JPH04247100A - 新規ペプチド、その製造法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、下記構造を有する新規
なペプチドを提供するものであり、アンギオテンシン変
換酵素阻害剤等として有用なペプチドに関する。 Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ

【０
００２】

【従来の技術】アンギオテンシン変換酵素は、主として
肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在し、アンギオテ
ンシンＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ一
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に作用して
、アンギオテンシンＩのＣ末端よりジペプチド（Ｈｉｓ
９−Ｌｅｕ１０）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有
するアンギオテンシンＩＩを生成させる酵素である。 また、この酵素は生体内降圧物質であるブラジキニンを
破壊し不活化する作用も併有し、昇圧系に強力に関与し
ている。

【０００３】従来より、アンギオテンシン変換酵素の活
性を阻害すれば、降圧に働き、臨床的には高血圧症の予
防、治療に有効であると考えられている。最近ではプロ
リン誘導体であるカプトプリルが合成され、降圧活性が
確認されて以来、種々のアンギオテンシン変換酵素阻害
物質の合成研究が盛んであり、又天然物からの取得も試
みられているところである。

【０００４】天然物由来のアンギオテンシン変換酵素阻
害剤は食品あるいは食品原料から得られるので低毒性で
安全性の高い降圧剤となることが期待されるからである
。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、天然物
中に見出されるアンギオテンシン変換酵素阻害物質は極
めてまれで、僅かにブラジル産や日本産蛇毒より得られ
たテプロタイド（ノナペプチド，ＳＱ２０８８１）等や
、ストレプトミセス属に属する放線菌の代謝産物ＩＳ８
３（特開昭５８−１７７９２０号公報）が知られている
に過ぎない。また、天然物を酵素処理して得られたアン
ギオテンシン変換酵素阻害物質としては、牛乳カゼイン
をトリプシンにより分解して得たペプチド類等が知られ
ているが（特開昭５８−１０９４２５号、同５９−４４
３２３号、同５９−４４３２４号、同６１−３６２２６
号、同６１−３６２２７号）新規な阻害物質の開発が望
まれているところである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる課
題を解決すべく天然物質で副作用の少ないアンギオテン
シン変換酵素阻害物質を鋭意探索した結果、蛋白質特に
アルブミンを特定の酵素で加水分解した組成物中にアン
ギオテンシン変換酵素阻害活性を有する物質の存在をつ
きとめ、該物質が一般式Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙ
ｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで示されるペプチドであることを知
見し、本発明を完成した。

【０００７】本発明の一般式Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−
Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで示されるペプチドは文献未載
の新規なペプチドであり、アルブミン等の蛋白質をペプ
シンによって加水分解することによって製造され、実用
にあたっては組成物をそのまま用いても良く、あるいは
必要に応じて精製して使用される。更にはペプチド合成
の常套手段を適用して合成することによって製造するこ
ともできる。上記でいうＡｓｎはアスパラギン、Ｉｌｅ
はイソロイシン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｔｙｒは
チロシン、Ｃｙｓはシステイン、Ｐｒｏはプロリンを意
味し、かかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。

【０００８】本発明のペプチドは蛋白質をペプシンで加
水分解することによっても、ペプチド合成法でも取得で
きる。蛋白質をペプシンで加水分解するには、蛋白質の
性状により処法は異なるが、難溶性の場合には熱水に蛋
白質を混合し強力な撹拌でホモジナイズし、所定量のペ
プシンを加え温度１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０
℃、ＰＨ０．１〜４．０で１０分〜３日間静置又は撹拌
反応を行う。

【０００９】蛋白質としては、アルブミンが有用である
。アルブミンとしては動物や植物の体液及び組織中に広
く分布している可溶性蛋白質例えば、卵白アルブミン、
血清アルブミン、乳アルブミン等が任意に用いられるが
、特に卵白アルブミンが有用である。加水分解液中には
本発明のペプチド以外に、他のペプチドが存在してるが
、これらは混合物のままで各種の用途に用いられても良
く、又、本発明のペプチドのみを単離して用いても差し
支えない。

【００１０】単離する場合は加水分解液を遠心分離等の
公知の操作で濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを
適用した後、あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤
に対する吸着親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あ
るいは溶解度の差、２種の混ざり合わない液相間におけ
る分配の差、分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液
からの析出性あるいは析出速度の差などを利用する手段
を適用して目的物を単離するのが好ましい。これらの方
法は必要に応じて単独に用いられ、あるいは任意の順序
に組合せ、また反覆して適用される。

【００１１】本発明のペプチドはペプチド合成に通常用
いられる方法、即ち液相法または固相法でペプチド結合
の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に
相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方の
フラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料と
をカルボジイミド法、活性エステル法等を用いて縮合さ
せ、生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基
を除去させることによっても製造し得る。

【００１２】この反応工程において反応に関与すべきで
ない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保
護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル、ｔ−
ブチルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピロ
オキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカル
ボニル等が挙げられる。カルボキシル基の保護基として
は例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成
し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカ
ルボキシル基はクロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、
Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合
している。

【００１３】縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の
存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたは
ペプチド活性エステルを用いて実施する。縮合反応終了
後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプ
チドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明
のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオ
ン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる
。

【００１４】本発明で使用するペプチドの投与経路とし
ては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでも
よいが、経口投与が好ましい。本発明のペプチドの投与
量は、化合物の種類、投与方法、患者の症状・年令等に
より異なるが、通常１回０．００１〜１０００ｍｇ、好
ましくは０．０１〜１０ｍｇを１日当たり１〜３回であ
る。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調
製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製
剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応
しない物質が用いられる。

【００１５】具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マン
ニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン
、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ
酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセ
ルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロー
ス、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセル
ロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビ
ニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ
酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、
ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪
酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂
肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラ
チン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、
流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非
イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等が挙げ
られる。

【００１６】剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤
、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤
、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。 これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤
にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸
濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方
法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発
明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応
じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよ
く、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。

【００１７】これらの製剤は、本発明のペプチドを０．
０１％以上、好ましくは０．５〜７０％の割合で含有す
ることができる。これらの製剤はまた、治療上価値ある
他の成分を含有していてもよい。

【００１８】

【作　　　　用】本発明のペプチドは、新規なペプチド
であり優れたアンギオテンシン変換酵素阻害作用を有し
、血圧降下作用、ブラジキニン不活化抑制作用を示し、
本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧
症の予防、治療剤、これらの疾患の診断剤や各種の病態
において用いられる血圧降下剤、狭心病発作の閾値上昇
、心筋梗塞の減少、うっ血性心不全における病態の改善
剤として有用である。

【００１９】

【実施例】次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明
する。生卵白を蒸留水で５倍に希釈溶解した後、ＩＮ−
ＨＣｌでＰＨ１．６に調整した溶解液（２０ｍｇ／ｍｌ
の蛋白を含む）にペプシン０．２ｍｇ／ｍｌ（シグマ社
製）を添加して３７℃、３時間静置反応を行い１００℃
、１０分間煮沸して反応を停止させた。この反応液を１
００００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、濃縮した後高
速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ−，ＰＨ−及びＣＮ
−カラム）より精製し、ペプチドを得た。

【００２０】本品を気相プロテインシーケンサー（アブ
ライド　　バイオシステムズ社製　　４７７　　Ａ型）
を用いる自動エドマン分解法を適用してアミノ酸配列を
分析し、下記の構造を得た。 Ｈ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ
−ＯＨ

【００２１】該ペプチドの物性値はつぎのとうり
である。

【００２２】〔ペプチドの合成〕市販のＢｏｃ（ブトキ
シカルボニル）−Ｐｒｏ−Ｏ−Ｒｅｓｉｎ　　０．７５
ｇ（置換率０．４０ｍｅｑ／ｇ）をバイオサーチ社のペ
プチド合成装置ＳＡＭ２の反応槽に分取し、以下のよう
に合成を行った。４５％トリフルオロ酢酸、２．５％ア
ニソール、２％エタンジチオールを含む塩化メチレン中
、２５分間の反応により、Ｂｏｃ基を除去したのち、塩
化メチレンによる洗浄、１０％ジイソプロピルエチルア
ミンを含む塩化メチレンによる中和、及び塩化メチレン
による洗浄を行った。これと５ｍｌの０．４Ｍ　　Ｂｏ
ｃ−Ｃｙｓ（ＭｅＯＢｚｌ）（メトキシベンジル基）の
ジメチルホルムアミド溶液、５ｍｌの０．４Ｍジイソプ
ロピルカルボジイミドの塩化メチレン溶液とを混合した
後、反応槽に加え、室温にて２時間撹拌反応させた。

【００２３】得られた樹脂をジメチルホルムアミド、塩
化メチレン、１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む
塩化メチレン、塩化メチレン更に塩化メチレン及びジメ
チルホルムアミドとの混合液で洗浄し、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ
（ＭｅＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ樹脂を得た。引き続き同様の
Ｂｏｃ基の除去、Ｂｏｃとアミノ酸のカップリングを繰
り返しＡｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚ
ｌ）（ジクロルベンンジル基）−Ｃｙｓ（ＭｅＯＢｚ１
）−Ｐｒｏ樹脂を得た。

【００２４】該樹脂を２０ｍｌの１０％アニソールを含
むフッ化水素中で０℃、１時間撹拌し、ペプチドを樹脂
から遊離させた。フッ化水素を減圧留去し、残渣を３０
％酢酸で抽出し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。これ
をＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　　５Ｃ１８）によ
る逆相クロマトグラフィーにより精製し、Ｈ−Ａｓｎ−
Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−ＯＨ（収量
１００ｍｇ）を得た。本品を前記と同一のプロテインシ
ーケンサーにより分析した結果、上記の組成であること
が判明した。

【００２５】該ペプチドの物性値はつぎのとうりである
。尚、ＴＬＣの溶媒は以下すべて前記と同一である。 Ｒｆ：０．７１

【００２６】実施例１ （アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定）アンギオ
テンシン変換酵素阻害活性の測定は、ＣｈｅｕｎｇとＣ
ｕｓｈｍａｎの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｐｈ
ａｒａｍａｃｏ１ｏｇｙ　　２０，１６３７（１９７１
）〕に準じて以下の方法で行った。 酵素基質；Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
（８６ｍｇを水８ｍｌとリン酸緩衝液８ｍｌに溶解した
溶液） 酵　　素；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製
）（１ｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍｌ中で粉砕し
た後、遠心分離した上澄液）

【００２７】上記の酵素基質を１００μｌ、酵素溶液を
１２μｌ及び本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水
で全体を２５０μｌとした後、３７℃で３０分間反応を
行った。反応は１Ｎ−ＨＣｌ　　２５０μｌを用いて終
了させた。反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れＶ
ｏｒｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。酢酸
エチル層から１．０ｍｌをとり出して、酢酸エチルを留
去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、抽
出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（ＯＤ２２８
）を測定した。

【００２８】阻害率は阻害剤なしで反応したときのＯＤ
２２８を１００％とし、反応時間０分のときのＯＤ２２
８を０％として求め阻害率５０％の時の阻害剤（本発明
のペプチド）の濃度ＩＣ５０（μＭ）で活性を表示する
とＩＣ５０＝２０μＭであった。

【００２９】

【効　　　　果】本発明ではアンギオテンシン変換酵素
阻害剤として有用な、新規なペプチドが得られる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−
   Ｃｙｓ−Ｐｒｏで示される新規ペプチド
2. 【請求項２】蛋
   白質をペプシンで加水分解することを特徴とする一般式
   Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで示
   される新規ペプチドの製造法
3. 【請求項３】蛋白質として
   アルブミンを使用する請求項２記載の製造法
4. 【請求項４】蛋白質として卵白を使用する請求項２記載
   の製造法
5. 【請求項５】一般式Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−
   Ｃｙｓ−Ｐｒｏで示されるペプチドを有効成分とするア
   ンギオテンシン変換酵素阻害剤