JPH04232464A - アミン富化タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は臨床化学に関する。 【０００２】 【従来の技術】天然の免疫学的反応を利用するイムノア
ッセイは、臨床化学における分析技術として広範な用途
が見出されている。反応の特異性のために、イムノアッ
セイは例えば抗体、治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモン、
タンパク質等を包含する生物学的分析物（本明細書中で
はリガンドと呼称する）を定量する上で特に有利である
。 【０００３】競合結合アッセイにおいては、標識された
リガンド類似体（本明細書中ではしばしばリガンド類似
体と呼称する）が、固定量の適当な結合剤（本明細書中
ではレセプターと呼称する）との反応を目当てにした未
標識のリガンドとの競争状態に置かれる。結合したリガ
ンド類似体または未結合の（即ち遊離の）リガンド類似
体のいずれかの測定シグナルからリガンドの未知の濃度
を決定することができる。反応は次のように進行する：
【化１】 【０００４】有用な標識としては、タンパク質、例えば
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含むペルオキ
シダーゼである。ＨＲＰは、例えば、エンザイムイムノ
アッセイにおける使用に望ましい酵素にする多数の特性
、例えば低濃度における検出可能性、良好な抗原−抗体
結合と両立できる最適ｐＨ、長期安定性、低費用および
患者の試料中に内因性活性がないこと、を有する。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】リガンドをタンパク質
に結合する多数の方法は、タンパク質上における反応性
アミノ基の利用可能性を必要とする。問題は、天然に存
在するＨＲＰのようなタンパク質がごく少数しか反応性
アミノ基を含まないことである。報告された数は、使用
する精製方法に依存して０〜７の間で異なる。アミノ基
を介してＨＲＰのような酵素をリガンドにカップリング
せしめる方法は、相当な割合の未反応酵素を生じる。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明は、アミン富化タ
ンパク質、例えば酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ）、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（以後しば
しばアミン富化ＨＲＰと称する）のようなペルオキシダ
ーゼを提供する。 【０００７】 【作用】本発明者らは、ポリアミンの存在下でのＨＲＰ
とアミド結合形成試薬との反応がＨＲＰの遊離カルボキ
シル基の幾つかをポリアミンのモノアミドへ転化せしめ
、それによってＨＲＰ中に追加のアミノ基を導入するこ
とを発見した。 【０００８】有用なポリアミンは２以上のアミノ基を有
し、そのようなものとしてエチレンジアミン、Ｎ−メチ
ルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ′−ジメチルエチレンジア
ミン、ジエチレントリアミン、ピペラジン、Ｎ−（２−
アミノエチル）ピペラジン、ヘキサンジアミン、リジン
、リジルリジン、スペルミジン、および少なくとも２つ
のアミンを含むペプチドが挙げられる。好ましくは、ア
ミンは塩として、より好ましくはＨＣｌまたはＨＢｒか
ら誘導されるハロゲン化水素塩として反応混合物中に添
加される。例えば、エチレンジアミンは二塩酸塩　ＨＣ
ｌ・ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２　・ＨＣｌ　とし
て反応液に添加することができる。 【０００９】本発明において使用されるアミド形成剤と
しては、例えば、Ｅｒｉｃｈ　Ｓｃｈｍｉｄｔ，　Ｆｒ
ｉｔｚ　Ｈｉｔｚｌｅｓ，　Ｅｂｅｒｈａｒｄ　Ｌａｈ
ｄｅ，　Ｂｅｒｉｃｈｔｅ　ｄｅｒ　Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
ｎ　Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅｎ　Ｇｅｓｅｌｌｓｈａｆｔ　
，　Ｖｏｌ．７１　ＩＩ，　ｐ．１９３３　（１９３８
）　　およびＢｕｌｌ．　Ｓｏｃ．　Ｃｈｅｍ．　Ｆｒ
ａｎｃｅ　，ｐ．１３６０　（１９５６）において報告
されたようなカルボジイミド；ドイツ国特許出願（ＯＬ
Ｓ）　第２，３２２，３１７　号に記載されたジヒドロ
キノン化合物；ドイツ国特許出願（ＯＬＳ）　第２，２
２５，２３０　号、第２，３１７，６７７　号および第
２，４３９，５５１　号に記載されたカルバモイルピリ
ジニウム化合物；ドイツ国特許出願（ＯＬＳ）　第２，
４０８，８１４　号に記載されたカルバモイルオキシピ
リジニウム化合物；並びに米国特許第４，８７７，７２
４　号に記載されたジカチオンエーテルを挙げることが
できる。 【００１０】そのような化合物は、米国特許第４，８６
３，８４１　号に記載および例示されており、特に第１
１段落６３行目から第２１段落４２行目までを参照のこ
と。米国特許第４，８６３，８４１　号（前掲）中のそ
のような物質に関係する記載は、あたかも以後に完全に
記載されたかのように本明細書中に参考として組み込ま
れる。それらの剤の中で或る種のものが好ましい。好ま
しいアミド形成剤のクラスは、下式（Ｉ）　を有する： 【００１１】 【化２】 【００１２】上式中、Ｒ１　およびＲ２　（これらは同
一であっても異なっていてもよい）は各々、　　１〜１
０個の炭素原子を有するアルキル基（例えばメチル基、
エチル基、２−エチルヘキシル基等）、６〜１５個の炭
素原子を有するアリール基（例えばフェニル基、ナフチ
ル基等）、または７〜１５個の炭素原子を有するアラル
キル基（例えばベンジル基、フェネチル基等）を表す。 前記Ｒ１　およびＲ２　が互いに一緒になって窒素原子
と共に複素環を形成することも好ましい。環を形成する
ものの例は、ピロリジン環、ピペラジン環、モルホリン
環等である。 【００１３】式（Ｉ）　中のＲ３　は、水素原子、ハロ
ゲン原子、カルバモイル基、スルホ基、ウレイド基、１
〜１０個の炭素原子を有するアルコキシ基、１〜１０個
の炭素原子を有するアルキル基等といった置換基を表す
。Ｒ３　がアルコキシ基またはアルキル基である時、そ
れらの基はハロゲン原子、カルバモイル基、スルホ基ま
たはウレイド基のような置換基により置換されることが
ある。 【００１４】式（Ｉ）　中のＸ−　はアニオンを表し、
そしてＮ−カルバモイルピリジニウムカチオンの対イオ
ンになる。式（Ｉ）　のアミド形成剤が分子内塩を形成
する時、前記Ｘ−　は不要である。Ｘ−　により表され
るアニオンの例は、ハロゲン化物イオン、硫酸イオン、
スルホン酸イオン、ＣｌＯ４　−　、ＢＦ４−　、ＰＦ
６　−　等である。使用することができるアミド結合形
成剤の別のクラスは、次の式（ＩＩ）を有する： 【００１５】 【化３】 上式中、Ｒ１　，Ｒ２　，Ｒ３　およびＸ−　は、式（
Ｉ）　について定義したものと同じ意味を有する。 【００１６】本発明において使用することができるアミ
ド結合形成剤の別のクラスは、次の式を有する：【００
１７】 【化４】 【００１８】Ｒ１　は水素、１〜２０個の炭素原子を有
するアルキル、７〜２０個の炭素原子を有するアラルキ
ル、６〜２０個の炭素原子を有するアリール、−ＹＲ７
　、式： 【化５】 により表される基、または式： 【化６】 により表される基を表し、ここでＹは硫黄または酸素を
表し、そしてＲ７　，Ｒ８　，Ｒ９　，Ｒ１０およびＲ
１１は各々独立して、１〜２０個の炭素原子を有するア
ルキル、７〜２０個の炭素原子を有するアラルキル、６
〜２０個の炭素原子を有するアリール、もしくは２〜２
０個の炭素原子を有するアルケニルを表し、またはＲ８
　とＲ９　が一緒になって複素環を形成し、またはＲ１
０とＲ１１は各々独立して水素であるかもしくは一緒に
なって環構造を形成し、またはＲ１　が　　Ｒ２　もし
くはＲ３　と一緒になって複素環を形成し、Ｒ２　およ
びＲ３　は各々独立して、１〜２０個の炭素原子を有す
るアルキル、７〜２０個の炭素原子を有するアラルキル
、６〜２０個の炭素原子を有するアリール、もしくは２
〜２０個の炭素原子を有するアルケニルを表し、または
Ｒ１　もしくは互いと一緒になって複素環を形成し、Ｒ
４　，Ｒ５　およびＲ６　は、それぞれＲ１　，Ｒ２　
およびＲ３　であるように定義され、そしてＲ１　，Ｒ
２　またはＲ３と同じであるかまたは異なり、そしてＸ
−　は、アニオンまたは分子内塩を形成する化合物のア
ニオン部分を表す。 【００１９】それらの化合物は米国特許第４，８７７，
７２４　号（前掲）に記載されており、その特許の記載
は、あたかも以後に完全に記載されたように参考として
本明細書中に組み込まれる。本発明において有用なアミ
ド結合形成剤の例は次のものである： 【００２０】 【化７】 １−（４−モルホリノカルボニル）−４−（２−スルホ
エチル）ピリジニウムヒドロキシド，内部塩（ＭＳＰＨ
）【００２１】ＣＨ３ＣＨ２−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−ＣＨ２ＣＨ
２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２・ＨＣｌ　１−エチル−３−（
３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（
ＥＤＣ）　 【００２２】 【化８】 【化９】 【００２３】上式中、Ｔｆ　は「トリフレート」、即ち
トリフルオロメタンスルホン酸アニオンＣＦ３ＳＯ２Ｏ
　−　を表す。 【００２４】一般に、（ａ）　ＨＲＰのようなタンパク
質、（ｂ）　ポリアミン（またはその塩）、および（ｃ
）　アミド結合形成剤の反応は、好ましくは　０．５〜
５０　ｍｇ／ｍｌのタンパク質、ＨＲＰのモルより１０
〜１０００倍過剰に等しい量（またはＨＲＰ中のアスパ
ラギン酸とグルタミン酸の遊離カルボキシ基の数の　０
．１〜１０倍）　のアミド結合形成剤、およびアミド結
合形成剤のモルの量の１．５　〜１０倍に等しい量のポ
リアミンを含む水性反応媒質中で行われる。反応は好ま
しくは４　〜４０℃の温度で１５分〜２４時間行われる
。 反応は４　〜７　のｐＨの適当な緩衝液中で行われるだ
ろう。 アミン富化タンパク質が形成された後、それを徹底的に
透析または濾過して過剰のアミンおよびアミド結合形成
剤を除去する。所望であれば、アミン富化タンパク質を
長期保存またはその後の反応のために多数の適当な緩衝
液のいずれかに移すことができる。生物体による分解を
防ぐために防腐剤を添加することができる。 【００２５】例えば、アミン富化ＨＲＰを調製する本発
明の方法は、ＨＲＰを２−（Ｎ−モルホリノ）エタンス
ルホン酸（ＭＥＳ）のような緩衝液中に２　〜２０　ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で　５〜６．５　のｐＨにおいて溶解せ
しめることにより行われる。次いでＨＲＰ溶液を同ｐＨ
の同緩衝液中のアミンの溶液（通常はＨＲＰのモルより
約１００　〜１０００倍過剰）と混合する。前記２溶液
の同容量を混合することができる。 【００２６】少量の同緩衝液中に溶解された調製したば
かりのアミド結合形成剤の溶液を上記溶液（通常はＨＲ
Ｐのモルより約２０〜５００　倍過剰）に添加する。反
応液を転倒型回転により１〜２４時間混合または攪拌す
る。反応終了後、適当な緩衝液に対する大規模な透析に
より、過剰のアミンおよびアミド結合形成剤を除去する
。例えば、ＨＲＰの長期貯蔵安定性のためには、３−（
Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸が好ましい。メチ
オラートまたは他の適当な防腐剤を添加することができ
る。 【００２７】上記の方法に従って調製されたアミン富化
ＨＲＰは、還元型または非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り検出可能な凝集体を全く含まない。これは、本発明の
方法が別のＨＲＰ分子のカルボキシル基と共有結合を形
成するアミン富化生成物または生来のＨＲＰ上のアミン
により引き起こされ得る架橋ＨＲＰの形成を生じないこ
とを意味する。ＲＺ（Ｒｅｉｎｈｅｉｔｚａｈｌ）は吸
光度の比Ａ４０３　／Ａ２８０　である。この値はヘミ
ン対タンパク質含量の比の表示である。ヘミンの損失を
導く操作は低いＲＺ比を生じるだろう。生成物のＡ４０
３　／Ａ２８０　比は３／１で高いままであり、生来の
ＨＲＰから変わらない。これは、本発明の方法がＨＲＰ
からのヘミンの損失を導かないことを意味する。誘導化
後のＨＲＰ活性の保持率は＞８５％の活性保持率で高い
ままである。これは、本発明の方法がＨＲＰの酵素活性
の不活性化または低下を導かないことを意味する。 【００２８】本発明のアミン富化タンパク質を等電点電
気泳動（ＩＥＦ）によって特徴づけた。等電点電気泳動
法は、ｐＨ勾配中で電気泳動的に実施される。この方法
では、タンパク質はそれらの等電点（ｐＩ）に一直線に
整列するまで移動する。このタンパク質特徴づけ方法は
公知である。この方法は、製造業者の教示に従って市販
のＬＫＢ　Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ　ＰＡＧ　プレート上で
実施した。使用したプレートは３．５　〜９．５　のｐ
Ｈ域を有した（カタログ番号１８０４−１０１）。 【００２９】上記の本発明の方法にかけたタンパク質の
等電点は、天然のタンパク質のものよりも常に大きかっ
た。例えばそれらの試験において使用した天然のＨＲＰ
のｐＩは９であった。本発明の方法から得られたアミン
富化ＨＲＰのｐＩは常に９より大きく、通常は９．５以
上であった。異なる源から得られたＨＲＰのような天然
のタンパク質または他のタンパク質は異なるｐＩを有す
ることは当業者より理解されるであろう。それにもかか
わらず、アミン富化変種は常に大きいｐＩを有するだろ
う。 【００３０】アミン富化酵素で標識されたリガンドは、
イムノアッセイを実施するために設計された乾式分析要
素において特に有用である。そのような要素は、典型的
には、支持層、試薬区域および展開区域を含んで成る。 前記２区域は、単一層に組み合わせることができ、また
は別々の層であることができる。典型的な層の構成は次
の通りである： 【００３１】Ａ．　　１）免疫試薬（抗体）を有するビ
ーズ展開区域 ２）試薬（緩衝液、アミン富化ＨＲＰで標識されたリガ
ンド、等）を有するゼラチンまたはポリマー区域３）支
持体 Ｂ．　　１）ビーズ展開区域 ２）ビーズ−免疫試薬区域 ３）ゼラチンまたはポリマー試薬区域 ４）支持体 Ｃ．　　１）ビーズ展開区域 ２）結合した免疫試薬を有するビーズ層３）ゼラチンま
たはポリマー−酵素接合体区域（水溶性） ４）ゼラチン試薬区域 ５）支持体 【００３２】ＨＲＰのようなアミン富化酵素が有用であ
る幾つかのアッセイでは、１または複数の試薬は、分析
要素に含まれるよりもむしろ、分析しようとするリガン
ド試料に添加される。例えば、ジゴキシンアッセイでは
、アミン富化ＨＲＰで標識されたジゴキシンを試料と混
合する。Ｍａｕｃｋ　らの下記特許出願に従って、そし
て米国特許出願第４４４，０７９　号の第８頁に明記さ
れたようにして、大小のビーズの混合物を有する要素上
に前記混合物をスポットする。一般に前記要素は、下記
のように、支持体、該支持体上にコーティングされた或
る種の試薬を有するゼラチン層、および該ゼラチン層上
にコーティングされた展開−試薬層を含んで成る。 【００３３】 【表１】 【００３４】試料をスポットした後、未知のジゴキシン
とアミン富化ＨＲＰで標識されたジゴキシンとが小ビー
ズ上での複合体形成および固定化を目指して競争する。 次いで前記要素を洗浄溶液で処理すると、複合体形成し
なかったジゴキシンおよびアミン富化ＨＲＰで標識され
たジゴキシンは洗浄溶液の縁に移動する。ビーズ上に固
定されたジゴキシンと標識ジゴキシンは前記要素の中心
にとどまる。アミン富化ＨＲＰ標識は、試料と洗浄溶液
により湿らせた後でゼラチン層から移動するロイコ色素
および電子伝達剤である４′−ヒドロキシアセトアニリ
ドからの色素の形成を触媒する。次いで形成された色素
の密度を、好ましくは標識ジゴキシンが固定されている
要素の中心において読み取る。しかしながら、密度は洗
浄溶液により形成された半径上の他の場所においても読
むことができる。後者のタイプの読み取りは、未結合の
試薬を遠方の媒親性または固定化領域（環）に移動させ
ることを要求するかもしれない。 【００３５】前記要素は、１または複数の層、例えば別
々のまたは組み合わされた試薬／展開層、および他の必
要な添加剤、カップリング酵素等を含むゼラチン緩衝液
層を含んで成ることができる。ビーズは大小両方のポリ
マービーズを含むことができ、それらは同一のまたは異
なる層でコーティングすることができる。小ビーズは大
ビーズの前に、同時にまたは後にコーティングすること
ができる。 【００３６】前記要素の試薬層または展開層は、１もし
くは複数の合成もしくは天然の結合剤、例えばゼラチン
、または天然のコロイド、ホモポリマーおよびコポリマ
ー、例えばポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルピロ
リドン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、
ポリ（アクリルアミド−ｃｏ−Ｎ−ビニル−２−ピロリ
ドン）および類似のコポリマー、中に分散された１また
は複数の試薬を含有する指示薬組成物を含んで成ること
ができる。 【００３７】他の任意の層、例えば下塗層、放射線遮断
層等を所望により含めることができる。該要素の全ての
層は互いに液体接触しており、これは液体並びに液体中
の試薬および複合体形成していない反応生成物が近隣の
層の重なった領域間を通過できることを意味する。下塗
層、中間層等の追加の層を使用することもできる。それ
らの層は、所望であればアッセイ用試薬を含むこともで
きる。 【００３８】酵素基質は、要素中に存在するかまたは洗
浄溶液において要素に添加される。基質は液体試料より
前もしくは同時に、または結合反応の終了後に要素に添
加することができる。与えられた標識に対して適当な基
質を決定することは臨床化学に属する当業者の技術の範
囲内である。基質は、酵素標識により直接作用される物
質、または当業者に周知であるような標識の酵素反応を
伴う一連の反応に関与する物質であることができる。当
業者は、アッセイにおいて使用する酵素標識の量に対し
て適当な基質の量を調整する方法を知っているであろう
。 【００３９】試薬層は、標識の反応の結果として検出可
能な分子種を提供する１または複数の試薬を含んで成る
指示薬組成物を含有する。好ましくは、指示薬組成物は
、アミン富化ＨＲＰで標識されたリガンドと基質との酵
素反応の結果として比色的に検出可能な分子種を提供す
る比色指示薬組成物である。指示薬組成物は、酵素反応
によって検出可能な色素を生成する単一の化合物である
ことができ、または色素を生成する試薬の組合せである
ことができる。例えば、該組成物は、ロイコ色素および
アミン富化ＨＲＰを含むことができる。有用なロイコ色
素は当業界において既知であり、例えば米国特許第４，
０８９，７４７　号および米国特許第４，６７０，３８
５　号に記載されたものを包含する。比色指示薬組成物
の特定量およびそれの様々な成分は当業者の技術の範囲
内である。 【００４０】要素の層は、望ましいが任意である他の様
々な成分、例えば界面活性剤、増粘剤、緩衝剤、硬化剤
、酸化防止剤、カップラー溶剤、および当業界で既知の
他の物質を含むことができる。それらの成分の量も当業
者の技術の範囲内である。イムノアッセイは手動または
自動であることができる。一般に、液体試料中の分析物
の量は、供給ロール、チップパケットまたは他の源から
要素を取り、そして展開層の有限領域を液体の試料、例
えば１〜１００　μｌ　と接触せしめることにより測定
される。接触させる有限領域は通常は１００ｍｍ２以下
である。 【００４１】酵素標識されたリガンドが製造中に要素中
に組み込まれない場合、要素との接触と同時にまたはそ
れより前にそれを試験試料と混合することができる。い
ずれかの態様における試料の適用後、試験結果の獲得を
速めるかまたはそうでなければ促進するのに望ましいで
あろういずれかの条件、例えばインキュベーション、加
熱等に要素を暴露する。 【００４２】リガンドの量は、複合体形成したリガンド
類似体を直接検出するためにまたは酵素標識と基質との
酵素反応の結果として形成された検出可能な分子種を検
出するために適当な装置に前記要素を通過させることに
よって測定される。例えば、前記分子種は、一般に既知
である方法を使って、放射計、蛍光計または分光光度計
装置を用いて検出することができる。酵素反応において
は、生成した生成物は、例えば試験試料と接触させた有
限領域の中心における反射または透過密度を測定するこ
とにより測定される。測定される領域は、競合アッセイ
については通常直径３〜５ｍｍである。液体試料中の分
析物の量は、有限領域の中心において測定された標識の
量に逆比例する。上述したように、好ましい態様では、
複合体形成したリガンドと複合体形成しなかったリガン
ドとを分離するために分離洗浄段階を必要とする（半径
方向洗浄）。通常、標識の測定は試料の接触および洗浄
液の適用または展開の５〜１８０　秒後に行われる。 【００４３】 【実施例】次の実施例は、アミン富化ＨＲＰの製造方法
、それの免疫反応性およびイムノアッセイにおける利用
性を証明する。 実施例１−エチレンジアミンとＭＳＰＨを使ったＨＲＰ
のアミン富化 ２００ｍｇ　のＨＲＰを１０ｍｌの緩衝液に溶解せしめ
ることにより、０．１Ｍ　ＭＥＳ緩衝液，ｐＨ＝５．５
　中のＨＲＰの溶液を調製した〔ＭＥＳ　＝２−（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸〕。タンパク質濃度はＡ
４０３　測定（Ａ４０３　／ｍｇ／ｍｌ＝２．２４）に
より１５．１　ｍｇ／ｍｌであると決定された。 ＨＲＰ（２５ｍｇ，　１．６５６ｍｌ）　を１５ｍｌの
ポリプロピレン遠心管中で０．３４４　ｍｌのＭＥＳ　
緩衝液および５０ｍｇのエチレンジアミン二塩酸塩と混
合した。調製したばかりのアミド結合剤１−（４−モル
ホリノカルボニル）−４−（２−スルホエチル）ピリジ
ニウムヒドロキシド内部塩（調製したばかりのＭＥＳ緩
衝液中の７５　ｍｇ／ｍｌの溶液　５００μｌ）を添加
し、そして反応液を室温で６時間転倒回転せしめた。反
応液を０．０２Ｍ　ＭＯＰＳ緩衝液，ｐＨ＝７．０（１
０℃，　３　リットル）　〔ＭＯＰＳ＝３−（Ｎ−モル
ホリノ）プロパンスルホン酸〕に対して透析した。透析
緩衝液を２回交換した。等電点電気泳動実験の結果は、
反応後に残っている未反応のＨＲＰが無いことを示した
。 【００４４】アミン富化ＨＲＰで標識されたジゴキシン
活性化ハプテンは、ビーズ上に固定されたジゴキシン抗
体で処理した時、　１００％免疫反応性であることがわ
かった。それは以前にＭａｕｃｋ　らにより記載された
要素を使ったＥｋｔａｃｈｅｍラジアル洗浄イムノアッ
セイにおいて良好に機能した。更に次のポリアミンとペ
プチド結合形成剤の組合せに本発明の方法を適用するこ
とにより、アミン富化ＨＲＰを調製した。 【００４５】実施例２−スペルミジンとＭＳＰＨを使っ
たＨＲＰのアミン富化 実施例３−スペルミジンとＥＤＣを使ったＨＲＰのアミ
ン富化 実施例４−リジンとＭＳＰＨを使ったＨＲＰのアミン富
化 実施例５−リジンとＥＤＣを使ったＨＲＰのアミン富化
実施例６−リジルリジンとＭＳＰＨを使ったＨＲＰのア
ミン富化 実施例７−リジルリジンとＥＤＣを使ったＨＲＰのアミ
ン富化 【００４６】本発明は、天然の西洋ワサビペルオキシダ
ーゼよりも大きいレセプターとの免疫反応性を有する標
識リガンドの調製を可能にするアミン富化西洋ワサビペ
ルオキシダーゼを提供する。本発明はまた、天然に存在
するタンパク質をポリアミンまたはその塩の存在下でア
ミド結合形成剤と反応させる段階を含んで成るアミン富
化タンパク質の製造方法を提供する。 【００４７】本発明は更に、リガンドについてのイムノ
アッセイ法であって、 ａ）アミン富化酵素で標識されたリガンドを提供し；ｂ
）リガンドを含む溶液をａ）と混合し；ｃ）ｂ）からの
混合物を前記リガンドに対する既知量の抗体と反応させ
、ここで前記抗体は固体マトリックスに結合しており； ｄ）前記マトリックスを洗浄することにより、未結合の
リガンドおよびアミン富化酵素で標識されたリガンドを
除去し；そして ｅ）前記固体マトリックスに結合したアミン富化酵素の
量を測定することにより、前記標識されたリガンドの量
を測定する、段階を含んで成る方法を提供する。 【００４８】 【発明の効果】西洋ワサビペルオキシダーゼのようなア
ミン富化タンパク質は、臨床化学における標識としての
用途のために提供される。該標識は、天然のタンパク質
よりも大きい免疫反応性を有する。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　天然に存在する西洋ワサビペルオキシ
   ダーゼのものよりも大きい等電点（ｐＩ）を有する西洋
   ワサビペルオキシダーゼ。
2. 【請求項２】　　アミン富化タンパク質の製造方法であ
   って、天然に存在するタンパク質をポリアミンまたはそ
   の塩の存在下でアミド結合形成剤と反応させる段階を含
   んで成る方法。
3. 【請求項３】　　リガンドについてのイムノアッセイ法
   であって、 ａ）アミン富化酵素で標識されたリガンドを提供し；ｂ
   ）抗原を含む溶液をａ）と混合し； ｃ）ｂ）からの混合物を前記抗原に対する既知量の抗体
   と反応させ、ここで前記抗体は固体マトリックスに結合
   しており； ｄ）前記マトリックスを洗浄することにより、未結合の
   抗原およびアミン富化酵素で標識されたリガンドを除去
   し；そして ｅ）前記固体マトリックスに結合したアミン富化酵素の
   量を測定することにより、前記標識されたリガンドの量
   を測定する、段階を含んで成る方法。