JPH0413684A - リグニン配糖体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なリグニン配糖体およびその用途に関する
。

（従来技術・発明が解決しようとする課Ｂ）現有の抗癌
剤の殆どは、ＤＮＡ合成あるいは細胞分裂を抑制する作
用を持つが、これは正常細胞細胞分裂が速く、正常細胞
は遅いと言う差を利用して、癌細胞に、より多くの障害
を与えることで治療が成り立っている。正常細胞が受け
た障害は、副作用として表現され、生体がその副作用に
どこまで耐えられるかが、癌治療の上で重要なポイント
となっている。

以上の様に、本来の癌治療は癌細胞の生物学、生化学な
どに根ざすべきものであるが、現実にはその様な癌治療
法にまで結びついていない。

さて、癌の原因と言うと発癌物質、放射線およびウィル
スの３つが古くより言われてきた。その内、癌ウィルス
の持つ遺伝情報により細胞が癌化することが明らかにな
り、ｏｎｃｏｇｅｎｅ　（癌遺伝子）なる言葉が生まれ
た。その後、癌遺伝子は正常細胞にも存在し、それがあ
る時スイッチオンされて、細胞が癌化すると言う仮説が
立てられたのである。

これは、時の流れと共に発展し、今日その大筋は正しか
ったことを誰しも認めるところである。

一方、高等動物のゲノムには癌遺伝子となり得るｌｌｒ
ｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅは５０種以上存在し、それら
は正常細胞の増殖や分化に重要な生理機能を果たしてい
る。それ故、細胞増殖や癌の制御の遺伝子のレベルもし
くは遺伝子産物のレベルでのコントロールの可能性が生
まれて来た０本発明は癌遺伝子発現の段階を、特異的阻
害剤で抑制する癌治療剤を開発することにある。挿入さ
れたマウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ　）遺伝子の発現が
コルチコイドにより制御されているマウス乳癌細胞を用
い、ＭＭＴＶ遺伝子発現にはクロマチンタンパク質での
脱ポリＡＤＰ−リポース反応が引金となっていることが
見出されている。即ち、ポリＡＤＰ−リボースが分解さ
れることにより、その部分のクロマチン構造の局所変化
が、最終的にはＲＮＡポリメラーゼのプロモーターへの
結合と転写促進につながると考えられている。【ジャー
ナル・バイオロジカル・ケミストリー、２５８　：　１
５３７１　　（１９８３）］。

そこで、発明者はポリＡＤＰ−リボースの分解を阻止す
れば、癌遺伝子が活性化されなくなることが予想された
ため、ＡＤＰ−リボースの分解に関与する酵素であるポ
リ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼをヒト胎盤
より分離精製し、本酵素に対し阻害作用をもつ化合物を
検討した結果、幾つかの天然化合物に強い阻害活性を見
出した９そして、さらに検討を勧め、ポリ（ＡＤＰ−リ
ボース）グリコヒドロラーゼ阻害に基づく抗癌作用を有
する医薬として使用に耐え得る新規化合物を見出し、本
発明を完成した。

〔課題を解決するための手段］ 即ち、本発明は次の要皆を有するものである。

■　以下に示す性質を有するリグニン配糖体（ｉ）リグ
ニンおよび多糖類が結合 （ｉｉ）分子量は８０００〜１００００（ｉｉ　）リグ
ニンと多糖類の結合比は１；１〜２：１（分子比） （ｉｖ　）多糖類はウロン酸１０〜２０％、中性ｔＪ！
８０〜９０％で構成されている。

■　リグニン配糖体を主成分とするポリ（ＡＤＰ−リボ
ース）グリコヒドロラーゼ阻害剤。

本発明のリグニン配糖体は、リグニンと１！（多ｍ類）
との結合体である。リグニンと＄１！（多糖類）との結
合はエーテル結合による。その結合比は、リグニン：構
成糖の重量比で１〜２：ｌ程度が例示される。また、リ
グニンと多糖体との分子比で１〜２：１程度が例示され
る。

リグニン配糖体の糖部分はウロン酸および中性糖より構
成される。その組成としてはウロン酸１０〜２０％、中
性１！８０〜９０％程度が例示される。

中性糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノー
ス、アラビノースが挙げられる。その組成としてはグル
コース２５〜３０ｍｏ１％、ガラクトース４０〜４５ｓ
＋ｏｌ　％、マンノース２０〜２５ｍｏ１％、アラビノ
ース５〜ｌｏｍｏ１％程度が例示される。

これらの構成糖は全体としてｒｓ鎖構造を取っており、
多１１１４Ｍを形成する。

リグニン配糖体の分子量は８０００−１００００程度で
あり、多糖類部分の分子量は２０００〜４０００程度で
ある。またリグニン部分は分子量４０００土２０００程
度を有する。

本発明リグニン配糖体は、元素的にはＣ原子３５〜４５
重量％、Ｈ原子１−１０重量％、０原子５０〜５５重量
％程度が例示される。

本発明のリグニン配糖体は以下のように調製される。

出発原料としては松かさ、茶（葉）、草みづき、三豆根
等が挙げられる。

原料を各種溶媒（例えば、熱水、エタノール、アセトン
等）で処理する。処理時間は１−１５時間程度である。

処理済み原料をアルカリ性溶液（０，１〜ＩＮ水酸化ナ
トリウム、アンモニウム等）で抽出する。抽出液をｐＨ
４〜６に調整し、等量のエタノールを添加して上清画分
を回収する。上清画分をゲル濾過で精製して活性部分を
回収する。

こうして得られたリグニン配糖体は透析、遠心分離、凍
結乾燥等を施すことができる。

本発明のリグニン配糖体は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）
グリコヒドロラーゼ阻害作用を有し、ヒトを含む哺乳動
物（ヒト、ウマ、イヌ、マウス、モルモット、ラット等
）に対してポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラー
ゼ阻害活性を有し、ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒ
ドロラーゼ阻害剤として悪性腫瘍、ウィルス性感染症の
治療、予防に有用なものである。

本発明のリグニン配糖体は、経口的または非経口的に投
与される。

リグニン配糖体は、それ自体または製薬上許容されるキ
ャリアとの医薬製剤の形で投与される。

当該製剤は、自体既知の方法によって調製される。

剤型としては、錠剤、カプセル剤、散開、半開、注射剤
等が例示される。

リグニン配糖体は、例えば、経口投与の場合、通常０．
１−１００Ｍ／ｋｇ体重程度を１日１回または数回にわ
たって投与されるが、年齢、体重、および／または処置
すべき病状の重度や治療に対する反応によりその投与量
は変わりうる。

毒性実験 本発明のリグニン配糖体のマウスに対する毒性は、いず
れも経口投与でＬＤｓａ値が１００■／ｋｇ以上であり
、投与量にくらべてＬＩ）ｓ。値が極めて大きく、安全
域の広い化合物である。

〔実施例） 実施例１ 以下の処理に付すことによってリグニン配糖体を抽出し
た。

例 松かさ ↓焦水並■　　　　煮沸時間は松かさの量、また（Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ−４Ｂにて精製する（移動層は
０．１Ｎ　Ｎａ０ＩＩ　）　。

実施例２ リグニン配糖体の糖部分、グリコン（ｇｌｙｃｏｎｅ）
及び非糖部分、アグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）の構造
の特徴を検討するために、本配糖体をメタツリシス（メ
タノール−塩酸分解）、あるいは亜塩素酸塩（ＮａＣＩ
Ｏｔ）法によりグリコンとアグリコンに分離して分析を
行った。その結果は次の通りである。

〔グリコンの分析〕

Ｉ！組成ｍｌ　　　　　　　（％）　　　（全重置％）
ウロン酸　　　　　　１．４　　　１５．１中性＄１！
　　　　　　　　８．９　　　８４．９グリコンの５／
６が中性糖であるという特徴を持つ。

中性糖の組成１　　　　（鵬０１％） グルコース　　　　　　２５．ｌ ガラクトース　　　　　４３．１ マンノース　　　　　　２１．９ アラビノース　　　　　　９．９ フコース　　　　　　　　　０ 中性糖としてはグルコース、ガラクトース、マンノース
、アラビノースを含むが、フコースは含まない。

ａ）ウロン酸はカルバゾール法、中性糖はフェノ−ルミ
！酸法で定量した。

ｂ）中性糖の組成はメタツリシスで生成するメチルグリ
コシドをトリメチル化した後ガスクロマトグラフィーで
分析した。

〔アグリコンの分析］ 分子量：トヨバールＨＷ−４０Ｆゲル濾過法により４０
００±２０００ 赤外吸収分析口Ｒ） ！ＲはＫＢｒディスクにより測定した。

その結果、３５００〜３７００ｃｇ＋−’範囲に３４０
０１−１にピークをもつ吸収が検出された。この吸収は
フェノール性水酸基の存在を示す、　　１６００ｃｍ−
’付近の吸収は芳香族二重結合を示す、１７００ｃｍ付
近にカルボニル基の吸収がないことよりタンニンに見ら
れるようなエステル結合はなく、リグニンに見られるよ
うなエーテル結合で重合している化合物であることを示
す。

指紋領域も含めて全体のスペクトラムはリグニン（アｌ
レカリ）と極めて類（以している。

以上のＪＲスペクトルの結果から本配糖体のアグリコン
はタンニン様化合物ではなく、リグニン様化合物である
と結論される。

紫外吸収（ＵＶ）分析 ２８０ｎｍに最大吸収値、２６０ｎｍに最小吸収値をも
つ。

２８０／２６０＝１．０２ リグニンも同様のＵＶスペクトルをもつ２８０／２６０
−１．０３ ＵＶスペクトルにより芳香族（おそらくフェノール）の
存在を示す。

電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分析 リグニンと同様にｇ＝２．００４ＥｓＲシグナルが検出
されることより安定なフリーラジカルを有する構造体を
含むことを示す、なお、タンニンにはこの樟なシグナル
は見られない。

〔リグニン配糖体の分析〕

リグニン配糖体全体としての特徴 元素分析　　　（ｗｅｉｇｈＬ％） Ｃ４０，３Ｂ Ｈ４，８５ ０５４、７４ Ｎ　　　　　　　　Ｏ，０３以下 Ｏ 窒素、硫黄を含有しないことより蛋白、硫Ｍ基を含まず
セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　）　ＣＬ−４Ｂゲ
ル濾過法による分子量は約９０ｏＯである。

リグニンと糖の結合比は重量比で約１．５：ｌである。

従って本配糖体は、糖部分（グリコン）として中性糖を
全重量の約８５％も含有するという特徴をもっている。

中性糖としてはグルコース、ガラクトース、マンノース
、アラビノースを含む、非糖部分（アグリコン）はリグ
ニンより成るという特徴を有する。

本配糖体は糖の還元末端ラクトール水酸基がリグニンの
アルコール性またはフェノール性水酸基と脱水縮合して
エーテル状に結合した〇−配糖体である。また、リグニ
ンと糖の結合比が重量比で約ｔＳ：ｔであり、特に、中
性糖を多く含有する、分子量約９千のリグニン配糖体（
アグリコンの特徴で分類した場合）である。

本配糖体の推定構造モデルは図面に示す通りである。

試験例１゜ ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼに対する
阻害効果 アッセイ用パンファー（０，０１％ウシ血清アルフ゛ミ
ンー１（１ｗＭメルカプトエタノールリウム・リン酸、
ｐ　Ｈ　７．　０　）に、３Ｈ−（　ＡＤＰリボース）
７８、を加え、その２７μｌに被験物質およびヒト胎盤
より調製した核由来、ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコ
ヒドロラーゼ溶液を加えて全量３０，１／Ｊ！とした後
、３７℃にて１時間インキエベーシッンした．その後、
ＤＥ８１濾紙に反応液を吸収させ、水、エタノール、ア
セトンで濾紙を洗浄した後、それを乾燥させ、液体シン
チレーションカウンターにて、未反応基質３Ｈ−（ＡＤ
Ｐ−リボース）を測定し、本酵素に対する試験物質の阻
害作用を検討した．その結果を示したのが表１であり、
用いた被験物質の全てが、用量依存的にポリ（ＡＤＰ−
リボース）グリコヒドロラーゼを阻害した。

（以下余白） 表１ リグニン配糖体のポリ　（ＡＤＰ−リボース）グルコヒ
ドロラーゼ阻害活性 試験例２。

遺伝子発現に対する阻害効果 本試験で用いた遺伝子発現系は、糖質コルチコイド惑受
性遺伝子である、マウス乳癌ウィルス（問ＴＶ）遺伝子
を持つ、マウス乳癌細胞である３４１株を使用した．本
細胞は、糖質コルチコイド存在下において、３＆ＳＲＮ
Ａと、さらにスプライシングを受けた２４ＳＲＮＡの２
種類を発現する．この発現は　ｅｎｖ部分の　ｃＤＮＡ
　　を用いることにより検出することが出来る。そこで
、３４１株に被験物質を３０ｕｇ／ｘｌとなる様に加え
、３７“Ｃ、３０分間インキュベーションし、次に、そ
の系に１０−’Ｍとなる様にデキサメタシンを添加し、
さらに１時間インキエベーションした．その後、３４１
細胞を集め、高分子ＲＮＡをグアニジン−塩酸法で抽出
、６０℃で５分間処理（　２　０　ｍＭＭＤＰｓ。

ＰＨ７．０．　　５ｍＭ　　酢酸ナトリウム、１　ｍＭ
ＥＤＴ＾）後、１、２％アガロース・ゲル（同バッファ
ー）にて、電気泳動（４０Ｖ，１６ｈ）を行った．その
後、ニトロセルロースへトランスファーＬ，、”Ｐ−？
ＩＭＴνＤＮＡ　（ｅｎｖに特異的なｃＤＮ＾）をハイ
ブリダイズし、Ｘ線フィルムによるオートラジオグラム
を作成した．その後、オートラジオグラムより３５Ｓお
よび２４ＳＲＮＡのバンドの濃度をデンシトメーターで
測定することにより、ＲＮＡ発現量を測定し、被験物質
の無添加の場合と比較して、ＲＮＡ発現抑制割合を算出
した．その結果を示したのが表２であり、用いた被験物
質はＭＩＩＴＶ遺伝子発現抑制作用を示した。

表２ リグニン配糖体の乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）遺伝子発現
に対する作用 デキサメタシン　リグニン配糖体 （１０−’Ｍ）　　　　（３０μｇ　／ｄ）３５Ｓ，　
　２４Ｓ バンドの感光度 ！　　　　　＋ ４十 ＋＋＋＋ ＋　　　　　　　　　＋ ＋ 十＋＋ ｌは陽性対照、２．３は陰性対照、４は実験群試験例３
。

マウス実験腫瘍に対する制癌効果 マウスの腹腔内に、ザルコーマ１８０腫瘍細胞をＩＸＩ
Ｏ’個移植し、移植後１〜４日間被験物質を腹腔内に連
続投与した．抗腫瘍活性は、生理食塩液投与群との比較
による延命率より求めた。

腫瘍移植後４５日目にて実験終了とした。その結果を示
したのが表３であり、用いた被験物質は制癌作用を示し
た。

表３ マウス腫瘍ザルコーマ１８０に対する リグニン配糖体の制癌作用 リグニン配糖体 ４０×４ ２０×４ １Ｏ×４ ５×４ リグニン配糖体は移植日翌日から４日間連日投与した。

図面は本発明リグニン配糖体の推定横道をボテ。

手続補正書動側 １、事件の表示 平成２年特許願第１１３０４９号 ２、発明の名称 リグニン配糖体およびその用途 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人■５４１ 住所　大阪市中央区平野町三丁目３番９号（場末ビル） 電話（０６）　２２７−１１５６ 腫瘍移植後４５日目にて実験終了とした。その結果を示
したのが表３であり、用いた被験物質は制癌作用を示し
た。

表３ マウス腫瘍ザルコーマ１８０に対する リグニン配糖体の制癌作用 リグニン配糖体 ４０Ｘ４　　　　１３５ ２０Ｘ４　　　１７７ １０Ｘ４　　　１５７ ５Ｘ４　　　１２２ 明細書の「図面の簡単な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）別紙の通り、明細書第１９頁を差し替える。

リグニン配糖体は移植日翌日から４日間連日投与した。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明リグニン配糖体の措定構造を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の性質を有するリグニン配糖体。 （ｉ）リグニンおよび多糖類が結合 （ｉｉ）分子量は８０００〜１００００ （ｉｉｉ）リグニンと多糖類の結合比は１：１〜２：１
   （分子比） （ｉｖ）多糖類はウロン酸１０〜２０％、中性糖８０〜
   ９０％で構成されている。
2. （２）リグニン配糖体を主成分とするポリ（ＡＤＰ−リ
   ボース）グリコヒドロラーゼ阻害剤。