DE60034720T2

DE60034720T2 - Röhrchen und Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma

Info

Publication number: DE60034720T2
Application number: DE60034720T
Authority: DE
Inventors: Satoru Ichikawa-shi KANEKO; Tadatoshi Kita-ku Osaka-shi Uchida
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 1999-02-02
Filing date: 2000-02-01
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2020-02-02
Also published as: DE60034720D1; AU764294B2; EP1025904B1; EP1025904A3; EP1025904A2; US6398719B1; AU1482500A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Röhrchen zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma und ein Verfahren zum Verwenden des Röhrchens, um von Menschen abgenommenes Sperma, welches zu einer assistierten Fortpflanzungstechnology (Assisted Reproduction Technology, ART) beitragen soll, zu reinigen und zu konzentrieren.
Hintergrund der Erfindung
Die Gründe für eine männliche Unfruchtbarkeit sind verschiedenartig, aber näherungsweise 90% beruhen auf einer schlechten Samenqualität in Folge einer idiopathischen Fehlfunktion der Spermatogenese. Die Behandlungsverfahren für eine männliche Unfruchtbarkeit werden grob in eine chirurgische Behandlung, eine Arzneimitteltherapie zur Aktivierung der Spermatogenese und eine ART eingeteilt. Die chirurgische Behandlung weist Verfahren wie zum Beispiel eine hohe Ligatur einer varikozelen Spermaphlebektasie, eine Samenganganastomose bei Verstopfungen des Samengebiets und dergleichen auf, welche gute Ergebnisse in dem urologischen Gebiet bewirken. Die Wirksamkeit der Arzneimittelbehandlung ist jedoch in dem Fall einer schlechten Samenqualität nicht hoch und ist sehr mühsam. Deshalb wurde für eine Behandlung einer männlichen Unfruchtbarkeit ART zur praktischen Verwendung gebracht. ART bedeutet allgemein ein Durchführen einer Befruchtung, medizinisch assistiertes Ausbilden einer Keimzelle, Befruchten, Implantation und Aufrechterhalten einer Schwangerschaft. Praktisch bedeutet dies häufig eine Befruchtung durch künstliche Befruchtung von einer Intragebärmutterbefruchtung (Intra-Uterine Insemination, IUI) bis zu einer In-Vitro-Befruchtung- Embryo-Übertragung (In Vitro Fertilization Embryo Transfer, IVF-ET) und ferner zu einer Mikroinjektionbefruchtung.
Die Anzahl der Spermien in dem Samen, welcher in die Vagina ejakuliert wird, verringert sich, während er innerhalb des weiblichen Genitaltrakts wie zum Beispiel dem Cervixkanal, der Gebärmutterhöhle und dem Eileiter aufsteigt. Schließlich erreichen näherungsweise 10 Spermien die Eileiterampulle, wo eine Befruchtung stattfindet. Die Bedeutung einer schlechter werdenden Samenqualität ist eine Verringerung der Anzahl von Spermien, welche den Ort einer Befruchtung erreichen. Deshalb weisen das Studium und die Behandlung von ART zwei Richtungen auf. Eine ist eine Verbesserung des Verfahrens für eine Befruchtung, indem das Sperma so dicht wie möglich der Oozyte mittels einer Umgehung des Anstiegs des Spermas den weiblichen Genitaltrakts hinauf bereitzustellen, um eine Befruchtung mit so wenig Spermien wie möglich zu ermöglichen. Bei einer IUI wird der Cervixkanal umgangen. Bei einer IVF-ET wird die Oozyteizelle aus dem Körper entnommen und in vitro befruchtet. Ferner läuft bei einer Intrazytoplasmaspermainjektion (ICSI) ein Spermium durch Perforation in das Zytoplasma einer Oozyte, wodurch insbesondere auch eine Befruchtung umgangen wird. Bei weiteren Verfahren wird ein Reinigen und Konzentrieren von ejakuliertem Samen unternommen, um so viel Sperma wie möglich für eine Befruchtung bereitzustellen.
Die grundlegendste Funktion des Spermas ist, die Chromosomen zu übertragen. Das Spermium wird funktional in das Akrosom, den Spermiumkopf und den Mittelteil-Schwanz unterteilt. Der Spermakopf weist das Chromosom auf. Der Mittelteil-Schwanz befasst sich mit dem Energiestoffwechsel und der Spermienbeweglichkeit. Und das Akrosom befasst sich mit einem Anhaften an und einem Verschmelzen mit der Oozyteizelle. Im Allgemei nen weist ein Vorbereiten eines Spermas, welches für eine künstliche Befruchtung vorgesehen ist, als eine Aufgabe eine Auswahl von fortschreitend frei beweglichem Sperma auf, welches in dem gereiften Normalzustand ist, was hauptsächlich die Funktion des Mittelteil-Schwanzes betrifft.
Das Sperma weist unmittelbar nach einer Ejakulation nur eine potentielle Zeugungsfähigkeit auf, aber erlangt die Möglichkeit einer Befruchtung durch physiologische und morphologische Änderungen, wie zum Beispiel Qualifizierung, Akrosomreaktion und dergleichen durch Kultivieren für einige Stunden in dem weiblichen Genitalgebiet oder in vitro. Da bei einer IVF-ET die Konzentration des für eine Befruchtung benötigten Spermas gering ist, wird es als das beste Verfahren für eine Behandlung eines Oligozoospermas und eines Astenozoospermas betrachtet. Es ist jedoch in dem Fall einer schlechten Samenqualität klinisch anschaulich, dass eine Befruchtung aufgrund des wenigen frei beweglichen Spermas unmöglich ist, was nahe legt, dass ein Verständnis der akrosomalen Funktionen, welche eine Fähigkeit zum Einleiten einer akrosomalen Reaktion aufweisen, zusätzlich zu einer Konzentration und Beweglichkeit von Spermien (die Funktion des Mittelteil-Schwanzes), welche zuvor als ein Anzeichen für eine Fruchtbarkeitsfertilität (und zwar die Fertilität in Abhängigkeit von einer Frau) betrachtet wurde, auch wichtig ist. Da ICSI bei einem schweren Fall einer schlechten Samenqualität eingesetzt wird, ist es ferner wichtig, die Funktion eines Spermiums sowie eine Bewertung eines Chromosoms im Detail zu verstehen. Eine Verbesserung des Verfahrens für eine Befruchtung führt dazu, dass die Anzahl der Spermien, welche für die Befruchtung bereitgestellt werden, verringert wird. In vitro-Einsätze einer Oozyte-Eizelle und eines Embryos werden jedoch ferner benötigt. Ferner wird bei der Vorbereitung des Spermas benötigt, eine Auswahl von Sperma durchzuführen und eine physiologische Änderung des Spermas in vitro anstatt in dem weiblichen Genitalbereich durchzuführen. Deshalb ist ein Einrichten eines verbesserten Verfahrens zum Aufbereiten des Spermas, welches der Verbesserung des Verfahrens zum Befruchten entspricht, unabdingbar.
Das Sperma, welches für eine künstliche Befruchtung vorgesehen ist, unterscheidet sich in den Bedingungen für eine Vorbereitung gemäß dem Verfahren der Befruchtung. Und zwar wird bei einer IUI zuerst eine Spermakonzentration benötigt. Bei einer IVF-ET ist eine benötigte Spermakonzentration geringer als bei einer IUI, aber hochwertigere Techniken, wie zum Beispiel eine Auswahl eines frei beweglichen Spermas, ein Entfernen von Seminalplasma und Bakterien und dergleichen werden auch benötigt (das Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma). Das Vorbereiten des Spermas wird grob in zwei Gruppen unterteilt, und zwar ein Verfahren durch Zentrifugieren und ein Verfahren durch ein Trennen, welches durch die Beweglichkeit des Patienten bewirkt wird. Bei dem Verfahren durch Zentrifugieren wurde früher ein Dichtegradientzentrifugieren unter Verwendung einer polimerisierten Saccharose, Ficoll, verwendet, aber derzeit ein modifiziertes Kolloidkieselerdegel oder Percoll. Als das Verfahren zur Befruchtung werden das einschichtige „Percoll"-Verfahren zur Spermakonzentration, das Pufferverfahren, das mehrschichtige „Percoll"-Verfahren, welches die Auswahl des Spermas ermöglicht, das Dichtegradientzentrifugierverfahren mit kontinuierlichen Stufen und dergleichen verwendet. Und als das Verfahren zum Trennen aufgrund der Beweglichkeit des Patienten wird im Allgemeinen das Aufschwimmverfahren verwendet, aber in dem Fall einer schlechten Samenqualität wird das Abschwimmverfahren, welches eine Variation des Aufschwimmverfahrens ist, verwendet.
Das Dichtegradientzentrifugierverfahren, welches Percoll verwendet, ist ein Verfahren, welches, um Komplikationen beim Betrieb der Dichtegradientzentrifugierung mit kontinuierlichen Stufen zu vermeiden, Samen direkt auf 80% Percoll, welches isotonisch hergestellt ist, schichtet und die Schichten des Samens und Percolls verrührt, um einen durchgängigen Dichtegradient für ein Zentrifugieren herzustellen. Das frei bewegliche Sperma wird in dem Sediment konzentriert.
Sperma verliert während seiner Ausbildung und Reifung Zytoplasma. Das gereifte Sperma, welches eine Beweglichkeit aufweist, weist eine höhere Dichte als Bakterien und ungereiftes Sperma mit Zytoplasma auf. Das Dichtegradientzentrifugierverfahren, welches Percoll verwendet, wird durch Trennen des gereiften beweglichen Spermas von Seminalplasma und Bakterien basierend auf einer derartigen Theorie getrennt.
Bei dem bisherigen Dichtegradientzentrifugierverfahren, welches Percoll verwendet, gibt es jedoch, da der Überstand nach dem Zentrifugieren durch Pipettieren usw. entfernt wird, einen Mangel, dass das konzentrierte Sperma in dem Sediment wieder durch die Strömung eines Seminalplasmas oder Bakterien, welche an der Wand eines Zentrifugenröhrchens anhaften, in das Sperma verunreinigt wird. Es gibt einen weiteren Mangel, dass viel Percoll zurückbleibt, da die Menge des Sediments in etwa 0,1 bis 0,2 ml beträgt. Bei einer künstlichen Befruchtung mit einem Samen eines Mannes (AIH) durch Einführen des gereinigten Spermas in die Gebärmutterhöhle wird ferner erwartet, dass das Sediment wieder mit einem Nährmedium verdünnt wird und bei einer geringen Geschwindigkeit zentri fugiert wird, um Percoll zu entfernen. Demzufolge wird die Spermarückgewinnungsrate verringert (eine Konzentration des Spermas wird verringert) und eine Beweglichkeit des Spermiums wird auch verringert. Somit weist eine Reinigung des Spermas Schwierigkeiten auf. In dem ejakulierten Samen sind ferner Fasern von Unterwäsche, an welcher Bakterien anhaften, enthalten. Demzufolge ist es ferner ein Problem, dass das Sperma mit Fasern verunreinigt ist, welche in dem Sediment nach einem Zentrifugieren enthalten sind.
Ferner ist das auf dem Markt erhältliche Percoll eine Qualität für Forschungszwecke und weist einen hohen Pegel von Endotoxin auf. Deshalb kann ein derartiges Percoll nicht zum Reinigen von Sperma verwendet werden, und in Percoll aufgelöstes Sperma kann nicht direkt zu dem Embryonährsystem für eine IVF-ET hinzugefügt werden.
Die vorliegende Erfindung wurde in Anbetracht der zuvor erwähnten Hintergrundinformation angefertigt. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma und ein Röhrchen zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma bereitzustellen, mit welchem Verunreinigungen durch Bakterien und zurückbleibendes Percoll nicht bewirkt werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ferner, ein Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma und ein Röhrchen zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma bereitzustellen, mit welchem eine hohe Spermarückgewinnungsrate ohne verringerte Spermienbeweglichkeit erzielt wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma und ein Röhrchen zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma bereitzustellen, mit welchem Endotoxin wirksam entfernt werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Als Ergebnis ausgiebiger Untersuchungen, um die zuvor erwähnten Probleme zu lösen, fanden die vorliegenden Erfinder heraus, dass eine Strömung eines Überstands verhindert werden kann, indem ein kleiner Durchmesser an dem Boden des Zentrifugenröhrchens bereitgestellt wird, um Sperma an dem Boden, welcher einen kleinen Durchmesser aufweist, durch Zentrifugieren zu konzentrieren und nach einem Zentrifugieren durch Knicken und Abtrennen des Bodens, welcher den kleinen Durchmesser aufweist, unter einer Bedingung, dass ein verringerter Druck in dem Zentrifugenröhrchen gehalten wird, zu konzentrieren. Daher wurde die vorliegende Erfindung ausgeführt.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Röhrchen zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma nach Anspruch 1.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma, welches die Schritte umfasst:

i) Füllen des zuvor erwähnten Glasröhrchens zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma mit einem Dichtegradient,
ii) Absaugen einer Samenflüssigkeit, welche mit dem gleichen Volumen einer HANKS-Lösung oder einer physiologischen Salzlösung verdünnt ist, in eine Spritze,
iii) vorsichtiges Ablassen der Samenflüssigkeit von Schritt ii) auf einen Filter zum Entfernen von Fasern, gelatineähnli cher Masse und Urolithiasis darin durch den Filter, und Schichten der gefilterten Samenflüssigkeit auf den Träger mit einem Dichtegradient in dem Glasröhrchen,
iv) nach einem Schichten der gesamten Menge der Samenflüssigkeit auf dem Träger mit einem Dichtegradient, Rühren der beiden Seiten einer Schnittstelle zwischen der Samenflüssigkeit und dem Träger mit einem Dichtegradient, um die Schnittstelle zu entfernen,
v) Zentrifugieren des Glasröhrchens aus Schritt iv),
vi) nach dem Zentrifugieren Bereitstellen der elastischen Blase in einem zusammengedrückten Zustand an dem offenen Ende des Glasröhrchens und Erhalten eines Sediments, welches die gereinigte und konzentrierte Samenflüssigkeit und den Träger mit einem Dichtegradient enthält, durch Knicken und Abtrennen des Bodens mit einem kleinen Durchmesser von dem Glasröhrchen und
vii) Entfernen des Trägers mit einem Dichtegradient, um nur das Sediment zurückzulassen.

Hierin ist beispielhaft der Träger mit einem Dichtegradient, ein modifiziertes Kolloidalsilica, ein Percoll oder polymerisierte Saccharose, Ficoll und dergleichen. Vorzugsweise wird das Percoll behandelt, um Endotoxin zu entfernen, und wird dann zu einem Nährmedium gegeben, um isotonisch gemacht zu werden, und weist eine Konzentration von 90 bis 98% auf. In der vorliegenden Erfindung bedeutet „Percoll" ein Kolloidalsilicasol mit einer Polyvinylpyrrolidonbeschichtung.
Die Bedingung eines Zentrifugierens kann verschiedenartig gemäß der gewünschten Aufgabe gewählt werden und ist vorzugsweise 1,000 × g für 20 bis 30 Minuten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Draufsicht, welche eine Ausführungsform des Röhrchens zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma der vorliegenden Erfindung zeigt.
2 ist eine Querschnittsansicht entlang II-II des in 1 gezeigten Röhrchens.
3 ist eine Figur, welche die Verwendung des in 1 gezeigten Röhrchens zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma erklärt.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Zuerst wird unter Bezugnahme auf 1 und 2 das Röhrchen zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma der vorliegenden Erfindung erklärt.
1 ist eine Draufsicht, welche eine Ausführungsform des Röhrchens zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma der vorliegenden Erfindung zeigt. 2 ist eine Querschnittsansicht entlang einem Schnitt II-II des in 1 gezeigten Röhrchens.
Wie in 1 und 2 gezeigt, umfasst das Röhrchen zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma der vorliegenden Erfindung ein Glasröhrchen 1 mit einem offenen Ende 11 und einem Boden mit einem kleinen Durchmesser 12, und eine elastische Blase 2, welche an dem offenen Ende 11 des Röhrchens 1 vorzusehen ist. Hierin ist ferner ein geschwächter oder angreifbarer Teil (Abtrennteil) 13 in dem Boden mit einem kleinen Durchmesser 12 vorgesehen, um zu ermöglichen, dass der Boden mit kleinem Durchmesser 12 einfach geknickt und abgetrennt werden kann.
Das Röhrchen 1 weist das offene Ende 11 und den Boden mit kleinem Durchmesser 12 auf. Da das gesamte Röhrchen aus Glas gefertigt ist, ist es möglich, eine Sterilisation bei ungefähr 300°C für eine Stunde durchzuführen, um die organischen Verunreinigungssubstanzen, wie zum Beispiel Endotoxin, zu inaktivieren. Da das Röhrchen aus Glas gefertigt ist, kann ferner der Boden 12 nach einem Zentrifugieren geknickt und abgetrennt werden. Die Größe des Röhrchens 1 beträgt 5 bis 20 mm im Innendurchmesser des offenen Endes 11 und 40 bis 170 mm in der Länge. Die Größe des Bodens 12 beträgt 15 bis 40 mm in der Länge und 2 bis 7 mm im Innendurchmesser. Gemäß dem Volumen des Spermas (üblicherweise 5 bis 10 μl) ist der Abtrennteil (der angreifbare Teil) 13 vorzugsweise an einer Position von näherungsweise 10 bis 30 mm von dem Boden des Röhrchens 1 vorgesehen.
In 1 und in 2 ist die elastische Blase 2 an dem offenen Ende 11 des Glasröhrchens 1 vorgesehen und kann davon entfernt werden. Beim Sammeln von Sperma ist die elastische Blase 2 an dem offenen Ende 11 des Röhrchens 1 vorgesehen, wird von Fingern einer Bedienperson zusammengedrückt und aus dem zusammengedrückten Zustand losgelassen. Dann kann die ursprüngliche Form der elastischen Blase 2 durch ihre Elastizität wieder hergestellt werden und ein verringerter Druck wird in dem Röhrchen 1 erzeugt. Und wenn der Boden mit kleinem Durchmesser 12 geknickt und abgetrennt wird, um den Boden zu öffnen, wird die Flüssigkeit (Überstand), welche in dem Röhrchen 1 an einer höheren Position als der geknickte und abgetrennte Teil ist, aufgrund des verringerten Drucks vor einem Ausströmen geschützt. Ferner ist Sperma, welches sich in dem Boden des Röhrchens befindet, durch das Zentrifugieren in dem Sediment in ein Volumen von näherungsweise 5 bis 10 μl konzentiert. Deshalb ist es möglich, das Sediment möglichst nur durch Entfernen der Schicht des Percolls zurückzulassen. In dem Fall, dass das Sperma in ein Nährmedium gemäß der Aufgabe resuspendiert wird, kann der Einschluss von Percoll aufgrund des kleinen Durchmessers des Röhrchens minimiert werden.
Als nächstes wird unter Bezugnahme auf 3 das Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma der vorliegenden Erfindung erklärt.
Zuerst wird Samenflüssigkeit unter Bestätigung des Namens, der Nummer der Patientenkarte und dergleichen aufgenommen und grob bezüglich der Erscheinung untersucht (um es auf Hämatospermia und dergleichen zu überprüfen). Dann wird unter Bestätigung des Namens des Patienten die Samenflüssigkeit in eine 5 ml Wegwerfspritze gesaugt, die Menge davon gemessen und wird dann einige Male von einer Spritze aufgesaugt und abgelassen, um die Samenflüssigkeit zu verflüssigen und zu homogenisieren. Nach der Verflüssigung und Homogenisierung der Samenflüssigkeit wird die Samenflüssigkeit auf einen Objektträger getropft, um die Anzahl und Beweglichkeit der Spermien festzustellen. Dann werden der Zustand einer Verflüssigung der Samenflüssigkeit und ein Beinhalten von einem Gel festgestellt. Demgegenüber wird das Röhrchen 1 der vorliegenden Erfindung zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma mit dem Percoll gefüllt, welches isotonisch gemacht wurde und eine Konzentration von 90 bis 98% aufweist (Schritt i). Dann wird die Samenflüssigkeit mit dem gleichen Volumen einer HANKS-Lösung oder einer physiologischen Salzlösung gemischt und wiederholt von einer Spritze S aufgesaugt und abgegeben, um sie zu verdünnen, und die verdünnte Samenflüssigkeit wird in die Spritze S aufgesaugt (Schritt ii). Die Samenflüssigkeit wird vorsichtig auf das Entfernungsfilter F abgegeben, welcher in das offene Ende 11 des Röhrchens 1 eingesetzt ist, um Fasern, gelatineähnliche Masse, Urolithiasis und dergleichen darin durch das Entfernungsfilter F (3-1) zu entfernen, und die gefilterte Samenflüssigkeit wird auf das Percoll geschichtet ((Schritt iii), 3-2). Nach einem Schichten des gesamten Volumens der Samenflüssigkeit auf das Percoll werden beide Seiten der Schnittstelle zwischen der Samenflüssigkeit und dem Percoll in dem Röhrchen 1, üblicherweise ein Abstand von 2 cm von beiden Seiten, von zum Beispiel einem L-förmigen Stab verrührt, um die Schnittstelle zu entfernen ((Schritt iv), 3-3).
Dann wird das Röhrchen 1 zum Beispiel bei 3000 U/m (1.000 × g) für 20 bis 30 Minuten zentrifugiert. Durch Zentrifugieren wird Sperma an dem Boden mit kleinem Durchmesser 12 des Röhrchens 1 konzentriert ((Schritt v), 3-4). Nach dem Zentrifugieren wird eine elastische Blase 2 an dem offenen Ende 11 des Röhrchens 1 in dem zusammengedrückten Zustand bereitgestellt und dann Sperma durch Knicken und Abtrennen des Bodens mit kleinem Durchmesser 12 an dem Abtrennteil 13 erhalten ((Schritt vi), 3-5). Bei dem Knicken und Abtrennen des Glases ist es, um Verletzungen dadurch zu vermeiden, vorzuziehen, das Glas, welches für die (in 3 nicht gezeigte) Verwendung eine Spitze davon an der unteren Position des Röhrchens 1 aufweist, vorsichtig zu knicken und abzutrennen. Da das erhaltene Sperma in näherungsweise 10 μl an der Unterseite des Röhrchens konzentriert ist, ist durch Entfer nen der Schicht des Percolls möglichst nur das Sediment übrig ((Schritt vii), 3-6). Gemäß der gewünschten Aufgabe kann das Sperma in einem Nährmedium resuspendiert werden (3-7). Der obere Teil des Röhrchens 1 und der Überstand werden entsorgt, aber die elastische Blase kann wiederholt verwendet und dann gewaschen und beibehalten werden.
Beispiel 1
Selbst entnommene menschliche Samenflüssigkeit wurde für eine Verflüssigung bei Raumtemperatur für näherungsweise 30 Minuten gelagert, bezüglich der allgemeinen Samenflüssigkeitsqualität beobachtet, gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigt und konzentriert (3000 U/m, 20 Minuten), und eine Spermakonzentration, Spermienbeweglichkeit und eine saure Phosphataseaktivität (Acid P) gemessen. Die Ergebnisse, wie sie in Tabelle 1 gezeigt sind, wurden erhalten.

Während der Beobachtung wurde die Temperatur bei 37°C durch Verwenden einer transparenten Inkubationsscheibe für ein Mikroskoptischchen gehalten und die Spermakonzentration wurde durch Verwenden einer Makler-Spermaberechnungsscheibe gemessen. Die Spermienbeweglichkeit (Beweglichkeit, Freibeweglichkeitsrate) wurde durch Anwenden von 10 μl einer Samenflüssigkeit auf einer Kammer, welche mit menschlichen Albuminserum für die Beobachtung der Spermienbeweglichkeit behandelt wurde, beobachtet und von einer bildgebenden Computeranalysevorrichtung gemessen (CASA 3000, hergestellt von Cell Soft). Darüber hinaus wurde die saure Phosphataseaktivität durch Acid Phosphatase KII Test Wako (hergestellt von Wako Chemicals) als ein Reagens für eine Messung der saure Phosphataseaktivität (Acid P) und 4,6 mmol Dinatriumphenylphosphat als ein Substrat bei 37°C gemessen. Tabelle 1

	Ursprüngliche Samenflüssigkeit	Gereinigte und konzentrierte Spermasuspension
Spermakonzentration (Sperma/ml)	35 ± 26 × 10⁶	2247 ± 1203 × 10⁶
Beweglichkeit (%)	38,4 ± 11,8	68,8 ± 15,4
Freibeweglichkeitsrate des Spermiums (μm/s)	28,8 ± 7,23	30,8 ± 6,36
Acid P (KA Einheit/ml)	25,8 ± 23,4 × 10⁴	12,4 ± 9,45

Hinweis: Die Menge der ursprünglichen Samenflüssigkeit betrug 2,4 ± 1,1 ml. Nach einem Reinigen und Konzentrieren gemäß dem vorliegenden Verfahren wurde die Spermasuspension in einer HANKS-Lösung auf ein Volumen von 10 ml resuspensiert.
Bei dem vorliegenden Verfahren wird, unter Berücksichtigung, dass unreifes Sperma eine schlechtere Beweglichkeit und Zeugungsfähigkeit aufweist, da es viel Zytoplasma enthält, nur reifes Sperma, welches eine bessere Beweglichkeit und Fruchtbarkeit aufweist und dessen Zytoplasma verschwunden ist, selektiv zurückgewonnen. Demzufolge wurde eine dutzendfache Konzentration des Spermas, wie in Tabelle 1 gezeigt, erzielt. Die Spermienbeweglichkeit wurde durch Reinigen auch verbessert. Die Entfernungsrate eines Seminalplasmas wurde, wenn man die saure Phosphataseaktivität der erhaltenen Samenflüssigkeit mit der der ursprünglichen Samenflüssigkeit vergleicht, erheblich verringert. Deshalb wird angenommen, dass das Seminalplasma durch Reinigen vollständig entfernt werden konnte.
Wie zuvor erklärt ist klar, dass eine Befruchtungsrate gemäß der vorliegenden Erfindung verbessert werden kann, da das Sperma, welches eine hohe Beweglichkeit aufweist, selektiv mit einer hohen Spermarückgewinnungsrate rückgewonnen wird.

Claims

Röhrchen zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma, umfassend ein Glasröhrchen (1) mit einem offenen Ende (11) und einem Boden mit einem kleinen Durchmesser (12) und eine elastische Blase (2), welche entfernbar an dem offenen Ende (11) des Röhrchens (1) vorgesehen ist, wobei der Bodenabschnitt mit einem kleinen Durchmesser (12) einen geschwächten Abschnitt (13) zum Knicken und Entfernen des Bodens mit einem kleinen Durchmesser (12) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das offene Ende (11) des Röhrchens (1) einen Innendurchmesser von 5 bis 20 mm aufweist, dass das Röhrchen (1) eine Länge von 40 bis 170 mm aufweist, und dass der Bodenabschnitt mit einem kleinen Durchmesser (12) eine Länge von 15 bis 40 mm und einen Innendurchmesser von 2 bis 7 mm aufweist.
Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma, welches die Schritte umfasst: (i) Füllen des Glasröhrchens zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma nach Anspruch 1 mit einem Träger mit einem Dichtegradient, (ii) Verdünnen einer Samenflüssigkeit mit einer äquivalenten Menge einer HANKS-Lösung oder einer physiologischen Kochsalzlösung, (iii) Bereitstellen der Samenflüssigkeit von Schritt (ii) auf einem Filter zum Entfernen von Fasern, gelatineähnlicher Masse und Urolithiasis darin und Schichten der gefilterten Samenflüssigkeit auf dem Träger mit einem Dichtegradient in dem Glasröhrchen, (iv) nach einem Schichten der gesamten Menge der Samenflüssigkeit auf dem Träger mit einem Dichtegradient, Rühren der beiden Seiten einer Schnittstelle zwischen der Samenflüssigkeit und dem Träger mit einem Dichtegradient, um die Schnittstelle zu entfernen, (v) Zentrifugieren des Glasröhrchens aus Schritt (iv), (vi) nach dem Zentrifugieren Bereitstellen der elastischen Blase in einem zusammengedrückten Zustand an dem offenen Ende des Glasröhrchens und Erhalten eines Sediments, welches die gereinigte und konzentrierte Samenflüssigkeit und den Träger mit einem Dichtegradienten enthält, durch Entfernen des Bodens mit einem kleinen Durchmesser von dem Glasröhrchen, und (vii) Entfernen des Trägers mit einem Dichtegradient, um im Wesentlichen nur das Sediment zurückzulassen.
Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma nach Anspruch 2, wobei der Träger mit einem Dichtegradient Kolloidalsilica oder polymerisierte Saccharose ist.
Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma nach Anspruch 2, wobei der Träger mit einem Dichtegradient Kolloidalsilica mit einer Polyvinylpyrrolidonbeschichtung ist.
Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Sperma nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Träger mit einem Dichtegradient, bevor er in das Glasröhrchen gefüllt wird, behandelt wird, um Endotoxin zu entfernen, und dann zu einem Nährmedium gegeben und isotonisch gemacht wird und eine Konzentration von 90 bis 98% aufweist.