JPH04230858A

JPH04230858A - 糸状対照素子付き免疫検定試験具および試験方法

Info

Publication number: JPH04230858A
Application number: JP10513791A
Authority: JP
Inventors: Carol A Miller; キャロル・エー・ミラー; Harmesh K Sharma; ハーメッシュ・ケー・シャーマ
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1990-04-12
Filing date: 1991-04-11
Publication date: 1992-08-19
Also published as: AU634026B2; EP0451686A3; EP0451686A2; CA2035595A1; AU7122391A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、分析の実施過程中に分
析試薬成分の機能を評価するため対照（コントロール、
ｃｏｎｔｒｏｌ）試薬を含む免疫試験具に関する。さら
に詳細には、本発明はフロースルー型免疫試験具に対照
試薬を施すことに関する。

【０００２】

【従来の技術】過去数年間にわたり、迅速で簡便な免疫
試験を実施する際に使用するために、多くの種々の試験
具が開発された。このような器具は特に、患者又は患者
になるかもしれない人などの、比較的不馴れな実施者自
身および病院の関係者に、免疫試験を実施せしめること
に成功している。迅速な免疫試験は、現在ｈＣＧ（ヒト
絨毛性ゴナドトロピン、妊娠）、ＬＨ（黄体形成ホルモ
ン、排卵）及び連鎖球菌Ａ（ストレップスロート、ｓｔ
ｒｅｐ　ｔｈｒｏａｔ）の判定のためのものが販売され
ている。

【０００３】フロースルー試験具は今日このタイプのも
のとしては最も普通に用いられているものである。この
ような器具は、標識された抗体試薬と結合した検出され
るべき分析対象物を含む免疫複合体を最終的に固定化す
ることが出来る試験面を持つフィルター又は膜のような
、多孔質固体支持体を有する。通常フィルターまたは膜
は、試験表面を通して液体を吸い取るように働く吸収材
と接触して作られる。液体の試験媒体が試験面に施され
、試験面を通して吸収された後、１つ以上のさらなる液
体試薬を施し、もし充分な分析対象物が試験される液体
媒体中に存在した場合には色または他の光学的な信号が
形成される。

【０００４】これらのフロースルー免疫試験具は、比較
的不馴れな人々が用いるように意図されたものであるの
で、使用する人々が正しく試験を行なっており、試薬が
正確に機能しているということをその人々に知らせる対
照装置を内蔵することの需要がある。正しくない使用方
法は、試験試料を適用したり処理したりする場合であろ
うと試験の実施各段階においてであろうと、誤ったマイ
ナスの結果、たとえば、実際には分析対象物が陽性であ
る試験試料に関しては観察されるべき信号が観察されな
いというような結果を生むことがある。同様に、試薬が
、不適当な貯蔵法又は取り扱いなどによって、品質が低
下していた場合にも誤った陰性の結果が得られることが
ある。

【０００５】使用する人に、使用者が試験を正確に実施
したか、そしてまた試薬が正しく機能したかをさまざま
な度合まで示す対照装置を内蔵するために多くの方法が
考えられて来た。最も一般的な方法は、たとえば対照試
薬を担持する粒子の懸濁液を試験面上に適用することな
どによって、適当な対照試薬を試験面上に固定化する方
法であった。この粒子は、支持体に捕獲され得るような
ものが選択され、通常、対照の応答を陽性の試験結果と
区別する形で、つまり、今日市販されている器具に見ら
れる「プラス−マイナス」又は「＋／−」の形で施され
る。

【０００６】対照特性を持ついくつかのものを含む、代
表的なフロースルー免疫試験具は、米国特許第４６２３
４６１号、４６３２９０１号、４６９３８３４号、４７
２７０１９号及び４８１８６７７号中、欧州特許公告公
報第１８６１００号、２００３８１号、２１７４０３号
、２４９４１８号、２５３４６４号及び２６９８７６号
中ならびにＰＣＴ公表公報第８７−０３６９０号中に記
載されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】フロースルー免疫試験
具に対照試薬を包含させるための先行技術の方法には重
大な欠点がある。それらは総じて所望の対照試薬を粒子
に結合させたり固定させたりするための種々の合成的方
法を用いることが要求される。さらに試薬粒子を試験面
に施すことを調整するのに複雑で感度の高い器具が必要
とされ、一方、それでもなお最終産物はしばしば試験面
上の対照試薬を施した範囲の不鮮明さの影響をこうむる
ことになる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、対照試薬が、
試験面の表面上に張り渡された糸素子に包含されるフロ
ースルー免疫試験具を提供するものである。この試験具
は液体の試験媒体、たとえば試験試料または希釈した、
もしくは処理した試験試料を含有する液体混合物などの
液体試験媒体を、多孔質の固体支持体を通過させ、そし
て固体支持体表面で固定化された分析対象物が、試薬系
と反応して試験面に色の発現のような光学的応答をおこ
すことによって検出されるような方法において、用いら
れる。これ以降に、より詳細に述べるが、免疫試験の種
々の形式はそのようなフロースルー試験具を、分離及び
検出に用いて実施される。

【０００９】一般に固体支持体の試験面は液体の試験媒
体がしみ通りやすく、分析対象物、または、たとえば、
抗体などのそれらの特定の結合相手と複合体を作ったり
結合したりした分析対象物を、固定化し得るように製造
されている。本発明の糸素子はそのような試験面に液流
接触しかつその試験面に張りわたされており、試薬系の
１つまたはそれ以上の成分と反応して、試験媒体中の分
析対象物の存在とは別個に、糸上に光学的応答を生み出
す対照試薬を包含する。

【００１０】この糸による対照は一次、二次又は三次の
対照を提供する。一次対照としては、包含される対照試
薬は分析対象物又はその類似物であって、それゆえ試薬
系のすべての成分が正しく機能している場合にのみ光学
的試験応答を提供する。二次及び三次の対照としては、
包含される対照試薬は試薬系の成分の全部より少ないも
のと反応する物質である。

【００１１】本発明は一般に「プラス−マイナス」又は
「＋／−」試験反応と呼ばれるものを提供する、フロー
スルー免疫分析試験器具において特に有用である。その
ような器具においては、陽性の試験結果は、光学応答の
「＋」のパターンの表示によって示され、一方試験が分
析対象物陰性の場合にのみ「−」パターンが表示される
。本発明の対照糸素子は、試験結果が分析対象物に関し
て真に陰性である時に、試験試薬（単数または複数）が
正しく機能していることを示す「−」パターンの基本と
して働くことが出来る。

【００１２】本発明に従った糸状対照素子の利用は数多
くの重要な利点を提供する。そのぴんと張った線状構造
のせいで、糸状対照素子は試験面のバックグラウンドに
対して明確な際立って対照的な対照応答を提供する。色
彩の応答である場合には対照応答を視覚的に認識する能
力を強化する結果となる。加えて糸状対照素子が試験面
上で完全に露出されているので、最終的な光学的応答の
全体、たとえば、色が観察しやすくなる。その上、糸状
対照素子を包含する試験具は対照試薬粒子の液体拡散に
よる試験面への定型的適用を包含する先行技術器具より
もっとたやすく製造できる。対照試薬適用の際、容量、
位置及び環境の注意深い調整を必要とする先行技術の器
具と比較して、本発明の対照糸は大量に製造され、試験
面上の位置に張り渡され固定される。また、有用な糸素
材はたやすく手に入り、対照試薬の糸素子への包含も比
較的簡単な製造操作からなる。

【００１３】本発明の試験具の二つの基本的構成要素は
（１）光学的試験応答を観察、測定する試験面を含む多
孔質固体支持体、（２）対照糸である。

【００１４】まず最初に多孔質試験支持体を考えると、
この要素の重要な特徴は、特定の免疫試験方法を実施す
る過程で施される試験媒体及び液体試薬を基本的に通過
させやすいということである。さらに、試験支持体が分
析対象物または、抗体のような特定の結合相手に結合さ
れた分析対象物、のどちらかを固定化することが出来る
であろうことである。この固定化は以下に詳細に記載す
るような多くの異なるやり方の結果として起こる。この
点で、この試験支持体が選択的に分析対象物を試験媒体
から分離し、試験面での検出に適するようにする働きを
すると言ってよい。このような検出は試験面上の光学的
反応、視覚的に観察されるか、好適な機器によりたやす
く読み取りされる、通常は色の発現を生じる、試薬系と
の反応の結果としてなされる。

【００１５】該糸状対照素子は多孔質の支持体の露出し
た試験面と液流接触状態でその上に張り渡されて存在す
るか又は固定されている。このような液流接触は液体が
この試験支持体と接触したりその中を通過する場合に糸
素子ともまた接触するか、接触することになることを意
味している。通常、対照糸は試験面に実際に物理的に接
触して保持される。この対照糸は、光学的応答を生ぜし
める検出試薬系の成分の１つ又はそれ以上（対照が一次
、二次又は他のレベルの対照であるかどうかによって）
のものとの反応する対照試薬を包含する。この光学的応
答は通常、検出系の応答と同じタイプの応答であり、施
した試薬媒体中の分析対象物の存在や量とは別個のもの
である。

【００１６】好ましくは、試験手順及び／又は試験支持
体は、検出試薬系の光学反応（試験応答）が試験面上で
の目に見える形、たとえば、小さな、中実丸もしくは点
、または他の幾何学的な形あるいは線又は棒（−）のパ
ターンであるような形に設計されるのがよい。また対照
糸上の光学的応答は試験応答と同じ性質であること、た
とえばどちらの場合においても同じ色が現われることが
好ましい。生成する効果はそれゆえ、試験応答と対照応
答は試験面上に生じる形によって区別できるということ
である。より好ましいのは、試験及び対照応答の双方が
発生した時にのみ独特のパターンを協力して生じる試験
及び対照パターンのデザインであり（例えばプラスのサ
イン又は「＋」）、このようにして「真の」陽性の応答
を発生する。検出時及び対照反応時の光学的応答は、利
用者の必要性及び要求に従って選択される。色の変化又
は色の発生もしくは消失が一般に好ましい。蛍光、化学
発光又は他の光学的な応答もまた用いられる。

【００１７】本発明の糸状対照素子を包含する典型的な
試験具は、特に比較的不馴れな人による試験の実施のた
めにデザインされる。たとえば、試験支持体は、好適な
円形又は他の形状の試験面を露出する、小さな自立構造
のプラスチック器具中に、組込まれていてもよい。通常
、この器具はまた、その下に囲いこんだ、試験支持体を
通過して機能を果たした後の液体の流れ、および格納を
容易にするために試験支持体と液流接触する、吸収性の
受け材を、組込んでいてよい。そのような器具は現在よ
く知られている。（たとえば、米国特許第４６２３４６
１号、４６３２９０１号、４６９３８３４号、４７２７
０１９号及び４８１８６７７号参照。）

【００１８】本
発明に適用し得るきわだって独創的な試験具を図に示す
。図１〜３に示すように、試験具（１０）は基台部（１
１）と、取外し式ろうとエレメント（１２）からなる。基台部（１１）は、吸収剤ブロック（１４）（たとえば
米国バージニア州リッチモンドのＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｆ
ｉｌｔｒｏｎａ　社から購入できるＴｒａｎｓｏｒｂと
いう商標名の蓄水剤のような高吸水性材料の成型品）、
およびガラス繊維フィルター（１５）（たとえば、英国
ケント州のＷｈａｔｍａｎ　Ｐａｐｅｒ　社から購入で
きるＰＤ−００８１２Ｂ１００を切ったもの）の双方を
収納する空腔（１３）を有する。キャップ（１６）は、
内側にみぞをつけて型成形され、基台部（１１）上の突
起（１７）上にスナップフィットする（ぱちんと嵌る）
ようになっており、内壁（１９）の底縁によって形づけ
られる円形開口部（１８）を有する。吸収剤ブロック（
１４）とガラス繊維フィルター（１５）を組合わせた高
さは、スナップフィットするキャップ（１６）中の内壁
（１９）の底縁によって、それらが正しい位置にしっか
りと保持されるよう、充分な寸法である。キャップ（１
６）中の内壁（１９）の底縁に取付けられて開口部（１
８）を直径方向に横切って伸びているのは対照試薬を包
含した糸状素子（２０）である。結果として、キャップ
（１６）が基台部（１１）にぱちりと嵌まると、糸状素
子（２０）は蓋の開口部（１８）中に露出しているガラ
ス繊維フィルター（１５）の表面と物理的に接触した状
態に保持される。図５は、取外し式ろうとエレメント（１２）を取り外し
た状態の、器具（１０）の上面図である。キャップの開
口部（１８）に露出しているガラス繊維フィルターの表
面（５０）上を横切って糸状素子２０が見える。

【００１９】図３及び図４に示すように、ろうとエレメ
ント（１２）の底板（２１）は十字又はプラスの印（＋
）の形状をしている開口部（２２）を有する。さらに、
ろうとエレメント（１２）をキャップ（１６）に挿入し
た場合にしっかり定位置に保持されるよう、ろうとエレ
メント（１２）は環状フランジ（２３）及びペグ（２４
）を有する。ペグ（２４）はまた、ろうとエレメントが
キャップ（１６）にはまった時に、十字形開口部（２２
）のクロスしているすじの１つが、キャップの開口部（
１８）中に露出しているガラス繊維フィルター（１５）
の表面を横切って伸びている対照糸（２０）と、ぴった
り重なるように、方向決めするような働きをする。

【００２０】クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍ
ｉｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）　検出分析法での
試験具（１０）の好ましい使用方法は次のように説明さ
れる。試験具（１０）とは別に、子宮頸管部綿球及び尿
道部線球のような検体を検体処理液に浸け、もしも検体
中にクラミジア抗原がある場合には、この抗原を放出し
、かつ露出させる。綿球を取除き、検体がクラミジア陽
性である場合には、多価のクラミジア抗原を含有してい
る液体混合物を残す。酵素標識した抗体試薬を液体混合
物に加えて、好適な時間、たとえば２０分間、クラミジ
ア抗体との免疫複合体の形成がなされるようにインキュ
ベートする。液体試験混合物を、次いで、場合によって
は予備ろ過の後に、組み立てた試験具（１０）のろうと
エレメント（１２）中に注いで、対照糸（２０）と接触
させつつ十字型開口部（２２）に流して通し、ガラス繊
維フィルター（１５）を通過させ吸収剤ブロック（１４
）へと、注ぐ。

【００２１】結果として、標識された免疫複合体は、ガ
ラス繊維フィルター（１５）の露出表面上の十字型のパ
ターンで、ガラス繊維フィルターによって保持される。次いで、フィルター（１５）の露出面を洗浄し、結合し
ていない標識抗体および存在している可能性のある妨害
物質を、吸収剤ブロック（１４）へ送るために、洗浄液
を試験具へと注ぐ。最後に適当な基質／色原体指示薬溶
液を試験器具に注ぎ、その結果糸対照素子上に色が生じ
て（もし試験工程が正しく実施されかつ試薬が機能して
いるなら）、そして陽性の検体である場合には、露出し
たフィルターの表面上に十字つまりプラス印で色が生じ
る。

【００２２】図６（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）は、キャップの開
口部（１８）に見える露出表面（５０）の上に現われる
、起りうる試験結果を説明したものである。図６（Ａ）
はクラミジア陽性の検体に対する検査の結果の露出試験
表面の状態を示すものである。ろうとエレメントによっ
て試験面上に露出された十字型部分（６０）は、対照糸
（２０）と同様に、発色する（ハッチングによって表示
）。図６（Ｂ）は本当に偽の検体の分析結果である露出
試験面の状態を示したものである。試験面の露出した表
面上には何ら色の応答が現れていないが、しかし対照糸
（２０）は発色しており、試験方法が正しく行なわれ、
かつ試薬類が機能的であったことを示した。最後に、図
６（Ｃ）は誤って操作されたかまたは機能しない試薬を
用いた場合の分析の結果の露出試験面の状態を示したも
のである。フィルターの露出面上にも、対照糸素子上に
も、偽のマイナスの結果を示す発色したパターンはあら
われなかった。このような試験結果は分析のやりなおし
を必要とする。

【００２３】一般に、本発明の糸状対照素子は単繊維材
料、または、たとえばねじった多数の繊維のような集合
束から形成される長い糸状構造からなる。選択される糸
の材料は製造する試験器具のそれぞれの必要性によって
異なってよい。糸は柔軟性とひっ張り強さに関して有利
なように選択され、対照試薬の包含の目的のために種々
の化学的性質を有してよい。天然糸を用いても合成糸を
用いもてよく、両者ともに対照試薬の、糸への、疎水性
、静電性及び共有結合性付着に有用な多数の化学的反応
性官能基を含有する。有用な糸は一般に高価ではなく、
市販のものでまにあう。本発明で用いられる糸の材料の
例としては、米国Ｎｏｒｔｈ　Ｃａｒｏｌｉｎａ州　Ｃ
ｈａｒｌｏｔｔｅのＪ．＆　Ｐ．Ｃｏａｔｓ　社、米国
マサチューセッツ州、Ｗｅｓｔ　ＷａｒｒｅｎｎのＷｍ
．Ｅ．　Ｗｒｉｇｈｔ社（Ｍｏｌｎｌｙｋｅ）のような
種々のメーカーから得られる１００％綿（セルロース）
、ポリエステル、ナイロン、亜麻及びその他である。糸
はいろいろなサイズで用いられてよく、たとえば、キル
トウェイト（Ｑｕｉｌｔ　ｗｅｉｇｈｔ）、８号（８＃
）、４０号、６０号が例としてはあげられる。ある場合
には大きな直径を有する糸がその表面で非均一的対照反
応を生み出すので、より細い糸、たとえば４０号などが
好ましい。

【００２４】選択した糸素子に対照試薬を包含すること
は、糸材料の中または上に、そのような試薬の基本的な
不溶化、定着もしくは固定化をもたらす、いかなる所望
の方法によってもなされる。通常これは非共有結合的方
法、たとえば疎水性もしくは静電的な方法、又は共有結
合による方法によってなされる。対照試薬がその関与す
る特定の検出系により、又は第一、第二もしくは他のレ
ベルの対照を必要とするのかにより広範囲に異なってい
るということを考えると、そのような異なる包含手段は
、包含される試薬の最大の反応性及び安定性を獲得する
のに有利な柔軟性を有している。たとえば低分子量ペプ
チドは、疎水性の相互作用により包含された場合には検
出系の抗体と結合するのに限られた能力を持つのみだが
、糸への共有結合の場合は本質的に充分な結合能力を保
持する。さらに、ある場合には、静電的相互作用は、疎
水性又は共有結合的相互作用と比較して、糸上への対照
試薬のより多量の包含を提供する。

【００２５】市場で手に入る糸は化学的に処理されてい
たり、１つまたはそれ以上の不明の要因（たとえば光沢
、強さ及び被染色性を与えるために化成処理をされてい
るなど）を有していることが予想される。それゆえ多く
の場合、対照試薬を包含する準備として、糸の前処理が
望ましいかまたは必要である。木綿糸の場合、典型的な
前処理は、洗剤液、結晶性構造を分解しニトロセルロー
スの痕跡を除去する塩基（たとえば１．０Ｎ水酸化ナト
リウム）、酸可溶性物質を抽出する酸（たとえば１．０
Ｎ塩酸）及び／又は有機溶媒可溶性の物質を抽出するジ
メチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、アルコール（たと
えばメタノール）又はアセトンなどの有機溶媒のいくつ
か、に浸漬することを含んでよい。処理した糸は除湿下
で保存される。対照試薬包含の性質を改良するための他
の処理方法は、この分野の一般の当業者には自明のこと
であろう。

【００２６】対照試薬を糸素子に包含させる方法の選択
は、両物質の本来の化学的性質又はそのような性質を変
化させる能力にかかっている。たとえば、対照試薬が抗
体などの蛋白質のような重要な疎水性基を含有する包含
に関しては、疎水性相互作用が信頼がおける。さらに糸
は疎水性相互作用を強化するために変性されうる。その
ような場合には、電荷の相互作用を解離させて、疎水性
結合を有利にするように、高い塩濃度条件下で糸を対照
試薬にさらすことにより包含が実施される。ある例とし
ては、蛋白対照試薬の疎水性付着は、室温において一夜
、ｐＨ９．５で高塩分緩衝液（　通常イオン濃度が約０
．２Ｍ以上）　の存在下、蛋白：糸比１：５０（重量／
重量）で行なわれる。弱く結合した蛋白は塩化グアニジ
ニンでｐＨ７．０〜７．３で洗浄して取除き、次いで高
いｐＨその次に低いｐＨでの洗浄を行ない、燐酸塩で緩
衝した食塩水（ＰＢＳ）で最終的に洗浄する。

【００２７】静電気的相互作用による包含は、本来プラ
スもしくはマイナスに荷電した化学基を含有するか、そ
のような基を導入するように化学的に変性された対照試
薬の場合にも同様に適用できる。従来の糸材料は、通常
、静電気的相互作用を得るためには荷電した化学的基の
導入を必要とする。ある特定例としては、蛋白対照試薬
の静電的付着は糸をニトロ化する（硝酸及び硫酸の水溶
液を用い、次いで９５％エタノールで三度還流して潜在
的に爆発性のニトロ基を取り除いて）ことによってなさ
れた。次いで蛋白質を、糸と共に低塩濃度、中性のｐＨ
、蛋白：糸比１：１７（重量／重量）でインキュベート
した。次いで空いている結合点が、牛血清アルブミンで
一夜インキュベートすることによってブロックされた。弱く結合した材料は低塩緩衝液で繰り返し洗うことによ
り除去された。

【００２８】対照試薬の共有結合は、糸と、包含される
特定の対照試薬双方の、天然の又は化学的に導入された
基の間の共有結合の形成を含む。この工程には非常に広
い範囲の結合方法が適用できることは明らかである。特
定の単なる例として、ここで、オキシランとシッフ塩基
の結合と水素化ホウ素還元を述べる。オキシラン結合に
おいては、０．２ｍｌのブタンジオールジグリシジルエ
ーテルが１００ｍｇの糸と１．７８ｍｇの蛋白対照試薬
と共に用いられ、大成功を収めた。反応時間は室温で約
２４時間であり、疎水性付着に関して上記した条件を用
いて洗浄した。シッフ塩基法は、蛋白対照試薬がアミノ
基を通じて結合してシッフ塩基を生成するカルボニル基
を生成するための、糸の過ヨウ素酸塩による酸化を含む
。不安定なシッフ塩基は従来の水素化ホウ素還元によっ
て安定する。

【００２９】上に示したように、対照試薬は第一次、第
二次又は第三次の対照を提供するように選択される。第
一次対照は、応答を示すためには、すべての検出試薬と
反応しなければならないものである。かくして第一次対
照はすべての試薬が正しい順序で加えられ、すべて正し
く機能しているかを示す。例えば、典型的分析対象物検
出系は酵素標識化抗−分析対象物抗体及び基質／色素原
指示薬を有している。第一次対照試薬は酵素標識された
抗体接合体と充分に結合する分析対象物そのものである
かまたは分析対象物の類似物であってよい。それゆえ、
標識された抗体接合体と基質／色素原が試験具に正しい
順序で加えられ、接合体中の抗体、酵素標識、基質／色
素原指示薬が正しく機能していれば（たとえば効果が低
下したりしていなければ）、糸に包含された対照試薬と
の反応は糸の中及び／又は上での光学的反応を発生しう
る。

【００３０】二次又は三次対照は、対照応答を提供する
ために、すべての検出試薬の内の一部のものとは反応し
ないものである。酵素標識化抗体例を用いて、第二次対
照は酵素標識及び基質／色素原指示薬が機能しているか
をテストするが、接合体中の抗体の機能はテストしない
。このような対照試薬はたとえば当業者に公知の抗−抗
体、非阻害性抗酵素抗体、標識接合体中の結合基に対す
る抗体などの標識化接合体に対する抗体又は抗体断片で
あってよい。三次対照はより少ない検出系成分の機能を
テストするものである。たとえば標識に用いられる酵素
は、第三次対照試薬として用いられ、基質／色素原指示
薬が正しく働いているかを指示する。

【００３１】本発明は分析対象物が結局は固定され、固
体の試験支持体の表面上での反応によって検出される、
いかなる免疫試験具にも適用される。たとえば、試験面
は、分析対象物に対する抗体試薬の固定化された形態か
らなることができる。試験具を通して分析対象物を含有
する検体が通過すると、固定化された抗−分析対象物抗
体に結合することにより、試験面での分析対象物の結合
又は固定化がおきる。好ましくは、抗体試薬は、試験面
を横切る糸状対照素子と協力して、検体が検出可能な量
の分析対象物を含有していた場合に、陽性の試験結果を
示す光学的反応パターンを提供するようなやり方で、露
出した試験面の限られた範囲で固定化されるのが良い。そのようなパターンは糸に対して垂直に位置する細い帯
として、抗−分析対象物抗体を試験面上に固定すること
によって提供される。それによって、試験結果が陽性の
ときは“＋”パターンの応答が生じ、試験結果が真に陰
性のときは、糸の上でのみ反応が起るので、単に“−”
パターンの応答が生ずるのみである。

【００３２】抗−分析対象物抗体を、実質的に、露出し
た試験面上全体に固定化し、しかし、対照糸の長さに添
った細長い帯及び糸に垂直方向にクロスした細い帯の限
られた範囲にのみ検体を施すことによっても、基本的に
同様な結果が得られる。このように検体を施すには、試
験具の取り外し可能な部分か、検体付着器の出口かに取
り付けたろうとエレメントを用る。

【００３３】分析対象物を検出するために固定化するた
め、抗−分析対象物抗体を試験面に固定化することの代
替手段として、分析対象物に対する抗体と分析対象物の
あいだに形成される免疫複合体を通さないように試験面
を選択することができる。このような免疫複合体は、試
験混合物に可溶又は懸濁可能であるか、または、抗体−
ラテックス粒子を試薬として用いること等により、分離
を手助けする、ラテックス又は他の粒子から構成されて
いてもよい。検体を抗体試薬、好ましくは、酵素標識抗
体接合体のような標識接合体とインキュベートした後、
試験具を通過した試験混合物は、試験面で分析対象物／
抗体複合体の固定化をきたす。好ましくは、試験面を横
切る糸状対照素子と協力して、検体が検出可能な量の分
析対象物を含有していた場合に陽性の試験結果を示す光
学的反応パターンを提供する上述のようなやり方で、試
験混合物を、露出した試験面の限られた範囲に、施すの
が良い。そのようなパターンは試験混合物を、対照糸の
長さに沿って伸びる細い帯とその糸に垂直方向のクロス
する細い帯とからなる十字形の領域のみに限って施すこ
とによって提供される。試験混合物のこのような施しは
、この試験具の取り外し可能部分であるか、検体施し部
の出口を構成する部分である、ろうとエレメントを用い
てなされる。上述のように、陽性の試験結果は「＋」パ
ターンの応答を生じ、真の負の試験結果は、糸の上での
み反応が起るので、「−」パターンの応答を生ずるのみ
である。

【００３４】本発明をこれから実例を上げて説明するが
、本発明は下記の実施例によって制限されるものではな
い。

【００３５】実施例１第一次対照糸の作成第一次対照糸は、対照抗原を綿糸に結合するための、共
有結合及び疎水性の方法を用いて製造される。徹底的に
清潔にした綿糸（上述した通り）を用い、この糸と対照
試薬を（抗原１．７６ｍｇ：糸１００ｍｇの比で）一晩
２．０ｍｌのカルボン酸塩緩衝液（０．５Ｍ　、ｐＨ９
．５）中で撹拌した。試験抗原はあらかじめ鍵穴リンペ
ットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈ
ｅｍｏｃｙａｎｉｎ，ＫＬＨ）又は牛血清アルブミン（
ＢＳＡ）に共有結合したクラミジア細胞外皮蛋白複合体
であって、抗原と担体蛋白との比は各１００：１である
、種特異性ペプチド（アミノ酸１２単位及び２０単位か
らなるもの）を含有した。紫外線照射されたクラミジア
　　トラコマティスの基本体（ＥＢ）を、ＥＢ蛋白：糸
の比が１．１２：１００（重量／重量）であることを除
いては同様の方法で糸に付着させた。吸着の後遊離のリ
ガンドを５Ｍ　塩酸グアニジン（１ｍｌで１〜２時間）
で洗浄し、次いで燐酸塩緩衝食塩水，ＰＢＳ（０．１Ｍ
Ｐ０４，０．１５ＭＮａｃｌ，ｐＨ７．４，３×２．０
ｍｌ）、炭酸塩緩衝液（０．５Ｍ　炭酸塩、ｐＨ９．５
，２ｍｌ）及びグリシン緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ３．０
，２．０ｍｌ）で順次洗浄することによって除去した。次いで、糸をＰＢＳ（３×２．０ｍｌ）で洗い、反応性
であることを証明した。つまり、フィルター上にある部
分が次第に、複合体と反応して、洗浄され、基質にさら
され、糸の部分に青い色を表わした。同様に複合体にさ
らされ、洗浄され次いで可溶性の基質にさらされた部分
は分光光度計で測定できる可溶性の生成物を生じたこと
を示した。

【００３６】前述した方法、つまり担体に非共有結合的
に結合した方法で、遊離ペプチドを用いて作られた第一
次対照糸は、糸母材に疎水的に結合した場合には、反応
性ではないことが判明した。かわって、ヒドラゾン結合
（シッフ塩基化学）を介して綿糸に共有結合したペプチ
ドは、抗体結合能力を保持した。共有結合に関しては、
洗った糸（５０ｍｇ）を２．０ｍｌ、５０ｍＭのメタ過
ヨウ素酸ナトリウムで、室温でｐＨ４．０、１０ｍＭ酢
酸緩衝液中で酸化した。一晩反応させた後、糸を酢酸緩
衝液でくり返し洗浄して過ヨウ素酸塩を除去した。ペプ
チドリガンド（２０単位として示される）１．１６ｍｇ
を、２．５ｍＭ　ＭＥＤＴＡ　　ｐＨ９．５と共に、３
ｍｌの１０ｍＭＣＯ３　／ＨＣＯ３　緩衝液中で、活性
化した２５〜３０ｍｇの糸とインキュベートした。０℃
で２４〜４８時間インキュベートした後、反応混合物を
吸い出し、１〜１．２ｍｌの１Ｍ　ＮａＢＨ４　で０℃
、４時間炭酸塩緩衝液中で遊離のカルボニル基を減少さ
せた。糸は次いで上述のようにＰＢＳで洗浄した。

【００３７】疎水性相互作用と比較して、たとえば綿や
ポリエステルの糸を出発物質として用いる、ＩｇＧの静
電的吸着は好ましい方法であることが判明した。この方
法はリガンド：糸比を減少させることにより、糸上に付
着させるリガンドの量を増加させるという利点がある。簡潔には、ポリエステル糸の場合、糸を４０％ＨＮＯ３
　、４０％Ｈ２　ＳＯ４　、２０％Ｈ２　Ｏ中に６０分
間の窒素化時間中１５℃で暴露し、次いでウサギＩｇＧ
抗−ヤギＩｇＧと反応させた。綿糸の場合、糸は６４％
Ｈ２　ＳＯ４　、２０％ＨＮＯ３　、１６％Ｈ２　Ｏに
１０〜１５分間のインキュベーション時間、１５℃で暴
露し、次いで抗体と反応させた。この対照糸は引張強さ
を保持し、次に複合体／基質試薬と接触した際に強い反
応を示した。窒素化の条件を強くし、また窒素化時間を
長くすると糸のもろさが増すので避けたほうがよい。

【００３８】実施例２第二次対照糸の製法綿とポリエステルの糸との双方が、糸の母材にウサギＩ
ｇＧ抗ヤギＩｇＧを、疎水的と静電的に結合することに
よって、第二次対照糸を製造するのに、採用された。徹
底的に清浄にした綿糸又は湿らせた糸（徹底的に洗った
ものではない）への、ＩｇＧの疎水的結合（疎水的結合
は、たとえば濃度約０．１Ｍ　と０．５Ｍ　のあいだの
ような高濃度の塩の存在によってうまくなされる。）は
次いで複合体の抗体基と結合する対照試薬を得るように
なされた。１．７６ｍｇ　　ＩｇＧと１００ｍｇ糸を混
合（２３ｍｇ　　ＩｇＧ／３２０ｍｌの０．５ＭＮａＨ
ＣＯ３　緩衝液）して製造された対照糸は均一な色を示
した。疎水的結合がこの吸着操作によってなされるとい
うことは、対照糸が、２０％のジメチルホルムアミド（
ＤＭＦＡ）に漬けられた場合にその結合能力を失うとい
う研究によってさらに確実になった。ＤＭＦＡで処理し
た場合に、共有的に結合したＩｇＧはその機能を保持す
るので、機能の喪失は蛋白変性のせいではない。

【００３９】実施例３ポリエステル対照糸の製造ポリエステル糸（５０ｍｇ）を１０〜１５分間、４〜５
℃に冷却した混合酸浴（５．０ｍｌ）中でインキュベー
トした。この混合酸浴は４０％Ｈ２　ＳＯ４　、４０％
ＨＮＯ３　及び２０％Ｈ２　Ｏからなる。硫酸の濃度は
、たとえば３０％などの低い濃度は糸の低い機能性をま
ねくので、重要である。かわって４０％以上の濃度、た
とえば５０％では３〜５分以内に糸の分解をまねく。こ
の混合酸浴を高温にすることもまた、糸の保持に有害で
ある。

【００４０】糸を前もって冷却した水５０〜１００ｍｌ
中に浸すことによって反応は中止する。酸処理した糸を
確実にすぐにＨ２　Ｏ浴に移すように注意を払わなけれ
ばならない。糸を空気にさらすと水分を吸着し、Ｈ２Ｏ
のソルボリシスによる過度の発熱が始まる。この点での
糸の温度の上昇は糸の迅速な分解の原因となる。糸は冷
たいＨ２　Ｏで繰り返し洗うことにより酸を含まなくな
る。水浴のｐＨが中性に到ったら、次いで糸を５ｍｌの
ＰＢＳ（２０ｍＭのＰＯ４　、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．０）中に浸す（２度連続してすすぐ）。

【００４１】糸を、糸のウサギ抗−（ヤギＩｇＧ）抗体
（ＲＡＧ）に対する比１００：１（重量／重量）で、Ｐ
ＢＳ中のＲＡＧ（０．１ｍｇ／ｍｌ）でインキュベート
した。吸着は室温で２４時間かけて、時々撹拌しつつ行なった
。吸着反応の後、糸を取り出し３．０ｍｌのＢＳＡ含有
溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ　）中に浸漬した。このブ
ロック反応は室温で２４時間行なわれた。糸を次いで３
．０ｍｌ　　ＰＢＳ（２０ｍＭのＰＯ４　、３０ｍＭの
ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で三度洗い、そしてＰＢＳ（０
．１Ｍ　ＰＯ４　、１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、ｐＨ７．
４）中で保存してもよい。

【００４２】実施例４糸素子への好ましい結合方法

【００４３】Ａ．共有結合この方法においては、ヒドラジドのような反応性の基を
、過ヨウ素酸による一晩の処理で活性化された糸に吸着
させる。

【００４４】綿糸（１ｇ）を、暗闇の中で、新しく調整
した過ヨウ素酸（０．７％酢酸１４０ｍｌ中に１．７ｇ
）中で、静かに撹拌した。一晩もしくはそれ以上の反応
時間の後、糸を水で洗って過ヨウ素酸を除去した。分光
光学的分析により、過ヨウ素酸の約９〜１２％が反応中
に消費され、これは糸に関して、０．５μｍｏｌｅ／ｃ
ｍ　又は１μｍｏｌｅ／ｍｇ　と等価である。

【００４５】過ヨウ素酸塩によって酸化された糸は、ア
ジピン酸ジヒドラジン（０．７％酢酸中に１４ｍｇ／ｍ
ｌ　溶液として１ｇ又はそれ以上を溶解させたもの）と
共に静かに撹拌した。一夜インキュベートした後、最終
洗浄液がＴＮＢＳテスト［Ａｂａｌ・Ｂｉｏｃｈｅｍ．
　１７５：１３９−１４４（１９８８）］によってアジ
ピン酸ジヒドラジドに関して陰性となるまで、糸を水で
充分に洗った。

【００４６】ウサギ抗−（ヤギＩｇＧ）抗体（ＲＡＧ）
（２０ｍｇ）　を、０．１Ｍ　ＮａＣｌを含有し、ｐＨ
５．５である０．１Ｍ　酢酸緩衝液２００ｍｌに対して
透析を一夜行なった。次いで４〜５時間かけて同量の緩
衝液に対してさらに透析した。溶液を、１５，０００ｒ
ｐｍ　で１０分間遠心分離し、蛋白質の量を、１ｍｇ／
ｍｌ　溶液のＡ２８０の値　１．５を用いて分光光度的
に測定した。蛋白質はメタ過ヨウ素酸ナトリウム（蛋白
量の　１．５倍）で暗室中で４℃で処理された。一晩イ
ンキュベートの後、反応を５０％グリセロール１００μ
ｌ　によって停止させ、溶液を１００ｍｌの酢酸緩衝液
に対して２〜３時間透析し、この透析を２回以上繰り返
しそして溶液を１５，０００ｒｐｍ　で　１０分間遠心
分離した。上清中の蛋白質を分光光度計で定量し、反応
により生成したカルボニル基の量をグリコーゲンをスタ
ンダードとして用いてＰＡＳ−Ｓｃｈｉｆｆ反応によっ
て定量した。典型的な手順中、Ａ５５０が０．１５−０
．２／蛋白質１ｇ又は蛋白質１ｇあたりに等しい１０〜
２２μｇ　グリコーゲンが、その糸への結合に適してい
ることが判明した。

【００４７】アジピン酸塩化した糸（１ｇ）を、１５０
ｍｌ酢酸緩衝液中で過ヨウ素化されたＲＡＧ２０ｍｇと
共に静かに撹拌する。一夜又は場合によってはそれより
長い期間反応させた後、糸を０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含
有する０．１Ｍ　ＰＯ４　，ｐＨ７．０の液で数回洗い
、室温で３〜４時間乾燥し、さらなる使用のために４℃
で保存した。

【００４８】Ｂ．疎水性結合上気したＡ部の、アジピン酸ジヒドラジドのフェニルヒ
ドラジンによる置換は、結果として非常に疎水性の糸を
、形成する。このように製造された糸は、実施例の前段
に述べた疎水結合における結合母材として、とってかわ
ることができる。

【００４９】典型的反応として、過酸素化された糸（２
２６ｍｇ）溶液を、室温で、フェニルヒドラジン溶液（
０．２Ｍ　ＨＣｌ　　１００ｍｌ中に２５３ｍｇを溶解
）中で静かに撹拌した。８０分後、糸を０．２Ｍ　ＨＣ
ｌで５回（１回につき１００ｍｌ使用）洗い、最終的に
はこの酸を除去するために水で洗浄し、さらなる使用時
まで４℃で保存した。

【００５０】本発明は特に上述のように記載し、例示し
た通りである。明らかに、本発明の多くの他の変型例や
修飾例が、本発明の範囲と要旨から離れることなく、な
されうるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】クラミジア・トラコマティスの分析実施に有用
であって本発明の糸状対照素子を内蔵する試験具の等角
投影図である。

【図２】図１の試験具の分解図である。

【図３】図１の試験具の断面図である。

【図４】図１の試験具の平面図である。

【図５】取外し式ろうとエレメントを取り外した状態の
図１の試験具の平面図である。

【図６】図１の試験具を用いて行なったクラミジア分析
試験において、キャップ開口部の露出表面上に現れうる
異なる試験応答を示すものである。（Ａ）陽性の検体の試験結果を示す。（Ｂ）真に偽の検体の試験結果を示す。（Ｃ）誤操作又は機能しない試薬を用いた場合の試験結
果を示す。

【符号の説明】

１０……本発明の試験具。１１……基台部１２……取外し式ろうとエレメント。１３……収納空腔１４……吸収剤ブロック１５……ガラス繊維フィルター１６……キャップ１８……キャップ開口部２０……糸状素子２２……十形状の開口部５０……露出面６０……ろうとエレメントにより、試験面上に露出され
た十字型

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　液体試料または試料を含む液体試験混
合物を、多孔質の固体支持体に通し；該固体支持体の表
面で固定化された分析対象物を、該表面上に光学的応答
を生じる試薬系との反応によって検定する、液体試験媒
体中の分析対象物の存在を検定する免疫試験法に用いる
試験具であって、（１）分析対象物、または、特異的結
合相手と結合した分析対象物を固定化することができる
試験面を有し、かつ、液体試験媒体が浸透できる固体支
持体；および（２）該試験面に液流接触し、かつその上
に張りわたされている糸であって、該試薬系の１つ又は
それ以上の成分と反応して、試験媒体中の分析対象物の
存在とは別個に、糸の上に光学的応答を生じさせる対照
試薬を包含している糸；を有することを特徴とする、試
験具。
【請求項２】　　光学的応答が色の発生である請求項１
の試験具。
【請求項３】　　対照試薬が分析対象物又はその類似物
である請求項１の試験具。
【請求項４】　　対照試薬が試薬系のすべての成分より
少ない成分と反応して該光学的応答を示す物質である、
請求項１の試験具。
【請求項５】　　試薬系が、分析対象物に対する標識抗
体試薬を含有し、対照試薬が該標識化抗体試薬に対する
抗体または該抗体断片である、請求項４の試験具。
【請求項６】　　試薬系が、酵素標識抗体試薬、及び酵
素標識抗体試薬中に含まれる酵素と反応して該光学的応
答を生じる基質／指示薬組成物とを含み、また、対照試
薬が該酵素である、請求項４の試験器具。
【請求項７】　　試験面が分析対象物に対する、固定化
された抗体試薬を含み、それにより、試験媒体が該試験
具の試験面を通過すると、分析対象物が、該固定化抗体
試薬と結合することによって、そのような面に固定化さ
れる、請求項１記載の試験具。
【請求項８】　　抗体試薬が、露出した試験面の限定さ
れた範囲に、かつ、試験具に接触した試験媒体が検出し
うる量の分析対象物を含有している場合には、該糸と協
同して陽性の試験結果を示す光学的応答の形を提供する
パターンを有して固定化されている、請求項７記載の試
験具。
【請求項９】　　抗体試薬が試験面上で固定化されてい
るパターンが試験面を横切る糸に垂直に位置した細い帯
であって、それによって陽性の試験結果が「＋」パター
ンの光学的応答を示し、そして陰性の試験結果が該糸の
上のみの光学的応答を生じるためにただ「−」パターン
の光学的応答を生じるだけである、請求項８の試験具。
【請求項１０】　　抗体試薬が、実質的に全露出試験面
上に固定化されている、請求項８の試験具。
【請求項１１】　　試験媒体を試験面に施す形が、該糸
の長さ方向に沿って施された細い帯と、試験面を横切っ
て延びる糸に対し垂直に施された細い帯とからなる十字
であり、それによって陽性の試験結果が「＋」パターン
の光学的応答を、陰性の試験結果が、糸の上だけの光学
的応答を生じるために「−」パターンの光学的応答を生
じるのみである、請求項１０記載の試験具。
【請求項１２】　　試験面が、分析対象物と分析対象物
に対する抗体試薬とのあいだで形成される免疫複合体を
通過させず、それによって、試験具の試験面を試験媒体
が通過すると、該免疫複合体が試験面を通過不可能なた
めに、そのような表面で分析対象物が固定化される、請
求項１の試験具。
【請求項１３】　　試験具と接触する試験媒体が検出で
きる量の分析対象物を含有する場合に、該糸と協同して
陽性の試験結果を示す光学的応答のパターンを与えるよ
うなパターンで、露出した試験面の限られた範囲に試験
媒体を施された、請求項１２の試験具。
【請求項１４】　　試験媒体を試験面に施す形が、該糸
の長さ方向に沿って施された細い帯と、試験面を横切っ
て延びる糸に対し垂直に施された細い帯とからなる十字
であって、それによって陽性の試験結果が「＋」パター
ンの光学的応答を、陰性の試験結果が、糸の上だけの光
学的応答を生じるために「−」パターンの光学的応答を
生じるのみである、請求項１３の試験具。
【請求項１５】　　多孔質の固体支持体が、吸収性の受
け材と液流接触する、フィルター又は膜からなる、請求
項１の試験具。
【請求項１６】　　糸が非共有結合的方法で対照試薬を
包含している、請求項１の試験具。
【請求項１７】　　糸が共有結合によって対照試薬を包
含している、請求項１の試験具。
【請求項１８】（ａ）液体試験試料または試料を含む液
体試験混合物を、分析対象物または特異的結合相手と結
合した分析対象物を固定化することができる試験面を有
し、かつ液体試験媒体が浸透できる、多孔質固体支持体
を通過せしめ；（ｂ）該固体支持体表面で固定化された分析対象物を該
表面上に光学的応答を生じる試薬系との反応によって検
定する、試験試料中の分析対象物の存在を検定する免疫
試験方法において、その試験面に液流接触し、かつその
上に張りわたされている糸を有する多孔質固体支持体を
用いることを含み、該糸は該試薬系の１つ又はそれ以上
の成分と反応して試験媒体中の分析対象物の存在とは別
個に、糸の上に光学的応答を生じる対照試薬を包含する
ことを特徴とする免疫試験方法。
【請求項１９】　　該光学的応答が色の発生である、請
求項１８の方法。
【請求項２０】　　対照試薬が分析対象物又はその類似
物である、請求項１８の方法。
【請求項２１】　　対照試薬が、試薬系のすべての成分
より少ない成分と反応して該光学的応答を生じる物質で
ある、請求項１８の方法。
【請求項２２】　　試薬系が、分析対象物に対する標識
抗体試薬からなり、対照試薬が該標識抗体試薬に対する
抗体またはその抗体の断片である、請求項２１の方法。
【請求項２３】　　試薬系が、酵素標識抗体試薬、及び
酵素標識抗体試薬中に含まれる酵素と反応して該光学的
応答を生じる基質／指示薬組成物とを含有し、また、対
照試薬が該酵素である、請求項２１の方法。
【請求項２４】　　試験面が、分析対象物に対する固定
化された抗体試薬を、それによって試験媒体が該試験具
の試験面を通過すると、その面において、該固定化され
た抗体試薬に分析対象物が結合することによって固定化
される、請求項１８の方法。
【請求項２５】　　抗体試薬が露出した試験面の限定さ
れた範囲に固定化されている、請求項２４の方法。
【請求項２６】　　抗体試薬が試験面上で固定化されて
いる形が試験面を横切る糸に垂直に位置した細い帯であ
って、それによって陽性の試験結果が「＋」パターンの
光学的応答を示し、そして陰性の試験結果が該糸の上の
みの光学的応答を生じるためにただ「−」パターンの光
学的応答を示すのみである、請求項２５の方法。
【請求項２７】　　抗体試薬が露出試験面の実質的に全
体の面に固定化され、試験具と接触する試験媒体が検出
できる量の分析対象物を含有する場合に、糸と協同して
陽性の試験結果を示す光学的応答のパターンを与えるよ
うなパターンに、露出した試験面の限られた範囲に試験
媒体を施す、請求項２４の方法。
【請求項２８】　　試験媒体を試験面に施す形が、該糸
の長さ方向に沿って施された細い帯と、試験面を横切っ
て延びる糸に対し垂直に施された細い帯とからなる十字
であって、それによって陽性の試験結果が「＋」パター
ンの光学的応答を、陰性の試験結果が、糸の上だけの光
学的応答を生じるために「−」パターンの光学的応答を
生じるのみである、請求項２７の方法。
【請求項２９】　　試験面が、分析対象物と分析対象物
に対する抗体試薬とのあいだで形成される免疫複合体を
通過させず、それによって、試験具の試験面を試験媒体
が通過すると、該免疫複合体が試験面を通過不可能なた
めに、そのような表面で分析対象物が固定化される、請
求項１８の方法。
【請求項３０】　　試験具と接触する試験媒体が検出で
きる量の分析対象物を含有する場合に、該糸と協同して
陽性の試験結果を示す光学的応答のパターンを与えるよ
うなパターンで、露出した試験面の限られた範囲に試験
媒体を施された、請求項２９の方法。
【請求項３１】　　試験媒体を試験面に施す形が、該糸
の長さ方向に沿って施された細い帯と、試験面を横切っ
て延びる糸に対し垂直に施された細い帯とからなる十字
であって、それによって陽性の試験結果が「＋」パター
ンの光学的応答を、陰性の試験結果が、糸の上だけの光
学的応答を生じるために「−」パターンの光学的応答を
生じるのみである、請求項３０の方法。