JPH04152889A - アルギニン特異的カルボキシペプチダーゼ及び臨床検査法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はアルギニン特異的カルボキシペプチダーゼ及び
これを用いた臨床検査法に関する。

従来の技術 従来、血清や血漿等の中に存在するカルボキシペプチダ
ーゼとしては、カルボキシペプチダーゼＮｔ）＜知うレ
テイタ−［Ｅｒｄｏｓ、　Ｅ、　Ｇ、　ａｎｄ　５ｌｏ
ａｎｅ。

Ｅ、　Ｍ、、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
、　　１１．５８５−５９２（１９６２）］。この酵素
はキニン、アナフィラトキシン、フィブリノペプチッド
、エンケファリンへキサペプチッド、クレアチンキナー
ゼ等の活性ペブチッドを不活性化する酵素として重要な
役割を果しテイルと考えられてきた［Ｓｋｉｄｇｅｌ、
　Ｒ，Ａ、。

Ｂｅｎｎｅｔｔ、　Ｃ，Ｄ、、　Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ、
　Ｊ、　Ｗ、、　Ｆｕｌｏｎｇ。

Ｔ、、　Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ、　Ｄ、　Ｋ、　ａｎ
ｄ　Ｅｒｄｏｓ、　Ｅ、　Ｇ、。

ＢＢＲＣ，１５４，１３２３−１３２９（１９８８）　
；　Ｅｒｄｏｓ、　Ｅ、　Ｇ。

ｉｎ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｅｒｄｏｓ、　Ｅ、
　Ｇ、　ｅｄ、）、　Ｖｏｌ、２５．５ｕｐｐｌｅ、　
ｐｐ、４２８−４８７、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｈｅｉ
ｄｅｌｂｅｒｇ　（１９７９）　；　Ｓｋｉｄｇｅｌ。

Ｒ，Ａ、ａｎｄ　　Ｅｒｄｏｓ、Ｅ、Ｇ、、Ｔｒｅｎｄ
ｓ　　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。

Ｓｃｉ、、　９．２９９−３０４　（１９８８）　］　
。そして、活性ペプチッドのカルボキシ末端のアルギニ
ン或はリジンを切除して不活性化する作用をもつ血漿中
の唯一の酵素がカルボキシペプチダーゼＮであると考え
られてきた［Ｓｋｉｄｇｅｌ、　Ｒ，Ａ、、　ａｎｄ　
Ｅｒｄｏｓ、　Ｅ、　Ｇ。

ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ、　３ｒｄ　ｅｄ。

（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ、　Ｈ，Ｕ、　ｅｄ、）、　Ｖｏ
ｌ、５．　ｐｐ、６０−７２゜Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍ
ｉｅ、　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　（１９８４）］　。最近ニ
ナッて、血液中にはアルギニンを切断する不安定なカル
ボキシペプチダーゼが存在する可能性のあることを示唆
する短い報告がなされている［Ｈｅｎｄｒｉｋｓ　。

Ｄ、、　５ｃｈａｒｐｅ、　Ｓ、　ａｎｄ　ｖａｎ　５
ａｎｄｅ、　Ｍ、　ａｎｄＬａｍｍａｅｒｔ、　Ｍ、　
Ｐ、、　Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、、３５．１７７　（１９
８９）］。

発明が解決しようとする課題 本発明は新規なアルギニン特異的カルボキシペプチダー
ゼ及びこれを用いた臨床検査法を提供することを目的と
する。

課題を解決するための手段 本発明者らは血清中の酵素活性と血漿中のそれとにつき
種々比較検討を重ねた結果、血液凝固反応に伴って、新
規なアルギニン特異的カルボキシペプチダーゼが生成さ
れることを見出だし、該酵素を単離し、その新しい臨床
検査への応用に成功し、ここに本発明を完成するに至っ
た。

即ち、本発明によれば、凝固反応に際して生成され且つ
次の性質を有することを特徴とするアルギニン特異的カ
ルボキシペプチダーゼ、及び上記アルギニン特異的カル
ボキシペプチダーゼを用いて被検体液液のカルボキシペ
プチダーゼ活性を測定することを特徴とする臨床検査法
が提供される。

本発明のアルギニン特異的カルボキシペプチダーゼは以
下の性質を有している。

（１）作用：キニン、アナフィラトキシン、フィブリノ
ペプチッド、エンケファリンへキサペプチッド、クレア
チンキナーゼ等の活性ペプチッドを不活性化する作用を
有する Ｃ）基質特異性：リジン基質とは反応せず、アルギニン
基質に特異反応性を有する （３）至適ｐＨ：約７．８である （４）温度による失活：半減期が短く、３７℃では２時
間でそのほとんどが失活する （５）阻害、活性化及び安定化：コバルトイオン添加に
よっても活性は増強されない （６）　　Ｋｍ値：０．７×１０　　Ｍである（７）分
子量：ＴＳＫ　　５Ｗ３０００（東ソー社製）を用いた
ゲルが過による分子量は６７０００である 以下、本発明アルギニン特異的カルボキシペプチダーゼ
及びその有する上記性質につき詳述する。

本発明酵素は、以下の点で従来公知のカルボキシペプチ
ダーゼＮ（以下ｒｃＰＮＪという）とは明確に区別され
る別異の酵素であることが明らかである。

まず、ＣＰＮに対する特異抗体（ａｎｔｉＣＰ　Ｎ抗体
）を次の通り作成した。即ち、血漿からエルトスらの方
法［Ｌｅｖｉｎ、　Ｙ、、　Ｓｋｏｄｇｅｌ、　Ｒ，Ａ
、　ａｎｄＥｒｄｏｓ、　Ｅ、Ｇ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、。

７９、４６１８−４６２２　（１９Ｂ２）　；　Ｐｌｕ
ｍｅｒ、　Ｔ、　Ｈ，ａｎｄＥｒｄｏｓ、　Ｅ、　Ｇ、
、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　８０．４４
２−４４９（１９８１）］に準じてＣＰＮを精製し、該
精製ＣＰＮをウサギに免疫してａｎｔＩＣＰＮ抗体を得
た。

次に、上記ａｎｔｉＣＰＮ抗体をセファロースに結合さ
せたａｎｔｉＣＰ　Ｎ−セファロースで血漿を処理する
と、血漿中のＣＰＮを完全に除去することができるが、
このようにして作成されたＣＰＮ除去血漿につき、凝固
反応を起こさせると本酵素の生成が認められる。

上記凝固反応は血漿１　ｘｉに高純度トロンビン（１Ｍ
塩化カルシウム水溶液に溶解して１００Ｕ／　ｘｉとし
たもの）１０μｌを添加して実施される。

尚、上記凝固反応に先立って、血漿は該血漿中に含まれ
ている抗凝固剤であるクエン酸を燐酸緩衝生理食塩水（
Ｐ　Ｂ　Ｓ）に対して透析して除去しておいた。

本酵素生成の確認は、上記ＣＰＮ除去血漿につき、リジ
ン基質及びアルギニン基質を用いたカルボキシペプチダ
ーゼ活性（その詳細は後記実施例において説明する）の
測定により行ない得る。

上記ＣＰＮ除去血漿試料についてのカルボキシペプチダ
ーゼ活性測定結果を、対照試料としての血漿、血清（凝
固剤無添加で血液を室温で１時間凝固させ速やかに採取
した血清）及びＣＰＮ除去血漿由来血清の同測定結果と
共に下記第１表に示す。尚、血清中に新たに生成の確認
されるカルボキシペプチダーゼは、予備実験の結果、３
７℃では１時間以上おくと速やかに失活してしまうこと
が判ったので、上記血清試料の場合、血清凝固は室温（
２０〜２５℃）で行ない、１時間以内に遠心分離して採
取し、凍結保存するか又は水槽中に保存したものを用い
た。

第　　　１　　　表 尚、リジン基質１に対する活性は、１μｍｏｌのフロリ
ルアクリロイルアラニルーし一リジン（ｆｕｒｏｙｌａ
ｃｒｙｌｏｙｌａｌａｎｙｌ−Ｌ−１ｙｓｉｎｅ　）を
、３７℃にて１分間で分解する活性を１単位（Ｕ）とし
た。

またアルギニン基質１に対する活性は、１μｍｏｌのヒ
プリルーＬ−アルギニン（ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ａｒ
ｇｉｎｉｎｅ、　ｈｉｐ−ａｒｇ　）を、３７℃にて１
分間テ分解する活性を１単位（Ｕ）とした。

上記第１表より、ＣＰＮ除去血漿からもカルボキシペプ
チダーゼ活性が生成されていることが判るが、これはア
ルギニンをカルボキシ末端に持つ基質を分解するが、リ
ジンのそれは分解しない。

これに対して血漿中にもともと存在するＣＰＮはリジン
基質もアルギニン基質も共に分解する。従って、ＣＰＮ
を除去していない血清における活性測定値は、アルギニ
ン特異的カルボキシペプチダーゼとＣＰＮとの総和とな
ることが判る。

また、本酵素はその酵素活性の半減期が短く、３７℃で
は２時間でそのほとんどが失活する特徴を有しており、
この点でも公知のＣＰＮとは明確に区別される。即ち、
上記活性測定試験において、新鮮血清を３７℃、３０℃
及び２２℃のそれぞれの温度下に放置しておき、経時的
にそれらの一部を取り出してそれぞれカルボキシペプチ
ダーゼ活性の測定を行なった所、３７℃では４５分で血
漿レベルまでその活性が低下してしまうことが判った。

また、３０℃では１８０分経過後でもまだ血漿レベルよ
りは若干高い活性が保持されており、更に２２℃では１
８０分経過後でも僅かに活性低下が認められるだけであ
った。

これは第１図に示される通りである。

更に、ＣＰＮはコバルトイオン添加により、その活性が
約２倍に増強されるが、本発明のアルギニン特異的カル
ボキシペプチダーゼのそれは全く増強されず、むしろ若
干抑制されることが確認され、この点でも本酵素はＣＰ
Ｎと明確に区別された。

加えて、上記試験においてＣＰＮ除去血漿から作成した
血漿試料を、１０ｍＭトＩＪス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０
）で５倍に希釈し、これをファルマシア社製ＦＰＬＣの
モノＱカラムに吸着させて、食塩濃度を漸増させて溶出
させるクロマトグラフィーを実施すると、０．２Ｍ食塩
濃度の分画にカルボキシペプチダーゼ活性（本発明酵素
）が溶出される。これに対してＣＰＮは同クロマトグラ
フィーの結果、０．４Ｍ食塩濃度の分画に溶出されるの
で、このことからも、本酵素はＣＰＮとは異なる物質で
あることが判る。

更に加えて、１０ｍＭｈｌＪス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０
以上）及びリン酸緩衝液（ｐ）（７，Ｏ以下）を用いて
、ｐＨを０．１ずつ変化させた反応系にて、本酵素の至
適ｐＨを求めた所、本酵素はｐＨ７，８で最も強い反応
性を示した。

また、本酵素（モノＱカラムで新鮮血液から分画したも
の）のＫｍ値を、ヒプリルーＬ−アルギニ：／　（Ｈｉ
ｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ　）を基質トシテ
用イて解析した結果、該Ｋｍ値は０．７Ｘ１０　　であ
り、同時１：　Ｖ　ｍａｘは０．１５３μｍＯ１／分／
ｘｉ。

ｋは０．２１８６分　であった。同様にして求められた
ＣＰＮ　（血清から精製したもの）のＫｍ値は１．４７
Ｘ１０　　であり、ｖ　ｍａｘは０．５５μｍｏｌ　／
分／　ｘｉで、ｋは０．３７４分　であった。

このことから本酵素はＣＰＮより強い酵素活性を有する
ことが明らかである。

以上の点より、本酵素は新規なアルギニン特異的カルボ
キシペプチダーゼであることか明らかとなった。

本発明アルギニン特異的カルボキシペプチダーゼの上記
した諸性質を、公知のカルボキシペプチダーゼと対比し
た結果を、下記第２表にまとめて示す。

第 表 尚、上記第２表中の各略号は次のものを示す。

ＣＰＢ・・・カルボキシペプチダーゼＢ（膵臓に分泌さ
れるもの） ＣＰＮ・・・カルボキシペプチダーゼＮＣＰＮ活性物質
・・・ＣＰＮが部分分解した活性フラグメント ＣＰＭ・・・カルボキシペプチダーゼＭ（膜結合型カル
ボキシペプチダーゼ） ＣＰＨ・・・カルボキシペプチダーゼ■１本発明ＣＰＲ
・・・本発明アルギニン特異的カルボキシペプチダーゼ Ｈｉｐ−ａｒｇ・・・ヒプリルアルギニン（馬尿酸結合
アルギニン） Ｈｉｐ−１ｙｓ・・・ヒプリルリジン（馬尿酸結合リジ
ン）ＦＡ−Ｌｙｓ　　・・・フリル−アクリロイル−し
−リジン（ｆｕｒｙｌ−ａｃｒｙｌｏｙｌ−Ｌ−１ｙｓ
ｉｎｅ　）Ｈｉｐ　ａｒｇ−ａｃｉｄ・−・ヒプリルー
Ｌ−フルギン酸（Ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉ
ｃ　ａｃｉｄ　）ＦＡ−ａｒｇ　　・・・フリル−アク
リロイル−Ｌ−アルギニン（ｆｕｒｙｌ−ａｃｒｙｌｏ
ｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）また基質特異性の項にお
ける＋は反応することを、−は反応しないことを示し、
コバルト効果における＋は活性増強が認められることを
、は阻害されることをそれぞれ示す。

上記基質特異性の測定においては、以下の文献を参照し
た。

ＯＲ，Ａ、　Ｓｋｉｄｇｅｌ、　ＴＩＰＳ、　９．２９
９−３０３　（１９８８）ｏ　Ｒ，Ａ、　Ｓｋｉｄｇｅ
ｌ、　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂ、　Ｃ，、２６４（
４）。

ｏ　　Ｙ、Ｌｅｖｉｎ、ｅｔ、ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、　　７９．４６１８−４６２２　（１９
Ｂ２）上記の通り、本発明のアルギニン特異的カルボキ
シペプチダーゼ（以下ｒＣＰＲＪという）は、公知のカ
ルボキシペプチダーゼとは異なって、Ｈｉｐ−１ｙｓ　
、　ＦＡ−Ｌｙｓ、　Ｈｉｐ　ａｒｇ−ａｃｉｄ、ＩＦ
Ａ−ａｒｇ等に対する作用は実質的に認められず、また
公知のカルボキシペプチダーゼ（ＣＰＮ）がコバルト添
加により活性増強が認められるのに対して、本酵素はむ
しろ若干の抑制がかかる傾向を認めた。

本発明ＣＰＲは、該酵素の性質を利用した各種の方法に
より精製することができ、例えばＣＰＮ除去血漿から作
成した血漿を、１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，
０）で５倍に希釈し、これをファルマシア社製ＦＰＬＣ
のモノＱカラムに吸着させて、食塩濃度を漸増させて溶
出させるクロマトグラフィーにより、０．２Ｍ食塩濃度
の分画を集めることにより精製できる。即ち、本酵素の
酵素活性は不安定であるため血清中の既に活性化された
本酵素の精製は困難であるが、該酵素はその前駆体が存
在する筈であると考え、該前駆体の精製を行なうことに
より本酵素の精製を行ない得る。

これは次のようにして実施できる。血液凝固反応によっ
て本酵素が精製するので、血液凝固系の蛋白分解酵素が
本酵素の前駆体を部分分解して活性型の本酵素に変換す
る可能性が高い。従って、血漿中にすでに存在する安定
型の本酵素を除くため血漿を前記モノＱカラムで分画す
るとＣＰＮは０．４ＭＮａＣ／付近に分画される。血清
を同様に分画すると０．２Ｍ付近に本酵素の活性が認め
られるが、血漿を流した時はその活性は全く認められな
い。上記各フラクションにトリプシンを加えて処理する
と本酵素の活性は出現する（後記第２図の黒塗り棒グラ
フ部分参照）。

この結果を第２図に示す。第２図はヒト血漿１ｘｉをモ
ノＱカラム（１０ｍｍＸ１００ｍｍ、ファルマシア社製
）に、１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）にてア
プライして、食塩濃度勾配により溶出させ、次いで得ら
れる各フラクション４０μノに０．１■／ＩＩ！のトリ
プシン１０μｌを加えて処理（前駆体を活性化させる処
理）し、その活性を求めた結果を示したものであり、図
の横軸はフラクション番号を、縦軸は曲線（１）で示さ
れる吸光度（ＯＤ２８ｏ）、グラフ（２）で示されるカ
ルボキシペプチダーゼ活性（ｍＵ／ｚ／）及び直線（３
）で示されるＮａＣ１濃度（Ｍ）をそれ”ぞれ示す。

読図より本酵素の活性はトリプシン処理にて、ＮａＣ１
濃度０．２Ｍ付近に現れることが明らかである。尚、ト
リプシン処理を行なわないときは上記０．２Ｍ付近の活
性は検出されず、ＮａＣ１濃度０．４Ｍ付近に若干の活
性が検出される（第２図白抜き棒グラフ参照）だけであ
る。

また上記活性は、トリプシン処理に代えてプラスミン処
理を行なう場合にも同様に出現することが本発明者らに
より確認されている。

本発明のＣＰＲは、以下の方法によっても精製すること
ができる。

まず前記血漿試料を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ
７，０）を用いて０．１２Ｍ　　ＮａＣ１でＤＥＡＥセ
ルロースカラムに通すと本酵素の前駆体画分（トリプシ
ン処理で本酵素に変換される両分）が得られる（フラク
ション番号８〜１０）。

上記において０．２Ｍ　　ＮａＣ１で溶出すると吸着し
ていたＣＰＮが溶出されてくることから、このＤＥＡＥ
カラムにて、上記本酵素の前駆体をＣＰＮと分離できる
ことが判る。

上記画分をプールし、１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ　
Ｈ７，０）で４倍に希釈し、再度ＤＥＡＥセルロースカ
ラム（０，０３Ｍ　　ＮａＣｌ含有、１０ｍＭ）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したもの）にアプライ
して、食塩濃度勾配による溶出を行なうと、フラクショ
ン１００付近に本酵素の前駆体画分（トリプシン処理で
本酵素に変換される画分）が得られる。

上記２回目のＤＥＡＥカラム精製フラクションを、０．
５Ｍ　　ＮａＣ１含有１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ
７，０）で平衡化したＴＳＫ　　５Ｗ３０００　（東ソ
ー社製）カラムにアプライして、ゲルが過を行なうと、
フラクション番号４０〜５０の間に本酵素の前駆体画分
（トリプシン処理で本酵素に変換される画分）が得られ
る。その溶出位置は、分子量６７０００付近と算出され
る。

尚、血清から本酵素を直接精製してもＤＥＡＥやモノＱ
カラムの溶出位置はほぼ同じであるので、トリプシン等
の蛋白分解酵素で活性化しても本酵素の分子には大きな
変化はもたらされないと考えられる。また血清を直接Ｔ
ＳＫ　　５Ｗ３０００のゲル濾過にかけると、本酵素は
疎水性が高まっているために遅れた分画に溶出されてく
るが、それをポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける
と分子量は約６６０００付近のバンドを示す。このこと
から、前駆体から本酵素への変換の過程では本酵素の分
子量には大きな変化は認められないことが明らかとなっ
た。

上記各精製過程での精製度を求めた結果を下記第３表に
まとめて示す。

第 表 本発明のＣＰＲは、血液凝固等の生体内事変に伴って急
きょ生成され、しかも３７℃では速やか゛に消退してし
まうものであるから、生体内では炎症反応等が過度に起
こるのを防ぐ役割を果していると推察された。即ち、こ
のＣＰＲを生成する能力に欠陥があると過剰な炎症反応
等を起こして、種々の疾病の原因となることもあると考
えられる。

従って、患者の退役、特に血漿中のＣＰＲを測定するこ
とは、新しい臨床検査法として重要な役割を果たす筈で
ある。即ち、このＣＰＲを生成する能力を、被検患者の
退役（血液、血漿等を含む）について測定することは、
被検者の状況を把握する臨床検査に用いることができる
。

本発明はかかる臨床検査法をも提供するものであり、該
検査法は本発明のＣＰＲを用いて被検血液のカルボキシ
ペプチダーゼ活性を測定することを必須の要件としてお
り、その詳細は後記実施例において説明される通りであ
る。

実７施　例 以下、本発明実施例を挙げる。

尚、カルボキシペプチダーゼ活性の測定は以下の方法に
より行なった。

〈カルボキシペプチダーゼ活性の測定〉エッペンドルフ
チューブに、被検液（サンプル）又は標準液１０μｌと
基質［３０ｍＭのＨｉｐ−ａｒｇ（シグマ社製）又はＨ
ｉｐ−１ｙｓ　　（シグマ社製）を５０ｍＭ　　ＨＥＰ
ＥＳ　（同口社製）（ｐＨ８，２）に溶解して使用］４
０μｌを入れ、３７℃で４５分間反応させる。その後、
ＩＭ　　ＨＣ７５０μｌを加えて反応を停止させ、酢酸
エチル３００μｌを加えて軽く３０秒間攪拌する。次い
で５０００ｇにて１分間遠心分離（ＭｉＣｒＯＣｅｎｔ
ｒｉｆｕｇｅ　Ｍｏｄｅ１５９Ａ、　Ａ１１ｉｅｄ　Ｆ
ｉｓｈａｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製を使用）を行な
い、上層１００μｌを採取し、ロータリー・エバポレー
ター（Ｓｐｅｅｄ　ｖａｃｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ。

５ａｖａｎｔ社製）にて溶媒を１０分間を要して蒸発さ
せ、得られる残渣２００μｌをミリＱ水（Ｍｉｌｌ　Ｑ
Ｗａｔｅｒ）に溶解させた。

ＨＰＬＣ分析は１０μｌのループを用いてＨＰ　Ｌ　Ｃ
［Ｌ−６００ポンプ（日立）　、Ｌ−４２００ＵＶ−Ｖ
ＩＳ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ　（日立）　、５６１　Ｒｅｃ
ｏｒｄｅｒ　（日立）、ＡＳ−８０００オートサンプラ
ー（東ソー）、カラムＷＰＭ Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ（ＣＩＢ）、　ＲＰ−７１０４−０
０ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ４．６　Ｘ２５０　Ｂ、　Ｊ、Ｔ
、Ｂａｋｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔ社製
］に、溶媒として７．５％のアセトニトリルを含む１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ３，５）を用い、サン
プルは０．４５μｍのフィルターを通した。溶出するヒ
プリル酸のピークの高さより、予め作成した標準曲線を
利用して、酵素反応によって遊離するヒプリル酸の量を
求めた。

上記標準曲線はヒプリル酸（Ｈｉｐｐｕｒｉｃ　ａｃｉ
ｄ２２．５μモル／ｌ）の５０．１００．１５０及び２
００μｌをそれぞれ取り、上記と同反応系にサンプルの
代わりに加え、１０分間ロータリー・エバポレーターに
て蒸発させ、残渣を１．ＯｘｌのミリＱ水に溶解して、
上記と同様にＨＰＬＣ分析を行なって、ヒプリル酸の濃
度とピークの高さにより作成した。

酵素活性は３７℃で１分間に１μモルのヒプリル酸を遊
離させる活性を１単位（Ｕ）として、次式により求めた
。

４５　　　Ｘ　　　Ｏ，０１ 実施例　１ 本発明ＣＰＨの製造及び精製 まずヒト血液から採取した血漿試料を１０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）を用いて０．１２Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１でＤＥＡＥセルロースカラムに通して、本酵素の前
駆体画分（トリプシン処理で本酵素に変換される画分）
を得た（フラクション番号８〜１０）。

上記画分をプールし、１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ
７，０）で４倍に希釈し、再度ＤＥＡＥセルロースカラ
ム（０，０３Ｍ　　ＮａＣ／含有、１０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したもの）にアプライし
て、食塩濃度勾配による溶出を行なって、フラクション
１００付近に本酵素の前駆体画分（トリプシン処理で本
酵素に変換される画分）を得た。

上記２回目のＤＥＡＥカラム精製フラクションを、０．
５Ｍ　　ＮａＣ／含有１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ　
Ｈ７，０）で平衡化したＴＳＫ　　５Ｗ３０００　（東
ソー社製）カラムにアプライして、ゲルが過を行なって
、フラクション番号４０〜５０の間に本酵素の前駆体画
分（トリプシン処理で本酵素に変換される両分）を得た
。その溶出位置は、分子量６７０００付近と算出された
。

上記で得られた本酵素の前駆体画分をトリプシン処理（
フラクション４０μｌに対して０．１■／　ｘｉのトリ
プシン１０μｌを使用）して本酵素を得た。

かくして得られた本発明ＣＰＲの収率等及び該酵素の性
質は前述した通りであった。

実施例　２ 本発明ＣＰＲを用いた臨床検査法 最も簡便な検査法は、被検者から２本の試験管で採血を
行ない、一方はヘパリン添加しておいたもので血漿採血
用とし、他方は無添加で血液凝固を起こさせて血清採取
用とする。血清採取は、試験管を室温で４５分から６０
分の間（必ず６０分以内とする）放置して血液凝固を起
こさせ、直ちに冷却遠心機（約４℃）で遠心分離して血
清を採取する。採取した血清は２時間以内であれば水槽
中に待機してよい。速かに測定に供し得ない時には凍結
保存しておく。

このようにして用意した血漿と血清とをペアーにして、
ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ　（ｈｉｐ−
ａｒｇ）を基質として用イテ、Ｈｅｎｄｒｉｋｓら［Ｈ
ｅｎｄｒｉｋｓ、　Ｄ、、　ｖａｎＳａｎｄｅ、　Ｍ、
　ａｎｄ　５ｃｈａｒｐｅ　、Ｓ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃ
ｈｉｍ、　Ａｃｔａ。

す７．１０３−１０８　（１９８６）コの方法でアルギ
ニル切除活性を測定する。ペプチダーゼのカルボキシ末
端切除活性を測定できるものであれば、どの方法でもヨ
イ。例えば、Ｓｋｉｄｇｅｌ、　Ｒ，Ａ、　ａｎｄ　Ｅ
ｒｄｏｓ、　Ｅ。

Ｇ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ、　ｖｏｌ、５゜ｐｐ３４−４３．　Ｖ
ｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ、　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　（１
９８４）　］らが記載している方法等を応用することが
できる。

血漿中の活性は、ＣＰＮによるものであるが、血清中の
活性は、ＣＰＮと新たに生成された本発明ＣＰＲとの和
である。従って、血清中の活性が血漿中の活性に比べて
どれだけ高いかによりＣＰＲの生成量を知ることができ
る。

正常人の３０人について測定したところ、例外なく血清
の値は血漿の２倍乃至２．５倍の間にあった。従って、
血液凝固に際して、血漿中のＣＰＮ活性と等量以上の活
性がＣＰＲの生成によってもたらされる。

これに対して、炎症性疾患の一つである慢性関節リュウ
マチの患者を例にとり、２等患者の血漿と血清との活性
をそれぞれ測定した。その結果、血漿の値そのものは正
常人のそれと殆んど差は認められず、ＣＰＮ活性には異
常がないと考えられた。ところが、血清中の活性上昇は
殆んど認められない患者が試験した全すュウマチ患者中
の約半数を占め、上昇を認めた患者でも２倍を越える者
はいなかった。

上記試験結果を第３図に示す。

上図は横軸に患者百分率を、横軸にヒプリルーし一アル
ギニン基質に対するカルボキシペプチダーゼ活性の血漿
レベルに対する血清レベルの比率を取り、正常患者（黒
塗り棒グラフ）及びリュウマチ患者（斜線付き棒グラフ
）のそれぞれを棒グラフに表わしたものである。

この結果より、血漿と血清とのペアーについて、本発明
ＣＰＲの活性を測定することが、リュウマチ患者等の診
断に意義の高いことが明らかであり、本発明によりかか
る新しい検査法を提供できることが判る。

尚、本発明の上記検査法では、血漿と血清とを分けて別
々に採血する代りに、血漿として採血しておき、測定時
に、血漿の一部を凝固させて血清を分離して用いる方法
も有用である。血漿の状態であれば、たとえ、室温に３
日間放置しておいてもＣＰＲを生成する能力の低下は認
めなかったので、試料の品質管理上取扱いが容易である
。勿論、血漿を凍結保存しておけば、長期間試料を保管
することができる。

上記したごとく炎症疾患の例として慢性関節リュウマチ
患者について調べたところ、ＣＰＲの生成能に著しい低
下が認められた。この様な患者には当然ＣＰＲ生成能を
回復させることが新しい治療目標となり得る。そこでＣ
ＰＲの力価の高い血漿を選別して投与することが治療法
として有効である。更に、患者に欠乏しているＣＰＲ生
成素材成分を投与する方法も治療法として成立すると考
えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明酵素の温度安定性を調べた結果を示すグ
ラフである。 第２図はモノＱカラム（ファルマシア社製）を用いた食
塩濃度勾配法による本発明酵素の溶出パターンを示すグ
ラフである。 第３図は本発明酵素を用いた臨床検査法の実施によるリ
ュウマチ患者と正常患者との区別を示すグラフである。 （以　上） 第 図 第 図 七、石数 （％）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］凝固反応に際して生成され且つ次の性質を有する
   ことを特徴とするアルギニン特異的カルボキシペプチダ
   ーゼ。 （１）作用：キニン、アナフィラトキシン、フィブリノ
   ペプチッド、エンケファリンヘキサペプチッド、クレア
   チンキナーゼ等の活性ペプチッドを不活性化する作用を
   有する （２）基質特異性：リジン基質とは反応せず、アルギニ
   ン基質に特異反応性を有する （３）至適ｐＨ：約７．８である （４）温度による失活：半減期が短く、３７℃では２時
   間でそのほとんどが失活する （５）阻害、活性化及び安定化：コバルトイオン添加に
   よっても活性は増強されない （６）Ｋｍ値：０．７×１０＾−＾３Ｍである（７）分
   子量：ＴＳＫＳＷ３０００（東ソー社製）を用いたゲル
   ろ過による分子量は６７０００である ［２］請求項［１］に記載のアルギニン特異的カルボキ
   シペプチダーゼを用いて被検体液中のカルボキシペプチ
   ダーゼ活性を測定することを特徴とする臨床検査法。