JPH0413660B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 液体試料中の肝炎Ｂ表面抗原（HB_sA_g）の
存在を検出するイムノアツセイであつて、 (a) 液体試料； 上記HB_sA_gに多数現れる抗原決定基に対
する、固定化された高親和性I_gＭモノクロー
ナル抗体を含有する固相免疫吸着剤；及び 上記HB_sA_gの多数現れる抗原決定基に対
する標識化された、可溶性、高親和性モノク
ローナル抗体； を含有するインキユベーシヨン混合物を形成し、 (b) 上記インキユベーシヨン混合物を、液体試料
中の抗原が固定化モノクローナル抗体と標識化
された可溶性モノクローナル抗体との両方に結
合するのに十分な条件下および十分な時間イン
キユベートし、 (c) 上記インキユベーシヨン後、インキユベーシ
ヨン混合物から固相免疫吸着剤を分離し、 (d) 液体試料中の上記HB_sA_gの量の指標として、
上記固相免疫吸着剤に結合した標識化モノクロ
ーナル抗体を検出する、 各工程からなることを特徴とするイムノアツセ
イ。 ２ 前記標識化された可溶性モノクローナル抗体
と前記固定化されたモノクローナル抗体とが同一
のモノクローナル抗体であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載のイムノアツセイ。 ３ 前記標識化された可溶性モノクローナル抗体
が放射性標識を有する特許請求の範囲第１項また
は第２項記載のイムノアツセイ。 ４ 前記放射性標識が ¹²⁵Iからなる特許請求の
範囲第３項記載のイムノアツセイ。 ５ 前記標識化された可溶性モノクローナル抗体
が酵素標識で標識化されている特許請求の範囲第
１項または第２項記載のイムノアツセイ。 ６ 前記標識化された、可溶性モノクローナル抗
体が光学的標識である特許請求の範囲第１項また
は第２項記載のイムノアツセイ ７ 前記光学的標識が蛍光物質であることを特徴
とする特許請求の範囲第６項記載のイムノアツセ
イ。 〔技術分野〕 本発明は免疫学の分野に属し、特に抗原の検出
の為のイムノアツセイに関するものである。 〔背景分野〕 病院や臨床検査室で使用する事ができるウイル
ス感染の早期検出の為のイムノアツセイ開発の要
望は広く認められているところである。そのよう
な検定の必要性は例えば種々の肝炎ウイルス感染
の一つの型である急性Ｂ型肝炎の例がある。この
ウイルスによる急性Ｂ型肝炎は有意な死亡率と罹
病率および慢性感染を起こし、また肝臓細胞の
癌、慢性活動性肝炎および肝硬変にも関連してい
る。この必要性の観点から、患者の血流中のＢ型
肝炎のウイルスマーカーであるＢ型肝炎表面抗原
（HB_sA_g）のようなウイルス抗原を検出できるイ
ムノアツセイの発展に多くの研究が向けられてき
た。 一般に現在まで発展してきたイムノアツセイは
ラジオイムノアツセイ（RIA）あるいはイムラジ
オメトリツクアツセイ（IRMA）に分類される。
RIAにおいては、限られた量の抗体を用い、標識
抗原と競合させることにより試料中の抗原量を間
接的に測定する。IRMAにおいては抗原と過剰の
標識抗体を反応させる事により抗原を直接検定す
る。 IRMA検定の一つの方法においては、道の抗原
を不溶化し、標識抗体と反応させる。抗原を固相
抗体と反応させ、不溶化するとその検定は“２部
位IRMA”、“ジヤンクシヨン試験”あるいは“サ
ンドイツチ検定”と呼ばれる。サンドイツチ検定
は更にその方法論により順、逆あるいは同時サン
ドイツチ検定に分類される。 これまでＢ型肝炎ウイルスのイムノアツセイに
最も広く用いられていたのは順サンドイツチ検定
である。この検定では、HB_sA_gを含む患者の試
料を最初HB_sA_gの為の固定抗体を含む固相免疫
吸着剤とインキユベートする。患者試料中のHB_s
A_gが固相免疫吸着剤上の固定抗体に結合するの
に十分な時間インキユベーシヨンを続ける。この
第一のインキユベーシヨン終了後、固相免疫吸着
剤をインキユベーシヨン混合物より分離し、過剰
の抗原および患者試料中に存在する非特異結合蛋
白などの他の妨害物質を除く為に洗浄する。固定
抗体に結合したHB_sA_gを含む固相吸着剤は続い
て多価であるHB_sA_gと結合できる標識抗体とも
う一度インキユベートする。第二のインキユベー
シヨン後、更に洗浄し、非結合性の標識抗体を固
相免疫吸着剤より除き、それにより非特異性結合
標識抗体を除く。固相吸着剤に結合した標識抗体
を検出し、検出された標識抗体の量が本来患者試
料中に存在するHB_sA_gの量を直接測定した量と
なる。このような順サンドイツチ検定は特許文
献、特にChung−MeiLingによる米国特許第
3867517号と第4012294号に記載されている。 広く使用されているにもかかわらず、順サンド
イツチ検定にもある種の固有の欠点がある。例え
ば、２回の別々の洗浄に加えて２個の別々のイン
キユベーシヨンを行う事を必要とする為この検定
は相対的に時間がかかり、また熟練した技術者に
より行わなければならない多くの巧みな操作が必
要であり、それにより順サンドイツチ検定はかな
り高価につく。それに加え、第二のインキユベー
シヨン中の速度は、標識抗体がこの段階において
固相免疫吸着剤上の不溶化抗体に結合した抗原と
反応しなければならないので比較的遅い。 逆サンドイツチイムノアツセイが順サンドイツ
チ検定のいくつかの欠点を克服して発展してき
た。逆サンドイツチ検定においては、患者試料を
最初に標識抗体とインキユベートし、その後固定
抗体を含む固相免疫吸着剤を加え第二のインキユ
ベーシヨンを行う。このように、順サンドイツチ
検定の最初の洗浄過剰を必要としないけれども、
第二のインキユベーシヨン期間後の洗浄は行う。
順サンドイツチ検定に比べ逆サンドイツチ検定の
主な利点は最初の洗浄過程が除ける事と標識抗体
と患者の血清中の抗原を最初に一緒にインキユベ
ートするので反応の動力学が改良される事であ
る。このように反応が平衝に達するのに必要な総
計のインキユベーシヨン期間が短く順検定により
逆検定が感度が高くなる事が期待される。逆サン
ドイツチ検定は、RogerN.Piasioらによる米国特
許第4098876号に記載されている。 逆サンドイツチ検定は順サンドイツチ検定より
も有力な利点を持つているが、それにはまだ２つ
の別々なインキユベーシヨン期間と１回の洗浄が
必要である。同時サンドイツチ検定においては、
患者試料、固定抗体をその上に持つ免疫吸着剤お
よび標識抗体を一つのインキユベーシヨン過程で
同時にインキユベートする。一回のインキユベー
シヨンで洗浄過程を必要としないのは確かな有力
な利点であるけれど、同時サンドイツチ検定はこ
れまで順および逆サンドイツチ検定より感度が悪
く信頼性が低いとされてきた。もちろんこれは患
者試料は、蛋白質のような多くの非特異的結合分
子を含んでおり、これらは順サンドイツチ検定で
なされる様な洗浄がなく検定条から洗浄されない
事から考えられる事である。 〔発明の開示〕 本発明は患者の血液のような液体試料中の多認
識抗原の存在を検出する同時サンドイツチ検定に
関するものである。上で指摘したように、同時サ
ンドイツチ検定においては患者試料は抗原のため
の固定抗体を含む免疫吸着剤および抗原のための
標識抗体の両方と同時にインキユベートされる。
その後、免疫吸着剤に結合した標識抗体を検出し
患者試料中の抗原存在量とする。 広い意味においては、本発明は同時サンドイツ
チ検定において、固定抗体および標識抗体両方の
ための高親和性モノクローナル抗体を用いる改良
法である。これらの高親和性抗体としてはモノク
ローナルI_gＧまたはモノクローナルI_gＭ抗体が可
能である。この同時サンドイツチ検定の一つの良
好な具体例ではＢ型肝炎ウイルスの特に高感度検
定においてHB_sA_gのための固定および標識抗体
に高親和性モノクローナルI_gＭ抗体を使用する。 ここに記す同時サンドイツチ検定は以前から認
められている同時サンドイツチ検定の有力な利点
を実現する。例えば、本検定はただ一つのインキ
ユベーシヨンのみであり、洗浄過程を必要としな
いので工程が少なく簡便である。この事は熟練し
た技術者の必要時間を減じる即ち、検定実施のコ
ストを下げる。 しかしながらより重要な事は、同時サンドイツ
チ検定にモノクローナル抗体を用いると驚くべき
感度が得られる事である。例えば統計のインキユ
ベーシヨン時間を同一にすると、HB_sA_gの検出
においてここに記した同時サンドイツチ検定は順
あるいは逆検定よりも高感度である事が見い出さ
れた。 ここに記した検定の他の予期しない利点は、た
だ一回のインキユベーシヨンで洗浄過程を行わな
い事実にもかかわらず広い範囲の抗原濃度で検出
できる事である。例えば、本検定では1000万倍以
上の希釈範囲でHB_sA_gを検出する事ができる事
が見い出された。 〔発明を実施するための最良の態様〕 ここに記す同時サンドイツチ検定は多認識抗原
の検出に有用である。“多認識”という用語は複
数の同じ抗原決定基（エピトープ）を含む抗原を
意味する。時々、そのような抗原を文献中“ポリ
デタミナント”抗原とも言うが、しかしここでは
そのような抗原を記載する場合は術語“多認識”
を使用する。 抗原決定基を記載するのに使用する他の用語に
“多価”がある。用語“多価”はここでは抗原上
に複数の異つた抗原決定基あるいはエピトープが
ある場合を意味する。 多くのウイルス抗原は多認識である多価であ
る。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスは少くとも３つの
十分に特定された抗原を持つ複雑な42ナノメータ
（ｎｍ）の粒子である事が知られている。それら
はＢ型肝炎芯抗原（HB_sA_g）、Ｂ型肝炎ｅ抗原
（HB_sA_g）およびＢ医肝炎表面抗原（HB_sA_g）で
ある。 HB_sA_g抗原は無傷のＢ型肝炎ウイルスの表面
上に存在する高分子量の複雑なたん白である。し
かしながらHB_sA_gは環状の22mm粒子あるいは繊
維状の形をしたＢ型肝炎に感染した患者の血液に
もまた存在する。感染患者の血流中に存在するた
めHB_sA_gは急性および慢性Ｂ型肝炎感染の特異
的ウイルスマーカーとして広く用いられるように
なつた。 患者血清試料中のHB_sA_gは約800マイクログラ
ム／mlにより高い濃度と思われていた。しかしな
がら、その血清濃度が約50pq／mlの低濃度でも
感染している事を示すデータがある。この事は検
定が異常に広い範囲に及ばねばならない事を意味
する。 ここに記載する同時サンドイツチ検定の多くの
記述はHB_sA_gの検出に関して示されているが、
検定それ自体はどんな多認識抗原の検出にも適し
ている事を認めねばならない。これには単純ヘル
ペスウイルスおよび、帯状ヘルペスウイル
ス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バー
ウイルス、BKあるいはJCウイルスのようなパポ
バウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、イ
ンフルエンザあるいはパラインフルエンザウイル
スのような多認識の他のウイルス抗原がある。ウ
イルス蛋白殻のようなウイルスのサブユニツトも
またそのようなサブユニツトは多認識であるので
検出できる。更に、抗原は多認識であればウイル
スの状態である必要はなく、ここに記載する同時
サンドイツチ検定はそのような非ウイルス多認識
抗原の検出に適している。そのような非ウイルス
多認識抗原としては、例えば、細胞、免疫複合
体、膜標本、バクテリアその他がある。 そのような多認識抗原は液体試料として検定さ
れる。しばしば、液体試料とは患者の血液あるい
は血漿あるいは血清のような血液成分である。尿
のような他の液体試料ももちろんここに記載する
同時サンドイツチ検定により検定できる。 本検定においては、高親和性モノクローナル抗
原を標識抗体同様免疫吸着剤に結合した固定抗体
にも用いる。 “高親和性”という用語はここでは抗体が
10^-9n^-1以上で好ましくは10¹¹n^-1以上の親和結合
定数（Ｋ）を持つている事を意味している時に用
いる。結合定数は既知の技術を用いScathchard
プロツトから決定し、もちろん、部位当りに基づ
くより全体の抗原と抗体分子から決定される。 “モノクローナル”という用語は、抗体が単一
の抗体産生細胞からクローン化した細胞株により
産生される事を意味する。モノクローナル抗体は
各々の抗体が単一の抗原決定基に対して効果的に
あるので、特別に純粋で単一でそして再現できる
ものである。 モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞より
有意な量を得る事ができる。ハイブリドーマ細胞
は抗体産生細胞と癌細胞との融合により得られる
融合細胞である。このようなハイブリドーマ細胞
に関する最初の仕事はCesarMilsteinとGeorge
Ko¨hlerによりマウスミエローマ細胞と羊赤血球
細胞で免疫したマウスからの脾臓細胞を用いてな
された。Ko¨hlerら、Eur.J.Immunol.，６，511−
19（1976）；Ko¨hlerら、Nature，256，495−７
（1975）；およびMilstein，Scientific American，
243，(4)，66−74（1980）を参照。 最初では、Hilary Koprowskiとその学生が特
定のウイルスおよび癌に対してのモノクローナル
抗体産生ができるハイブリドーマ細胞株を発展さ
せる事により本来のハイブリドーマの仕事を拡張
した。米国特許第4196265号および第4172124号を
参照。さらに最近では、肝炎ウイルスに対するモ
ノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ細
胞株を作るまでにハイブリドーマ技術が更に拡張
された。Jack.R.WandsとVincent R.Zurawski
の名前による1979年の米国特許申請通し番号第
86947号（10月22日出願）を参照。また最近、ハ
イブリドーマ細胞株から産生されるモノクローナ
ルI_gＭ抗体がある種のイムノアツセイに用いそれ
らの感度と特異性を改良した事も発見された。
Jack R.Wands，Vincent R.Zurawskiおよび
Hubert J.P.Schoemakerの名前による1980年の
米国特許申請通し番号第188735号（９月19日出
願）を参照。 このように一般科学および特許文献にハイブリ
ドーマ細胞株とその細胞株から産生されるモノク
ローナル抗体の多くの記述がある。これらの教え
はその中で既して、そして特に今まで述べたハイ
ブリドーマ細胞株および／あるいはモノクローナ
ル抗体に関する各々の論文および特許の教えに依
存しておりまたこの結果参考にして組み入れてい
る。更に、これらの前の特許申請で確立された細
胞株H25D3のクローンはAmerican Type
Culture Collection（ATCC）（Rockuille，Md.）
に保管されており、ATCC受理番号HB8058と同
一である。 上に記載したように、本発明の同時サンドイツ
チ検定では検定される多認識抗原用の高親和性モ
ノクローナル抗体は固相免疫吸着剤に固定され
る。用いられてきたそのような固相免疫吸着剤に
は多くの種類がある。よく知られている免疫吸着
剤としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピ
レン、デキストランその他の物質からなるビー
ズ；そのような物質からなる、あるいはそれでコ
ートしたチユーブ；その他がある。抗体はアミド
あるいはエステル結合による共有結合または吸着
などの技術を用い、固相免疫吸着剤に共有結合的
あるいは物理的に結合できる。この分野に精通す
る者は、抗体をその上に固定する多くの他の適し
た固相免疫吸着剤と方法を知つているだろうし、
そのような使用法は常用検査にすぎない事を確認
できるだろう。 ここに記載した同時サンドイツチ検定において
は、高親和性モノクローナル抗体はまた標識抗体
としても使用するそのような抗体は ¹²⁵Iのよう
な放射性物質；螢光物質のような光学活性物質、
酵素、あるいはいくつかの他の既知の技術により
標識できる。 液体試料、固定モノクローナル抗体を持つ固相
免疫吸着剤および標識、可溶性モノクローナル抗
体を抗原が固定抗体と標識抗体の両方に結合でき
る条件下十分な時間インキユベートする一般的
に、標識抗体が固相へ最大限結合する事によりシ
グナルが増加するので可能なだけ抗体を十分に結
合させるインキユベーシヨンが条件を与えるのが
普通望ましい。典型的な時間と温度の条件は45℃
で２時間あるいは37℃で12時間である。 標識抗体は固定抗体より速く抗原に特徴的に結
合する、なぜなら前者は溶液に溶解しているのに
対し一方後者は固相保持剤に結合しているからで
ある。このため標識抗体は固定抗体より低い濃度
で用いる事ができ、標識抗体を高比放射能で用い
るのが良好である。例えば、約１〜50nｇ／検定
の濃度で標識抗体を用い、一方固定抗体は100〜
500nｇ／検定の濃度である。標識抗体は例えばI_g
Ｍ当り１ヨード分子あるいは、１分子のI_gＭ抗体
当りＺ標識ヨードの高さの比放射能で用いる。 もちろん、標識抗体および固定原体の特定の濃
度、温度そしてインキユベーシヨンの時間も他の
検定条件同様多くの因子に依存する。例えば検定
する特定の抗原、抗原の濃度、および用いるモノ
クローナル抗体あるいは抗体類である。この分野
に精通する者にとつては、常用検査法を用い各々
の決定のための望ましい有効で最適な検定条件を
決定する事ができる。 一回のインキユベーシヨン後、固相免疫吸着剤
をインキユベーシヨン混合物より除去する。この
過程は沈澱や遠心などのどんな既知の分離技術も
伴わない。混合した標識抗体の検出以前に洗浄過
程を必要としない。検出は例えば標識が放射性ガ
ンマエミツターであればシンチレーシヨンカウン
ターで行い、例えば、もし標識が螢光物質であれ
ば螢光光度計で行う。酵素標識の場合は、検出は
酵素の競合基質を用い比色法で行う。 上で注意したように、ここに記載した同時サン
ドイツチ検定を用いる事で得られる結果は、検定
の総計のインキユベーシヨン時間が同じならば順
および逆サンドイツチ検定より高感度である事を
示している。これは驚くべき事であり、そのよう
な感度の理由をよく理解できない。この理論と結
びつけるのを望むわけではないが、一つの可能な
説明は、インキユベーシヨン混合物中において、
モノクローナルI_gＭ抗体は架橋構造を形成する傾
向を持つている事である。これにより、多量の抗
原と標識抗体が固相免疫吸着剤に結合できる。例
えば間接的ではあるがデータは抗体分子の数から
期待されるよりも多くの抗原分子が固相に混合で
きる事を示しており、この事は、架橋あるいは取
り木の概念を支持している。 実施例で示すデータはI_gＭ抗体のものである
が、この同時サンドイツチ検定はまたI_gＭ抗体を
固定あるいは標識抗体またはその両方に用いても
可能であると信じられる。I_gＧ分子は二つの結合
部位を持ち、また抗原と架橋できる。 本発明の同時サンドイツチ検定を以下の実施例
により、もつと明確に例示する。 実施例 １ HB_sA_gのイムノラジオメトリツクアツセイ HB_sA_g検出の順、逆、および同時サンドイツ
チ検定を比較した。 各々に用いられたモノクローナル抗体はHB_s
A_gに対して高い親和性を持つたモノクローナルI_g
Ｍ抗体でハイブリドーマ細胞株5D3により産生さ
れた。5D3ハイブリドーマ細胞株はBALB／Ｃマ
ウスMOPC21ミエローマより誘導されたP3−
NS1／１−Ag ４−１ミエローマ細胞株と特別な
免疫法によりHB_sA_gで免疫されたマウス脾臓細
胞を融合させて得たクローン株である。用いた特
別な方法は米国特許申請通し番号第86947号（10
月22受理、1979）に詳しく、それを参考に取り入
れた。 固相免疫吸着剤はPrecision Plastic Ball
Company（シカゴ、イリノイ）社製の1/4インチ
のポリスチレンビーズである。ビーズは以下の様
にしてモノクローナルI_gＭ抗体でコートした。免
疫したBALB／Ｃマウスからの腹水液をリン酸
緩衝液（PBS）で１：500から１：5000に希釈す
る。ビーズを室温で16時間インキユベートし、蒸
留水で３回触洗する。 モノクローナルI_gＭ抗体はBolten Huntev法に
より標識する。比放射能は約２から約20μCi／μ
ｇの範囲であつた。 順サンドイツチ検定のプロトコールは、その表
面に固定モノクローナル抗体を持つビーズを１％
ウシアルブミンを含む100μのPBSおよび100μ
のHB_sA_g含有患者血清と45℃で１時間インキ
ユベートし、続いて蒸留水で３回洗浄し、続いて
200μの標識抗体を加え、45℃で１時間インキ
ユベートする。 逆サンドイツチ検定のプロトコールでは、
100μの標識抗体を100μのHB_sA_g含有患者血
清と溶液相中、45℃で１時間インキユベートす
る。続いて固体ビーズ上にコートしたモノクロー
ナル抗体を加え更に45℃で１時間インキユベート
する。続いてビーズを３回蒸留水で洗浄し、シー
チレーシヨンカウンターに入れる。 同時サンドイツチ検定プロトコールではコート
したビーズと100μの標識抗体および100μの
患者試料を２時間45℃で同時にインキユベートす
る。続いてビーズを蒸留水を３回洗浄し、シンチ
レーシヨンカウンターに入れる。 更に、患者試料を10倍の希釈度で多数回希釈
し、各々のプロトコールで再検定し、各々の検定
プロトコールの限界の感度を決定した。陰性の対
照としてはヒト血清を用いた。 結果を表に示した。表のデータからわかる
ように、各々の検定でHB_sA_gに対する同じモノ
クローナルI_gＭ抗体を用い、各々の検定で同じイ
ンキユベーシヨン条件であるにもかかわらず、同
時サンドイツチ検定は順あるいは逆検定よりも感
度が高い。 【表】 【表】 実施例 ２ 臨床患者研究 比較臨床患者研究はMassachusetts General
Hospitalで異つた出所の290の患者試料を用いて
行つた。用いた同時サンドイツチ検定は実施例１
に記載したものである。用いた市販の検定法を記
した。その結果は： 【表】 SSAは急性肝炎および輸血後肝炎の場合陽性
試料として検出したのに対し、一方市販の検定は
陰性の結果を与えた事が指摘されなければならな
い。 〔産業上の利用可能性〕 ここに記載した発明はＢ型肝炎表面抗原（HB_s
A_g）のような多認識抗原の検出に有用である。
このように本検定は病院や臨床検査室でウイルス
感染の早期検出や、非ウイルス抗原の検出に用い
ることができる。 〔均等技術〕 この分野に精通する者は常用検査法にすぎない
様な方法を用い、ここに記載した発明の具体例と
多くの均等技術を認めあるいは確かめ得るであろ
う。そのような均等技術は次の請求の範囲に包含
することを意図する。