JPH04186162A - 免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野１ 本発明は、流体試料中の微量成分、特に生物学的流体試
料中の特定微量成分を測定する方法に関するものである
。 【発明の背景】 生物学的？ｈ棒体試料中極微量含有される物質を検出す
る方法として、各種の分析法が開発されて来゛ζいる。 この分析法の−・つとして、免疫反応をその原理とする
ものがあり、免疫測定法として知られている。 免疫ａｔｌ＋定法は、その標５；：（物質の種類から種
々のものがあり、標識物質°としては以下のようなもの
が挙げられる。例えば、放射性同位元素、酵素、酵素基
質、補酵素、酵素阻害物質、ハクテリオファーノ、循環
反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠う）子族、
化学発光性反応体及び螢光性分子等がある。 これらの中でも、その扱いやすさから、酵素を標識物質
として用いた酵素免疫測定法が広く用いられている。標
識酵素としては種々のものが使用されているが、試料と
して生物学的流体試料を扱う場合には、該試料中での含
有量が少ない酵素が好ましく、そのような酵素としてβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼが知られている。β−Ｄ−ガラ
クトシダーセを標識物質として用いる場合の検出方法は
、一般に、該酵素に対する自己顕色性基質を用いる場合
が多く、該酵素の加水分解作用により生成する非糖成分
（アグリニ１ン）の呈色により検出される。このような
酵素Ｗ質として、０−ニトロフ二二ルーβ−Ｄ−ガラク
トシド、５−ブロム−４りしＩロインドリル−β−１〕
−ガラク；・シ１゛（特開平ｌ−０，３２８１０６号公
報）、クロロフェニルレット−β−Ｄ−ガラクトシド（
特願平２−２０７０号）か使用されているが、これらは
吸光係数が小さく、感度が不充分であったり、流体試料
として血液、血清、血漿糖を用いろ場合には、測定波長
の関係で、血中成分、例えばビリルビン、ヘモグロビン
の影響を受けやすいという欠点を持っている。 又、乾式分析素子を用いての検出においては、反応ｌ’
＋ｉ＋　、酵素基質番；Ｉ乾焔状態で存在し、流体試料
又はｌｈ体体材料含む水溶液の点着により、酵素基質が
）岩解し、反応が始まる。それ故、乾式分析素子を用い
て検出する場合の酵素基質は、水溶性の高いものでなく
てはな、らないが、これらの点においても上記β−Ｄ−
ガラクトシダーセの基質は不充分である。 又、免疫測定法は、均一免疫測定法と非均−免疫測定法
に大別される。ずなわら、抗原抗体反応生成物（Ｂｏｕ
ｎｄ体）と非反応物（Ｆｒｅｅ体）の分１ＦｉＩＩ（Ｂ
／ド分離）か必要な非均−免疫測定法と、Ｂ／Ｆ分ｍｌ
＋の必要のない均一免疫測定法とに大別される。このう
ち、測定対象物質が高分子である場合には、１３７Ｆ分
離が必要な非均−免疫測定法が利用されている。 とごろで、この非均−免疫測定法は、洗浄操イ１、試薬
の調整が必要であること、標識物質、基質、反応停止液
等の添加が必要であることから、操作が煩雑であること
、又、一般に、免疫反応は長時間を要し、測定時間が長
＜　ｔＩ′ること等の問題がある。 これらの問題点に対して各種の技ｊＩＦｉが稈案されて
いる。例えば、特開昭６４−６３８６３号公報、特開昭
６４　−６３８６　、’１号公報、１、Ｙ開平２−８３
４４号公報においでは、乾式分析素子を用いるごとによ
り操作性は０１１便になゲζいるが、免疫反応について
は改良がされておらず、測定にＪＢ待時間要するという
問題がある。 そして、この問題に対して特願平２−２０７０−号おい
ては、不溶化微粒子６子を用いるごとにより免疫反応■
、１間の短縮を達成しているが、不溶化微粒子を用いる
ことにより非特異吸着が大きくなり、精度などの点にお
いて問題が残されている。

【発明の開示】

本発明の目的は、流体試料中の特定成分を、簡便な操作
で、感度、正確度、精度及び再現性良く定１１ｉ−Ｃき
る技術を提供ずろことである。 この本発明の目的は、反応型式が１ステップでサントイ
ソチ法の非均一系免疫測定法を用いて試料中の抗原を分
析する方法であって、抗体が結合された不溶化微粒子、
酵素で標識したＦａｂ又はＦａｂ’型の抗体、及び試料
を接触、免疫反応さ・ｌ、前記不溶化微粒子と結合した
反応生成物と非反応物とを分離した後、前記不溶化微粒
子と結合していない非反応物における酵素標識体の酵素
活性を乾式分析素子で測定することにより、試１′・１
中の抗原を分析することを特徴とする免疫測定方法に、
Ｌっで達成される。 尚、本発明において、β−Ｄ−ガラクＩ・シダーゼが標
識酵素として用いられた場合、乾式分析素子に内蔵する
酵素基質としで７−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ
〜９．９゛−ジメチル−９１１−アクリジン−２−オン
が用いられることにより、他の酵素活性を用いた場合に
生しる感度不足、血中成分（ビリルビン、ヘモグロビン
）の干渉、溶解性の問題は大幅に改善される。 そし″（、反応型式が１ステノプザントイノ千法の非均
一系免疫測定法が用いられるにもかかわらず、巨大分子
の生成による酵素検出反応やＢ／Ｆ分離の不安定性や、
非特異吸着に起因する測定誤差の問題も大幅に敗訴され
る。 例えば、抗体を粒径２ｍｍ以Ｆ、好ましくは０゜１〜３
００μｍの微粒子の担体に化学的及び／又は物理的に結
合さ−Ｉ、不溶化微粒子抗体を得、これとβ　Ｉ〕−ガ
ラクトシダーゼ等の酵素で標識されたＦａｂ又はＦａｂ
“型の抗体及び試料とを接触、免疫反応さ−け、１３／
Ｆ分離した後、不溶化微杓子抗体に結合しないで遊離の
状態で存在する酵素標識体を含む液相の−・定量を乾式
分析素子−ヒに滴干し、酵素標識体の酵素活性を乾式分
析素子で測定する場合には、測定に際して不溶化微粒子
による妨害がなく、試料中の抗原が簡便な操作で、感度
、正確度、精度及び再現性良く定量できたのである。 本発明におい一〇、試料としてはあらゆる形態の溶液、
二ｌロイ１溶液などが使用しうるが、好ましく乙、１牛
物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、脳を髄液
、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉ン１等が挙げられる。 本発明に用いられる標識酵素としては特に限定されない
が、好ましくはβ−Ｄ−ガラクトシダーセ、ペルオニト
シダーゼ、アルカリフメスファターゼ、グル：１−スオ
キシダーセ、グルタメートヒドロゲナーゼ、アミラーセ
等が挙げられるが、さらに好ましくはβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼである。 β　１〕−ガラク１−シダーゼのような酵素を標識物質
とする場合、酵素反応系、発色系は公知のものを使用で
きる。具体的には、特開昭６１−２９２０６０号公報、
特開昭６２−９０５３９号公報、特開昭６３−１３１０
６２号公報、特開昭６３−４５Ｆｉ６２Σ公報、特願昭
６３−２１９８９３号明細書に記載の物質（物質群）が
挙げられるが、ごれらに限定されるものではない。 そして、これら標識物質の抗体への結合は、当業者間で
知られている公知の試薬と方法で行うことができ、例え
ば石川　栄冶、何台　忠、宮井潔　騙「酵素免疫測定法
（第２版）、医学書院、１９７８年」や日本臨床病理学
余線「臨床病理」臨時増刊特隼第５３号「臨床検査の為
のイムノアッセイ−技術と応用−２臨床病理刊行会、１
９８３年」ｉＩ：どに記載された力骨力を参上にするこ
とかできる。 又、本発明で使用される抗体は、その由来を特に限定さ
れるものではなく、哺乳動物等に抗原を投−５、免疫し
て得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるいは従来
公知の方法である硫酸すトリウム沈澱法、硫酸アンモニ
ウム沈澱法、ｐファデンクスゲルによるゲル濾過法、イ
オン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳動法等
（右田俊介偏「免疫化グ」中白書店ｐｐ７４〜８８参照
）で精製して用いることができる。 あるいは、抗原で感染した哺乳動物など（例えばマウス
）の肺臓細胞や骨Ｕ腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞
（ハイブリト−マ）を得てモノクローナル抗体を作成し
、これを特定成分と特異的に結合しうる物質として使用
すると特異性が向上し、好ましい。 不溶化微粒子に結合させる抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉｇ
Ａ、、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画、或いはこれらの抗体を酵
素処理してＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）ｚといっ
た活性抗体フラグメントにして使用しでも良い。酵素で
標識する抗体は上記のうち、ＦａｂまたばＦ、ａｂ”の
みを使用する。ざらに、これらの抗体は中−で使用して
も、複数の抗体を１．ｔｌ　２＞合わせて使用しても良
い。 本発明の免疫測定方法による反応型式としては、１ステ
ップのサンドイツチ法に限られる。尚、本発明におりる
１ステップとは、途中で洗浄を入れないという意味であ
り、デイレード１ステップも含む。 抗体を結合させる不溶化担体としては、その大きさが２
ｍｍ以下の粒状体が好ましく、より好ましくは０．１　
ｌｔｍ〜３００７ｚｍのサイスの微１ｂ了−（粉砕物）
である。 不溶化微粒子の＋Ａ料としては、アガロース、セルロー
ス、架橋デキストラン、ポリアクリルアミＩ・、セル「
１−ス、微結晶セルロース、架橋アガｒ！−ス、架橋ポ
リアクリルアミド、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二
酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂
、ポリスチレン等の各種の合成樹脂のほか、後述する多
孔質層の素（Ａ、さらには磁性微粒子が利用できる。 好ましくはツガ１コース、架橋アガロース、架橋デ４−
ス１−ラン、ポリアクリルアミ１゛、架橋ポリアクリル
アミド、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、セルロー
ス、微結晶セルロース等であり、更に好ましくはポリア
クリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリスチレン
、微結晶セルロース等である。 上記不溶化微粒子は数種を混合して用いでも良い。 抗体又は抗原は、これら不溶化担体（微粒子）に、当業
者ご公知の方法で化学的及び／又は物理的に直接、ある
いは間接的に結合させることができる。 結合法につい゛（は１９７６年、講談社発行、千畑一部
シ、■か２名編「実験と応用　アフィニティクロマ１−
グラフィー」　（第１刷）、１９７５年、講談社発行、
山峡　誠ほか２名編「アフィニティクロマトグラフィー
Ｊ　（第１版）を参考にできる。 結合反応後、標識抗体（又は抗原）の非特異反応を（）
１除する目的で、測定すべき特異的反応に関与しない蛋
白質を担持させることができる。それらの代表的な例と
しては哺乳動物及び鳥類の正常血清蛋白質、アルブミン
、スー１−ムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲン及びそれ
らの分解物質等が挙げられる。 又、Ｆ記の非特異吸着抑制蛋白質は、不溶化担体に１「
１持させるだｊＪでなくはなく、免疫反応時にその一定
星を　　免疫反応溶液中に添加することにより、−・層
非特異吸着の抑制効果が上がる。 Ｂ／Ｆ分離は、フィルターを用いての濾過手段、遠心分
渾手段などで行え、又、不溶化）５一体として硼ｆｉｌ
　１ｉｊＱ　ｉｆｉ、−７−が用いられた場合には磁気
的な分離り段を用いることもできる。好ましくは、瞬時
にＢ／Ｆ分離が可能なフィルター濾過手段である。 本発明に用いる乾式分析素子ＣＪ、少なくとも−−１１
−一 層以１−の多孔質層を持つことが好ましい。 多孔質層の素材は特に限定されないが、好ましい例きし
て番、［サイズ１〜３５０μｍの粒状体あるいは４０〜
４００メツシユの繊維から一つ以ト選ばれた素材により
構成される構造体が挙げられろ。 該粒状体の材料としては、ケイ藻土、二酸化チタン、硫
酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セル１１−ス、
ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デー１−スｉ・リン
、架橋ポリアクリルアミド、アガロース、架橋アゴ１１
−ス、ポリスチレン等の各種の合成樹脂のほか、次のよ
・）な反応性基を持つ化合物から成る自己結合型粒子が
挙げられる。 例示化合物 （１）　　ポリ（スチレン−コーグリシジルメタクリレ
ート）　　　　　　　　　　　（９０／１０　）（２）
　ポリ（ス千しンーニ１−ノチルアクリレート−コーグ
リシジルメタクリレー日 （８０／１５１５　） （３）　ポリ（スチレン−コ−プチルメタクリレ−−ｌ
−−、’ｌ　　グリシジルメククリレート）１ニア５／
１５／１０　） （４）　　ポリ（スチレン−コービニルベンジルクロラ
イドーコーグリシジルメタクリレー１−　）　　　　　
　　　　　　　（８０／１０／１０）（５）　　ポリ（
スチレン−コージビニルー＼ンゼンーニ１−グリシジル
メタクリレ−１〜）〔９０／２／８） （６）　ポリ（ｐ−ビニルＩ・ルエンーコーグリシシン
メタクリレ−１−）　　　　　（９０／１０　）（７）
　ポリ（メチルメタクリレ−１・−コーグリシジンメタ
クリレ−１−）　　　　（８０／２０　）（８）　ポリ
（スチレン−＝ｒ−Ｎ−，どＮ−ジメチルアミノエチル
メククリレート）　　（９５１５）（９）　ポリ　（ス
チレン−コーアジリジニルエチルメタクリレ−Ｉｎ　　
　　　　　（９５１５）（Ｈｌ）　　ポリ（スチレンー
コーメチルアクリレート−コーアクロレイン）　　　　
（９０１５１５：１（１１）　　ポリ（スナレンーニＪ
−アクリルアミ１゛）［：９５１５） （＋２）　　ポリ（スチレン−コービニルチオール）（
１３）　　ポリ（スチレンーコーＮ−メヂロールアクリ
ルアミド）（９５１５） （１４）　　ポリ（スヂレンーコー１．−ブチルアクリ
レ−１・−コーグリシジルメタクリレ−１・）（１５）
　　ポリ（スチレン−′：ｌ−ビニルイソシア不−１・
）（９５１５） （１６）　　ポリ　（メチルアクリレート−：１−スチ
レンーコ　Ｎ−メチ−コールアクリルアミド）（５０／
３５／１５） （１７）　　ポリ（スチレン−：Ｊ−グリシジルメタク
リレート−コーＮ、Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリ
レ−Ｌ　）　　　　（９０１５１５）（１８）　　ポリ
（スチレン−コーメタクリル酸−コーアクリルアミト）
　　　　　　（９５／２／３　）（１９）　　ポリ（ス
チレン−コ　Ｎ−メチ１１−ルアクリルアミド−コーメ
トキシエチルアクリレート）　　　　　　　　　　　ｌ
：　９０１５１５　）（２０）　　ポリ（ｐ−ビニルト
ルエンーコーＮ−メーｆ−ｏ−ルアクリルアミドーコー
アクリル酸）（９０／８／２　） （２１）　　ポリ　（メチルメタクリレ−１・−コーグ
リシジルメタクリレ−１〜−コーＬ−ブチルアクリレー
ト）　　　　　　　（８０／１０／１０：１（２２）　
　ポリ（スチレン−二）−ｐ　ビニルヘンシルク１」ラ
イトーコーアクリル酸　コーラレイ）・上チルアクリレ
ート） （７５／１０１５／１０） （２３）　　ポリ（スチレン−′：、ｊ　メタクロレイ
ン−コーα−ヒドロキシコニチルメタクリレ−（２４）
　　ポリ（スチレン−：Ｉ−アク口レイン−コーアセト
アセトキシエチルメタクリレーＩ・）　　　　　　　　
　　　　（８５１５／１０　〕（２５）　　ポリ（スチ
レン−コーＮ、Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート
ーコ−ビニルスルボニルエチルメタクリレ−１−） ［９０１５１５） （２６）　　ホ’Ｊ　（ｐ　　ビニルトルコニンーコー
ー／ミノスチレン−コーヒニルスルボニルエチルメタク
リレ−１−）　　　　　　（８５／１０１５　）（２７
）　　ポリ（スチレン−、：Ｉ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミ
ノコルチルメタクリレ＝１・）　　［９／１０）（２８
）　　ポリ（スチレン−コーアクリル酸）（９７／３） （２９）　　ポリ（スチレン　コーアクリルアミ１）（
９７／３） （３０）　　ポリ（ｐ−ビニ月利・ルエンーコー１．−
ブチルアクリレ−１１（９５１５） （３１）　　ポリ　（メチルアクリレートーコ　メタク
リルアミＦ）　　　　　　　　　　　（９５１５）（３
２）　　ポリ（スチレン−＝１−Ｎ−メチロール）′ク
リルアミド）　　　　　　　　　　Ｃ９５１５）（３３
）　　ポリ　（ｐ−ビニルヘンジルクロライトーコ−Ｎ
−メチ−コールアクリルアミド）Ｃ９６／４） （３４）　　　ポリ（スチレン−コーイタコン酸）（９
８／２］ （３５）　　ポリ（スチレン−二＋−１−）゛デルアク
リレーＩ・）　　　　　　　　　　　　　　（　９２／
８　）（３６）　　ポリ（メチルアクリレート−コース
チレンーコーアクロレイン）　　　（３０／６５１５　
）（３７）　　ポリ（メチルメタクリレ−１・−コース
チレンー、ツー２−ヒドロキシエチルメタクリレ−１・
）　　　　　　　　　　（２５／７０１５　〕（３Ｂ）
　　ポリ（スチレンーコービニルスルボニルエチルアク
リレー１−　　　　　　（８０／２０　）（３９）　　
ポリ（スチレン−：Ｊ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル
アクリレ−＋−）　　（９０／１０　’１（４０）　　
ポリ（スチレン−コーメチルアクリレートーコーアセ１
−アセトキシエチルアクリレ−Ｉ・）　　　　　　　　
　　　　（　９０１５１５　〕（４１）　　ポリ（スチ
レン−コーメタクリル酸）尚、各例示化合物の後の括弧
内は重合反応に用′いられた単量体の重量％を示す。 これらの粒子数種を混合して用いるごともできる。 又、多孔質層に用いる繊維としては、パルプ　ｑ 粉末濾紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キｌ＝リーン、
セルロースエステル ンモニアレーヨン、ポリアミｌ　（６−ナイロン、６、
６　リーイ［イン、６．１０−　ナイロン等）、ポリエ
ステル（ポリエチレンテレフタレー＋−　ｅ９　）、ポ
リオレフィン（ポリプロピレン、ビニｔ゛２ン等）、ガ
ラス繊維、石綿なとの植物性、動物性、合成、半合成、
再生繊維を用いることができ、あるいはこれらを混合し
ζ用いても良い。あるいは別の態様としては吸水性の洋
紙、和紙、濾紙、プラッシュポリマー、あるいはガラス
繊維、鉱物性繊維（石綿など）、植物性繊維（木綿、麻
、パルプ等）、動物１テＩ繊糺（エユモ、絹など）、合
成繊維（各種ナイロン、ビニ１−Ｉン、ポリエチレンテ
レフタレート、ポリプロピレン等）、再生繊維（レーヨ
ン、セル■：１−スエステル等）などを単独あるいは混
合して製造した織物、不織布、合成紙などを該多孔質層
に用いることもできる。 ごのような粒状体、繊維、あるいは粒状体と繊維の混合
物を塗布及び／又は製膜することにより、自由に接触し
得る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造か存在する多孔
質層を形成する。自己結合性をイｌしないｔＤ了は適当
な接着剤を用いて粒子同志が点接着ずろ形で製膜するこ
とができ、例えば特開昭４９　　５３８１１８ｑ公報、
特開昭５　５　−　り　０８５０″；３公報、特開昭Ｆ
ｉ　７−６　７　８　６　０　’；；公報に記載の方法
をｉＭ用することができる。自己結合性を有する有機ポ
リマー粒子は特開昭５７−用０４７６０号公報、特開昭
５　７　−　１　０　１　７　６　１号公報、ｌｊｒ開
昭開閉８　−７　０　１　６　３号公報に記載の方法に
より同様に製膜できる。繊維又は繊維及び粒子の混合物
につい′（は特開昭５　７−１　２　！’ｉ　８　４　
７号公報、特開昭５７−１９７４６６号公報に記載され
た繊維分１１シ液を塗布するごとにより多孔質層を形成
できる。又、特開昭６　０　−　１　７　３　４　７　
１号公報で行われている方法のようにゼラチンやポリビ
ニルビ＋：ＩＩＪ　ｌンのような水）容１１ハ・イング
ーを使用しノご繊維分散液を塗布することも可能である
。又、このときのバインダーは水溶性に限らず、疏水性
のノ＼イングーの使用も可能である。このような分１１
り液を製造する為には、多くの方法を単独又は組み合わ
一Ｕて用いることが可能である。例えば、有用な方法の
一つとし゛（、界面活性剤を液体キャリヤーへ添加し、
粒状体及び／又は繊維の分散液１１喝こ分布及び安定化
を促進することができる。 使用可能な代表的な界面活１ソ１剤の例としては、トラ
イトンＸ　−　１　０　０　（＋：＋ームアンドハース
社製；オクチルフェノキシポリ〕ニドキシエタノール）
、サーフアクタンｌ　ｌ　Ｏ　Ｇ　（オリーン社製；ノ
ニルソエノキシボリグリシドール）等の非イオン性界面
活性剤がある。 １−記界面活性剤む４広範に選択された量を用いること
が可能であるが、粒状体及び／又は繊維の重量に対しで
０．ｆ１０５〜１０重景％、好ま重量Ｇ：１０、１５〜
６重量％用いることができる。更に、別の方法として、
該粒子単位と液体キャリヤーの音波処理、物理的混合、
及び物理的攪拌処理、Ｐｔｌ調整がある。これらは前記
の方法と組み合わせるごとにより、更に有用である。 標識抗体又は抗原の非特異的反応を１′Ｊ１除する目的
で、測定すべき特異的反応に関与しない蛋白質を担持す
るごとが可能である。それらの代表的な例としては、哺
乳動物の正常血清蛋白質、アルブミンン、スキムミルク
、乳酸酌酵物、コラーゲン、ゼラチン及びそれらの分解
物等が挙げられる。 このような固定化操作は、前述の粒状体あるいは繊維に
あらかじめ行ったおいた後、多孔質層を形成しでも良く
、あるいは多孔質層を形成した後に該固定化操作を行う
ことも可能である。 乾式分４１７素子の形態は分析を行いうるものであれば
よく、１、１°に制限されるものではないが、製造上及
び測定操作−ヒ、フィルム状あるいはシート状であるこ
とが好ましい。 乾式分析素子は一層から成っていても、多層から成って
いてもよい。 例えば、７−β＝−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ−９
．９゛−ジメチル−９Ｈ−アクリジン−２−オンのよう
な基質を内蔵した多孔質層のみからなるものとか、吸水
層上に多孔質層（基質が少なくともどりらかの層に内蔵
）が設番」られてなるものとか、吸水層−にに複数の多
孔質層（基質が少なくとも何れかの層に内１銭）が設け
られてなるものとかが考えられ、必要に応してそれらは
光透過性支持体上に設ｉＪられたり、光反射性支持体」
二に設けられたり、光透過性支持体上に基質を内蔵した
多孔質層が設けられ、その」二に光反射性層が設けられ
たりする。 尚、吸水層の素材とし゛（は、例えばゼラチン、フタル
化ゼラチン等のゼラチン誘導体、ポリビニ１レア月仁１
−ル、ポリビールビ１：Ｊリドン、ポリビニルイミダゾ
ール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸す１−リウ
ム等の合成品′）′ｉ子、ヒＩ＋コキシエチルセルロー
ス、カルボニトシメヂルセルロースナトリウム塩などの
セルロース誘導体の多耕１類などが挙げられる。好まし
くは、ゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体
である。 光透過性支持体の素材としては、例えば酢酸セル１′Ｉ
−ス、ポリエチレンテレフタレート、ポリビールビ−１
・及びポリビニル化合物（例えばポリスチレン）のよう
な透明品分−ｒ化合物あるいはガラスのような透明無機
化合物が挙げられる。 光反射性支持体の素材としては、例えばセラミックス、
金属、あるいは樹脂被覆された紙などが挙げられ、必要
に応してこれらの素）わ」Ｊに１ＪＴｉ０２．１１　ａ
　ＳＯ４、マイカなどの白色顔料などを含（１又εＪ塗
布さセたものでも良い。 そし−（、例えば光透過性支持体上に７−β−Ｄ−ガラ
ク１−ピラノシルオキシ−９，９’　−ジメチル−９１
１−アクリジン−２−オンのような基質を内蔵した多孔
質層が設けられてなる乾式分析素子が用いられる場合に
は、試！４は多孔質層側から滴下されるが、信号の測定
は両側から可能であり、光反射性支持体上に基質を内蔵
した多孔質層が設けられてなる乾式分析素子が用いられ
る場合には、試’４’４の滴下及び信号の測定は多孔質
層側から行われるものであり、光透過性支持体」−に基
質を内蔵　　。 した多孔質層が設けられ、そのにに光反射性層が設けら
れてなる乾式分析素子が用いられる場合には、試料の滴
下は光反射性層側から行われ、信号の？１１１１定は光
透過性支持体側から行われる。 標識酵素に起因した信号は、吸光度法（比色法）、螢光
法または発光法で検出することができ、測定法として（
Ｊ信−シの経時的変化を測定するレート測定法ｉｉたは
一定時間後の信号を測定するエンドポイント測定法で測
定するごとができる。好ましくは吸光度法であり、吸光
度法（比色法）では紫外線、可視光、近赤外光を利用す
ることができ、例えば流体試料として血清及び血漿を用
いる場合には、血清及び血漿による吸光の影響を小ざく
するために緑色光、赤色光または近赤外光を利用するの
が好ましい。例えば７−＝β−Ｄ〜ガラク１−ピラノシ
ル第４−シー９，９゛−ジメチル−９Ｈ〜アクリジン−
２−オンを用いる場合には、５５０ｎｍ〜６　＋Ｉ　Ｏ
ｎ　ｍの波長の光が利用でき、血中成分の影響を受けに
くい。 乾式分析素子口、滴下された液相を展開する為の展開層
を有するものであることが好ましい。展開層は供給され
た試料液の体積に比例し、液相を展開することが好まし
い。展ｌｆＷ層の素材としては、多孔質層と同様なもの
を塗布、製膜、貼イ・１しても良い。 本発明にあっては、展開層内に基質等を内蔵させ、反応
層としての役目を持たせても良い。 乾ｒ（分ＩＪτ素子には、他の添加剤、例えば緩衝剤、
保恒剤、界面活性剤、媒染剤等を目的に応して添加する
ことができる。 緩衝剤は、特異的結合反応、酵素反応、発色反応等に適
したｐ　Ｈとする為に含有される。用いることができる
緩衝剤としてはト１木化学余線「化学便覧）□（保線」
　（東京、丸１４Ｑ狼　１９６６）ｐｐ１３１２〜１３
２０、Ｎ、Ｅ、Ｇｏｏｄ等；　Ｂｉ　。 ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　Ｖｏｌ　　５、ｐ４６７　（１
９６Ｇ）、合材、斎藤：化学の領域、Ｖｏ１３０（２）
、ｐ７９　（＋９７６）、Ｗ、　Ｊ、　ＦｅｒｇｕｓＯ
ｎ等　Δｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｖｏｌ　　ＩＯ２
、ｐ３００（１９８０）等の文献に記載されているもの
をｚトげることができる。具体的な例としては、ボウ酸
塩、り、１−ン酸塩、燐酸塩、炭酸塩、トリスバルビッ
ール、グリシン、グツト緩衝剤など力稍（げられる。好
ましくはグツド緩衝剤であり、特に標識としてβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼを用いる場合にはＢ　ｉ　ｓ　−ｔ　
ｒ　ｉ　ｓ、、ＨＥＰＥＳ、　ＩＦ、ＰＰＳ、、Ｐ　Ｉ
　ＰＥＳ、、ＭＯＰＳ（’ｌ、ＡＤＡ、ｉ”　ｌ’：　
Ｓといったグツト緩衝剤を用いることが好まし７い。 ごれらの緩衝剤は必要に応して単独で層を形成さ・１て
もよい。 保恒剤は尽質発色試薬の保存安定化の為に含有される。 その物質としては、日本生化学余線「生化学実験Ｉ」座
１、蛋白質の化学１」　（東京化学同人Ｏ狼１９７ｆｉ
）ｐｐ６６〜６７、実験と応用「アフィニティクロマト
グラフィ」ｐｐ１６〜１０４、特開昭ｆｉ　Ｏ−１４９
９２７号公報などに記載されているものが皐げられる。 ｖ体的例としては、ゼラチン、ゼラチン分解物、アルブ
ミン、シフ１１デートストリン頻、非１７元糖類（シュ
クロース、トレハロース）、ポリエチレングリコール、
アミノ酸、各種イオン、アジ化ソーダ等が挙げられる。 界面活性剤としては、前述のものが挙げられる。 その他の層中に含有される試薬としては、溶解助剤、ブ
１コツカー試薬などがある。これらの添加剤は必要乙こ
応して適当量添加する。媒染剤は、酵素活１ノＦ測定の
為の検出物質を測光部側に集中的に望めたり、検出物質
が色素の場合吸光度係数を高めたり、波長をシフ１−さ
−ｌる物質であり、検出物質と強い相７１作用を示す。 カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー及びこれらの
ポリマーのラテックスか用いられろ。 乾式分析素子は、必要に応して設＋ｊる接着層、保護層
、タイミング層といった補助層を設けることができる。 これらの層は、その機能に応して設けられるべき位置が
決定される。

【実施例】

以下、本発明を実施例によって更に具体的に説明するが
、本発明はこれら実施例によって限定されるものではな
い。 〔実施例１〕 １−（］）　　比較用のβ−Ｄ−ガラク１〜シダーゼ標
識ＣＲＰ抗体の作成 ＣＲＰ抗体（ヒツジＩｇＧフラクション、カッベル社製
）２０ｍＨをＯ，］Ｍのリン酸緩衝液（ｐ６．５）２．
０ｍｌに溶解し、これにＮ−（ε−マレイミドカプロイ
ルオキシ）スクシンイミド（同化化学研究所製）が２．
５ｍｇ／ｍｌのジメチルボルムアミド溶液７７μｌを加
えて、３０°Ｃで２０分間反応後、５ｍＭの１７．Ｄ　
ｉ’　Ａを含有する０、１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６，
０）で平衡化したセファデックスＧ２５カラＪ、で精製
し、マレイミド化したＣＲＰ抗体を得た。 次に、β−Ｄ−ガラクトソダーゼ（東洋紡社製）がｌＯ
，５ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液１゜８ｍｌに、
前記マレイミド化したＣ　ＲＰ抗体を１３．６ｍｇ含む
溶液３．２ｍｌを加えて、４°Ｃで４５時間反応後、０
．１Ｍの２−メルカプトエチルアミン１７５μｍを加え
て３０°Ｃで２０分間反応さ−ｌ、０．１５Ｍの塩化ナ
トリウムを含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４
）で平衡化したスーパーローズ６プレソブグレード（フ
ァルマノアン１製）カラＪ、で分離、精製し、そしてウ
シ血清アルブミン（アーマ−社製）が０．　１％、アジ
化すトリウムが０．１％となるように添加し、比較用の
β−Ｄ−ガラクＩ−シダーゼ標識ＣＲＰ抗体１を得た。 １−（２）　　本発明に用いられるβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ標識ＣＲＰ抗体の作成 ＣＲＰ抗体（ヒツジＦ（ａｂ’）２、カッペル社製）２
０ｍｇを蒸留水２ｍｌに溶解し、５ｍＭノＥ　ｒ）　’
ｌ’　Ａを含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０
）で−晩透析した後、０．１Ｍの２−メルカプトエチル
アミン］、１２ｍ１（ジメチルホルムアミドに溶解）を
加えて、３７°Ｃで９０分間反応後、５ｍＭのＥ　Ｄ　
ＴＡを含有する０、ＩＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
で平衡化したセファデックスＧ２５カラｌ、（ファルマ
シア社製）で精製し、ＣＲＰ抗体（Ｆａｂ’）を得た。 次に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（東）イニ紡社製）４
０ｍｇを０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）８ｍｌに
溶解し、これにＮ、Ｎ’　−ｏ−フェニレンンマレイミ
ド（同化化学研究所製）２ｍｇ／ｍｌのジメチルホルム
アミド ３０°Ｃで２０分間反応後、５ｍＭのＥＤＴＡを含有す
る０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平１かｉ化し
たセファう一゛ノクスＣ２５カラムで精製し、マレイミ
！化したβ−Ｄ−ガラクＩ・シダーゼを（ワた。 このマレ・イミド化したβ　Ｄ　カラク１−ンダーｆ　
Ｇ　ｍ　ｇ／　ｍ　Ｉ　ｍ液の２．１４ｍ１に前記ＣＲ
Ｉ）抗体（Ｆ；１１）’）の８　ｍ　Ｂ　／　ｍ　Ｉ溶
液を２．８／／１加え、４０°Ｃ（］　７１１．’１間
反応後、０．］５Ｍの＋２４　、ｆヒナｉ　ＩＪ　１°
ノＪ、＠　含イｊスＺ：ｌ　Ｏ、］　Ｍ　’Ｊ　ンＨｆ
ｆｉｊｈ？（’ｊ。 （ｐｔ１６．５）で平ｉｆｉ化したスーパー１コーズ６
プレソプクＬ−−１”カラＪ・（ファルマソア社製）で
分面１．４’＋’ｉ製し、ウシ血清−フルブミン（−）
′−■−ン］製）がＯ１％、アジ化すトリウｌ、がＯ，
１％となるように添加し、本発明に用いるβ−■）−ガ
ラク１−ンダーゼ標８ｉｉ（ＣＲｒ’抗体２を得た。 １−（３）　ＯＲＰ抗体抗体固定化パイパーギン１Ｃ（
＋）合成 オイバーギントＣ（１：Ｉ−Ｊ、ファーマ社製）３ｇを
０．１５Ｍの塩化すトリウＪ１を含有する０、１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８，０）４０ｍｌ中に分散し、これにＣ
ＲＰ抗体（ウサギＴｇＧフラクション、クウンズ社製）
１３６ｍｇを入れ、４°Ｃで２０時間攪拌し反応させる
。反応後、濾取し、０゜１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）
と０．１Ｍの炭酸緩衝液（ｐｌ−１８，０）を交互に用
い、充分洗浄した。 次いで、水洗した後、経口３８μｍのメソシュでふるい
をかけた。オイパーギッ１−　ｃの非特異的結合部位を
ブロックする為、」１記のふるいをかけたオイパーギノ
トＣを３％スキムミルク添加の０゜１５Ｍの塩化すｌ・
リウムを含有する０、１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７，４
）中で４°Ｃｌ２Ｏ時間隔拌した。次いで水洗し、ＣＲ
Ｐ抗体固定化オイパーギノト′Ｃを得た。 ］−（４）　　乾式分析素子の作成 厚さ１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフク
レー１〜フィルムの上に、下記の組成の塗布液（１）を
塗布し、乾燥させ、ゼラチン層を作成さゼた。 塗布液−（１） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　　６．２ｇ１□ライｌ
−７Ｘ−１０００，２５ｇ ＥＰＰＳ　（グツト緩衝剤、同化化学研究所製）７．５
ｇ °　Ｉ、２−ビス（ビニルスルボニル）エタン０．０１
ｇ 塩化マグネシウム・６水和物（関東化学社製）４０．６
ｍｇ 純水　　　　　　　　　　　　　８６．０ｇ次に、塗４
１液−（２）を前記ゼラチン層の上に塗布し、乾燥した
。 塗布液−（２） 粉末ろ紙Ｄ（東洋濾紙社製）　　　１５．２ｇポリビニ
ルピロリドン　　　　　　２．１３ｇｎ−ブタノール　
　　　　　　　　５６．５８ｇ７−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシルオキシ−９゜９“　−ジメチル−９Ｈ−アクリ
ジン−２−オン６１３ｍｇ メタノール　　　　　　　　　　　８．４ｇトライトン
Ｘ−１００１，２５ｇ これを１．５ｃｍＸ１．５ｃｍの大きさに裁断し、乾式
分析素子とした。 ］−（５）　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＩ？Ｐ
抗体１、β−Ｄ−ガラクＩ・シダーゼ標識ＣＲＰ抗体２
を用いてのｃＲＰ測定 １ｍＭ塩化マグネシウム及び３重量％ウシ血清アルブミ
ンを含有する０、３Ｍのビストリス緩衝液１９０７／　
ｌ　Ｌこ、Ｃ１？Ｐ抗体固定化オイパーギットＣｌ５ｍ
ｇ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体１　（Ｉ
Ｏμｇ／ｍｌ）又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲ
Ｐ抗体２（１０ｇｇ／ｍ１）２５〃ｌ、ＣＲＰ溶液（０
，３，１０，３ｏ、１００．３００μｇ／ｒｒ＋Ｉ）７
μｌを添加混合し、室温で１２分間免疫反応さセる。 反応後の混合液を口径０．２７ｚｍのセルロースアセテ
ートメンブランフィルタ−（ミリボア社製）で濾過し、
その濾液１０μｍを前記１−（４’ｌで作成した乾式分
析素子に滴下した。 ３７°Ｃで７分間インキユヘートしながら、支持体側か
ら６００ｎｍの反射濃度をを測定した。 ３分３０秒〜７分の反射濃度差（ΔＤｒ）を用いて検量
線を作成した結果を第１図に示す。すなわち、第１図は
本発明の免疫測定方法により作成されたＣＲＰの検量線
及び比較例を示すグラフであり、横軸はＣＲｒ’ｌ（７
！ｇ／ｍｌ）を、縦軸は反射濃度差（ΔＤｒ）を示す。 この結果から、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ　
ｊｉｉ体２を用いた本発明は操作も簡便であり、測定時
間も短時間でＣＲＰが測定可能であり、さらにはβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体Ｉを用いた比較例の
場合よりも感度良く測定できていることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例で作成された検量線を示すグ
ラフである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）反応型式が１ステップでサンドイッチ法の非均一
   系免疫測定法を用いて試料中の抗原を分析する方法であ
   って、抗体が結合された不溶化微粒子、酵素で標識した
   Ｆａｂ又はＦａｂ′型の抗体、及び試料を接触、免疫反
   応させ、前記不溶化微粒子と結合した反応生成物と非反
   応物とを分離した後、前記不溶化微粒子と結合していな
   い非反応物における酵素標識体の酵素活性を乾式分析素
   子で測定することにより、試料中の抗原を分析すること
   を特徴とする免疫測定方法。
2. （２）特許請求の範囲第１項記載の免疫測定方法におい
   て、標識酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼが用いら
   れてなるもの。
3. （３）特許請求の範囲第１項記載の免疫測定方法におい
   て、分析素子に内蔵する酵素基質として７−β−Ｄ−ガ
   ラクトピラノシルオキシ−９，９′−ジメチル−９Ｈ−
   アクリジン−２−オンが用いられてなるもの。