JPH04197185A - 酵母発現ベクター及びこれを用いた誘導的発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト・マンガンスーパーオキシドディスムター
ゼ（以下ヒトＭｎＳＯＤと略す）を酵母で誘導的に発現
させる発現ベクター及びその発現ベクターで形質転換し
た組換え酵母に係る。また本発明は上記の組換え酵母を
増殖させ、本発明の特別な誘導条件で誘導することによ
り活性型ヒトＭｎＳＯＤを高発現させ、同ＳＯＯを分離
・精製して得る活性型ヒトＭｎＳＯＤ製造方法に関する
。

〔従来の技術〕

本発明に関連する技術としては、ヒト？１ｎＳＯＤを酵
母サッカロミセス・セレビジエを宿主とし、Ａｎ旧プロ
モーターを使用して酵母菌体内にあるいはミトコンドリ
ア内に発現させた例（文献１）がある、シフしながら、
ＡＤ旧プロモーターを用いて酵母菌体内でヒ）　ＭｎＳ
ＯＤを発現させた場合、発現量は０．５■／ｌ（文献１
）と低いものであった。本発明者らもＡＤＨ＋プロモー
ターを用いた発現ベクターを用いて組換え酵母でヒ）　
ＭｎＳＯＤを発現させ、発現量を抗体法で測定したとこ
ろ、発現量は０．４ｍｇ／Ｉｌで低いことが確かめられ
、しかも発現産物のＳＯＤ活性についてネイティブゲル
電気泳動−活性染色法（文献２）で調べたところ、ＳＯ
Ｄ活性は検出されず、発現産物にＳＯＤ活性がないか低
比活性である結果を得た。これらの結果から従来の酵母
を宿主としたヒ）　ＭｎＳＯＤを製造する技術は未完成
で実用的な技術とはいえなかった。

ヒトＭｎＳＯＤを産生ずる他の技術としては、大腸菌を
宿主とした例（文献３）がある。

単純蛋白の発現に於ては大腸菌を宿主にして問題はない
、しかし、複雑な高次構造を有する、あるいは糖鎖等２
次的な修飾を受けた蛋白の発現の場合、より高度な機能
を有する宿主である酵母あるいは動物細胞を用いること
で良い結果を得ることができる（文献４）０例えば、ヒ
トＣｕＺｎ５ＯＤは酵母を宿主とすることでＮ末端メチ
オニン除去とそれに続くＮ末端アセチル化の翻訳後修飾
が正しくなされた（文献５）、また、Ｂ型肝炎ウィルス
表面抗原の抗原性のある粒子形成は大腸菌宿主では良い
結果が得られなかったが、酵母で良い結果が得られた〔
文献６）、複雑な構造を有する糖蛋白であるｔＰＡの場
合、大腸菌宿主では活性型蛋白はほとんど産生されず（
文献７）、動物培養細胞で良い結果が得られた（文献８
）。

ヒトＭｎＳＯＤは分子量２１．５　ｋＤａでＭｎが配位
してなる単量体が会合して４量体となり、高次構造を有
する金属蛋白であることが知られている（文献９）が、
大腸菌を宿主としてヒ）　ＭｎＳＯＤを産生させた例で
は４量体の形成はみられず、２量体であった（文献３）
。

ヒ）　ＭｎＳＯＤのＳ−３結合による立体構造の維持、
文献４に示される各種の翻訳後修飾については今だ解明
されていないが、他のヒト由来有用蛋白の例から類推す
るとそれらの存在する可能性は高く、従ってヒトＭｎＳ
ＯＤの製造は大腸菌を宿主とするより酵母を宿主とする
ことで立体構造、未知の修飾について目的物に有用性が
生じると判断された。

また、大腸菌を宿主とする場合、酵母には認められない
が（文献１０）、菌体に発熱等副作用の原因となるエン
ドトキシンが大量に含まれる為、エンドトキシン除去を
目的とした特別の精製ステップが必要となり、目的物を
医薬として使用する場合、精製工程が煩雑となる（文献
１１）。

以上に示した立体構造、未知の修飾及びエンドトキシン
混入といった点から宿主として大腸菌は酵母に及ばない
ことにより、酵母を宿主としてヒ）　ＭｎＳＯＤを製造
することに利点が認められるが、従来の酵母を宿主とし
た方法では生産量が低く、場合によっては目的物に活性
が認められず、実用的な技術になりえていない。

このように、酵母を宿主としてヒトＭｎＳＯＤを製造す
ると、大腸菌を宿主として製造する場合に比べ、宿主の
性質からしてよりすぐれた品質の目的産物が得られると
考えられた。しかし従来技術の酵母を宿主したヒトＭ：
＋三〇〇の生産量は低く、場合によっては活性も認めら
れず実用的な技術になりえてないことも上記−２べた通
りである。

〔発明が解決しようと７る課題〕 本発明の目的は酵母を宿主として活性の高いヒ）　Ｍｎ
ＳＯＤを大量に産生する方法を提供することを目的とす
る。

本発明の他の目的ハ正記の方法を実施するに有用な発現
ベクターとｌ［”Ｊえ酵母を提供することである。

〔課題を解決するため２手段〕 本発明者らは、酵母を宿主として用い活性型のヒ）　Ｍ
ａｓｏｎの高発現を臣的とし、発現ベクターの構成につ
いて、またその発現ベクターで特定の酵母を形質転換し
岨換え酵母を得、またその組換え酵母を増殖させた後に
目的物を誘導的に発現させる誘導条件について、あるい
はそれらの組合わせについて鋭意研究を行った。

その結果、通常は発現量が低く、誘導条件下で発現量が
高まる酵母Ｐ■５プロモーターを使用し、他の要素も入
れてヒ）　ＭｎＳＯＤの誘導的発現ベクターを構築し、
誘導のかかり易い酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｉ
ｅｕ２．　ｐｈｏ８０　）　株に同発現ベクターを導入
して組換え酵母を得、特定の誘導条件を採用して目的と
する活性型ヒトＭｎＳＯＤの高いレベルでの産生を可能
することにより上記課題を解決し本発明を完成した。

即ち、本発明は、酵母ＰＨ０５プロモーターとヒトＭｎ
ＳＯＤをコードする構造遺伝子と酵母ターミネータ−と
を有効に連結した発現ユニット、酵母複製起点、酵母Ｌ
ｅｕ２ｄ選択マーカー、大腸菌複製起点及び大腸菌選択
マーカーを含む、酵母でヒ）　ＭｎＳＯＤの誘導的発現
を可能とする発現ベクター、該発現ベクターで宿主とす
る酵母を形質転換して得た組換え酵母および該組換え酵
母を増殖させ、次にマンガンイオン含有、低すンｉ！１
ｌｆｉ度の富栄養培地を用い、酸素ガスあるいは酸素ガ
スを添加した空気で通気する条件下で誘導的に目的とす
る活性型ヒトＭｎＳＯＤを組換え酵母に産生せしめ、同
酵母菌体より目的物を分離・精製することにより活性型
ヒトＭＩＩＳＯＤを製造する方法である。

本発明によると、有機化合物９酸化や細胞、組織の破壊
といった悪影響を及ぼす原因物賃となる活性酸素を除去
し、その結果有機化合ｓ＃Ｏ抗酸化あるいは生体の保護
に役立つ酵素の１つであるヒトＭｎＳＯＤを酵母で効率
的に製造でき、得られたヒトＭｎＳＯＤは医薬、診断薬
、化粧品あるいは工業用酵素とじて使用できるので産業
上有用である。

以下に本発明の具体例を詳細に説明する。

ヒトＭｎＳＯＤは、ＭｃＣｏｒｄらによってヒト肝臓よ
り精製され諸性質が調べられた（文献９）、それによる
とヒト門ｎ５ＯＤは門ｎが配位し二金属酵素で４量体で
あった。

ヒトＭｎＳＯＤのアミノ酸配列は１９７７年にＨａｒｒ
ｉｓと５ｔｅｉｎｓａｎによりＮ末端より約２６アミノ
酸の配列が決定され（文献１２）、さらに１９８４年に
Ｂａｒｒらによって１９６のアミノ酸配列が決定された
（文献１３）。

ヒトＭｎＳＯＤをコードするｃＤＮ３−ｚ、Ｂａｒｒら
の決定したアミノ酸配列を基にして由来の異なるヒト組
織、細胞よりクローン化され、それぞれ２．３のアミノ
酸置換がある３種類のヒト門ｎ５ＯＤアミノ酸配列が明
らか二；った（文献１４．１５．１６）。

本発明の′ヒトＭｎＳＯＤをコードする構造遺伝子」は
、例えばヨ０らの発表したヒト肝ｆｉｇ　ｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａ由来遺伝子（文献１５）の配列と同一のものが挙げら
れるが、ヒトの組織あるいは培養細胞から作製したｃＤ
ＮＡあるいは化学合成で得た遺伝子、あるいはそれら両
者を組換えて得た半合成遺伝子からなるヒトＭｎＳＯＤ
をコードする構造遺伝子ならいかなるものでも良い。

ヒトＭｎＳＯＤｃＤ％３にコードされたポリペプチドの
アミノ酸配列より１番目のＭｅｔから２４番目Ｇｉｎま
での２４アミノ酸で構成されるシグナルペプチドを除去
することで、Ｌｙｓから始まる１９８アミノ酸から成る
成熟ヒ一！＋１１３０１）のアミノ酸配列が得られる（
文献１３、Ｉ５ン。

後述の実施例でばヒ）　ＭｎＳＯＤ成熟ペプチドの１番
目のアミノ酸のＬｙｓの直前にＮｅｔが付加した、いわ
ゆるＭｅｔ−ヒトＭｎ５Ｏ［］に対応する遺伝子を「ヒ
トＭｎ５Ｏ（ｌをニードする構造遺伝子」として酵母菌
体内に発現させる目的で使用したが、Ｍｅｔ付加のない
完全な″ｆｉ、熟ヒトＭｎ５ｏＤペプチドの産生を目的
とした場合、ヒトＭｎＳＯＤのシグナルペプチドあるい
は酵母由来シグナルペプチドの付加したヒトＭｎＳＯＤ
アミノ酸配列に対応する構造遺伝子を使用することにな
るが、そのような構造遺伝子も「ヒトＭｎＳＯＤをコー
ドする構造遺伝子」に含める。

本発明でいう「発現ベクターＪとは、ある遺伝子を発現
するべく構築されたベクターであり、その本体はＤＮＡ
である。一般にこの種のＤＮＡは環状二重鎖の形態すな
わちプラスミドとＩＰ通言われているものである。

本発明に用いる「酵母ＰＨ０５プロモーターゴを得るに
は例えば次のような方法が挙げられる。酵母ｐｈｏ５遺
伝子を含む８ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片（文献１７．１８
）のうち約２．８ｋｂｐ長のＥｃｏＲ７−Ｂａｄｌ−５
ａｌｌ断片文献１Ｂ）を大ｍ菌プラスミド（ρＢＲ）に
組込み、ＢａｔｘＦ１１部位を人為的に欠失して得た断
片を材料として用いる。ｐＢＲ配列を含むプラスミドに
組込まれたｐｈｏ５遺伝子のＮ末端付近のアミノ酸配列
をコードする配列を削除する目的で、５ａｌｌで切断後
Ｂａ１−３１消化を行い、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼテＸｈ
ｏｌ　ＩＪ　７カーＤＮＡを連結し、目的遺伝子のクロ
ーニング部位（Ｘｈｏ１部位）を作成する。これにより
ＰＨ０５転写調転写域、ｐｅａｓプロモーター領域及び
同プロモーターの転写開始部位（文献１９）の直下まで
の配列からなるｒ　ＰＨ０５プＯ−［−一ター」を、Ｅ
ｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌ断片とシテ得ることができる。もち
ろんＰＨ０５プロモーター領域及びその転写開始部位を
含み、ＰＨ０５構造遺伝子（Ｎ末端メチオニン以下）を
含まないいわゆる「ＰＨ０５プロモーター」なら上記の
ものに限らずいかなるものでも良い。

本発明に用いる「酵母ターミネータ−」は、例えばＡＤ
ＨＩターミネータ−（文献２０）を使用できるが、酵母
由来の適当な転写終了及びポリＡ付加のシグナルを内在
し、酵母、で働くターミネータ−ならいかなるものでも
良い。

本発明では「発現ベクター」を構築するには、酵母ＰＨ
０５プロモーターをヒトＭｎＳＯＤをコードする遺伝子
に結合するが、その際ヒ）　ＭｎＳＯＤが酵母ＰＨ０５
プロモーターの発現制御下になる欅に開始コドンＡＴＧ
上流の配列（コザックの配列）にも注意して結合する。

さらにヒトＭｎＳＯＤ遺伝子下流には少なくとも１つの
酵母で働くターミネータ−を結合し、１つの転写可能な
発現ユニットをなすようにする。

この転写可能なユニットを作成するにあたって目的のヒ
）　ＭｎＳＯＤ構造遺伝子のコード頭載の他に５°及び
３°フランキング領域のある部分を含んでいてもかまわ
ないし、あるいはその構造遺伝子がイントロンを含んで
いてもかまわないし、また転写終了及びポリＡ付加の指
令を内在するＤＮＡ塩基配列の前後に転写の邪魔になら
ない長さのＤＮＡ、あるいは邪魔にならない性質のＤＮ
Ａ塩基配列をリンカ−ＤＮＡ含めて挿入してもかまわな
い。

本発明に用いる「酵母複製起点」とは酵母内で自律的に
複製する複製起点の配列を有するＤＮＡ断片のことをい
う０例えば２μｍ　ＤＮＡの複製起点（２μｏｒｉ）　
、酵母染色体ＤＮＡ由来の自律増殖に必要なりＮＡ配列
、例えばａｒｓ　１等が良く使われるがこれらに限らな
い。

本発明に用いる発現量の低いｒ　１ｅｕ２ｄ酵母選択マ
ーカー」は、例えばＢｅｇｇｓ　（文献２１）の報告し
た１、２ｋｂρのロイシン産生遺伝子（Ｌｅｕ２）を含
むＤＮＡが挙げられるが、１ｅｕ２遺伝子の一部削除に
よる発現量の低い１ｅｕ２ｄならいかなるものでも良い
。

本発明に用いる「大腸菌複製起点及び大腸菌選択マーカ
ー」とは、大腸菌菌体内でプラスミドが増殖する為に必
要な複製起点及び形質転換大腸菌を得る際に必要な選択
マーカーをいい、例えばＣ０ＩＥＩ系の複製起点、アン
ピシリン耐性遺伝子が挙げられ葛が、他の複製起点、他
の例えばカナマイシン耐性遺伝子、テトラサイタリン耐
性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子かあるいは
複数−の耐性遺伝子を用いても良い。

本発明のいう「組換え酵母」とはヒトＭｎＳＯＤ発現ベ
クターを、宿主とする酵母に導入したものであり、プラ
スミドの導入はいかなる方法でしたものでも良い。かか
る組換え酵母としては例えばリチウムクロライド法（文
献２６）により発現ベクターを導入し、ロイノンを含ま
ない合成培地で生育する株を選択して得たヒトＭｎＳＯ
Ｄを生産する能力を有する形質転換酵母が挙げられる。

本発明のいう「宿主とする酵母」はロイシン合成遺伝子
欠損株（例えば１ｅｕ２）ならいかなるものでも良いが
、本発明の発現ヘクターでより好ましい誘導的発現を得
るために、宿主として１ｅｕ２に加えてｐｈｏ８０に欠
損がある酵母サッカロミセス・セレビジエ変異株を用い
るとより好ましい。

本発明の発現ヘクターを組込んだヒトＭｎＳＯＤを産生
ずる組換え酵母は、サッカロミセス・セレビジエＭＴ−
４０３９２（ＦＥ−Ｒ？Ｉ　ＢＰ−３１７３）として寄
託している。

岨換え酵母の増殖は、発現ヘクター保持の為ロイシンを
含まない選択培地、例えばロイシンを欠くパークホルダ
ーの合成培地（文献２７）等で行うと良い０組換え酵母
は増殖させた後、次にＭｎイオン含有、低リン酸濃度の
富栄養培地を用い、酸素ガスであるいは酸素ガスを添加
した空気で通気する条件で目的とするヒトＭｎＳＯＤの
活性型蛋白を誘１的に発現せしめる。

本発明の誘導に用いる条件のうち培地は、０〜２５０１
１Ｍの濃度の、好ましくには０．１〜５抛門の濃度の、
特に好ましくは１ｍＭ程度の濃度のマンガンイオンを例
えば硫酸マンガン塩として培地に添加、増強し、１＋ｓ
Ｍ以下の、より好ましくには０．２■門以下の濃度のリ
ン酸イオンを例えばリン酸二水素カリウム塩として添加
した富栄養培地をいう、富栄養培地とは上記の合成培地
に対しカザミノ酸、ポリペプトンといったカゼイン分解
物を、あるいは肉エキス、イーストエキス等を添加して
調整したアミノ酸やペプチドを充分量含む培地をいう。

カザミノ酸はそのまま合成培地に添加して使用できるが
、ポリペプトン、肉エキス、イーストエキス等はリン酸
イオンの含量が高いので、硫酸マグネシウム添加による
リン酸塩形成による沈澱除去処理を行い、低リン酸濃度
とした後に培地の作製に使用すると良い。

酸素ガスであるいは酸素ガスを添加した空気で通気する
条件とは、醗酵槽を用いた培養で通常は空気を１ｖｖ−
程度供給して通気するところを、酸素ガスをあるいは酸
素ガスを添加した空気を０．１〜５ｖｖｍ　、好ましく
は０．３〜１ｖｖ−供給して通気する条件をいう。

本発明の誘導条件に於ては、空気による通気では活性型
ヒトＭｎＳＯＤの得られる割合が低いことに本発明者ら
は気付き、酸素ガスであるいは酸素ガスを添加した空気
で通気し、酵母細胞当りの酸素ガスの供給量の増大を図
ることにより活性型ヒトＭｎＳＯＤの割合を向上させて
いる。

本発明の「酵母菌体内より活性型ヒトＭｎ５Ｏ［ｌを分
離・精製」する方法とは以下に示した方法である。

誘導処理を終え集菌した菌体を、ＰＭＳＦ等蛋白分解酵
素阻害剤の存在下、例えばガラスピーズ等を使用する機
械的破砕法で菌体を破壊する。菌体の破壊を助ける目的
で、酵母細胞壁分解酵素（ザイモリエース）処理を前も
って行うと能率が向上する。

菌破砕液から遠心操作等で不溶物を除去して得られる目
的物を含む細胞抽出液は、好適なバッファー濃度、ｐＨ
を選択して陰イオン交換カラム及び陽イオン交換カラム
をその順序で用いた分離・精製の工程を経ることにより
、その抽出液より純粋な活性型ヒトＭｎＳＯＤを得るこ
とができる。

用いる陰イオン交換カラムとしては、置換基を持つアミ
ノ基を担持したものが好適である。なかでも、アミノエ
チル基をもつ３級アミノ基または４級のアンモニウム塩
が好適である。

具体的にはヒ）　ＭｎＳＯＤを含む細胞抽出液をｐＨ８
，２〜９の低濃度リン酸緩衡液、例えば１０５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ８，４）で平衡化した陰イオン交換樹脂カ
ラム、例えばＤＥＡＥ−セルロースあるいはＤＥＡＥ　
−セファ０−ス力ラムにアプライし、ヒトＭｎＳＯＤを
同カラムに吸着せしめ、上記の低濃度リン酸緩衝液で洗
浄し、ｐＨ６〜８の低濃度リン酸緩衝液、例エバｌ０１
１Ｍリン＃緩衝液（ρ）１７）でカラムに吸着した蛋白
を溶出させ、ヒ）　ＭｎＳＯＤの溶出画分を集めて粗精
製画分を得る。

陰イオン交換樹脂を用いた粗精製は上述の吸着・溶出法
でなく、上述よりより低いｐＨ１例えばｐｌ（７〜８の
低濃度リン酸緩衝液、例えば１０ｍＭリン酸！ｌ？＃液
（ｐＨ７，８）で平衡化したカラムに細胞抽出液をアプ
ライし、通過画分を回収することによっても可能である
。

次に、陽イオン交換カラムに吸着、溶出させる、用いる
担体としてはカルボキシメチル基あるいはスルフォン基
を持つものがあげられる。

具体的には、上記の陰イオン交換カラムを用いた分画で
得た粗精製画分を透析あるいはゲル濾過法でｐｎ　６．
０〜６．７の低濃度リン酸緩衝液、例えば１０■Ｎリン
酸緩衡液（ｐＨ６，５）にバッファー交換した後、同低
濃度リン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラム、例
えばＣＭ−セルロースあるいはＣＭ−セファロースカラ
ムにアプライし、同低濃度リン酸緩衝液で洗浄し、ｐ）
Ｉ　６．０〜６．７の３０ｍＭ以上の濃度のリンｆｌＩ
緩衡液、例えば４０■Ｎリン酸緩衡液（ｐＨ６，５）で
目的物を溶出させ活性型ヒトＭｎＳＯＤ画分を得る。

以上の方法により活性型ヒトＭｎＳＯＤを、ポリアクリ
ルアミド電気泳動−クマジーブリリアントブルー染色法
で単一バンドとして検出される単一蛋白として分離・精
製が可能である０分離・精製の全工程を無菌的に行うと
パイロジエンを含まない組換えヒトＭｎＳＯＤが得られ
る。

〔実施例〕

次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、
これは本発明のほんの一例示にすぎないものである。

実施例１（発現ベクターの構築） １−Ａ、ｐＹＭＴｌの構築 ＤＮＡ断片の長さは塩基対（ｂｐ）の数で示すが、この
明細書で示す値は全てこの技術分野の常識に従っておよ
その値であるとして読まれるべきである。

実施例で用いた各種制限酵素を使用したＤＮＡ断片、Ｒ
ＡＰ　（細菌性アルカリフォスファターゼ）処理、Ｔ４
ＤＮ＾リガーゼを使用したＤＮＡの連結、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩを用いたＤＮＡの平滑末端化、エクソヌクレア
ーゼＢａ１−３１を用いたＤＮＡの末端消化、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを使用したＤＮＡの５゜一端リン
酸化、フェノール／クロロフォルム処理による除蛋白、
ＤＮＡのゲル電気泳動による分画、ＤＮＡの電気抽出、
陰イオン交換カラムクロマトグラフによるＤＮＡの精製
、エタノール沈澱によるＤＮＡの回収、プラークハイブ
リダイゼーション法、組換えファージＤＮＡあるいはプ
ラスミドＤＮＡの調製法、大腸菌へのＤＮＡの導入法、
ダイデオキシ法あるいはマキサム・ギルバート法による
ＤＮＡの塩基配列の決定等の組換えＤＮＡに関する実験
は文献２３に従って行った。制限酵素等の組換えＤＮＡ
実験に必要な酵素類は、特に断わらない限りは宝酒造に
より人手したものを用いた。

先ず、発現量の低い酵母ロイシン産生遺伝子（ｌｅｕ２
ｄ）をコードする１、２ｋｂｐ長酵母ＤＮＡ断片が酵母
２μｍ　ＤＮＡのＰｓｔ１部位に挿入されたプラスミド
ｐＪＤＢ　２１９（文献２１）中の３．２ｋｂ長のＢｉ
ｎｄｌ［（断片を含むプラスミドｐｓＬｅｌ　（文献２
２）を酵母サッカロミセス・セレビジエ１ｅｕ２変異株
（ＡＨ２２）に導入し、ロイシンを含まない選択培地で
培養して形質転換酵母を得た。宿主の酵母２μｍ　ＤＮ
ＡとｐｓＬｅｌとで相同組換えで生じた分子量の大きい
２μｍＤＮＡをその形質転換酵母から回収することによ
り、２　ｕ　ｍ　ＤＮＡ　（ｔｙｐｅ＾）のＰｓｔ１部
位にＰｓｔ１部位が消失する方法で１ｅｕ２ｄが挿入さ
れた構成の組換えプラスミドｐｓＬｅ４　　（第１図）
を作製した。

ｐＳＬｅ４作製に必要な酵母を宿主とした形質転換実験
は、ｐｓＬｅ１作製の実験方法（文献２２）に従って行
った。

次に、文献１７に示される酵母サッカロミセス・セレビ
ジエのｐｂｏ５遺伝子を含むＢｋｂｐ長のＥｃｏＲＩ断
片のう也、２．８ｋｂｐ長のＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ　１
断片（文献１８、Ｆｉｇ、１３）と、大腸菌プラスミド
ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲｌ−５ａｌｌ断片（３，７ｋｂ
ｐ）を連結して作製した組換えプラスミドを出発材料と
し、同プラスミドをＢａｍＨＩで切断し直線化し、ＤＮ
Ａポリメラーゼｌクレノフ断片とｄＮＴＰｓでうめて平
滑末端化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで再び環状化し、ｐｈ
ｏ５遺伝子を含む２゜ａｋｂｐ長のＥｃｏＲＩ　−Ｓａ
Ｈの内部にあるＢａｍＢＩ部位を欠失させたプラスミド
ルＡ丁（第１図）を得た。

前述のｐｓＬｅ４をＥｃｏＲｒで部分分解し、得られた
ＥｃｏＲ１部分分解物を上記のｐＡＴのＥｃｏＲＥ部位
にＴ４リガーゼを使用し連結した。これを酵母サッカロ
ミセス・セレビジエ１ｅｕ２変異株（ＡＨ２２）に導入
し、ロイシンを欠く選択培地で増殖する形質転換酵母を
得た。得られた形質転換酵母からｐＡＴとｐｓｔ。

ｅ４が連結したＰＨ０５プロモーター領域を含ムプラス
ミドｐＡＴ４　（１４ｋｂｐ）を得た（第１図）。

ｐＡＴ４は大腸菌でプラスミドＤＮＡを増殖せしめるこ
とができる。大腸菌でプラスミドＤＮＡを増殖して得た
ｐＡＴ４プラスミドＤＮＡをＳａｌ　ｌで切断し、次に
エキソヌクレアーゼＢａ１−３１　（ＢＲＬ社製）を用
い供給者の示す反応液中で約１分間消化し、フェノール
／クロロホルム処理し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収
した。　Ｂａ１−３１で消化した［ｌＮＡにＸｈｏ　Ｉ
リンカ−ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して連結し
プラスミドｐＡＴ４０５　（１３，７ｋｂｐ）を作製し
た（第１図）　、　ｐＡＴ４０５は酵母発現用ベクター
として使用可能である（文献２４）。

次に、文献２０で示されるＡＤＨＩ遺伝子のＣ−末端コ
ード領域（ＨｉｎｄＩ［［部位下流）と３゛非コード領
域全長を含む０．４５ｋｂｐ長の旧ｎｄ　Ｄｌ［−Ｂａ
ｍＨＩ断片をｐＢＲ３２２に組み込んで作製した組換え
プラスミドを旧ｎｄｌ［Ｉで切断し、ＤＮＡポリメラー
ゼ１クレノフ断片ＣＢＲＬ社！りとｄＮＴＰｓでうめて
平滑末端化し、ＸｈｏＩ　リンカ−をＴ４ＤＮＡ　リガ
ーゼで連結し再び環状化してＡＤＨＩターミネータ−を
含む０．４５ｋｂｐ長のＸｈｏ　Ｉ　　Ｂａ５ｉｎ　Ｉ
断片がｐＢＲ３２２に組み込まれた岨換えプラスミドｐ
ＢＲ−ＴＩ　（４，５ｋｂｐ）を得た（第２図）。同プ
ラスミドをＸｈｏＩおよびｐＢＲのアンピシリン耐性遺
伝子コード領域にあるＰｓｔｌで切断し、３．７ｋｂｐ
長のＸｈｏｌ　−Ｐｓｔｌ断片を単離した。

単離した３、７ｋｂｐ長（７）　Ｘｈｏｌ　−Ｐｓｔ　
Ｉ断片にはＡＤ）１１９−１−ターを含む断片（ｏ、Ａ
ｓｋｂｐ長（７）　Ｘｈ。

１−ＢａｍＦＩＩ　）とｐＢＲ３２２の一部（３，２３
ｋｂｐＢａｍＨＩ　−ＰｓｔＩ）がその順番に連結され
ていた。

前述のｐＡＴ４０５をＸｈｏｌ及びＰＳｔ■テ切断し、
ＰＨ０５プロモーター、２　ｐ　ｍＤＮＡ　、　１ｅｕ
２ｄおよびｐＢＲ配列の一部を含む断片（１０，５ｋｂ
ｐ　）を単離し、上記で得られた３、７ｋｂｐ長（７）
　Ｘｈｏｌ　−ＰｓｔＩ断片とＴ４ＯＮＡリガーゼで連
結し、プラスミドｐＡＴ４０５Ｔ１を得た（第２図）　
、　ｐＡＴ４０５Ｔ１はＰＨ０５プロモーターとＡＤＨ
Ｉターミネータ−の間にＸｈｏｒ部位が存在し、酵母発
現用プラスミドとして使用可能である。

ついで、この　ｐＡＴ４０５Ｔ１を旧ｎｄｌ［Ｉで切断
して得られる長い断片（１１，２ｋｂｐ）を単離し、Ｄ
ＮＡリガーゼで再び環状化し、２μｍ　ＤＮＡの逆反復
配列の一方をコードするＨｉｎｄ　ｍ断片を除去したプ
ラスミドｐＹＭＴ２　（第２図）を得た。

別に、ｐＡＴ４０５Ｔ１を旧ｎｄｌ［［で切断して得ら
れる長い断片（１１，２ｋｂｐ）を単離し、旧ｎｄｌ［
［切断部位をＤＮＡポリメラーゼＩクレノフ断片（ＢＯ
ＩＬ社製）とｄＮＴＰｓでうめて平滑末端化した後にＴ
４ＤＮＡリガーゼで再び環状化し、上記のプラスミドｐ
ＹＭＴ２と比較しＨｉｎｄｎ［部位が欠失したプラスミ
ドｐＹＭＴ１を得た、　プラスミドｐＹＭＴ１とｐＹＭ
Ｔ２は誘導的プロモーターＰＨ０５と酵母ＡＤＨＩター
ミネータ−を含む、ｐＡＴ４０５Ｔ１に比較し逆反復配
列の一方が除去された構成の酵母発現プラスミドである
（第２図）。

１−Ｂ、ｐＧＥＭ−ＳＯＤ２１の構築 ヒト門ｎ５ＯＤｃＤＮＡ由来５６８ｂｐ長のＨａｅｌｌ
　−ＸｈｏＴ断片（成ｐ　ＭｎＳＯＤのほぼ全長をコー
ドする断片、Ｐｖｕ）部位にＸｈｏｌ　リンカ−付加）
と、合成法で得た５２ｂｐ長のＸｈｏ　ｒ−ＨａｅＩＩ
断片とを、大腸菌プラスミドｐＧＥＭ　−７Ｚｆ　（＋
　）　（Ｐｒｏｓｅｇａ社）のＸｈｏ１部位に挿入して
、ヒトＭｎＳＯＤ成熟蛋白をコードする組換えプラスミ
ドｐＧＥＭ　−ＳＯＤ２１を以下の手順で作製した。

まず、ヒトＭｎＳＯＤｃＤＮＡをヒト肝臓ｃＤＡＮライ
ブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を材料とし、合成り
ＮＡプローブをＨＯらの示すヒトＭｎＳＯＤｃＤＮＡ配
列（文献１５、Ｆｉｇ、　２　）を基に作製し、同プロ
ーブを用いたブラークハイプリダイゼーシゴン法で単離
した。単離したヒトＭｎＳＯＤｃＤＮＡの蛋白コード領
域の塩基配列を、グイデオキシ法で決定したところ前述
のＨＯらの示すヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー由来ヒト
ＭｎＳＯＤｃＤＮＡ配列と同一であった。

ヒトＭｎＳＯＤ成熟蛋白のＮ−末端のリジンより始まる
約１３アミノ酸をコードする塩基配列（文献１２）の直
前にＡＴＧが付加し、さらにその上流に酵母ＧＡＰ　（
グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺
伝子の＾ＴＧの上流の配列と同一となる樟な数塩基分の
配列が付加しているような設計で、センス鎖及びアンチ
センス鎖の２本の合成りＮＡを作製した０合成りＮＡの
配列は、センス鎖（ＬＮＫＳＯＤ３１．５２ｂ）が、５
”−ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣ
ＣＴＣＣＣＣＧＡＣＣＴＧＣＣＣＴＡＣＧＡＣＴＡＣＧ
ＧＣＧＣ−３“で、アンチセンス鎖（ＬＮＫＳＯＤ３２
．４４ｂ）が、５°−ＣＧＴＡＧＴＣＧＴＡＧＧＧＣＡ
ＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＴＴＧＴ
ＴＴＴＣ−３°であった。

合成りＮＡは、全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・バイ
オシステム社製、　３８１Ａ型）を使用し、アプライド
・バイオシステム社の指示する試薬を使用して同社の指
示する方法に従って作製した０合成した各々のＤＮＡは
、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、電気
抽出し、イオン交換樹脂で精製し、エタノール沈澱で回
収して純化して得た。

得られた２本の合成りＮＡは各々Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼとＡＴＰを用い５゛一端をリン酸化し、次に１
５０ｍＭの濃度のＮａＣ１が存在する緩衝液中で９５℃
、５分間加熱し、徐々に冷却し２２°Ｃで１４時間イン
キュベートしアニールして２零＠　ＤＮＡとした。アニ
ールして得た５２ｂｐ長の２零＠　ＤＮＡを、６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分画し、電気抽出し、イ
オン交換樹脂で精製し、エタノール沈澱で回収して得た
。５２ｂｐ断片の一端はＸｈｏＩ部位、他端はＨａｅ１
１部位となる欅に合成りＮＡの配列の設計を行った。（
第３図）。

別に、ヒトＭｎＳＯＤｃＤＮＡを、終止コドン（ＴＡＡ
）の数塩基対下流に存在するＰｖｕ　Ｉ部位で切断し、
ｄＮＴＰｓ非存在下ＤＮＡポリメラーゼｌ　（ＢＲＬ社
）処理を行ない、Ｐｖｕ　Ｉ切断部位の平滑末端化を行
った、次にＴ４ＤＮＡリガーゼを使用しＸｈｏ　Ｉリン
カ−ＤＮＡ　（宝酒造社製、　５’　−ｐＣＣＴＣＧＡ
ＧＧ−３”）を連結し、ＸｂｏＩリンカ−付加ヒトＭｎ
ＳＯＤｃＤＮＡを作製した、得られたＸｈｏ　Ｉリンカ
−付加ヒトＭｎＳＯＤｃＤＮＡを、Ｈａｅｌｌ及びＸｈ
ｏ　Ｉで切断し、５６８ｂｐ長の１ｌａｅＩＩ−Ｘｈｏ
ｌ切断を得、０．７％アガロース電気泳動で分画し、電
気抽出し、イオン交換樹脂で精製し、エタノール沈澱で
回収して得た。

前述の合成りＮＡを材料とした得た５２ｂＰ長のＸｈ。

−Ｈａｅｌｌ断片とヒトＭｎＳＯＤｃＤＮＡの５６８ｂ
ｐ長のＨａｅＩＩ−χｈｏｌ断片を、Ｘｈｏｌで切断し
直線化し、ＢＡＰ処理したプラスミドｐＧＥ？ｌ　−７
２ｆ　（＋　）にＴ４１］ＮＡリガーゼを使用して連結
し環状化し、プラスミドｐＧ［！Ｍ　−ＳＯＤ２１を作
製した（第３図）。

プラスミドｐＧＥＭ　−５ＯＤ２１を含む形質転換大腸
菌のうち１株（１６）をＳＯＤ＋＋ｄスケールで培養し
、プラスミドＤＮＡの分離精製をアルカリ法及びＣｓＣ
ｌ平衡密度勾配遠心法により行い、２０９μｇの精製Ｄ
ＮＡを得た。

ｐＧＥＭ　−５ＯＤ２１には、成！ｌｓ！ＭｎＳＯＤｃ
ＤＮ＾のＮ−末アミノ酸リジンの直前に開始コドン＾Ｔ
Ｇを付加しその上流は酵母用の塩基配列とし、終止コド
ン（ＴＡＡ）の下流の３゛非翻訳領域はなるべ（短くし
た構成の６２０ｂｐ長ヒトＭｎＳＯＤｃＤＮＡのＸｈｏ
ｌ断片が含まれている。

１−　Ｃ，ｐＹＭＴｌ−８００２１の構築１−Ａで得た
プラスミドｐＹＭＴ１（３μｇ）をＸｈｏｌで消化し直
線化しＢＡＰ処理を行ない、１１．２ｋｂ長の断片を得
た０次に１−Ｂで得たｐＧＥＭ−３ＯＤ２１（７，２μ
ｇ）をＸｈｏｌで切断し、ヒトＭｎＳＯＤをコードする
６２０ｂｐ長のＸｈｏ　Ｉ断片を、０．７％アガロース
ゲル電気泳動で分画し、電気抽出し、イオン交換樹脂で
精製し、エタノール沈澱で回収して得た。３７０ｎｇの
１１．２　ｋｂｐ断片と５７ｎｇの６２０ｂｐ断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼで連結し、大腸＠　ＪＭ１０９株コン
ピテント細胞（宝酒造製）に導入し、２１０個のアンピ
シリン耐性の大腸菌コロニーを得た。得られたコロニー
のうち４８コロニーを選びアルカリを用いたミニスケー
ルのプラスミドＤＮＡ！Ｉ製法でプラスミドＤＮＡを得
た。調製した各々プラスミド［ｌＮＡをＸｈｏｌで切断
し：　　０．７％アガロースゲル電気泳動とエチジウム
プロミド染色で調べたところ、１３のプラスミドＤＮＡ
に６２０ｂｐ長Ｘｈｏｌ断片の挿入が確認された。

次に挿入が確認された１３のプラスミドＤＮＡをＢａ５
ＨＩで切断し、０．７％アガロースゲル電気泳動とエチ
ジウムプロミド染色で６２５ｂｐ断片が検出される（９
００ｂｐではない）５つのプラスミドＤＮＡを選んだ、
得られた５つのプラスミドをいくつかの制限酵素で切断
し、０．７％アガロースゲル電気泳動とエチジウムプロ
ミド染色で解析したところ、５つのプラスミドは共にＰ
Ｈ０５プロモーター、ヒトＭｎＳＯＤｃＤＮ＾及びＡＤ
旧ターミネータ−がその順番である目的のプラスミドｐ
ＹＭＴ１−ＳＯＤ２１（１１，８ｋｂｐ）であることが
確認できた（第３図）。

プラスミドｐＹＭＴ１−ＳＯＤ２１を含む形質転換大腸
菌のうち１株（１３０）をＳＯＤＭ＆スケールで培養し
、プラスミドＤＮＡの分離精製をアルカリ法及びＣｓＣ
１平衡密度勾配遠心法により行い、４１４μｇの精製Ｄ
ＮＡを得た。

プラスミドｐＹＭＴ１−ＳＯＤ２１　（１３０）に挿入
された５２ｂｐ長のＸｈｏｌ−１ｌａｅＩＩ断片のＤＮ
Ａ塩基配列が、また５２６ｂｐ断片とＰＨ０５プロモー
ターとの、あるいは５２ｂｐ断片と５６８ｂｐ長のＩ（
ａｅｌｌ−Ｘｈｏｌ断片（ヒトＭｎｃＤＮＡ）とのジャ
ンクシラン部分の配列が各々目的通りの配列であること
を確認するために以下の方法で塩基配列の決定を行った
。

ｐＹＭＴｌ　−３ＯＤ２１　（３μｇ　）をＸｈｏｌ　
テ切断しＢＡＰ処理を行い、（ｒ−”Ｐ）　−ＡＴＰと
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用しアイソトープラ
ベルした。うベル化したｐＹＭＴｌ　−５ＯＤ２１ＤＮ
ＡをＣ１ａＩ及びＲａｍ旧で切断し、その結果、出現す
る２４０ｂｐ長及び４４７ｂｐ長の断片を各々６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分画し、電気抽出し、イ
オン交換樹脂で精製し、エタノール沈澱で回収して得た
。得られたラベル化ＤＮＡをマキサム・ギルバート法で
塩基配列の決定を行ったところ、変異等がなく予定して
いた通りの配列であることが確認できた。

実施例２（酵母の形質転換及び組換えヒ）　ＭｎＳＯＤ
の発現） 酵母サッカロミセス・セレビジエＹＡＴ７８０株（ａ。

１ｅｕ２．ｈｉｓ４．ｃａｎｌ、ｐｈｏ８０＋ｃｉｒ”
　）をプラスミドｐＹＭＴ１−ＳＯＤ２１（実施例１で
作製のプラスミド）で形質転換し、得られた形質転換酵
母の組換えヒ）　ＭｎＳＯＤ産生を以下の方法で調べた
。

サッカロミセス・セレビジエＹＡＴ７８０株はサッカロ
ミセス・セレビジエＡＨ２２（ａ＋１ｅｕ２．ｂｉｓ４
＋ｃａｎｌ。

ｃｉｒ”）（文献２２）を変異剤ＥＭＳで処理し、低リ
ン酸培地でのＰＨ０５発現量を低く抑える働きをもつ負
調節因子ＰＨ０８０の機能を失った株を選択（変異株の
選択方法、文献２５）することにより得た。

６．５μｇのｐＹＭＴｌ　−５ＯＤ２１ＤＮＡをキャリ
アーＤＮＡは添加せずにリチウム処理したサッカロミセ
ス・セレビジエＹＡＴ７８０株に導入しく導入法：文献
２６）、ロイシンヲ欠＜培地（Ｌ−ヒスチジン５０■／
ｌ、Ｌ−トリプトファン５０■／ｌおよびアデニン５０
■／ｌを添加したパークホルダー最少培地、文献２７）
で選択し、形質転換酵母２８株を得た。

得られた形質転換酵母２８株のうち８株を選び、４ｄの
し一ヒスチジンを５０■／ｌの濃度で添加したパークホ
ルダー最少培地（文献２７）で２８°Ｃ１４８時間振と
う（１５０回／分）し前培養を行った。

前培養物１．２５ａｆを２５ｍのし一ヒスチジン（５０
■／Ｅ）とカザミノ酸（デイフコ社製　５ｇ／４２）を
添加したパークホルダー培地へ接種し、２８℃２４時間
旋回培養（１５（ｌｒｐｓ）　Ｌ本培養を行った０本培
養で得られた細胞を無菌的に遠心し収面し、２５１ｄの
リン酸濃度を低くしたパークホルダー培地（リン酸濃度
は）（ＪＰＯｎとして３０■／２）にＬ−ヒスチジン（
５０ａ＋ｇ／ｊりとカザミノ酸（５ｇ／ｊｉｂ）を添加
した培地へ懸濁し、２８℃、２４時間旋回培養（１５０
ｒｐｍ）した。細胞を遠心により回収し１．２５ｄの１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（ＰＨ７，８）に再懸濁
せしめた。

次に細胞の懸濁液にザイモリエイス２０Ｔ（生化学工業
製）を３０１Ｅｇ／ｄ、プロテアーゼ阻害側Ｐ？ｌ５Ｆ
（シグマ社製）を０．１ｍＭになる樟に添加し、３７℃
、４０分間保温した後に、ガラス・ビーズを０．８容添
加し、４分間ポルテックスし細胞を破砕した。

細胞破砕液を２０００ｇ、　　５分間遠心し上清を得、
細胞抽出液とした。

形質転換酵母のヒ）　ＭｎＳＯＤ蛋白生産量を調べる為
に５μ２の細胞抽出液をポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分画し、抗ヒ）　ＭｎＳＯＤウサギ抗体を使用し、
ウェスタン・プロッティングを行った。

ウェスタン・プロッティングの結果、調べた８株の全て
がヒ）　ＭｎＳＯＤを生産していた（第４図）。

また、抗ヒ）　ＭｎＳＯＤウサギ抗体を使用したＥＬＩ
ＳＡ法による発現量の測定の結果、生産量は４■／２で
あった。

実施例３（組換え酵母における活性型ヒ）　ＭｎＳＯＤ
の誘導的発現） 実施例２でウェスタン・プロ・７テイングに供した細胞
抽出液をネイティブなポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分画し、２＋ｗＭにＣＮ存在下、リボフラビンとニト
ロブルー・テトラゾリウム（ＮＢＴ）によるネガティブ
染色法（文献２）でＳＯＤ活性のある分子種を調べた。

その結果、酵母由来ＭｎＳＯＤは検出されたが、ヒ）　
ＭｎＳＯＤの分画される位置にＳＯＤ活性が検出できず
、産生された組換えヒ）　ＭｎＳＯＤは不活性型かある
いは低比活性であると考えられた。

次に活性型ヒ）　ＭｎＳＯＤを得る目的で、実施例２で
得たウェスタン・プロンティング陽性株のうち１株（１
１３）を選び、誘導培養をフラスコを使用した旋回培養
でなく、醗酵槽を使用した空気あるいは純酸素で通気す
る方式で酸素供給量を増大させて以下に述べる方法で誘
導培養を行なった。なお、組換え酵母＃１３はＭＴ−４
０３９２の識別の番号を与え、微工研に寄託されている
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３１７３）　　。

まず、組換え酵母（１１１３株）を、Ｌ−ヒスチジンを
５０■／ｌの濃度で添加したパークホルダー最少培地２
５Ｈ１で２８℃、４８時間旋回培養（１５０ｒｐｍ）　
Ｌ前培養を行った０次に前培養物２０ｍを、Ｌ−ヒスチ
ジンを５０ｍｇ／ｊ！の濃度で、またカザミノ酸（デイ
フコ社製）を５ｇ／ｊ！の濃度で添加したパークホルダ
ー最少培地４００ｍで２８℃、４８時間旋回培養し本培
養を行った。

本培養で得た岨換え酵母（＃１３株）を無菌的に遠心し
集め、容積が２．２ｊｉの醗酵槽°（いわしや製、ミニ
・ジャーファーメンタ−ＮＢ−Ｗ）を使用し、１．２２
の次に述べる誘導用培地で、ＰＨを５．５、温度を２８
℃に保ち４５０ｒｐ■で攪拌し、純酸素あるいは空気で
通気（０，３〜１　ｖｖａ）　Ｌ２０時間培養した。誘
導用培地はＬ−ヒスチジン（５０■／Ｉｌ）、カザミノ
酸（５ｇ／ｊり及び硫酸マンガン（最終濃度０．９■Ｍ
）を添加し、リン酸濃度を減じて（３０■／ｊ！ＩｈＨ
ＰＯ４）変更を加えたパークホルダー最少培地（ＰＨ５
，５に調整）１．２１を使用した。２０時間の誘導培養
後培養液を冷却し、遠心して集菌した。菌体の収量は、
純酸素で通気した場合１１当りの細胞湿重量で１８．０
　ｇで、空気で通気した場合１１当りの細胞湿重量で１
７．７ｇであった。

酸素ガスあるいは空気で通気した誘導で得た菌体につい
て、前述のＮＯＴによるネガティブ染色法でＳＯＤ活性
のある分子種を調べたところ、活性のあるヒ）　ＭｎＳ
ＯＤが検出された（第５図）、純酸素で通気した培養と
、空気で通気した培養とで検出されたヒ）　ＭｎＳＯＤ
の活性を比較すると前者が２倍高かった。抗ヒ）　Ｍｎ
ＳＯＤ抗体を使用した測定で両者のヒトＭｎＳＯＤ抗原
量に差が認められなかったので、酸素ガスで通気した培
養で活性型ヒトＭｎＳＯＤの生成量がより高いと判断さ
れた。

実施例４　（組換えヒ）　ＭｎＳＯＤの精製）実施例３
で純酸素で通気した誘導培養を行って得た菌体を出発材
料とし、次の各ステップに従って活性型組換えヒ）　Ｍ
ｎＳＯＤの分離・精製を行ったステップ１　細胞の破砕 菌体６．５ｇを５．５＋＋ｄの１０１トリス酢酸（ＴＡ
）緩衝液（ｐＨ８，２）で懸濁し、１０■のザイモリエ
イス２０Ｔ（生化学工業型）を加え３７°Ｃ２４０分間
インキエベートした。インキュベート後反応液を水中で
１０分間冷却し、同容量のガラス・ビーズ（直径０．５
■−）とプロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ）　　（シグマ
社製）を最終濃度０．１ｍＭとなる欅に加え、４分間ポ
ルテックスした。得られた細胞破砕液を６００ｇで５分
間遠心し、上滑を回収した０次に回収した上清を１２０
００　ｇで１０分間遠心し、上清を回収した６回収した
上清に１０ｍＭ　ＴＡ緩衝液（ｐＨ８，２）を添加し、
２５１１の細胞抽出液を得た。

ステップ２　陰イオン交換クロマトグラフィーＤＥ５２
カラム（φ２．５Ｘ１Ｂｃｍ＝８８ａｄ、ファルマシア
）を１０ａＭ　Ｔ＾緩衝液（ｐＨ８，４）で平衡化した
。平衡化したカラムにステップ１で得た細胞抽出液をア
プライし、カラムにヒトＭｎＳＯＤを吸着させ、未結合
の蛋白質を２７０＋＋ｄの１０ｍＭ　ＴＡ緩衝液（ｐＨ
８，４で洗い流した０次に吸着したヒトＭｎＳＯＤを６
００ｉｄの２０ｍ？Ｉ　ＴＡ緩衝液（ｐＨ７）で溶出し
た（第６図）、ＭｎＳＯＤ活性を有するｐＨが８．２か
ら８．０付近の両分８５Ｍ＆を合わせ、１０−Ｍリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ６，５）　２　ｆｉに対して４°
Ｃで２回透析した。

ステップ３　陽イオン交換クロマトグラフィーＣＭ５２
カラム（φ　１．９Ｘ１０ｃｍ＝２８ｍ、ファルマシア
）を１０−Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，５）で平
衡化した。平衡化したカラムにステップ２で得た透析物
をアプライし、カラムにヒトＭｎＳＯＤを吸着させ、未
結合の蛋白質を１０５ｄの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６，５）で洗い流した０次に吸着したヒ）　Ｍ
ｎＳＯＤを２２５ｇｄの４０−Ｍリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６，５）で溶出し、ヒ）　ＭｎＳＯＤ活性を有す
る画分ｌＯ−を得た。第７図にＣＭ５２カラムの溶出曲
線を示した。

個々の精製ステップで達成したヒトＭｎＳＯＤの純度・
濃度・活性をそれぞれ非還元的ポリアクリルアミド電気
泳動とクマジープリリアントブルー（ＣＢＢ　）染色（
第８図）、抗体法−ウニスタン・プロッティング（第９
図）及びネイティブ・ポリアクリルアミド電気泳動−Ｎ
Ｂ？活性染色法（第１０図）で調べたところ、単一なバ
ンドとして活性型組換えヒトＭｎＳＯＤが得られた。

ＣＩ’１５２カラムかに於てステップ２で得た透析物を
アプライし、１０ｍＭ　Ｋ　　ＰＯａ　（ｐＨ６，５）
　１？洗浄した際、素通り及び洗浄画分に可成りの量の
ヒトＭｎＳＯＤが認められ（第７図、第９図）、溶出画
分のヒトＭｎＳＯＤとほぼ等量の目的物が失なわれた。

他の実験で、ステップ２の透析による溶媒の交換をセフ
ァテックスＧ−２５（ファルマシア製）を用いたゲル濾
過による方法で行うと溶媒の交換が完全になされ、上記
の素通り及び洗浄画分への漏出が軽減される。

なお、組換えヒ）　ＭｎＳＯＤの精製に用いたＭｎＳＯ
Ｄ活性の測定法は、２ｍＭ　ＫＣＮ存在下でキサンチン
・キサンチンオキシダー系によるニトロブルー・テトラ
ゾリウム（ＮＢＴ）の還元の阻害活性（文献２）によっ
た。

上記の分離・精製法で得た岨換えヒ）　ＭｎＳＯＤ精製
品の比活性は２，７００Ｕ／■であった。

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３：２７９−２９２８）にａｕｆｍａｎ　ＲＪ　ｅｔａ
ｌ（１９８５）Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、５：１７
５０−１７５９９　）　ＭｃＣｏｒｄ　ＪＭ　　ｅｔａ
１０９７７）ｉｎ　　５ｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　　ａｎｄ
　　５ｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　　Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ＋　
　Ｅｄｓ。

Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ　ＡＭ　ＭｃＣｏｒｄ　ＪＭ　　＆
　　Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ　Ｉ　＋Ａｃａｄｅ■ｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ＋　　１２９−１３８１０）　
Ｃａｕｎｔ　Ｐ　−Ｉｌ■１９ＢＢ）Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ　８：１７３−１９２１１）　　Ｈａｌ
ｅｎｂｅｃｋ　Ｒ（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ　７：７１０−７１５１２）　Ｈａｒｒｉｓ　ＪＴ
　　＆　Ｓｔｅｉｎｍａｎ　ＨＭ　（１９７７）ｉｎ　
５ｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ａｎｄ　５ｕｐｅｒｏｘｉｄｅ
　Ｄｉｓ＋ｗｕｔａｓｅ、　　Ｅｄｓ。

Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ　ＡＭ　ＭｃＣｏｒｄ　ＪＭ　＆　
Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ　Ｉ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、　ＰＰ
２２５−２３０１３）　　Ｂａｒｒａ　Ｄ　　ｅｔａ［
１９８４）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ（２５９二１２５９５
−１２６０１１４）　Ｂａｃｋ　Ｙ　　　ｅｔａｌ（１
９８７）Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄ　Ｒｅｓ、　　１５：９０
７６１５）　ＨＯＹ−３＆　Ｃｒａｐｏ　ＪＤ（１９８
８）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２２９：２５６−２６０１６
）　　Ｈｓ’ｃｋｌ　Ｋ、　　（１９８Ｂ）Ｎｕｃｌ、
Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　　１６：６２２４１７）　Ｒｏｇ
ｅｒｓ　ＤＴ　ｅｔａｌ　（１９８２）Ｐｏｒｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９：２１５７−２
１６１１８）　Ａｎｄｅｒｓｅｎ　Ｎ　　ｅｔａｌ　（
１９８３）Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　　３：５６
２−５６９１９）　Ｔｈ１ｌｌ　ＧＰ　　ａｔ紅（１９
８３）Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　３：５７０−５
７９２０）　Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ　ＪＬ　　＆　Ｈａｌ
ｌ　ＢＤ　（１９８２）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５
７：３０１Ｂ−３０２５２１）　　Ｂｅｇｇｓ　ＪＤ　
　（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ　２７５：１０４−１０９
２２）　Ｔｏｈ−ｅ　Ａ　ｅｔａｌ　　（１９８０）Ｊ
、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４１：４１３−４１６２３）
　　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　　Ｊ　　　ｅｔａｌ　　（１９
８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｒｔｉｎｇ、　　Ａ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　　２ｎｄＥｄ
、　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
、　　Ｐｒｅｓｓ２４）　Ｔａｎａｋａ　Ｔ、　ｅｔａ
ｌ（１９８８）Ｇｅｎｅ　６４：２５７−２６４ ２５）　Ｔｏｈ−ｅ　Ａ　ｅｔａｌ（１９７３）Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、１１３ニア２７−７３８２６）　Ｓ
ｈｅｒｍａｎ　Ｆ　ｅｔａｌ　　（１９８６）Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ　　ｆｏｒ
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ’１ｅａｓｔ　　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ２７）大嶋泰治ら　編集（１９８１） 微生物学実験法、講談社すイエンティフィク

【図面の簡単な説明】

添付の図面は以下のものを表した図である。 第１図　プラスミドｐＡＴ４０５の構築第２図　プラス
ミドｐＹＭＴ１及びプラスミドｐＹ）１７２の構築 第３図　プラスミドｐＹＭＴｌ　−ＳＯＤ２１の構築第
４図　酵母ＹＡＴ７８０株におけるプラスミドｐＹｌ’
１Ｔ１−５ＯＤ２１を介してのヒトＭｎＳＯＤの発現の
ゲル電気泳動−抗体法（ウェスタン・プロッティング）
による検出 レーア１？ヒト肝臓から精製したＭｎＳＯＤ　　１１０
０ｎレーン２　；　　ｐＹＭＴＩ−３ＯＤ２１／ＹＡＴ
７８０　　（＃９）レーン３　；　　　　　　　　　　
　　　　、（＃１０）レーン４　；　　　　　　　〃（
＃１１）レーン５　；　　　　　　　　　　　　　　（
＃１２）レーン６　ｉ　　　　　　　　　　　　　　（
＃１３）レーン７　、　　　　　　　　　　　　　　（
＃１４）レーンＢ　；　　　　　　　　　　　　　　（
＃１５）レーン９　；　　　　　　　〃（＃１６）第５
図　菌体破砕液に含まれる蛋白質のゲル空気泳動による
分離とそれに続くニトロブルー・テトラゾリウム（ＮＢ
Ｔ）による活性染色の結果レーンｌ；空気通気培養００
．。。の値（菌体）Ｘ液量（Ｉｉ）　＝８．５ レーン２；空気通気培養ＯＤ＆。。の値（菌体）Ｘ液量
（ｄ）　＝１９ レーン３；酸素通気培養００６０゜の値（菌体）Ｘ液量
（ｄ）　＝８．５ レーン４；酸素通気培養ＯＤ＆。。の値（菌体）Ｘ液量
（ｄ）　＝１９ レーン５；ヒト肝臓から精製したＭｎＳＯＤ　　０．８
Ｕレーン６　；　　　　　　　　　　　　　　　　１．
６ＵＵＣ２ＤＥ５２カラムクロマトグラフィーの溶出曲
線 ２０１１Ｍ　Ｋ−ＰＯ４（ＰＨ７）を使用した溶出のパ
ターンについて、溶出液の蛋白量（Ａｘｅ。）　、Ｍｎ
ＳＯＤ活性及びｐＨＯ値を示した０図中、黒線で示した
フラクション階９〜１７をプール（８５ｍｌり　した。 第７図　ＣＭ５２カラムクロマトグラフィーの溶出曲線 １０ｍＭ　Ｋ−ＰＯ４（１））１６．５）の条件でのア
プライ、洗浄及び４０１１Ｍ　Ｋ−ＰＯ４（１）Ｈ６，
５）での溶出で得た各フラクションについて蛋白量（Ａ
２８０）　、ＭｎＳＯＤ活性を示した。 第８図　精製の各ステップで得た蛋白質の非還元の条件
下でのＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分画とクマジープリリアントプルーで染色による蛋白質
の検出 レーンｌ；ヒト肝臓から精製したＭｎＳＯＤ　、　２０
０ｎｇ蛋白 レーン２；細胞抽出液　　　　　　　、　１ＳＯＤｎｇ
蛋白レーン３；ＤＥ５２カラムヒトＭｎＳＯＤ画分、　
〃レーンー４；ＣＭカラム素通り画分（１１２）、　　
−レーン５；　　　　”　　（１１１６）、　　＃レー
ン６　Ｈｊ　　溶出画分　（１１３８）、　　＃レーン
７；　　　　Ｉ’　　　　　　＃　　（１３９）、　　
＃第９図　精製の各ステップで得た蛋白質の非還元の条
件下での５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る分画と抗体法−ウニスタン・プロッティングによるヒ
トＭｎＳＯＤの検出 レーン１；ヒト肝臓から精製したＭｎＳＯＤ　　１２０
ｎｇ蛋白 レーン２；Ｄ２５２カラム溶出画分　　、　ＳＯＤｎｇ
蛋白レーン３；ＣＭカラム素通り画分（鯵１２）、　　
〃レーン４；　　　　　　　　　　＃　　（１１６）、
　　〃レーン５；　　　＃　溶出画分　（１１３８）、
　　’レーン６；　　　　　　　　　　＃　　（１１３
９）、　　＃第１０図　精製の各ステップで得た蛋白質
の非還元の条件下でのネイティブ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分画とそれに続くニトロブルー・テ
トラゾリウム（ＮＢＴ）による活性染色の結果レーンｌ
；ヒト肝臓から精製したＭ、ｎ５ＯＤ　１．６Ｕレーン
２　、　　　　　　　　　　　　　　　０．８Ｕレーン
３；細胞抽出液　　　　　　、１．５μｇ蛋白レーン４
　、　ＤＥ５２カラム溶出画分　　、　〃レーン５；鉗
カラム素通り画分（１１１２）、　　’レーン６；　　
　　　　　　　　＃　　（１１６）、　　ＩＩレーン７
；　　　〃　　溶出画分（暑３８）、　　〃レーン８；
　　　　　　　　　　〃（１３９）、　　＃特許出願人
　　三井東圧化学株式会社 第４図 ］　　２　３　４　５　６　７　８　９−　第５図 第６図 Ｆｙ（２Ｃ１’ｏｔＩ　Ｎｕｍｂｅｒ 第８図 第９図 第１０図

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵母ＰＨ０５プロモーターとヒトＭｎＳＯＤをコ
   ードする構造遺伝子と酵母ターミネーターとを有効に連
   結した発現ユニット、酵母複製起点、酵母Ｌｅｕ２ｄ選
   択マーカー、大腸菌複製起点及び大腸菌選択マーカーを
   含む、酵母でヒトＭｎＳＯＤの誘導的発現を可能とする
   発現ベクター。
2. （２）プラスミドｐＹＭＴ１−ＳＯＤ２１。
3. （３）請求項１の発現ベクターで宿主とする酵母を形質
   転換して得た組換え酵母。
4. （４）宿主とする酵母が、ＬＥＵ２、ＰＨ０８０に欠損
   があるサッカロミセス・セレビジエの変異株である請求
   項３記載の組換え酵母。
5. （５）酵母ＭＴ−４０３９２。
6. （６）請求項４の組換え酵母を増殖させ、次にマンガン
   イオン含有、低リン酸濃度の富栄養培地を用い、酸素ガ
   スあるいは酸素ガスを添加した空気で通気する条件下で
   誘導的に目的とする活性型ヒトＭｎＳＯＤを組換え酵母
   に産生せしめ、同酵母菌体より目的物を分離・精製する
   ことにより活性型ヒトＭｎＳＯＤを製造する方法。