JPH0413998B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
［発明の属する技術分野］
本発明は、脂肪酸を生産する時に要するエネル
ギー費用及び分離費用を節減するために逆ミセル
系（Reversed Micellar System）において油脂
を酵素的に加水分解することにより効率的に脂肪
酸を生産する方法に関するものである。 ［従来の技術とその問題点］ 脂肪酸は界面活性剤、ゴム、石鹸、ペイント、
化粧品等の原料に使用されるもので、現在は主に
牛脂、ヤシ油等を化学的に加水分解した後、脂肪
酸を抽出することにより生産している。 しかしながら、化学的方法による油脂の加水分
解は、48.3気圧以上の高圧と250℃の高温で行わ
れるために多くのエレルギーを要するだけでなく
高温によつて副反応が起こりケトン類、重合体等
の副生成物が生成し、生成物である脂肪酸が黒く
着色するという欠点を有する。従つて、化学的方
法により生産した脂肪酸を使用するためには生成
物を脱色、分離する等の工程を必要とし、それに
要する費用が問題となり、生成した副生成物は廃
水処理の側面からも問題を内在している
（Fattyacids and their industrial application，
E.S.Pattison Ed.，Marcel Dekker Inc.，N.Y.，
p.28，1968）。 上述のように油脂を化学的方法により加水分解
して脂肪酸を生産する方法の欠点を解決するため
の一つの方法としては、酵素により油脂を加水分
解する方法がある（Biotechnol.Bioeng.，17，
1401，1975）。リパーゼは、油脂と水の混合物に
添加すると、油脂を脂肪酸とグリセリンに分解す
る酵素であるが、界面で活性化する特徴があり、
リパーゼによる油脂の加水分解は油脂をエマルジ
ヨンにして反応させてきた。 しかしながら、リパーゼは基質である油脂だけ
でなく反応生成物である脂肪酸によつても阻害さ
れることが知られている。それゆえ、エマルジヨ
ン製造時にナトリウムイオンとカルシウムイオン
を阻害防止剤として添加しなければならない。 一方、エマルジヨン系でのリパーゼの反応速度
を油滴の大きさに従つて変化するが、５分間均質
化させ、30分間音波粉砕（sonification）した後
にも油滴の大きさが1000〜ｎｍであるから反応速
度が小さく回分式加水分解が終つた後、酵素と生
成物を分離し難いという欠点を有する（Agr.
Bion.Chem.，37，999，1973；Kor.J.Chem.
Eng.，１，153，1984；Biochem.Biophys.Acta，
164，47，1968）。 従つて、反応速度が大きく、リパーゼの阻害防
止剤を添加する必要がなく、反応が終つた後、酵
素と脂肪酸を分離し易い酵素反応系の開発が切実
に望まれている。 そこで、本発明者らは、上述した化学的方法の
欠点とエマルジヨン系での酵素反応の欠点を解消
することを目的として鋭意研究を重ねた結果、上
述の欠点を解消した優れた脂肪酸の製造方法を開
発することに成功して本発明を完成するに至つ
た。 ［発明の構成］ 本発明の脂肪酸の製造方法は、有機溶媒、界面
活性剤及び緩衝溶液又は水からなる逆ミセル系に
おいて、油脂をリパーゼで処理することを特徴と
するものである。 本発明の製造方法を簡単に説明すると次のとお
りである。有機溶媒に適当な界面活性剤を溶解
し、リパーゼを含んだ緩衝溶液を添加して撹拌す
ると逆ミセル溶液が形成される。この時、有機溶
媒は連続状になり、水は核を形成して所謂ウオー
タープール（Water poor）が形成されるが、こ
のウオータープールは界面活性剤で囲まれるよう
になる。添加したリパーゼは水によく溶解するの
でウオータープール内に存在する。これに油脂を
溶解すると油脂がウオータープールの方に又はリ
パーゼが有機溶媒の方に拡散しながら反応が起こ
り脂肪酸を製造する。 逆ミセル系での酵素反応は、界面活性剤の存在
下で有機溶媒に多量の水が溶解されることが明ら
かにされた（J.Pharm.Sci.，51，455，1962）後、
この水に酵素を溶解した時、酵素が反応を促進し
得ることが知られる（Biochem.Biophys.Res.
Commun.，47，1486，1972）ことによつて始ま
つた。 一方、水に不溶性である物質の転換反応を逆ミ
セル系で起うと、反応混合物全体の量を削減でき
るので、これらの物質を水溶液状で反応させるこ
とにより生産性が高まることが予測され、逆ミセ
ル系で酵素を用いてステロイドを転換する研究が
なされたことがある（Febs.Lett.，159，225，
1983）。 油脂の場合には基質だけでなく反応生成物であ
る脂肪酸も有機溶媒によく溶解するので逆ミセル
系でこれらの物質はリパーゼとは互いに異なる状
態で存在する。従つて、逆ミセル系でのリパーゼ
による油脂の加水分解は基質と生成物によつて阻
害されないので、本発明は、阻害防止剤を添加す
る必要がなく、かつ、反応後、脂肪酸とリパーゼ
を分離し易いという長所を有する。 以下、本発明を更に詳細に説明する。 本発明の製造方法において、原料としては、脂
肪酸の製造原料として広く用いられているオリー
ブ油、ヤシ油、大豆油、トウモロコシ油、、豚脂、
牛脂、米糠油及び魚油等を用いる。 有機溶媒としては、イソオクタン、オクタン、
シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ベンゼン、ジプ
ロピルベンゼン、及びｎ−ヘプタン等を単独で又
は二種以上の混合物として用いる。 界面活性剤としては、スルホコハク酸ジオクチ
ルナトリウム（dioctyl sodium sulfosuccinfte；
bis（２−ethylhexyl）sodium sulfosuccinate）
（以下「AOT」という）、ポリオキシエチレンア
ルコール、プロピオン酸ジオクチルアンモニウ
ム、オクトキシノール（Octcxynol）、セチルト
リメチルアンモニウムブロミド及びポリエチレン
グリコール等を単独で又は二種以上の混合物とし
て用いる。 リパーゼは、種々のものが市販されているので
それを用いてもよい。 逆ミセル系でリバーゼの反応速度を最適にする
ために反応速度に影響を及ぼす種々の因子の影響
について検討した。 界面活性剤としてAOT、有機溶媒としてイソ
オクタン、オクタン、シクロヘキサン、ｎ−ヘキ
サン、ジプロピルベンゼン、ｎ−ヘプタン等を用
いて、逆ミセル溶液を調製した後、オリーブ油を
原料に用いてリパーゼの反応速度を測定したとこ
ろ、あらゆる有機溶媒で脂肪酸が得られ、イソオ
クタンを用いた場合に初期脂肪酸生産速度が
19.7μmole／min／mlで他の有機溶媒を用いた場
合より脂肪酸生産速度が大きいことが判明した。 有機溶媒としてイソオクタン、界面活性剤とし
てAOT、ポリオキシエチレンアルコール、プロ
ピオン酸ジオクチルアンモニウム、オクトキシノ
ール、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、
ポリエチレングリコールを用いて、逆ミセル溶液
を調製した後、オリープ油を原料に用いてリパー
ゼの反応速度を測定したところ、あらゆる界面活
性剤からなる逆ミセル溶液で脂肪酸が得られ、
AOTを用いた場合に初期脂肪酸生成速度が
19.5μmole／min／mlで他の界面活性剤を用いた
場合より脂肪酸生成速度が大きいことが判明し
た。従つて、有機溶媒に対する溶解度が高く水溶
解性の界面活性剤は如何なるものでも本発明の製
造方法に用いることができると推定された。 逆ミセル系におけるリパーゼによる脂肪酸の生
成はPHと温度によつて左右される。逆ミセル溶液
のPHが４〜10の範囲内であれば脂肪酸が生成する
が、好ましいPH範囲は5.5〜10.0である。反応温
度が０〜60℃の範囲内であれば脂肪酸が生成する
が、好ましい温度範囲は15〜50℃である。 水と界面活性剤のモル比をＲ値と定義すると、
Ｒ値は、逆ミセル系での最適の反応速度をもたら
すイソオクタンを用い、AOT濃度を100mMに固
定した時、Ｒ値が２〜50の範囲でリパーゼによつ
て油脂が加水分解して脂肪酸が生成し、Ｒ値が10
の近辺である時に最も大きな初期脂肪酸生成速度
を与えた。 Ｒ値を４、７、10、13、16、25に変化させた
後、リパーゼを経済的な面を考慮して９ml添加し
て、反応を行つたところ、反応28時間後、脂肪酸
の収率は、Ｒ値が４、７、10、13、16、25の時、
それぞれ68.1、79.3、82.9、85.4、81.6、75.2％で
あつた。ここで脂肪酸の収率は初期脂肪酸生成速
度が最も大きいＲ値で最大とならずＲ値が13の時
に最大値を示した。 次いで、油脂加水分解反応の別の基質である水
の濃度が脂肪酸の収率に及ぼす影響について検討
した。AOTは有機溶媒に良く溶解するが経済的
な面を考慮して濃度を25、50、100、150、
250mMに変化させ、Ｒ値を10に維持するために
水をその濃度が0.25、0.5、1.0、1.5、2.5Mになる
ように添加した後、リパーゼを添加して反応させ
た。この時、初期脂肪酸生成速度は水の濃度に従
つて変化がほとんどなかつたが、反応35時間後に
脂肪酸を収率は水の濃度が0.25、0.5、1.0、1.5、
2.5Mに増加するに従つて48.3、67.8、82.4、88.6、
92.3％に増加した。従つて、水の濃度が油脂加水
分解反応の平衡に影響を及ぼすことが判明した。 一方、逆ミセル系で油脂（オリーブ油）の濃度
を2.5〜20％に変化させて反応させたところ、反
応28時間後の脂肪酸の収率はオリーブ油の濃度が
2.5、5.0、10.0、20.0％（Ｖ／Ｖ）に増加するに
従つて99.4、98.1、81.2、66.0％に低下した。こ
の時に生成した脂肪酸の含量はオリーブ油の濃度
2.5、5.0、10.0、20.0％（Ｖ／Ｖ）でそれぞれ
77.2、152.8、259.0、411.mMであつた。即ちオリ
ーブ油の濃度が増加するに従つて脂肪酸の収率は
低下するが、脂肪酸の生産性は高まることが判明
した。 油脂の種類を変えて、ヤシ油、牛脂、大豆油、
豚脂、米糠油及び魚油等を単独で、又はこれらを
種々の比率で混合して用いた場合にも、油脂の濃
度を反応混合物全体の５％（Ｖ／Ｖ）とした時、
96％以上の収率で脂肪酸を得ることができた。但
し、牛脂、豚脂、魚油は室温では良く溶解しない
ので35℃で反応させた。 この外に、酵素の使用量も生産性に影響を及ぼ
す。逆ミセル系に添加する酵素の濃度を低くする
と収率も低くなり反応が完結する時間が長くなる
が、酵素の濃度を高くすれば反応が完結する時間
も短くなる。しかしながら、経済的な面を考慮す
ると、酵素量を無限に増加させることはできな
い。酵素の濃度を0.25〜2.0（μｇ／ml）に変化さ
せて反応させた時の脂肪酸の収率と反応完結時間
を考慮すると約1.2（μｇ／ml）の酵素濃度で回分
式加水分解を行うことが経済的である。 一方、本発明に用いる酵素としては、植物体、
動物の膵臓及び微生物等由来の如何なる酵素をも
用いることができる。 本発明により得られる脂肪酸を工業製品の原料
として使用するためには反応が完結した後、それ
を反応系から分離しなければならない。反応が完
結した反応系には有機溶媒、水、リパーゼ、グリ
セリン、界面活性剤、脂肪酸が含まれているがリ
パーゼとグリセリンは水に良く溶解する制椎を利
用して反応系に水及び／又はアセトニトリルを添
加して撹拌した後、5000×ｇで20分間遠心分離す
ると界面活性剤（AOTなど）が沈澱し酵素とグ
リセリンは水及び／又はアセトニトリルからなる
下層部に存在し、脂肪酸と有機溶媒は上澄液とし
て残る。この上澄液を丸底フラスコに入れ回転蒸
発器で有機溶媒を留去すれば純粋な脂肪酸だけを
得ることができる。この時回収した脂肪酸の収率
は重量比で計算すると理論値の96〜97％である。 ［発明の効果］ 本発明によれば、エネルギー費用、分離費用を
節減でき、複雑な装置類を必要とせず、かつ、廃
水処理の問題を解消することもできる。 ［発明の実施例］ 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す
るが、これらの実施例は、本発明の範囲を何ら制
限するものではない。 以下の実施例において、脂肪酸含量の測定は公
知方法（Cupric Acetate−Pyridine法；J.Am.
Oil.Chem.Soc.，53，470，1976）に従つて行い、
オレイン酸（Oleic Acid）を内部標準に用いた。
油脂が脂肪酸に転換した転換率、即ち脂肪酸生成
収率は油脂の石鹸価に対する生成した脂肪酸の比
率で表示し、リパーゼ活性１単位は反応条件下で
１分間1μmoleの脂肪酸を生産する酵素の量で定
義した。 実施例 １ オクタン、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ジ
イソプロピルエーテル、ｎ−ヘプタン、ジプロピ
ルベンゼン又はイソオクタンのそれぞれの有機溶
媒450mlにAOTをその濃度が50mMになるように
溶解し、オリーブ油を50mlずつ添加した。反応混
合物の温度を30℃に調節した後、リパーゼを含む
リン酸緩衝溶液９mlを添加後、すぐに撹拌して逆
ミセル溶液を得た。10分間反応させた後、生成し
た脂肪酸の含量を定量し、生成した脂肪酸量
（μmole）／min／mlで表示した脂肪酸生成速度
は表１のとおりである。 【表】 実施例 ２ イソオクタン450mlにポリエチレングリコール、
セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ポリオ
キシエチレンアルコール（米国Atlas Powder
Co.製Brij35使用）プロピロン酸ジオクチルアン
モニウム、オクトキシノール（米国Ronm＆
HaasCo.製TritonX−100使用）、AOTをそれぞ
れその濃度が50mMになるように溶解し、オリー
ブ油を50mlずつ添加した。反応混合物の温度を30
℃に調節した後、リパーゼを含むリン酸緩衝溶液
９mlを添加後、すぐに撹拌して逆ミセル溶液を得
た。10分間反応させた後、生成した脂肪酸の含量
を定量し、生成した脂肪酸量（μmole）／min／
mlで表示した脂肪酸生成速度は表２のとおりであ
る。 【表】 実施例 ３ イソオクタン450mlにAOTをその濃度が50mM
になるように溶解し、オリーブ油を50ml添加し
た。反応混合物の温度を−10、０、15、25、30、
35、40、50、60℃に変化させて、リパーゼを含む
リン酸緩衝溶液９mlを添加後、すぐに撹拌して逆
ミセル溶液を得た。各温度で10分間反応させた
後、生成した脂肪酸の含量を定量し、生成した脂
肪酸量（μmole）／min／mlで表示した脂肪酸生
成速度は表３のとおりである。 【表】 実施例 ４ イソオクタン450mlにAOTをその濃度が50mM
になるように溶解し、オリーブ油を50ml添加した
後、反応混合物の温度を30℃に調節した。リパー
ゼを含むリン酸緩衝溶液のPHを4.0、5.5、6.5、
7.0、7.1、8.0、8.5、10.0に変化させて調製した
後、反応混合物に９mlずつを添加後、すぐに撹拌
して逆ミセル溶液を得た。10分間反応させた後、
生成した脂肪酸の含量を定量し、生成した脂肪酸
量（μmole）／min／mlで表示した脂肪酸生成速
度は表４のとおりである。 【表】 【表】 実施例 ５ イソオクタン882mlにAOTをその濃度が
100mMになるように溶解し、オリーブ油を100ml
添加した後、水の濃度が反応混合物全体中1.0M
になるように添加した後、すぐに撹拌して逆ミセ
ル溶液を得た。実際工程が経済的に運行できる酵
素濃度を定めるためにリパーゼを0.25、0.5、0.8、
1.2、1.5、2.0μｇ／mlに変化させて添加した後、
油脂の回分式加水分解を行つた。反応35時間後に
得た脂肪酸の収率は表５のとおりである。 【表】 表５から、酵素濃度が増加するに従つて脂肪酸
収率が増加するが、酵素濃度1.2μｇ／ml以上では
脂肪酸収率が大きく増加しないので、この濃度が
油脂の加水分解に経済的な濃度であることがわか
る。 実施例 ６ イソオクタン900mlにAOTをその濃度が
100mMになるように溶解し、オリーブ油を100ml
添加した後、温度を30℃に調節した。６個の反応
槽にリパーゼを含むリン酸緩衝溶液7.2mlを添加
後、各反応槽にリン酸緩衝溶液を更に添加して逆
ミセル溶液のＲ値を４、７、10、13、16、25に変
化させて油脂の回分式加水分解を行つた。反応35
時間後に得た脂肪酸の収率は表６のとおりであ
る。反応35時間後に得た脂肪酸の収率はＲ値が13
の時に最高の85.4％を示した。 【表】 次いで、油脂加水分解反応の別の基質である水
の濃度が脂肪酸の収率に及ぼす影響について検討
した。上述の反応条件中、AOTの濃度を25、50、
100、150、250mMに変化させ、Ｒ値を10に維持
するために水をその濃度が0.25、0.5、1.0、1.5、
2.5Mになるように添加して得た逆ミセル溶液で
オリーブ油（10％、Ｖ／Ｖ）の加水分解を行つ
た。反応35時間後に得た脂肪酸の収率は表７のよ
うに水の濃度が増加するに従つて増加した。 【表】 実施例 ７ イソオクタンにAOTを44.56ｇ溶解しオリーブ
油を25.50、100、200ml添加した後、イソオクタ
ンを更に添加して全部で982mlになるようにした。
温度を30℃に調節しリパーゼを含むリン酸緩衝溶
液18mlを添加後、すぐに撹拌して逆ミセル溶液を
得た。反応28時間後の脂肪酸の収率はオリーブ油
の濃度が2.5、5.0、10.0、20.0％（Ｖ／Ｖ）に増
加するに従つて99.4、98.1、81.2、66.0％に低下
した。 この時に生成した脂肪酸の含量はオリーブ油の
濃度2.5、5.0、10.0、20.0％（Ｖ／Ｖ）でそれぞ
れ77.2、152.8、259.0、411.0mMであつた。 実施例 ８ イソオクタンにAOTをその濃度か200mMにな
るように溶解して調製した864ml溶液にヤシ油、
牛脂、大豆油、豚脂、米糠油及び魚油のそれぞれ
の油脂を100mlずつ添加し温度を35℃に固定した。
この温度で各反応槽にリバーゼを含むリン酸緩衝
溶液36mlを添加後、すぐに撹拌して逆ミセル溶液
を得た。反応35時間後に得た脂肪酸の収率は表８
のとおりである。 【表】
ギー費用及び分離費用を節減するために逆ミセル
系（Reversed Micellar System）において油脂
を酵素的に加水分解することにより効率的に脂肪
酸を生産する方法に関するものである。 ［従来の技術とその問題点］ 脂肪酸は界面活性剤、ゴム、石鹸、ペイント、
化粧品等の原料に使用されるもので、現在は主に
牛脂、ヤシ油等を化学的に加水分解した後、脂肪
酸を抽出することにより生産している。 しかしながら、化学的方法による油脂の加水分
解は、48.3気圧以上の高圧と250℃の高温で行わ
れるために多くのエレルギーを要するだけでなく
高温によつて副反応が起こりケトン類、重合体等
の副生成物が生成し、生成物である脂肪酸が黒く
着色するという欠点を有する。従つて、化学的方
法により生産した脂肪酸を使用するためには生成
物を脱色、分離する等の工程を必要とし、それに
要する費用が問題となり、生成した副生成物は廃
水処理の側面からも問題を内在している
（Fattyacids and their industrial application，
E.S.Pattison Ed.，Marcel Dekker Inc.，N.Y.，
p.28，1968）。 上述のように油脂を化学的方法により加水分解
して脂肪酸を生産する方法の欠点を解決するため
の一つの方法としては、酵素により油脂を加水分
解する方法がある（Biotechnol.Bioeng.，17，
1401，1975）。リパーゼは、油脂と水の混合物に
添加すると、油脂を脂肪酸とグリセリンに分解す
る酵素であるが、界面で活性化する特徴があり、
リパーゼによる油脂の加水分解は油脂をエマルジ
ヨンにして反応させてきた。 しかしながら、リパーゼは基質である油脂だけ
でなく反応生成物である脂肪酸によつても阻害さ
れることが知られている。それゆえ、エマルジヨ
ン製造時にナトリウムイオンとカルシウムイオン
を阻害防止剤として添加しなければならない。 一方、エマルジヨン系でのリパーゼの反応速度
を油滴の大きさに従つて変化するが、５分間均質
化させ、30分間音波粉砕（sonification）した後
にも油滴の大きさが1000〜ｎｍであるから反応速
度が小さく回分式加水分解が終つた後、酵素と生
成物を分離し難いという欠点を有する（Agr.
Bion.Chem.，37，999，1973；Kor.J.Chem.
Eng.，１，153，1984；Biochem.Biophys.Acta，
164，47，1968）。 従つて、反応速度が大きく、リパーゼの阻害防
止剤を添加する必要がなく、反応が終つた後、酵
素と脂肪酸を分離し易い酵素反応系の開発が切実
に望まれている。 そこで、本発明者らは、上述した化学的方法の
欠点とエマルジヨン系での酵素反応の欠点を解消
することを目的として鋭意研究を重ねた結果、上
述の欠点を解消した優れた脂肪酸の製造方法を開
発することに成功して本発明を完成するに至つ
た。 ［発明の構成］ 本発明の脂肪酸の製造方法は、有機溶媒、界面
活性剤及び緩衝溶液又は水からなる逆ミセル系に
おいて、油脂をリパーゼで処理することを特徴と
するものである。 本発明の製造方法を簡単に説明すると次のとお
りである。有機溶媒に適当な界面活性剤を溶解
し、リパーゼを含んだ緩衝溶液を添加して撹拌す
ると逆ミセル溶液が形成される。この時、有機溶
媒は連続状になり、水は核を形成して所謂ウオー
タープール（Water poor）が形成されるが、こ
のウオータープールは界面活性剤で囲まれるよう
になる。添加したリパーゼは水によく溶解するの
でウオータープール内に存在する。これに油脂を
溶解すると油脂がウオータープールの方に又はリ
パーゼが有機溶媒の方に拡散しながら反応が起こ
り脂肪酸を製造する。 逆ミセル系での酵素反応は、界面活性剤の存在
下で有機溶媒に多量の水が溶解されることが明ら
かにされた（J.Pharm.Sci.，51，455，1962）後、
この水に酵素を溶解した時、酵素が反応を促進し
得ることが知られる（Biochem.Biophys.Res.
Commun.，47，1486，1972）ことによつて始ま
つた。 一方、水に不溶性である物質の転換反応を逆ミ
セル系で起うと、反応混合物全体の量を削減でき
るので、これらの物質を水溶液状で反応させるこ
とにより生産性が高まることが予測され、逆ミセ
ル系で酵素を用いてステロイドを転換する研究が
なされたことがある（Febs.Lett.，159，225，
1983）。 油脂の場合には基質だけでなく反応生成物であ
る脂肪酸も有機溶媒によく溶解するので逆ミセル
系でこれらの物質はリパーゼとは互いに異なる状
態で存在する。従つて、逆ミセル系でのリパーゼ
による油脂の加水分解は基質と生成物によつて阻
害されないので、本発明は、阻害防止剤を添加す
る必要がなく、かつ、反応後、脂肪酸とリパーゼ
を分離し易いという長所を有する。 以下、本発明を更に詳細に説明する。 本発明の製造方法において、原料としては、脂
肪酸の製造原料として広く用いられているオリー
ブ油、ヤシ油、大豆油、トウモロコシ油、、豚脂、
牛脂、米糠油及び魚油等を用いる。 有機溶媒としては、イソオクタン、オクタン、
シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ベンゼン、ジプ
ロピルベンゼン、及びｎ−ヘプタン等を単独で又
は二種以上の混合物として用いる。 界面活性剤としては、スルホコハク酸ジオクチ
ルナトリウム（dioctyl sodium sulfosuccinfte；
bis（２−ethylhexyl）sodium sulfosuccinate）
（以下「AOT」という）、ポリオキシエチレンア
ルコール、プロピオン酸ジオクチルアンモニウ
ム、オクトキシノール（Octcxynol）、セチルト
リメチルアンモニウムブロミド及びポリエチレン
グリコール等を単独で又は二種以上の混合物とし
て用いる。 リパーゼは、種々のものが市販されているので
それを用いてもよい。 逆ミセル系でリバーゼの反応速度を最適にする
ために反応速度に影響を及ぼす種々の因子の影響
について検討した。 界面活性剤としてAOT、有機溶媒としてイソ
オクタン、オクタン、シクロヘキサン、ｎ−ヘキ
サン、ジプロピルベンゼン、ｎ−ヘプタン等を用
いて、逆ミセル溶液を調製した後、オリーブ油を
原料に用いてリパーゼの反応速度を測定したとこ
ろ、あらゆる有機溶媒で脂肪酸が得られ、イソオ
クタンを用いた場合に初期脂肪酸生産速度が
19.7μmole／min／mlで他の有機溶媒を用いた場
合より脂肪酸生産速度が大きいことが判明した。 有機溶媒としてイソオクタン、界面活性剤とし
てAOT、ポリオキシエチレンアルコール、プロ
ピオン酸ジオクチルアンモニウム、オクトキシノ
ール、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、
ポリエチレングリコールを用いて、逆ミセル溶液
を調製した後、オリープ油を原料に用いてリパー
ゼの反応速度を測定したところ、あらゆる界面活
性剤からなる逆ミセル溶液で脂肪酸が得られ、
AOTを用いた場合に初期脂肪酸生成速度が
19.5μmole／min／mlで他の界面活性剤を用いた
場合より脂肪酸生成速度が大きいことが判明し
た。従つて、有機溶媒に対する溶解度が高く水溶
解性の界面活性剤は如何なるものでも本発明の製
造方法に用いることができると推定された。 逆ミセル系におけるリパーゼによる脂肪酸の生
成はPHと温度によつて左右される。逆ミセル溶液
のPHが４〜10の範囲内であれば脂肪酸が生成する
が、好ましいPH範囲は5.5〜10.0である。反応温
度が０〜60℃の範囲内であれば脂肪酸が生成する
が、好ましい温度範囲は15〜50℃である。 水と界面活性剤のモル比をＲ値と定義すると、
Ｒ値は、逆ミセル系での最適の反応速度をもたら
すイソオクタンを用い、AOT濃度を100mMに固
定した時、Ｒ値が２〜50の範囲でリパーゼによつ
て油脂が加水分解して脂肪酸が生成し、Ｒ値が10
の近辺である時に最も大きな初期脂肪酸生成速度
を与えた。 Ｒ値を４、７、10、13、16、25に変化させた
後、リパーゼを経済的な面を考慮して９ml添加し
て、反応を行つたところ、反応28時間後、脂肪酸
の収率は、Ｒ値が４、７、10、13、16、25の時、
それぞれ68.1、79.3、82.9、85.4、81.6、75.2％で
あつた。ここで脂肪酸の収率は初期脂肪酸生成速
度が最も大きいＲ値で最大とならずＲ値が13の時
に最大値を示した。 次いで、油脂加水分解反応の別の基質である水
の濃度が脂肪酸の収率に及ぼす影響について検討
した。AOTは有機溶媒に良く溶解するが経済的
な面を考慮して濃度を25、50、100、150、
250mMに変化させ、Ｒ値を10に維持するために
水をその濃度が0.25、0.5、1.0、1.5、2.5Mになる
ように添加した後、リパーゼを添加して反応させ
た。この時、初期脂肪酸生成速度は水の濃度に従
つて変化がほとんどなかつたが、反応35時間後に
脂肪酸を収率は水の濃度が0.25、0.5、1.0、1.5、
2.5Mに増加するに従つて48.3、67.8、82.4、88.6、
92.3％に増加した。従つて、水の濃度が油脂加水
分解反応の平衡に影響を及ぼすことが判明した。 一方、逆ミセル系で油脂（オリーブ油）の濃度
を2.5〜20％に変化させて反応させたところ、反
応28時間後の脂肪酸の収率はオリーブ油の濃度が
2.5、5.0、10.0、20.0％（Ｖ／Ｖ）に増加するに
従つて99.4、98.1、81.2、66.0％に低下した。こ
の時に生成した脂肪酸の含量はオリーブ油の濃度
2.5、5.0、10.0、20.0％（Ｖ／Ｖ）でそれぞれ
77.2、152.8、259.0、411.mMであつた。即ちオリ
ーブ油の濃度が増加するに従つて脂肪酸の収率は
低下するが、脂肪酸の生産性は高まることが判明
した。 油脂の種類を変えて、ヤシ油、牛脂、大豆油、
豚脂、米糠油及び魚油等を単独で、又はこれらを
種々の比率で混合して用いた場合にも、油脂の濃
度を反応混合物全体の５％（Ｖ／Ｖ）とした時、
96％以上の収率で脂肪酸を得ることができた。但
し、牛脂、豚脂、魚油は室温では良く溶解しない
ので35℃で反応させた。 この外に、酵素の使用量も生産性に影響を及ぼ
す。逆ミセル系に添加する酵素の濃度を低くする
と収率も低くなり反応が完結する時間が長くなる
が、酵素の濃度を高くすれば反応が完結する時間
も短くなる。しかしながら、経済的な面を考慮す
ると、酵素量を無限に増加させることはできな
い。酵素の濃度を0.25〜2.0（μｇ／ml）に変化さ
せて反応させた時の脂肪酸の収率と反応完結時間
を考慮すると約1.2（μｇ／ml）の酵素濃度で回分
式加水分解を行うことが経済的である。 一方、本発明に用いる酵素としては、植物体、
動物の膵臓及び微生物等由来の如何なる酵素をも
用いることができる。 本発明により得られる脂肪酸を工業製品の原料
として使用するためには反応が完結した後、それ
を反応系から分離しなければならない。反応が完
結した反応系には有機溶媒、水、リパーゼ、グリ
セリン、界面活性剤、脂肪酸が含まれているがリ
パーゼとグリセリンは水に良く溶解する制椎を利
用して反応系に水及び／又はアセトニトリルを添
加して撹拌した後、5000×ｇで20分間遠心分離す
ると界面活性剤（AOTなど）が沈澱し酵素とグ
リセリンは水及び／又はアセトニトリルからなる
下層部に存在し、脂肪酸と有機溶媒は上澄液とし
て残る。この上澄液を丸底フラスコに入れ回転蒸
発器で有機溶媒を留去すれば純粋な脂肪酸だけを
得ることができる。この時回収した脂肪酸の収率
は重量比で計算すると理論値の96〜97％である。 ［発明の効果］ 本発明によれば、エネルギー費用、分離費用を
節減でき、複雑な装置類を必要とせず、かつ、廃
水処理の問題を解消することもできる。 ［発明の実施例］ 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す
るが、これらの実施例は、本発明の範囲を何ら制
限するものではない。 以下の実施例において、脂肪酸含量の測定は公
知方法（Cupric Acetate−Pyridine法；J.Am.
Oil.Chem.Soc.，53，470，1976）に従つて行い、
オレイン酸（Oleic Acid）を内部標準に用いた。
油脂が脂肪酸に転換した転換率、即ち脂肪酸生成
収率は油脂の石鹸価に対する生成した脂肪酸の比
率で表示し、リパーゼ活性１単位は反応条件下で
１分間1μmoleの脂肪酸を生産する酵素の量で定
義した。 実施例 １ オクタン、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ジ
イソプロピルエーテル、ｎ−ヘプタン、ジプロピ
ルベンゼン又はイソオクタンのそれぞれの有機溶
媒450mlにAOTをその濃度が50mMになるように
溶解し、オリーブ油を50mlずつ添加した。反応混
合物の温度を30℃に調節した後、リパーゼを含む
リン酸緩衝溶液９mlを添加後、すぐに撹拌して逆
ミセル溶液を得た。10分間反応させた後、生成し
た脂肪酸の含量を定量し、生成した脂肪酸量
（μmole）／min／mlで表示した脂肪酸生成速度
は表１のとおりである。 【表】 実施例 ２ イソオクタン450mlにポリエチレングリコール、
セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ポリオ
キシエチレンアルコール（米国Atlas Powder
Co.製Brij35使用）プロピロン酸ジオクチルアン
モニウム、オクトキシノール（米国Ronm＆
HaasCo.製TritonX−100使用）、AOTをそれぞ
れその濃度が50mMになるように溶解し、オリー
ブ油を50mlずつ添加した。反応混合物の温度を30
℃に調節した後、リパーゼを含むリン酸緩衝溶液
９mlを添加後、すぐに撹拌して逆ミセル溶液を得
た。10分間反応させた後、生成した脂肪酸の含量
を定量し、生成した脂肪酸量（μmole）／min／
mlで表示した脂肪酸生成速度は表２のとおりであ
る。 【表】 実施例 ３ イソオクタン450mlにAOTをその濃度が50mM
になるように溶解し、オリーブ油を50ml添加し
た。反応混合物の温度を−10、０、15、25、30、
35、40、50、60℃に変化させて、リパーゼを含む
リン酸緩衝溶液９mlを添加後、すぐに撹拌して逆
ミセル溶液を得た。各温度で10分間反応させた
後、生成した脂肪酸の含量を定量し、生成した脂
肪酸量（μmole）／min／mlで表示した脂肪酸生
成速度は表３のとおりである。 【表】 実施例 ４ イソオクタン450mlにAOTをその濃度が50mM
になるように溶解し、オリーブ油を50ml添加した
後、反応混合物の温度を30℃に調節した。リパー
ゼを含むリン酸緩衝溶液のPHを4.0、5.5、6.5、
7.0、7.1、8.0、8.5、10.0に変化させて調製した
後、反応混合物に９mlずつを添加後、すぐに撹拌
して逆ミセル溶液を得た。10分間反応させた後、
生成した脂肪酸の含量を定量し、生成した脂肪酸
量（μmole）／min／mlで表示した脂肪酸生成速
度は表４のとおりである。 【表】 【表】 実施例 ５ イソオクタン882mlにAOTをその濃度が
100mMになるように溶解し、オリーブ油を100ml
添加した後、水の濃度が反応混合物全体中1.0M
になるように添加した後、すぐに撹拌して逆ミセ
ル溶液を得た。実際工程が経済的に運行できる酵
素濃度を定めるためにリパーゼを0.25、0.5、0.8、
1.2、1.5、2.0μｇ／mlに変化させて添加した後、
油脂の回分式加水分解を行つた。反応35時間後に
得た脂肪酸の収率は表５のとおりである。 【表】 表５から、酵素濃度が増加するに従つて脂肪酸
収率が増加するが、酵素濃度1.2μｇ／ml以上では
脂肪酸収率が大きく増加しないので、この濃度が
油脂の加水分解に経済的な濃度であることがわか
る。 実施例 ６ イソオクタン900mlにAOTをその濃度が
100mMになるように溶解し、オリーブ油を100ml
添加した後、温度を30℃に調節した。６個の反応
槽にリパーゼを含むリン酸緩衝溶液7.2mlを添加
後、各反応槽にリン酸緩衝溶液を更に添加して逆
ミセル溶液のＲ値を４、７、10、13、16、25に変
化させて油脂の回分式加水分解を行つた。反応35
時間後に得た脂肪酸の収率は表６のとおりであ
る。反応35時間後に得た脂肪酸の収率はＲ値が13
の時に最高の85.4％を示した。 【表】 次いで、油脂加水分解反応の別の基質である水
の濃度が脂肪酸の収率に及ぼす影響について検討
した。上述の反応条件中、AOTの濃度を25、50、
100、150、250mMに変化させ、Ｒ値を10に維持
するために水をその濃度が0.25、0.5、1.0、1.5、
2.5Mになるように添加して得た逆ミセル溶液で
オリーブ油（10％、Ｖ／Ｖ）の加水分解を行つ
た。反応35時間後に得た脂肪酸の収率は表７のよ
うに水の濃度が増加するに従つて増加した。 【表】 実施例 ７ イソオクタンにAOTを44.56ｇ溶解しオリーブ
油を25.50、100、200ml添加した後、イソオクタ
ンを更に添加して全部で982mlになるようにした。
温度を30℃に調節しリパーゼを含むリン酸緩衝溶
液18mlを添加後、すぐに撹拌して逆ミセル溶液を
得た。反応28時間後の脂肪酸の収率はオリーブ油
の濃度が2.5、5.0、10.0、20.0％（Ｖ／Ｖ）に増
加するに従つて99.4、98.1、81.2、66.0％に低下
した。 この時に生成した脂肪酸の含量はオリーブ油の
濃度2.5、5.0、10.0、20.0％（Ｖ／Ｖ）でそれぞ
れ77.2、152.8、259.0、411.0mMであつた。 実施例 ８ イソオクタンにAOTをその濃度か200mMにな
るように溶解して調製した864ml溶液にヤシ油、
牛脂、大豆油、豚脂、米糠油及び魚油のそれぞれ
の油脂を100mlずつ添加し温度を35℃に固定した。
この温度で各反応槽にリバーゼを含むリン酸緩衝
溶液36mlを添加後、すぐに撹拌して逆ミセル溶液
を得た。反応35時間後に得た脂肪酸の収率は表８
のとおりである。 【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 油脂をリパーゼで処理して脂肪酸を製造する
方法において；イソオクタン、オクタン、シクロ
ヘキサン、ｎ−ヘキサン、ジプロピルベンゼン及
びｎ−ヘプタンからなる群から選ばれる一種又は
二種以上の混合物である有機溶媒；スルホコハク
酸ジオクチルナトリウム、ポリオキシエチレンア
ルコール、プロピオン酸ジオクチルアンモニウ
ム、オクトキシノール、セチルトリメチルアンモ
ニウムブロミド及びポリエチレングリコールから
なる群からなる一種又は二種以上の混合物である
界面活性剤；及び緩衝溶液又は水からなる逆ミセ
ル系において、酵素反応を行うことを特徴とする
脂肪酸の製造方法。 ２ 油脂がオリーブ油、ヤシ油、大豆油、トウモ
ロコシ油、豚脂、牛脂、米糖油又は魚油である特
許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ３ PH5.5〜10.0及び15〜50℃の条件下で行う特
許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ４ 脂肪酸分離時に、反応系に水及び／又はアセ
トニトリルを加える特許請求の範囲第１項記載の
製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019860005147A KR880000565A (ko) | 1986-06-26 | 1986-06-26 | 효소에 의한 지방산의 제조방법 |
| KR5147/1986 | 1986-06-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS637789A JPS637789A (ja) | 1988-01-13 |
| JPH0413998B2 true JPH0413998B2 (ja) | 1992-03-11 |
Family
ID=19250742
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61306709A Granted JPS637789A (ja) | 1986-06-26 | 1986-12-24 | 酵素による脂肪酸の製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS637789A (ja) |
| KR (1) | KR880000565A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105779114A (zh) * | 2014-12-22 | 2016-07-20 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 一种反胶束溶剂萃取米糠的方法 |
| EP4365287A1 (en) | 2021-05-28 | 2024-05-08 | Kao Corporation | Method for promoting enzymatic reaction |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61293390A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-12-24 | ソシエテ・ナシヨナ−ル・エルフ・アキテ−ヌ | 脂肪物質の酵素による加水分解方法とその装置 |
-
1986
- 1986-06-26 KR KR1019860005147A patent/KR880000565A/ko not_active Application Discontinuation
- 1986-12-24 JP JP61306709A patent/JPS637789A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61293390A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-12-24 | ソシエテ・ナシヨナ−ル・エルフ・アキテ−ヌ | 脂肪物質の酵素による加水分解方法とその装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS637789A (ja) | 1988-01-13 |
| KR880000565A (ko) | 1988-03-26 |
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