ
と垂直な方向をｘとする。次に、細胞が基準流線２１か
らｘだけ偏った流線２３上を移動し、点線で示した拡大
像２４を結像したものとする。流線２３上の細胞は流れ
が基準流線から偏っているためその移動速度が流れの速
度分布に応じて小さくなっている。拡大像２４の移動速
度を（ｖ−Δｖ）として、拡大像２４がスリット１６を
通過し始めてから、スリット１８を通過し始めるまでに
要する時間をｔ３　、スリット１７を通過し始めるまで
に要する時間をｔ４　とすると、細胞の拡大像の流線２
３の偏り量ｘは次式の関係から求めることができる。

【００１１】 　　　　　　　　　　　　　　ｘ＝ｙ・ｔａｎθ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　…（数１）　　　　　　　　　　　　　　Ｌ＝ｖ・
ｔ２＝（ｖ−Δｖ）・ｔ４　　　　　　　　　　　　　
　　…（数２）　　　　　　　　　　　　　　ｙ＝（ｖ
−Δｖ）・ｔ３−ｖ・ｔ１　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　＝Ｌ・（ｔ３／ｔ４−ｔ
１／ｔ２）　　　　　　　　　　　　　　…（数３）　
　　　　　　　　　∴　　ｘ＝Ｌ・（ｔ３／ｔ４−ｔ１
／ｔ２）・ｔａｎθ　　　　　　　　…（数４）数４に
おいて、距離Ｌと角度θは既知の値であるので、細胞の
拡大像がそれぞれのスリットを通過し始める時間間隔ｔ
１，ｔ２，ｔ３，ｔ４を求めれば、その比から流線の偏
り量ｘが換算できる。流路内での細胞の流線の偏り量は
、値ｘを対物レンズの拡大率で割って求められる。

【００１２】図３に細胞の拡大像がスリットを通過する
ことによって光検出器から得られる信号を２値化した検
出信号の波形の一例を示す。横軸の時間ｔの経過にとも
なって、図２に示したスリット１６，１８，１７からの
２値化された信号波形が図示したように矩形状に得られ
る。図３の（ａ）は細胞が基準流線上を流速ｖで、流れ
る時の細胞拡大像からの信号波形、（ｂ）は細胞が基準
流線から偏り、そのスリット板上での偏り量ｘの流線上
を移動速度（ｖ−Δｖ）で流れる時の細胞拡大像からの
信号波形、（ｃ）は細胞が基準流線上を流れているが、
移動速度が遅くなり　（ｖ−Δｖ）　で流れる時の細胞
拡大像からの信号波形出ある。なお、この３例で扱う細
胞の直径は等しいものと仮定する。また、時間間隔の記
号ｔ１　からｔ４　と移動速度ｖ，移動速度の低下分Δ
ｖ，流線の偏り量ｘは図２と共通とする。信号幅ｔ７　
は細胞像がスリット１６を通過し始めてから通過し終わ
るまでの時間間隔である。信号幅ｔ８　がｔ７　より長
いのはスリット１８が角度θだけ傾斜していることに起
因する。また、信号幅ｔ９やｔ１０がｔ７　より長いの
は移動速度がΔｖだけ遅いためである。時間間隔ｔ３　
がｔ１　より長いのは流線が基準流線よりｘだけ偏った
ことと移動速度がΔｖだけ遅いことによる。流線の偏り
がなく、移動速度のみがΔｖだけ遅い場合には時間間隔
ｔ３　とｔ５　との差だけが生じる。

【００１３】互いに平行なスリット１６と１７とからの
信号の時間間隔は移動速度のみに依存して変わる。従っ
て、（ｂ）と（ｃ）は共に移動速度がΔｖだけ遅いので
、時間間隔ｔ４　とｔ６　は等しくなる。また、移動速
度が等しく、流線の偏りだけが生じている時には（ｂ）
と（ｃ）との比較から判るように、時間間隔ｔ４　とｔ
６　は等しく、かつｔ３　とｔ５　とが異なる値となる
。

【００１４】このように、時間間隔ｔ１　は流線の位置
と移動速度の両者に依存しているが、時間間隔ｔ２　が
移動速度のみに依存するので、時間間隔ｔ２　で無次元
化することで、流線のみの位置が数４で示したように算
出できる。従って、流速が変動してもその影響をほとん
ど受けることなく流線の位置を算出できる特徴を有して
いる。 なお、本発明では、細胞の拡大像を走査しているので、
移動速度ｖ　（＝Ｌ／ｔ２　）が求められるので、検出
信号幅ｔ７やｔ８から拡大像の寸法が、さらに細胞の寸
法が測定できるという従来技術で可能な機能が併用でき
ることはいうまでもない。

【００１５】図４は本発明の第２の実施例の２次元検出
のための細胞判別装置の主要構成図である。図１に示し
た本発明の検出光学系を、その光軸が互いに直交するよ
うに配置して、細胞の流れる流線の偏り量を２次元的に
求めることを可能にする構成になっている。細胞を懸濁
した懸濁液を流す流路２、流路内の細胞１を照明する半
導体レーザを用いた光源３，４３、細胞１の像を拡大し
結像する対物レンズ４，４４、結像面位置に設置された
スリット板９，４９、スリットを通過した像の光量を検
出する光検出器１０，５０、光検出器からの信号を増幅
し、検出信号の時間間隔から細胞流れの位置を換算する
図示していない処理回路から構成される。検出原理は記
述の方法の応用から明らかである。

【００１６】

【発明の効果】本発明の細胞判別装置では、流路中を流
れる細胞の流線の位置を特定できるので、流れの安定の
度合いを把握し、所定の流路上に細胞が流れるように流
れを制御することが容易になる。特に、流速変動による
影響を受けずに流線の位置が計測できるので、フローセ
ルを用いてシースフローを形成させる際の流量調整が容
易に行える効果がある。また、流速が早い乱流での測定
も可能であるので、試料を極細い基準流線上に流す条件
出しが容易となる。さらに、自動計測も可能であるので
、試料を長時間流し続けたりして配管や流路系の流路抵
抗が変わり流線が乱れたりする現象をモニタしたり、制
御することも可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】細胞の判別装置の主要構成図である。

【図２】スリット板上のスリットの拡大図である。

【図３】検出信号の波形の一例の図である。

【図４】２次元検出のための細胞判別装置の主要構成図
である。

【符号の説明】

１…細胞、２…流路、３…光源、４…対物レンズ、６，
７，８…スリット、１０…光検出器、１１…演算処理回
路。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粒子懸濁液を流す流路と、該流路内の粒子
   の拡大像を結像する光学系と、該拡大像を相対的に走査
   するスリット手段と、該スリットからの光量を検出する
   検出手段と、該検出手段からの検出信号間隔から粒子の
   流れの基準流線からの偏差量を算出する演算回路手段と
   からなることを特徴とする細胞判別装置。
2. 【請求項２】請求項１記載のスリット手段が、流路内の
   基準流線の方向に対して垂直で互いに平行な第１と第２
   のスリット、および該基準流線の方向に所定角度を成す
   配置で形成した第３のスリットから構成されるスリット
   手段を用いることを特徴とする細胞判別装置。
3. 【請求項３】請求項１記載の流路が、粒子懸濁液を搬送
   液で包んだシースフローを形成する流路であることを特
   徴とする細胞判別装置。
4. 【請求項４】流路に粒子の懸濁液を流し、該懸濁液の基
   準流線の方向に垂直で、かつ互いに平行な第１と第２の
   スリットから得られる該粒子の光学的拡大像の検出信号
   の間隔と、基準流線の方向に対して所定の角度をなす第
   ３のスリットと該第１のスリットから得られる該粒子の
   光学的拡大像からの検出信号の間隔とから、該粒子の流
   れの基準流線からの偏差量を求めることを特徴とする粒
   子の検出方法。