JPH04200473A - 精液の濃縮法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、精液の濃縮法に関する。換言すれば、本発明
は、濃縮された精液の製造法に関する。さらに具体的に
は、本発明は、受精能力の高い活動精子の濃度を高めた
ヒトおよび動物の精液を得る方法に関する。

〈従来の技術〉 従来、人工授精や体外受精のための精子を集める方法と
して、精液を遠心沈澱器にかけて回転沈澱させる方法が
国内でも国外でも広く用いられている。人工授精や体外
受精には、出来るだけ多くの精子を集め、しかも精漿を
除去する必要があるが、遠心沈澱法はこの点から好都合
だからである。

しかし、この方法は遠心力によって精子に圧力が印加さ
れるので、精子が障害を受けて受精能力が低下する可能
性があり、また上清中にかなりの数の運動精子が残るの
で、理想的方法とはいい難い。

他方、遠心沈澱を全く用いない方法としては、５ｗ１ｍ
　ｕｐ法、ガラスウール法、およびガラスビーズ法があ
る。しかし、５ｗ１ｍ　ｕｐ法は精子が自刃で泳いで上
昇してくるのを待つ方法であるため、回収率が不良であ
り、一方濾過の範啼に入るものとしてのガラスウール法
は炉液中にウールが混入しやすく、また精子がウールで
損傷を受けやすい欠点がある。

同じ濾過の範鴎に入るものと１５てのガラスビーズ法は
、従来Ｄａｙａら、　Ｂａｎｇｈａｍら、　Ｌｕｌ　ら
。

Ｍｅ　Ｇｒａｔｈらの報告があるが、良い方法であると
考えられる。この方法によれば、精液中の不動ないし死
亡精子や精子以外の夾雑物が選択的にガラスビーズの間
に残留して、生成流出液として相対的に活動ないし生存
精子の濃度の高まった精液が得られる。しかしながら、
このガラスビーズ法には、本発明者の経験したところに
よると、粘稠性の強い精液はガラスビーズの充填された
カラムを通過できないとい・う欠点がある。無理に精液
を通過させようとして圧力をかければ、遠心沈澱法にみ
られたような剪断力による精子の障害が発生する危険が
ある。

〈発明が解決し５ようとする課題〉 本発明は、上記の点に解決を与えること、より具体的に
はガラスビーズカラムによる方法の問題点を解決するこ
と、を目的とするものである。

く課題を解決するための手段〉 本発明による精液の濃縮法は、精液を下記の段階からな
る工程に付すこと、を特徴とするものである。

（イ）精液をα−アミラーゼで処理して、粘稠度を低下
させること、 （ロ）粘稠度を低下させた精液を、ガラスビーズを充填
したカラムに実質的に圧力を印加しないで通して、少な
くとも不動精子の量を減少させること、 （ハ）ガラスビーズ充填カラムを通過１．た精液を、精
ｆ−の通過しないン濾過Ｈに通して、精液中の精漿量を
減少させること。

〈発明による効果〉 精液をアミラーゼ処理したことにより、精液は粘稠度の
低下したものとなって、ガラスビーズカラムによる方法
に認められた前記の問題が解決された。

ガラスビーズカラムによる方法はガラスビーズ間の狭い
隙間を精漿共存下で活動精子は通過するが死亡精子等は
通過できないという差を利用するものであるところ、ア
ミラーゼ処理した精液にもこのような選択的通過性が保
存されていることは思いがけなかったことというべきで
ある。

く好ましい具体例の説明〉 本発明による精液の濃縮法は、下記の（イ）〜（ハ）お
よび必要に応じてさらに（ニ）の段階からなる工程から
なる。

（イ）精液をα−アミラーゼで処理して、粘稠度を低下
させること、 （ロ）粘稠度を低下させた精液を、ガラスビー”ズを充
填したカラムに実質的に圧力を印加しないて通Ｌ５て、
少なくとも不動精子の量を減少させること、 （ハ）ガラスビーズ充填カラムを通過した精液を、精子
の通過しないか過手」に通【７て、精液中の精漿量を減
少させること、 （ニ）ン濾過によって精Ｗ！ｍを減少させた粘液を精子
に適した培養液によって少なくとも１回洗滌し、出発精
液の精子濃度度量」−のａ度となるように培養液を残存
させること。

くａ−アミラーゼ〉 本発明では精液の粘稠性を低下させるために、α−アミ
ラーゼを予め作用させる。α−アミラーゼはこの目的に
よく適合し７、しかも精子の受精能を低トさせないこと
は既に報告されている。

ａ−アミラーゼは、周知のデンプン氷解酵素であって、
本発明でも各種の由来のものが使用＋ｉＪ能である。本
発明で使用するのに適したα−アミラーゼの一群は、微
生物のアミラーゼである。

本発明での前処理としてのα−アミラーゼ処理は、３６
〜３７℃程度の濃度で２０〜３０分程度の時間待なうこ
とがふつうである。

くガラスビーズカラムによる処理〉 不動精子ないし死亡精子を生存精子と分離する目的で、
ガラスビーズを充填したカラムを使用する。この際ガラ
スビーズの直径が小さすぎると、精子のｉ濾過が困難に
なるし、大きすぎると、不動精子、死亡精子も通過１７
でしまう。従ってガラスビーズの直径が重要であり、本
発明者の研究の結果、直径１００〜６００μｍのビーズ
が適当である。

ガラスビーズの充填床の長さは、５〜７ｃｍ程度が適当
である。

このようなガラスビーズ充填カラムに精液を通過させる
には、実質的に圧力を印加しないでこれを行なう必要が
ある。すなわち、精液は、重力によってカラムを通過さ
せることが望ましい。なお、極く僅かの圧力ならば印加
しても精子に対する悪影響は認められないが、本発明で
はα−アミラーゼ処理によって予じめ精液の粘稠度を低
下させであるので、そのような加圧は必要がないことが
ふつうである。

ガラスビーズ充填カラム通過の際の温度は、室温程度で
あることがふつうである。

ガラスビーズを充填したカラムは、滅菌される必要があ
る。この滅菌には、ガンマ−線照射か加熱減菌（１２１
℃２０分）が適している。なお、α−アミラーゼ液およ
び培養液もたとえばｉ濾過滅菌法により滅菌されなけれ
ばならない。

くｉ濾過／濃縮〉 ガラスビーズカラムからｔ濾過されてきた１戸液は、精
子の外に精漿とα−アミラーゼ液を含んでいる。

人工授精や体外受精のためには、アミラーゼおよび精漿
を除去することが望ましい。この目的のために、溶液を
通過させるが、精子を通過させないン濾過材を使用１７
て濾過を行なう。この時用いるン濾過材、たとえば膜、
の孔の直径は５μｍ以下でなければならない。適当なｉ
濾過材として、Ｍｌｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
　Ｄｌｖｌ−ｓｌｏｎ社のＭＩＬＬＥＸ−ＳＶがある。

濾過も、ガラスビーズカラムによる処理の場合はどでは
ないとし、でも、過大な圧力の印加を避けて行なうこと
が望ましい。

このようにして、濃縮精液が、受精能力を失なうことな
く得られる。

く精子の洗滌〉 濾過によって精漿の少なとくも一部を除去してなる濃縮
精液は、そのま＼で活動精子濃度の高い精液として人工
受精あるいは体外受精に使用することができる。

しかし、濃縮精液は、単に精漿量が減少した結果として
精子が高濃度になっているだけでは不十分なことがある
。たとえば、体外受精の場合には、精液の液相部分は培
養液と同じ組成のものであることが望ましい。また、−
射的にいっても、濃縮精液は精子以外の精液由来成分あ
るいは非精液由来成分たとえば本発明予備処理剤である
α−アミラーゼあるいは液アミラーゼによる消化産物を
含まないよう「精製コされたものが好ましいともいえよ
う。

従って、前記のようにして精漿の少なくとも−を除去１
．てなる濃縮精液を、精子の生存に適した液、たとえば
、体外受精で使用する培養液と混Ｃして前記のようなｉ
濾過材によりｉ濾過するという操作を少なくとも１回行
なう態様は、本発明による精液の濃縮法の一つの実施態
様である。

洗滌後の液は、原精液の精子濃度以上の精子濃度のもの
であるべきである。従って、（精子＋培養液）混合液を
濾過する場合には、原精液の精子濃度以上の濃度となる
ように培養液を残留させるべきである。

〈実施例〉 （］）　　採取した精液を室温で約３０分間静置【、。

た後、精液量、精子濃度、活溌精子、活動精子、および
不動精子数を算定して、その比率（％）を出し７、精子
の奇形率も測定し、記録する。

（２）　精液全量につきα　アミラーゼ溶液０．１〜０
．５ｍｌ程度を加えて、精液によく混ぜ、混合物をイン
キュベーター中で約３０分間静置する。

（３）　ディスポーザブルの注射Ｍｌ、Ｏｍｌ用の中に
、精子を通過させるがガラスビーズを通過させないフィ
ルター膜を敷き、その上にガラスビーズ（直径１００〜
６００μｍ）を充填して、注射器内筒でビーズの流出を
防ぐようにしたものを予め作成Ｌ、ガンマ−線を照射し
て滅菌または加熱減菌しておく　（以下、これをガラス
ビーズカラムと呼ぶ）。

（４）　直立したがガラスビーズカラムの中に約２ｍｌ
の滅菌培養液を流して、ビーズを洗滌しておく。流出液
はすてる。

（５）　前記のようにα−アミラーゼ消化により粘稠性
を低下させた精液を、少量ずつ直立ｌまたガラスビーズ
カラムの中へ上から流しこむ。

（６）　カラムの下には第二の滅菌ディスポーザブル注
射筒（５〜１０ｍ１）の外筒をおき、その先端には、孔
径５μ！η以下の滅菌済フィルター（例えば、Ｍｆｌｌ
ｉｐｏｒｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製ｒＭｉｌｌｅｘ−３
ＶＪ　　（孔径５．０μｍ）をつけ、その下に試験管を
置いておく。ガラスビーズカラムを通過した精液（中に
活動精子を含む）は、この第二の注射筒の中に溜り、一
部精漿は注射筒の先につけたフィルターを通過して外部
に流出するが、精子はすべて第二注射筒の中に集められ
る。

（７）　第一ガラスビーズカラムの中を精液が通過終了
したら、滅菌培養液少量（１〜２ｍ１）てカラムの中を
洗滌し、カラム中に残存する活動精ｆを第二注射筒の中
へ移動させる。

（８）　次に第二注射筒に内筒（ピストン）をはめて、
静かに相手加圧により注射筒中の液体（精漿と培養液混
合）をフィルターを通して、外部へ流出させる。この操
作により、注射筒中の液中に精子が濃縮される。

（９）　内筒をはずし、上から培養液を入れ、再び内筒
をつけて、加圧［７、注射筒内の精子を培養液で洗滌す
る。この操作を反復することにより、精漿をほとんど除
去することが出来る。

（１０）　内筒内の岐を人工授精の時には、原精液のｍ
如何にかかわらず０，５〜１．０ｍ１位に濃縮させ、Ｃ
Ｏ２インキュベーター中で３０〜６０℃の温度でインキ
ュベート［また後、女性の子宮内へ注入する。

（１１）　体外受精に使用するには、精子濃度をもう一
回算定し、適当な濃度に培養液で希釈してから、卵子を
含む液に加えて、培養し、受精させる。

出願人代理人　　佐　　藤　　−雄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、精液を下記の段階からなる工程に付すことを特徴と
   する、精液の濃縮法。 （イ）精液をα−アミラーゼで処理して、粘稠度を低下
   させること、 （ロ）粘稠度を低下させた精液を、ガラスビーズを充填
   したカラムに実質的に圧力を印加しないで通して、少な
   くとも不動精子の量を減少させること、 （ハ）ガラスビーズ充填カラムを通過した精液を、精子
   の通過しない濾過材に通して、精液中の精漿量を減少さ
   せること。 ２、請求項１の方法において、濾過によって精漿量を減
   少させた精液を精子に適した培養液によって少なくとも
   １回洗滌し、出発精液の精子濃度以上の濃度となるよう
   に培養液を残存させる工程をさらに実施する、請求項１
   に記載の精液の濃縮法。