JPH04110660A

JPH04110660A - 肝疾患診断用試薬

Info

Publication number: JPH04110660A
Application number: JP23016990A
Authority: JP
Inventors: Iwao Okubo; 岩男大久保; Minoru Sasaki; 實佐々木
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1990-08-30
Filing date: 1990-08-30
Publication date: 1992-04-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は肝疾患診断用試薬に関する。

〔従来技術・発明か解決しようとする課題〕肝疾患とは
、肝細胞の機能障害によって起こる症状を指す。肝疾患
は肝細胞の変成、壊死による肝機能の停止ないしは廃絶
によって起こることか多いが、肝循環障害が関与するこ
ともある。具体的な疾患としては、慢性肝炎、肝硬変、
肝癌、Ａ型肝炎、激痛肝炎等が挙げられる。これら肝臓
疾患の一般的な診断方法としては、種々の肝機能検査が
考案されており、それらの検査値が示すところの異常所
見の有無によることが多い。現在肝機能検査というへき
ものの数は２００以上にも及んでいる。代表的なものと
しては、（１）胆汁排泄機能血清ビリルビン値（抱合型
、非抱合型）、尿ビリルビン２尿ウロビリノーゲン、尿
中胆汁酸なと、（２）色素排泄機能・ＢＳＰ排泄試験、
ＩＣＧクリアランス試験なと、（３）タンパク代謝　血
清総蛋白量、血清アルブミン値１血清膠質反応（硫酸亜
鉛反応チモール混濁試験）、　Ａ／Ｇ比（アルブミン・
グロブリン比）、プロトロンビン時間なと、（４）糖質
代謝ガラクトース負荷試験、ブドウ糖負荷試験、果糖負
荷試験なと、（５）脂質代謝血清コレステロール値（エ
ステル比）、（６）血清酵素・血清アルカリ・フォスフ
ァターゼ（ＡＬＰ）　、血清コリンエステラーゼ（Ｃｈ
−Ｅ）、血清トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、　ＧＰＴ）
　、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、　　ロイシンアミノペ
プチダーゼ（ＬＡＰ）、　　γ−グルタミールトランス
ペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）、　５−ヌクレオチダーゼ
（５−Ｎ）なとか挙げられる。

しかしながら、肝は複雑な機能を有する臓器であり、予
備能の大きな臓器でもあるから、ある程度の障害があっ
ても、検査に異常所見か認められないこともある。また
、肝疾患の種類によって、障害される機能も異なり、異
常を示す検査の項目およびその異常度にも差かみられ、
そのため上記諸検査を組み合わせることによって肝疾患
の鑑別か行われるのが現状である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、これらの事情に鑑み各種研究を重ねた結
果、キニノーゲン・カルパイン複合体に対する抗体を用
いた試薬を調製し、これらが肝疾患診断用試薬として有
効であるという全く新しい見知に基づき、本発明の完成
に到った。

すなわち、本発明はキニノーゲン・カルパイン複合体に
対する抗体よりなることを特徴とする肝疾患診断用試薬
に関する。

キニノーゲンとは、血清中に遊離され、血漿α２−グロ
ブリン画分中に存在する降圧作用の強いペプチドである
キニンの前駆体で、高分子量および低分子量のものか存
在する。キニノーゲンはキニンゲナーゼという酵素で分
解されて生理活性型のキニンを生成する。本発明で使用
されるキニノーゲン・カルパイン複合体に対する抗体を
調製するためのキニノーゲン（よ高分子キニノーゲン、
低分子キニノーゲン、あるいはそのＨ鎖体等か例示され
る。特にヒト由来、就中ヒト血漿由来のものか好適であ
る。

カルパインはカルシウム依存性プロテアーゼとも呼ばれ
、高等動物のほぼすべての臓器の細胞内可溶化画分に存
在するチオールブロテアーセて、ある。その活性の発現
にはＣａ”＋を必須とする。本酵素はＳＨ阻害剤やエチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などで失活するほか、
微生物の生産するチオールプロテアーゼ阻害剤、ロイペ
プチン、アンチパイン、エポキシコハク酸誘導体のε−
６４なとで強く阻害される。生体内には本酵素を特異的
に阻害する蛋白質性のインヒビターも存在し、上記キニ
ノーゲンもまたカルパインの酵素活性を阻害することか
知られている。カルパインは分子量約８万および約３万
のサブユニットから成り、カルパインＩとカルパイン■
が存在する。本発明で使用されるキニノーゲン・カルパ
イン複合体に対する抗体を調製するためのカルパインと
してはカルパインエ、カルバイン■等か例示される。特
にヒト由来、就中ヒト赤血球由来のものが好適である。

本願発明で使用されるキニノーゲン・カルパイン複合体
は、Ｃａイオン等の二価陽イオンの存在下に結合する複
合体である。複合体におけるキニノーゲンとカルパイン
とのモル比は、通常２：ｌ〜ｌ二２、好ましくは、１；
ｌである。

肝疾患診断は、通常免疫学的分析法によって行われ、た
とえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）　、酵素抗体法
（ＥＩＡ）　、逆受身血球凝集反応（ＲＰＨＡ）なとが
適用される。

本発明においては、上記のキニノーゲン・カルパイン複
合体対する抗体を用いた肝疾患診断用試薬を提供するも
のである。

以下、その調製方法を詳述する。

（ｉ）抗原の調製抗原としては、キニノーゲン・カルパイン複合体を用い
た。

（ｉｉ）抗体の調製（ｉ）の抗原を用いて抗体を調製した。抗体はポリクロ
ナール抗体、モノクロナール抗体いずれても可である。

本発明に用いられるキニノーゲン・カルパイン複合体に
対する抗体（国際キニン学会１９８７年１１月２９日〜
１２月３日で発表）は公知である。

抗体調製方法は自体既知の方法で行われる。

モノクロナール法の場合、細胞融合法により抗体を得る
。細胞融合法は自体既知の手段にて行われ、その−例は
増殖性を持った細胞と目的とする抗体を産生じているリ
ンパ球とをポリエチレングリクールの存在下で反応せし
めることにより、増殖性と抗体産生能とを同時に兼ねそ
なえた細胞を製するもので、この細胞の産生ずる抗体は
一個の抗原決定基に対してのみ反応する単一抗体である
。

本発明では増殖性を持つ細胞としてマウスミエローマ細
胞を、抗体産生リンパ球として本抗原で免疫されたマウ
ス肺臓細胞（Ｂ細胞）を用いて融合させ、さらにスクリ
ーニングして、本抗原のモノクロナール抗体を得る。

ポリクロナール法の場合、抗体は、高度に精製した抗原
を動物に免疫し、得られた血清から回収・精製すること
によって得られる。

当該血清の製造は公知の方法にて行えばよく、例えば高
度精製抗原とフロイントの完全アジュバントの混合溶液
を作り、動物の皮肉に２〜３回注射し、最終免疫の数日
後採血を行い室温で凝固せしめた後、４°Ｃにて一夜放
置し、３．０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離より当該
抗血清が得られる。

免疫に用いる動物としては、特に動物種を選ぶ必要はな
く、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等が
挙げられる。当該抗血清の精製は例えば、Ｊ、Ａｍ、Ｃ
ｈｅｍ、Ｓｏｃ、、　６２．３３８６（１９４０）、　
Ｆｅｄ。

Ｐｒｏｃ、、　１７．１１６１（１９５８）に記載の方
法にて行われる。

（ｉｉ）測定試薬の調製（ｉｉ）の抗体を用いて試薬を調製する。キニノーゲン
・カルパイン複合体に対する抗体を用いた試薬は、既に
公知であり、本発明の試薬もこれに準じて調製される。

具体的には、固定化抗カルパイン抗体、ビオチン化抗キ
ニノーゲン・カルパイン複合体抗体、ペルオキシダーゼ
結合アビジン、０−フェニレンジアミン、過酸化水素か
らなる測定用キットか例示される。

（ｉｖ）測定方法診断用の試料としては生体内試料、たとえば尿、血液、
血漿、血清なとか使用される。測定方法は、自体既知の
方法によって行われる。

具体的に、酵素免疫分析／サンドイツチ法の場合て説明
する。この場合、−次抗体、二次抗体の一方が、抗キニ
ノーゲン・カルパイン複合体抗体てあればよい。

■　−次抗体の固定化一次抗体を担体（ビーズ、マイクロプレート、繊維等）
に固定化（０〜３７°Ｃ９２４時間）する。固定化後、
適当な溶媒で洗浄し、ブロッキングを行うことが好まし
い。

■　試料の添加キニノーゲン・カルパイン複合体を含む試料を添加し、
インキュベーション（１０〜３７℃、０．１〜５時間）
を行う。後に、液相を除去、洗浄することかできる。

■　酵素結合二次抗体の添加酵素結合二次抗体としてはビオチン化二次抗体と酵素結
合アビジンの組合せでもよい。酵素結合二次抗体を添加
し、インキュベーション（１０〜３７’Ｃ，０，１〜５
時間）を行う。後に、液相を除去、洗浄することができ
る。

■　基質の添加基質を添加し、酵素反応（１０〜３７°Ｃ，１０〜６０
分間を行った後に、形成した生成物の吸光度を測定する
。

本発明においては、酵素結合二次抗体としてペルオキシ
ダーゼ結合抗体を用い、自体既知の方法、すなわちペル
オキシダーゼを結合させた場合、０−フェニレンジアミ
ンと過酸化水素とを作用させ、主波長４９２　ｎｍ、副
波長６９０　ｎｍの波長にて吸光度を測定することがで
きる。

尚、測定限界はキニノーゲン・カルパイン複合体の場合
、１００　ｎｇ／−である。

〔発明の効果〕

本発明によって得られた肝疾患診断用試薬は、肝疾患（
慢性肝炎、肝硬変、肝癌、Ａ型肝炎、劇症肝炎等）の診
断において有用であり、臨床的意義を有するものである
。

〔実施例〕

実施例１；キニノーゲン・カルパイン複合体に対する抗
体を用いた肝疾患診断試薬（１）高分子キニノーゲンの精製高分子キニノーゲンは新鮮なヒト血漿からＤＥＡＥ−セ
ファデックス及び亜鉛キレート−セファロースを用いた
カラムクロマトにより精製した［Ｂｉｏｃｈｅｍ。

２５、１６６９．　（１９８６）］。

（２）カルバインＩの精製カルバインＩはヒト赤血球からＤＥＡＥ−セルロース、
ウルトラゲルＡｃＡ　３４、ブルーセファロース及びＤ
ＥＡＥバイオゲルＡを用いたカラムクロマトにより精製
した［Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｒｅｄ、　、　４．３８１．　
（１９８３）　ｌ。

（３）キニノーゲンとカルバインの複合体の形成複合体
を形成するために５　ｍＭ塩化カルシウム加２０　ｍＭ
ホウ酸緩衝液（ＰＨ８）中、キニノーゲンとカルパイン
の混合物を１，１のモル比で３０°Ｃ１１０分間インキ
ュベーションした（Ｎ複合体）。さらに１　ｍＭジサク
シニミジルスベレートを加えて室温で３０分間インキニ
ーベートし［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
、　ＵＳＡ８１．１６７９．（１９８４）］　、架橋化
複合体（ＣＬ複合体）を得た。

（４）細胞融合と抗体産生高分子キニノーゲンとカルパインとの架橋化複合体１０
μｇをフロイントの完全アジュバントで乳化し、Ｂａ１
ｂ／Ｃマウスに一週間おきに皮下注射した。

融合の４日前に、複合体の１０μｇを生食に溶解して静
注した。マウスの牌細胞を回収し、Ｈ５−１マウスミエ
ローマ細胞と５０％ポリエチレングリコール１５００の
存在下で融合した［Ｎａｔ　ｉｖｅ、　２５６．４９５
（１９７５）］。ＨＡＴ培地中に生存する陽性ハイブリ
ドーマをエンサイムーリンクド・イムノソルベント・ア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）法により同定した。ハイブリドマ
はＨＴ（ヒボキサンチン−チミジン）培地中で限界希釈
法によりサブクローン化され、１×１０７細胞数の接種
により１％ヌトリドーマＳＰ加ＤＭＥＭ培地中で３〜４
日間増殖、成育させた。

尚、ＤＭＥＭ培地には、２０　ｍＭグルコース、１０　
ｍＭＮ−（２−ハイドロキシエチル）ビペランンーＮ′
−２−エタンスルホン酸０（ＥＰＥＳ）　、１．１４　
ｍＭオキザロ酊酸、０．５　　ｍＭピルビン酸ナトリウ
ム、２００　ｕｎｉｔ／　Ｒインシュリン、５０μＭβ
−メルカプトエタノール、２６０μ闇カルベニシリン、
１７０μＭストレプトマイシン、１０μＭアムホトリシ
ンＢを補充してｐ　Ｈ７，２に調製した（ｃＤＭＥＭ培
地）。ＨＡＴ感受性培地は上記ｃＤＭＥＭ培地に１００
μＭヒボキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６
μＭチミジン及び１５％牛脂児血清を添加したもので、
ＨＴ培地はそのうちアミノプテリンを含まないものであ
る。

（５）抗体の選別９６ウエルのマイクロタイタープレートの各ウェルをＣ
Ｌ複合体の２０　ｍＭ　）リス−塩酸、　　ｐＨ７，５
（５μｇ／ｄ）溶液１００μｌて、室温て２時間コート
して、ＰＢＳ−トウィーン緩衝液で３回洗浄した後、１
％　ＢＳＡでブロックした（室温で１時間処理）。

ＰＢＳ　−トウィーン緩衝液て３回洗浄した後にハイブ
リドーマ培養上清５０μ！およびＰＢＳ−ＴＰＢ緩衝液
を加えて室温で２時間静置した。ＰＢＳ　−）ウィーン
緩衝液で３回洗浄した後、ＰＢＳ−ＴＰＢ緩衝液で１０
４倍希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ由来抗マウス抗
体（ＩｇＡ、　［ｇＧ、及び［ｇＭ）１００μｌを加え
、室温で２時間放置した。ＴＢＳ　−トウィーン緩衝液
で３回洗浄した後に、０．４■／−オルトフェニレンジ
アミン及び１．８２　ｍＭ　Ｈ２０□加０．１Ｍクエン
酸−リン酸緩衝液（ＰＨ５）　１００μｌを遮光下で加
えた。酵素反応は２Ｎ　　硫酸５０μｌを加えて１０分
後に停止させた。各ウェルの生成物の量を４９２　ｎｍ
の吸光度て測定した。モノクロナール抗体は１％ヌトリ
ドーマーＳＰ　ＤＭＥＭ培地から５０％飽和硫安分画お
よびセファクリルＳ−３００を用いたカラムクロマトに
より精製した。

尚、ＰＢＳは食塩で等強化した２０　ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，４）、ＰＢＳ　−）ウィーン緩衝液は０．０
５％トウィーン２０加ＰＢＳ　、　ＰＢＳ−ＴＰＢ緩衝
液は０．０５％トウィーン２０．２％ポリビニルピロリ
ドン、及び０．２％牛脂児アルブミン（ＢＳＡ）加ＰＢ
Ｓである。

（６）　　試薬の調製血漿中の複合体濃度を測定するために、（５）で選別し
た抗体を用いて、分析系（サンドイッチＥＬＩＳＡ）を
確立した。この分析系では、アフィニティクロマトによ
り精製したカルバイン■抗体（ポリクロ抗体）を固相抗
体として用い、−次抗体としてピオチン化抗複合体抗体
を、そして通常のＥＬＩＳＡでの二次抗体の代わりにペ
ルオキシダーゼ結合アビジンを用いた（第１図）。

架橋化高分子キニノーゲン・カルバインＩ複合体（ＣＩ
、複合体）及び非架橋化複合体（Ｎ複合体）の標準曲線
を第２図に示す。ＣＬ複合体ては１．　ｎｇ／　ｍｌま
て、Ｎ複合体では１００　ｎｇ／　ｍｌまて測定可能て
あった。

（７）検体の測定正常人（１３例）、慢性肝炎患者（１７例）、肝硬変患
者（２３例）、肝細胞癌（１８例）を用いて血清中のキ
ニノーゲン・カルパイン複合体の濃度を測定した。その
結果、正常人に比べて肝疾患患者では血清中のキニノー
ゲン・カルパイン複合体の濃度か有意に高いことか判明
した（第３図）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、高分子キニノーゲン・カルバイン■複合体の
分析系、第２図は、高分子キニノーゲンカルバイン■の
架橋化複合体（ＣＬ複合体）及び非架橋化複合体（Ｎ複
合体）の標準曲線、第３図よ、正常人と肝疾患患者との
血清中のキニノーゲン・カルパイン複合体濃度比較を示
す。複合体（ｎｇ／ｍｆ）第図高分子キニノーゲンカルバインＩ複合体の標準曲線

Claims

【特許請求の範囲】

　キニノーゲン・カルパイン複合体に対する抗体よりな
ることを特徴する肝疾患診断用試薬。