JPH04184410A - 共焦点走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は共焦点走査型顕微鏡に関し、特に詳細には、電
気的に暗視野測光法を実現するようにした共焦点走査型
顕微鏡に関するものである。

（従来の技術） 従来より、照明光を微小な光点に収束させ、この光点を
試料上において２次元的に走査させ、その際該試料を透
過した光あるいはそこで反射した光、さらには試料から
発せられた蛍光を光検出器で検出して、試料の拡大像を
担持する電気信号を得るようにした光学式走査型顕微鏡
が公知となっている。

なかでも、照明光を光源から発生させた上で試料上にお
いて光点に結像させる一方、この試料からの光束を再度
点像に結像させてそれを光検出器で検出するように構成
した共焦点走査型顕微鏡は、試料面上にピンホールを配
する必要が無く、実現容易となっている。なお特開昭６
２−２１７２１８号公報には、この共焦点走査型顕微鏡
の一例が示されている。

また、このような共焦点走査型顕微鏡において、解像度
を超えた微小物体像を識別可能とするために、暗視野測
光方式の適用も考えられている。

（発明が解決しようとする課題） 従来の暗視野測光方式の共焦点走査型顕微鏡においては
、光学系にビームトラップを取り付けて、光学的に暗視
野測光方式を実現していた。しかし、光学系にビームト
ラップを取り付けたり、またそこから取り外す操作は、
大変面倒なものである。

また本出願人による特願平１−２４８９４８号明細書に
示されるように、送光光学系と受光光学系とを共通の移
動台に搭載し、この移動台を試料台に対して移動させる
ことにより、照明光光点の走査を行なうことが考えられ
るが、そのような場合に上記ビームトラップを取り付け
ると、移動台が重くなって高速走査の上で不利になる。

そこで本発明は、ビームトラップを必要とせずに、暗視
野測光方式を実現できる共焦点走査型顕微鏡を提供する
ことを目的とするものである。

（課題を解決するための手段） 本発明による共焦点走査型顕微鏡は、光ヘテロダイン法
により暗視野測光方式を実現したものであり、 試料が載置される試料台と、 照明光を発する光源と、 この照明光を試料上において微小な光点として結像させ
る送光光学系と、 試料を透過した光を集光して点像に結像させる受光光学
系と、 上記光点を試料上において２次元的に走査させる走査手
段と、 試料に入射する前の照明光の一部を参照光として分岐さ
せる分岐手段と、 試料を透過した透過光と上記参照光とを合波する合波手
段と、 上記分岐手段を経た照明光を第１の変調周波数で変調す
る第１の変調手段と、 上記参照光を上記第１の変調周波数とは異なる第２の変
調周波数で変調する第２の変調手段と、上記合波手段で
合波された光を検出する光検出器と、 この光検出器の出力信号から、変調された上記照明光と
参照光とによるビート成分を除去した信号を得るフィル
ター手段とから構成されたことを特徴とするものである
。

（作用および発明の効果） 光検出器の出力信号に対して、上述のビート成分を除去
するフィルタリング処理を施すと、この処理後の信号は
暗視野像を担持するものとなる。

以下、この点について詳しく説明する。

照明光、参照光の強度をそれぞれＡ１、Ａ２、そして変
調周波数をそれぞれｆｌ　（第１の変調周波数）、ｆｚ
（第２の変調周波数）とすると、各光は以下のように変
調される。

Ａｓ　−Ａ１　ｃｏｓ（ν１　ｔ＋φｌ）・・・・・・
（１）ＡＺ−Ａ２ｃｏｓ　（ν２　ｔ＋φ２）・・・・
・・（２）ただしＡｌｌ！：Ａ２は振幅、ν１、ν２は
角周波数でシ１−２πｆ工、シ２−２πｆ２、ｔは時間
、φｌとφ２は初期位相である。

一方透過光には、試料を通過した０次光である照明光と
回折光（散乱光）とが合波されている。

その回折光の強度Ａ３は、以下の式で表わされる。

Ａ３　ｍＡ３　　ｃｏｓ　（１／３　　ｔ＋φ３）ただ
しに３は振幅、ν３は角周波数、φ３は初期位相である
。

以上のように規定すると、前記光検出器の出力信号ｌは
、 １ｏＣ（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３）２　・・・・・・（３）と
表わされる。

ここで、シ１−シ２！Δν φ１−φ２″″Δφ１２ φ２−φ３″″Δφ２３ φ３−φエ　−Δφ３、　　　と置くと、回折光の変調
周波数は照明光のそれと変わらないからシエーシ３であ
り、よって（３）式の右辺は下式で表わされる。

（Ａ、　＋Ａ２　＋Ａ３）２ −ＡＩ　Ａ２　　ｃｏｓ　（Δνを十Δφ１２）＋ＡＺ
　Ａ３　　ｃｏｓ　（−Δνｔ＋Δφ２３）＋Ａ３　　
Ａ１　　ｃｏｓ　（Δφ３□）−Ａ２ｅＯ８Δνｔ　　
（Ａ　＋　ｃｏｓΔφ１２＋Ａ３　　ＣＯ５Δφ２３）
＋Ａ２５ｉｎΔνｔ（Ａ３ｓｉｎΔφ２３　　ＡＩ　　
ＳｉｎΔφ１２）＋Ａ３　　ＡＨｃｏｓ　（Δφ３□）
　　　・・・・・・（４）−ｋｓｉｎ（Δν　ｔ＋Φ） ＋Ａ３　　ＡＨｃｏｓ　（Δφ３．）　　　　−−・−
（５）なお、この（５）式の第１項は、（４）式の第１
項と第２項の合成である。

以上のようにして光検出器からは、ビート周波数Δｆ−
Δν／２π−ｆｌ−ｆ２で変調された成分（（５）式の
第１項）と、それ以外の成分からなる信号が得られるこ
とになる。上記周波数Δｆで変調されていない成分は、
試料での回折光のみによるものであるから、前述のフィ
ルタリング処理を行なってこの成分のみからなる信号を
得ると、その信号は暗視野像を担持するものとなる。そ
こで、この信号に基づいて画像を再生すれば、試料の暗
視野像が得られる。

なお、光検出器の出力を上記のフィルタリング処理にか
けなければ、それは明視野像を担持する信号となる。そ
こでこの信号に基づいて画像を再生すれば、試料の明視
野像が得られる。このように本発明装置によれば、暗視
野像もまた明視野像も随意に得ることができる。

しかも、上記光検出器の出力を分岐して一方は上記のフ
ィルタリング処理にかけ、他方は上記のフィルタリング
処理にかけないようにすれば、同一試料面についての明
視野像と暗視野像とを得ることができる。そこで、これ
ら両像を合成すれば、試料の全体的な明暗状態も示す一
方、試料の輪郭部分は暗視野像で示すような画像を得る
こともできる。

以上述べたように本発明の共焦点走査型顕微鏡において
は、電気的処理によって暗視野測光方式を実現している
から、光学系にビームトラップを用いる必要がなく、よ
って操作が簡単なものとなる。また特に、前述したよう
に送光光学系、受光光学系を移動台に搭載し、この移動
台を移動させて照明光走査を行なう場合は、ビームトラ
ップが不要であることにより移動台が軽量化され、走査
速度を高める上で有利となる。

（実　施　例） 以下、図面に示す実施例に基づいて本発明の詳細な説明
する。

第１図は、本発明の第１実施例による透過型の共焦点走
査型顕微鏡を示すものである。図示されるように単色光
レーザ１０からは、照明光としてのレーザビーム１１が
射出される。直線偏光したこの照明光１１の一部は、後
述するハーフミラ−７４を透過した後、第１ＡＯＭ（音
響光学光変調器）８を通過し、ビームエキスパンダ１２
でビーム径が拡大された後、偏波面調整用のλ／２板９
に通され、収束レンズ１３で集光されて偏波面保存光フ
ァイバー１４内に入射せしめられる。

この光ファイバー１４の一端は移動台１５に固定されて
おり、該光フアイバー１４内を伝搬した照明光１１はこ
の一端から出射する。この際光ファイバー１４の一端は
、点光源状に照明光１１を発することになる。移動台１
５には、コリメーターレンズ１６および対物レンズ（コ
ンデンサーレンズ）１７からなる送光光学系１８か保持
されている。そしてこれら両レンズ１Ｂ、＋７の間には
、λ／４板１か配されている。

また移動台１５には、対物レンズ１９および集光レンズ
２０からなる受光光学系２１か保持されている。

これら両レンズ１９．２０の間には、λ／４板２４か配
されている。上記２つの光学系１８．２１は、互いに光
軸を一致させて固定されている。また両光学系１８．２
１の間には、移動台１５と別体とされた試料台２２か配
されている。

上記の照明光１１はコリメーターレンズ１６によって平
行光とされ、λ／４板１によって円偏光とされてから対
物レンズ１７によって集光され、試料台２２に載置され
た試料２３上で（表面あるいは内部で）微小な光点Ｐに
収束する。試料２３を透過した透過光１１′　の光束は
、受光光学系２１の対物レンズ１９によって平行光とさ
れ、λ／４板２４を通過して直線偏光とされ、次に集光
レンズ２０によって集光されて、点像に結像する。この
結像位置において移動台１５には偏波面保存光ファイバ
ー２５の一端が固定されており、透過光１１“は該一端
からこの光フアイバー２５内に入射する。なお透過光１
１’　には、試料２３を０次光として透過した照明光に
加えて、該試料２３で回折した回折光か含まれている。

光フアイバー２５内を伝搬した透過光１１′　はその他
端から出射し、コリメーターレンズ２６で平行光とされ
、偏波面調整用のλ／２板２７を通過してハーフミラ−
２８に入射する。透過光１１゛　はここで後述する参照
光ＩＬＲと合波される。その合波された光ＩＩｃは集光
レンズ２９て集光され、例えば光電子増倍管等の光検出
器３０によって検出される。この光検出器３０からは、
合波光１１Ｃの光量を示す信号Ｓが出力される。

なお本実施例では、照明光１１をλ／４板１により円偏
光として試料２３に入射させ、透過光１１°をλ／４板
２４で直線偏光に戻し、所定の向きに直線偏光した透過
光１１’　のみを検出するようにしているから、試料２
３周りの不要光を光検出器３０が検出してしまうことが
防止される。

次に、照明光光点Ｐの２次元走査について説明する。上
記移動台Ｉ５と架台３２との間には、積層ピエゾ素子３
３が介装されている。この積層ピエゾ素子３３はピエゾ
素子駆動回路３４から駆動電力を受けて駆動し、移動台
１５を矢印Ｘ方向に高速で往復移動させる。この往復移
動の振動数は、例えば１０ｋＨｚとされる。その場合、
主走査幅を１００μｍとすると、主走査速度は、 １０ＸＩＯ３ＸＩＯ（ｌ　ＸＸ１０−６Ｘ２−２／ｓと
なる。なお、光ファイバー１４．２５は可撓性を有する
ので、それぞれ照明光１１、透過光１１“を伝搬させつ
つ、移動台１５の振動を許容する。

一方試料台２２と架台３２との間には、積層ピエゾ素子
４７．４９が介装されている。積層ピエゾ素子４７はピ
エゾ素子駆動回路４８から駆動電力を受けて駆動し、試
料台２２をＹ方向（図の紙面に垂直な方向）に高速で往
復移動させる。それにより試料台２２は移動台１５に対
して相対移動され、前記光点Ｐか試料２３上を、主走査
方向Ｘと直交するＹ方向に副走査する。なおこの副走査
の所要時間は例えば１Ｘ２０秒とされ、その場合、副走
査幅を１００μｍとすると、副走査速度は、 ２０Ｘ　１００　Ｘ　１０’　−０，００２ｍ　／　ｓ
菖２ｍｍ／ｓ と、前記主走査速度よりも十分に低くなる。この程度の
副走査速度であれば、試料台２２を移動させても、試料
２３が飛んでしまうことを防止できる。

以上のようにして光点Ｐか試料２３上を２次元的に走査
することにより、前述の光検出器３０からは、試料２３
の２次元拡大像を担持する連続的な信号Ｓが得られる。

また、上端に上記副走査用積層ピエゾ素子４７を固定し
、下端が粗動ステージ５１を介して架台３２に取り付け
られた積層ピエゾ素子４９は、ピエゾ素子駆動回路５０
から駆動電力を受けて駆動し、試料台２２を保持した積
層ピエゾ素子４７を、主、副走査方向Ｘ、Ｙと直交する
矢印Ｚ方向、（光学系１８．２１の光軸方向）に移動さ
せる。こうして試料台２２をＺ方向に所定距離移動させ
る毎に照明光光点Ｐの２次元走査を行なえば、合焦点面
の情報のみが光検出器３０によって検出される。そこで
、試料２３をＺ方向に移動させた範囲内で、３次元画像
を担う信号Ｓを得ることが可能となる。

なおピエゾ素子駆動回路３４．４８および５０には、制
御回路３５から同期信号が入力され、それにより、光点
Ｐの主、副走査および試料台２２の光軸方向移動の同期
が取られる。

また上記の粗動ステージ５１は手動で、あるいは駆動手
段を用いてＹ方向に移動可能であり、こうして試料台２
２を動かすことにより、試料２３の交換を容易に行なう
ことができる。

先に述べたハーフミラ−７４においては、照明光１１の
一部が反射し、この光は参照光１１Ｒとしてミラー７５
に入射する。該ミラー７５て反射した参照光１１Ｒは、
第２ＡＯＭ７Ｂを通過した後、ビームエキスパンダ７７
でビーム径が拡大されて／％−フミラー２８に入射し、
そこで前述のように透過光１１′　と合波される。

ここで、前記第１ＡＯＭ８は駆動回路８０によって駆動
されて、ハーフミラ−７４を透過した照明光１１を変調
する。また第２　Ａ　ＯＭ２Ｏは駆動回路８１によって
駆動されて、参照光１１Ｒを変調する。この照明光１１
の変調は、前述の（１）式で規定されるようになされる
。一方弁照光１１Ｒの変調は、前述の（２）式で規定さ
れるようになされる。本例においては、照明光１１の変
調周波数ｆ　１　＝　８０Ｍ　Ｈｚ、参照光１１Ｒの変
調周波数ｆ２−７８〜ＩＨｚである。

このように照明光１１、参照光ＬＩＲを変調すると、光
検出器３０の出力信号Ｓには、それら両光によるビート
成分すなわち周波数Δｆ＝ｆ、−ｆ２で変調された成分
と、それ以外の成分とか含まれるようになる。この信号
Ｓはローパスフィルター７０に通されて信号Ｓ゛　とさ
れ、次にＡ／Ｄ変換器７１により、サンプリングクロッ
クＣＬＫに基づいてサンプリング周波数ｆｓでサンプリ
ングされ、画素分割されたデジタル画像信号Ｓｄに変換
される。このデジタル画像信号Ｓｄは一旦画像メモリ７
２に記憶され、その後、−例としてＣＲＴ表示装置７３
に入力されて、それが担持する画像の再生に供せられる
。

ここで変調周波数ｆ１、ｆ２は、Δｆの値がローパスフ
ィルター７０のカットオフ周波数ｆｃよりも高周波とな
るように設定され、そしてサンプリング周波数ｆｓは上
記カットオフ周波数ｆｃよりも低周波となるように設定
されている。すなわち、ｆｓ＜ｆｃ＜Δｆ てあり、本例では、Δｆ−２ＭＨｚＳ　ｆｃ　＝１．５
ＭＨｚ、ｆｓ−ＩＭＨｚとなっている。信号Ｓを上述の
ようなローパスフィルター７０に通すと、そこからの出
力信号Ｓ”は、周波数Δｆで変調された上述のビート成
分が除去されたものとなる。このような信号Ｓ′は先に
説明した通り、試料２３の暗視野像を担持するものとな
るから、ＣＲＴ表示装置７３においては、この暗視野像
が表示されるようになる。

なお上記光検出器３０の出力信号Ｓを、上述のようなロ
ーパスフィルター７０に通さないでＡ／Ｄ変換器７１に
入力することもできる。その場合、本例のようにΔｆの
公約数となるサンプリング周波数ｆｓでサンプリングす
れば、常にビート成分の同位相の情報をサンプリングす
ることになる。このように画素分割されたデンタル画像
信号Ｓｄに基づいてＣＲＴ表示装置７３に表示される画
像は、前述したように、試料２３の明視野像となる。

次に、第２図を参照して本発明の第２実施例について説
明する。なおこの第２図において、前記第１図中の要素
と同等の要素には同番号を付し、それらについての重複
した説明は省略する。

この第２実施例においては第１ＡＯＭ８が、移動台１５
に搭載された送光光学系１８内に配されている。そして
、この第１ＡＯＭ８に入射する前の照明光１１の一部は
ハーフミラ−２で反射し、モニタ光１１Ｍとして集光レ
ンズ３に入射して集光され、光検出器５によって検出さ
れる。この光検出器５は例えばフォトダイオード等の小
型軽量のものが用いられ、移動台１５に固定されている
。

光検出器５が検出し、た光量を示す光量信号Ｓ１は、光
量制御回路８３に入力される。この光量制御回路８３は
、所定光量を示す基準信号と上記信号Ｓ１とを比較し、
それらの偏差を解消する方向にＡＯＭ８の駆動を制御す
る駆動制御信号Ｓ２を出力する。この駆動制御信号Ｓ２
はＡＯＭ駆動回路８０に入力される。該駆動回路８０は
、第１図の装置におけるものと同様に、照明光１１を第
１の変調周波数ｆ１で変調するように第１ＡＯＭ８を駆
動するが、それに加えて、入力された上記信号Ｓ２に基
づいてＡＯＭ８の駆動を制御する。すなわち、光検出器
５の検出光量が上記所定光量を上回る場合は０次光の光
量を低下させるように、反対に検出光量が上記所定光量
を下回る場合は、０次光の光量を増大させるように、Ａ
ＯＭ８の駆動が制御される。

以上のようにすることにより、光ファイバー１４の曲が
りや、ファイバーカップリング部での振動や、温度変化
等に起因する光軸ずれ等による光量変動を補正して、変
調前の照明光ＩＩの光量を一定に保つことができる。し
たがって、上記のような光量変動の影響を受けないで、
濃度ムラの無い高画質の顕微鏡像を撮像可能となる。

また本実施例では、試料２３を透過した透過光１１′の
結像位置において移動台１５にピンホール板８４が固定
されており、このピンホール板８４を通過した透過光１
１°が参照光１１Ｒと合波されて、光検出器３０によっ
て検出される。この場合、移動台１５は照明光光点Ｐの
主走査のために光量８器３０に対して相対移動するので
、光検出器３０としてはある程度広い受光面を有するも
のか用いられる。なお、この光検出器３０は、受光光学
系２１とともに移動台１５に固定されても構わない。

上記のように透過光１１″をピンホール板８４を介して
検出することにより、そのハローや、試料２３で散乱し
た光等の不要光をカットすることができる。

また本実施例においては、光検出器３ｏの出力信号Ｓが
、まずＡ／Ｄ変換器７１によりデジタル画像信号Ｓｄに
変換され、このデジタル画像信号Ｓｄが画像メモリ７２
に記憶される。そして、この画像メモリ７２から読み出
されたデジタル画像信号Ｓｄがデジタルフィルター７９
に通されて、信号Ｓｄ’とされ、ＣＲ７表示装置７３に
おいてはこのデジタル画像信号Ｓｄ’　に基づいて画像
が表示される。

上記デジタルフィルター７９は、デジタル画像信号Ｓｄ
に対して、先に説明した（５）式の第１項を除去するフ
ィルタリング処理を施す。こうすることにより本実施例
においても、このフィルタリング処理後のデジタル画像
信号Ｓｄ’　を用いて、試料２３の暗視野像をＣＲ７表
示装置７３に表示させることが可能となる。またこの場
合も、上記のフィルタリング処理を行なわず、デジタル
画像信号ＳｄをそのままＣＲ７表示装置７３に入力すれ
ば、試料２３の明視野像を表示させることができる。

なお、試料台２２を移動させることによって光点Ｐの副
走査を行なう代わりに、移動台１５を移動させることに
よって光点Ｐの副走査を行なうようにしてもよい。また
移動台１５や試料台２２の移動は、積層ピエゾ素子を利
用して行なう他、例えば音叉、ボイスコイルあるいは超
音波による固体の固有振動を利用した走査方式等を用い
て行なうことも可能である。

また、以上、透過型のモノクロ共焦点走査型顕微鏡に適
用された実施例について説明したが、本発明は、カラー
画像を撮像する共焦点走査型顕微鏡にも適用可能である
。

【図面の簡単な説明】

第１図と第２図はそれぞれ、本発明の第１実施例、第２
実施例による共焦点走査型顕微鏡を示す概略側面図であ
る。 １．２４・・・λ／４板　　２．２８．７４・・・ハー
フミラ−３，２０・・・集光レンズ　５．３０・・・光
検出器８・・・第１ＡＯＭ　　　　９．２７・・・λ／
２板１０・・・単色光レーザ　　１１・・・照明光１１
′　・・・透過光　　　　１１Ｃ・・・合波光１１Ｍ・
・・モニタ光１２．７７・・・ビームエキスパンダ１３
・・・収束レンズ １４．２５・・・偏波面保存光ファイバー１５・・・移
動台　　　　　１６・・・コリメーターレンズ１７．１
９・・・対物レンズ　１８・・・送光光学系２１・・・
受光光学系　　　２２・・・試料台２３・・・試料　　
　　　　３２・・・架台３３．４７．４９・・・積層ピ
エゾ素子３４．４８．５０・・・ピエゾ素子駆動回路３
５・・・制御回路　　　　７０・・・ローパスフィルタ
ー７１・・・Ａ／Ｄ変換器　　７２・・・画像メモリ７
３・・・ＣＲ７表示装置　７５．７８・・・ミラー７６
・・・第２ＡＯＭ　　　　７９・・・デジタルフィルタ
ー８０．８１・・・ＡＯＭ駆動回路 ８３・・・光量制御回路　　８４・・・ピンホール板第
２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 試料が載置される試料台と、 照明光を発する光源と、 この照明光を試料上において微小な光点として結像させ
   る送光光学系と、 前記試料を透過した光を集光して点像に結像させる受光
   光学系と、 前記光点を試料上において２次元的に走査させる走査手
   段と、 前記試料に入射する前の照明光の一部を参照光として分
   岐させる分岐手段と、 試料を透過した透過光と前記参照光とを合波する合波手
   段と、 前記分岐手段を経た照明光を第１の変調周波数で変調す
   る第１の変調手段と、 前記参照光を前記第１の変調周波数とは異なる第２の変
   調周波数で変調する第２の変調手段と、前記合波手段で
   合波された光を検出する光検出器と、 この光検出器の出力信号から、変調された前記照明光と
   参照光とによるビート成分を除去した信号を得るフィル
   ター手段とからなる共焦点走査型顕微鏡。