JPH0358786A - カロチノイドの合成に有用なｄｎａ鎖 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 く技術分野〉 本発明は、リコピン、β−カロチン、ゼアキザンチン、
セアキサンチンージグルコシド等のカロチノイドの合成
に有用なＤＮＡ鎖に関するものである。

く先行技術〉 力ロチノイド（　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）は、緑色植物
に広く分布しており、また、ある種のかび、酵母等に含
まれる黄色〜橙色〜赤色を示す脂質であり、食品等の天
然着色料として最近特に注目を集めているものである。

その中で、β−カロチン（βｃａｒｏｔｅｎｅ）は、代
表的な力ロチノイドであるが、着色料としての利用の他
、動物体内ではビタミンＡの前駆体として利用され、最
近では、ガン予防素祠としての利用も検討されている重
要なものである（たとえば、食品と開発，　２４，　６
１．−６５（１９８９）を参照されたい）。β−カロチ
ンをはじめとしてカロチノイドは緑色植物に広く分布し
ているので、植物組織培養によって、自然環境に支配さ
れない形でカロチノイドを多量生産しようとする試みが
なされている（たとえば、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．、１２、５２５−５３１．　（１９７１．
）を参照されたい）。また、もともとカロチノイドを高
生産するかび、酵母、緑藻等の微生物を検出し、これら
の微生物により力ロチノイドを多量生産しようとする試
みがなされている（たとえば、昭和６３年度口本発酵工
学会大会講演要旨集、ｐ］３９を参照されたい）。しか
し、いずれの場合も、商業生産用途としては生産能力が
低く、β−カロチンの製造において合戊法を凌駕するこ
とができないのが現状である。もし、カロチノイドの生
合成に関与する遺伝子群を取得することができれば、非
常に有用であると思われる。なぜなら、この遺伝子群に
おける適当な遺伝子が多量発現するように再構成したも
のを、適当な宿主、たとえば、もともと力口チノイドを
牛産しているような植物組織培養細胞、かび、酵母等に
導入することにより、カロチノイドを多量に生産するこ
とが可能になるからである。このことが、β−カロチン
の製造においては、合成法を凌駕することを可能にする
かもしれず、また、それ以外の有用なカロチノイドにお
いても、これを多量に生産する道を開くものである。

また、力ロチノイドの生合成に関与する遺伝子群を取得
することは、力ロチノイドを全く産生じていない細胞や
器官でのカロチノイドの合成に道を開くものであり、こ
のことが、生物に新たな価値を与えることにつながるも
のと思われる。たとえば、花ア↑植物において、最近、
遺伝子操作を利用して、自然には存在しない花色を作り
出した例が出始めた（たとえば、Ｎａｔｕｒｅ，　３３
０　、８７７−６７８（１９８７）を参照されたい）。

花の色はアントシアニンや力ロチノイドなどの色素によ
って現われる。

アントシアニンは、赤色〜紫色〜青色の花色の原因であ
り、カロチノイドは、黄色〜橙色〜赤色の花色の原因で
ある。アントシアニンを合或する酵素の遺伝子は解明さ
れてきており、前述の新しい花色を作り出したという或
功例はアントシアニンに関するものである。しかし、花
弁でカロチノイドを合戊できないために濃黄色花を有さ
ない花再植物は多く存在している（たとえば、ペチュニ
ア、セントポーリア、シクラメン、プリムラ・マラコイ
デスなど）。カロチノイドの生合成に関与する遺伝子群
における適当な遺伝了が花弁で発現するように再構成し
たものを、これらの花吉植物に導入することにより、黄
色花を有する花吉柏物の作出が可能になると思われる。

しかし、カロチノイドを合或する酵素やこれをコードす
る遺伝子についての解明はほとんど行われていないのが
現状である。最近になって、ようやく、光合或細菌ロド
バクター・ギヤブスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　
ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）において、ある種のカロチノイ
ドの生合成に関与する遺伝子群の塩基配列が明らかにな
った（Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２１６，
２５４−２６８（１９８９）。しかし、この細菌はノイ
ロスボレン（　ｎｅｕｒｏｓｐｏｒｅｎｅ）を経由して
、閉環することなく、特殊なカロチノイドであるスフェ
ロイデン（ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｎｅ）を合成するので、
リコピン（　Ｉ　ｙｃｏｐｅｎｅ）　，β−カロチンお
よびゼアキサンチン（ｚｅａｘａｎｔｈｊｎ）のような
、一般的な力ロチノイドを合成することはできない。

エルビニア属細菌の黄色系色素またはカロチノイドに関
する先行例として、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　．、１６
８、６０７−６１２（１９８８）　、Ｊ．　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．．　１７０．　４８７５−４６８０（１９８
８）、及び、Ｊ．　ＧＢＩ．　ｌ［ｃｒｏｂｉｏｌ．、
１３０、１６２３−１６３１（１９８４）がある。最初
の文献は、エルビニア・ハービコラ（Ｅｒｗｉｎｊａ　
ｈｅｒｂｉｃｏｌａ　）　Ｅ　ｈ　ｏ１０ＡＴＣＣ３９
３６８より、黄色系色素を合成する遺伝子群を大腸菌に
１２．４キロ塩基対（ｋ　ｂ）の断片としてクローニン
グしたという内容である。なお、１２．４ｋｂの断片の
塩基配列は報告されていない。２番目の文献によりクロ
ーニングした遺伝子群により合成された黄色系色素が力
ロチノイドに属することか、紫外一可視スペクトルの分
析結果より報告されている。最後の文献は、エルビニア
・ウレドボラ（Ｅｒｗ４ｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ）２
０Ｄ３　　ＡＴＣＣ１９３２１に存在する２６０ｋｂの
大プラスミドが脱落すると黄色色素を生産しなくなるこ
とより、黄色色素生産７ に関与する遺伝子がこの大プラスミド上に存在すること
を示唆し、また、紫外一可視吸収スペクトルの結果より
この色素がカロチノイドに属することを報告している。

しかしながら、エルビニア属細菌が産生ずるカロチノイ
ドや中間代謝産物の化学構造、その生合成に関与する酵
素やこれをコードする遺伝子の塩基配列については、全
く知られていないのが現状である。

く要旨〉 本発明は、リコピン、β−カロチン、ゼアキサンチン、
ゼアキサンチン−ジグルコシド等のカロチノイドの合威
に有用なＤＮＡ鎖、すなわちカロチノイド生合成酵素を
コードするＤＮＡ鎖を提供するものである。

すなわち、本発明による力ロチノイドの合成に有用なＤ
ＮＡ鎖は、下記の（１）〜（６）に記載された■〜■の
ＤＮＡ鎖である。

（１）　　プレフィトエンピ口リン酸をフィトエンに転
換する酵素活性を有していてアミノ酸配列が只 実質的に第１図（イ）および（ロ）に示されているＡか
らＢまでのアミノ酸配列であるポリペプチドをコードす
る塩基配列を有するＤＮＡ鎖（ＤＮＡ鎖■）。

（２）　ゼアキサンチンをゼアキサンチン−ジグルコシ
ドに転換する酵素活性を有していてアミノ酸配列が実質
的に第２図（イ）および（口）に示されているＣからＤ
までのアミノ酸配列であるポリペプチドをコードする塩
基配列を有するＤＮＡ鎖（ＤＮＡ鎖■）。

（３）　リコピンをβカロチンに転換する酵素活性を有
していてアミノ酸配列が実質的に第３図（イ）および（
口）に示されているＥからＦまでのアミノ酸配列である
ポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖（
ＤＮＡ鎖■）。

（４）　フィトエンをリコピンに転換する酵素活性を有
していてアミノ酸配列が実質的に第４図（イ）、（ロ）
および（ハ）に示されているＧからＨまでのアミノ酸配
列であるポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤ
ＮＡ鎖（ＤＮＡ鎖■）。

（５）　ゲラニルゲラニルピロリン酸をプレフィトエン
ピロリン酸に転換する酵素活性を有していてアミノ酸配
列が実質的に第５図（イ）および（口）に示されている
ＩからＪまでのアミノ酸配列であるポリペプチドをコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡ鎖（ＤＮＡ鎖■）。

（６）　β−カロチンをゼアキサンチンに転換する酵素
活性を有していてアミノ酸配列が実質的に第６図に示さ
れているＫからＬまでのアミノ酸配列であるポリペプチ
ドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖（ＤＮλ鎖■
）。

く効果〉 本発明によりリコピン、β−カロチン、ゼアキサンチン
、ゼアキサンチン−ジグルコシド等のカロチノイドの合
成に有用な遺伝子群（カロチノイド生合成酵素をコード
する遺伝子群）を取得したことは、この遺伝子の多量発
現を可能な状態にしたプラスミドを作製し、これにより
形質転換された適当な植物組織培養細胞または微生物等
を利用すること等によって、有用な力ロチノイドを多量
に製造することを可能にするものである。また、本発明
によりリコピン、β−カロチン、セアギサンチン、ゼア
キサンチン−ジグルコシド等の力ロチノイドの合成に有
用な遺伝子群を取得したことは、この遺伝子の目的とす
る細胞や器官での発現を可能な状態にしたプラスミドを
作製し、これにより適当な宿主を形質転換することによ
り、カロチノイトを全く産生じていない細胞や器官での
力ロチノイドの合成に道を開くものである。

〔発明の具体的説明〕

本発明によるＤＮＡ鎖は、前記■〜■のＤＮＡ鎖であり
、カロチノイドの牛合成反応に関与する各酵素のポリペ
ブチト、具体的には、例えばエルビ０ア）ウレドボラ（
Ｅｒｗｉｎｉａ　ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）２０Ｄ３ＡＴＣ
Ｃ１９３２１に於けるカロチノイドの生含成反応に関与
する各酵素のポリペプチド、をコードする遺伝子である
。

これら■〜■のＤＮＡ鎖のうちの複数のＡ■ｌ合せによ
るＤＮＡ鎖を含む種々の遺伝子群は、微生物、植物等で
発現させて、それそれ微生物、抗物等にリコピン、β−
カロチン、ゼアキサンチン、ゼアキサンチンージグルコ
シＦ等の力ロチノイドの生合成能を付与することができ
る。この遺伝子群を構或する各ＤＮＡ鎖は、一つのＤＮ
Ａ鎖−Ｌに存７ｆしていてもよいし、互いに独立して別
々のＤＮＡ鎖として存在してもよいし、あるいは必便が
あれば一つのＤＮＡ鎖上に複数のＤＮＡ鎖が存在するも
のと単独のＤＮＡ鎖が独立して存在するものとの紹合せ
の状態で存在しているものでもよい。

上記遺伝子群は、力ロチノイドの生戊反応に関与する複
数の酵素のポリペプチドをコードするものであり、これ
らを適当なベクターに組入れて組換ＤＮＡ鎖を作製し、
この組換ＤＮＡ鎖を適当な宿主に導入して形質転換体を
作製し、この形質転換体を培養することにより、主とし
て形質転換体中にカロチノイドの生戊反応に関与する複
数の酵素が産生されると共に、これらの酵素によって形
質転換体中でカロチノイドか生合成される。

本発明によるＤＮＡ鎖の一例である第７図（イ）］１ 〜（ト）のＤＮＡ鎖は、エルビニア・ウレドホラ２０Ｄ
３　　ＡＴＣＣ１９Ｂ２１から取得したものであり、エ
ルビニア・ハービコラ　Ｅ　ｈ　ｏ　１　０ＡＴＣＣ３
９３６８の黄色系色素合戊遺伝子群を含むＤＮＡ鎖（前
記先行技術参照）と、ＤＮＡＤＮＡハイブリダイセーシ
ョン法による相同性を示さない（後記丈験例参照）。

〈各酵素のポリペブチドをコードするＤＮＡ鎖〉本発明
のＤＮＡ鎖は、■〜■のいずれかのＤＮＡ鎖であり、各
ＤＮＡ鎖は、アミノ酸配列が実質的に第１図〜第６図に
おける前記したような特定範囲（たとえば第１図ではＡ
−Ｂ）のアミノ酸配列であるポリベブチドをコードする
塩基配列を有するもの、である。ここてｒＤＮＡ鎖」と
は、ある長さを有するポリデオキシリポ核酸鎖を意味す
るものである。そして、本発明では、この「ＤＮＡ鎖」
は、それがコードするポリペブチドのアミノ酸配列によ
って特定されているところ、このポリペブチドは上記の
ように有限の長さのものであるから、このＤＮＡ鎖も有
限の長さである。

］２ しかし、このＤＮＡ鎖は、各酵素をコードする遺伝子を
含んでいてこのポリペブチドの生物工学的産生を行わせ
るに有用なものであるところ、この有限の長さのＤＮＡ
鎖のみによってこのような牛物工学的産生が行えるので
なく、その５′　一側上流および（または）３′　一側
下流に適当な長さのＤＮＡ鎖か結合した状態でこのポリ
ペブチドの生物工学的産生が可能となる訳である。従っ
て、本発明でｒＤＮＡ鎖」というときは、この特定の長
さのもの（第１図の幻応アミノ酸配列でいえば、Ａ−Ｂ
の長さ）の外にこの特定の長さのＤＮＡ鎖を構成員とす
る鎖状または環状ＤＮＡ鎖の形態にあるものを包含する
ものとする。

本発明による各ＤＮＡ鎖の存在形態のうち代表的なもの
の一つは、この各ＤＮＡ鎖を構戊員の一部とするプラス
ミドの形態ならびにプラスミドとして宿主、たとえば大
腸菌、中に存７ｌニする形態、である。本発明による各
ＤＮＡ鎖の好ましい存在形態の一つとしてのプラスミド
は、パッセンジャーないし外来遺伝子としての本発明の
ＤＮＡ鎖と、宿主中で安定に存在して複製可能なプラス
ミドベクターとプロモーター（原核生物の場合はリポソ
ーム結合部位を含む）とを一体に結合させたものである
。プラスミドベクターおよびプロモー夕としては公知の
ものを適宜組み合わせて用いることができる。

＜ＤＮＡ鎖がコードするポリペプチド〉本発明によるＤ
ＮＡ鎖がコードするポリペプチドは、アミノ酸配列が実
質的に第１〜６図における前記したような特定範囲（た
とえば第１図ではＡ−Ｂ）のアミノ酸配列を有するもの
である。本発明においては、このＤＮＡ鎖■〜■によっ
てコードされる６種のポリペプチド（すなわちカロチノ
イド生成反応に関与する６種の酵素）は、基質転換物質
の関係において前述のような各酵素の活性を有する限り
アミノ酸のいくつかについて欠失、置換、付加などの変
化があってもよい。このことは、「アミノ酸配列が実質
的に・・・」ということと対応している。たとえば、各
酵素の第１番目のアミノ酸（Ｎｅｔ）が欠失しているも
のなともこの１　ら アミノ酸配列の変化によるポリペプチドないしは酵素に
包含される。

本発明での典型的な各酵素活性を有するポリペプチドは
、第１〜６図の前記特定範囲のものであって、従来これ
らのアミノ酸配列は知られていなかったものである。

＜ＤＮＡ鎖の塩基配列〉 各酵素をコードするＤＮＡ鎖は、第１〜６図の前記特定
範囲の塩基配列を持つものまたはその縮重異性体並びに
上記のような各酵素のアミノ酸配列の変化に対応する塩
基配列を持つものまたはその縮重異性体、である。ここ
で「縮重異性体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なっ
ている同一のポリペプチドをコードすることのできるＤ
ＮＡ鎖を意味する。本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい具
体例は、３′　一末端に接して停止コドン（例えばＴＡ
Ａ）を少なくとも１個を持つものである。さらに、本発
明の５′　一側上流および（または）３′　一側下流に
は、非翻訳領域としてのＤＮＡ鎖（３′　　一側下流の
最初の部分は、ＴＡＡのような１　６ 停止コドンであることがふつうである）がある長さで続
いていてもよい。

くカロチノイドの合成に用いられる遺伝子群〉カロチノ
イドの合成に用いられる遺伝子群は、前記■〜■のＤＮ
Ａ鎖のうちの複数の組合せによるものであり、この代表
例が以下の（１）〜（４）に説明されている。各遺伝子
群は複数の各酵素のポリペプチドをコードし、これらの
酵素はカロチノイドの生成反応に関与して基質となる化
合物からカロチノイド生成させる働きを有している。

（１）　リコピンの合或に用いられる遺伝子群赤色を呈
するカロチノイドであるリコピン（Ｉ　ｙｅｏｐｅｎｅ
）の合成に用いられる遺伝子群は、上記の■、■および
■のＤＮＡ鎖を含むＤＮＡ鎖であり、この遺伝子群とし
ては、それぞれのＤＮＡ鎖が一つのＤＮＡ鎖上に存在す
るもの、各ＤＮＡ鎖が互いに別々のＤＮＡ鎖として存在
するもの、必要に応じて前記したような両者の組合せに
よって構成されるもの、がある。

一つのＤＮＡ鎖上に複数のＤＮＡ鎖が存在する場合には
、上記の■、■および■のＤＮＡ鎖の並ぶ順序および方
向は、その遺伝情報が発現可能な状態、すなわち、宿主
内で各々の遺伝子が適切に転写、翻訳される状態、であ
りさえすれば、どのような順序、どのような方向であっ
ても構わない。

大腸菌でのリコピンの生合戊経路は次のように説明され
る。すなわち、もともと大腸菌内に存在している基質で
あるゲラニルゲラニルビ口リン酸（ｇｅｒａｎｙｌｇｅ
ｒａｎｙｌ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、■のＤ
ＮＡ鎖がコードする酵素によりプレフィトエンピロリン
酸（ｐｒｅｐｈｙｔｏｅｎｅ　．ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ　）に転換され、これは、■のＤＮＡ鎖がコード
する酵素によりフィトエン（　ｐｈｙｔｏｅｎｅ）に転
換され、さらに、フィトエンは、■のＤＮＡ鎖がコード
する酵素により、リコピンに転換されるのである（第８
図参照）。

リコピンは赤色を呈するカロチン、スイカやトマトの実
に多量に存在する赤色色素であり、食用として全く安全
なものである。なお、後記の実験例において本発明によ
るＤＮＡ鎖により合威されたリコピンは、これらの植物
に存在するリコピンと、立体構造的に同一のものであっ
た。

本発明における遺伝子群の代表的な存在形態の一つは、
停止コドンを有する各ＤＮＡ鎖を構成員として含むプラ
スミドの形態ならびにプラスミドと１７で宿主、たとえ
ば大腸曲、中にイｆ在ずる形態、である。本発明による
遺伝子群の好ましい存在形態の一つとしてのプラスミド
は、パッセンジャーないし外来遺伝子と【７ての遺伝子
群と、宿主由で安定に存在して複製可能なプラスミドベ
クターとプロモーター（原核生物の場合はリポソーム結
合部位を含む）とを一体に粘含させたものである。

プロモーターとしては、例えば大腸菌、ザイモモナス属
細菌のような原核生物の場合には、各ＤＮＡ鎖に共通ず
るものを使用してもよい（７、各ＤＮＡ鎖にそれそれ使
用するようにしてもよい。

また、例えば酵母、植物のような真核生物の場合には、
各ＤＮＡ鎖にそれぞれプロモーターを使用するのが好ま
しい。

このＤＮＡ鎖の好ましい存在形態の一つは、■〜■のＤ
ＮＡ鎖の説明中で前記した通りである。

（２）　β−カロチンの合成に用いられる遺伝子群 黄色〜橙色を呈する力ロチノイドであるβ−カロチン（
β−ｃａｒｏｔｅｎｅ）の合成に用いられる遺伝子群は
、上記の■、■、■および■のＤＮＡ鎖を含むＤＮＡ鎖
である。すなわち、リコピンの合成に用いられるＤＮＡ
鎖である■、■および■のＤＮＡ鎖を含むＤＮＡ鎖に、
■のＤＮＡ鎖を加えることによって、β−カロチンの合
成に用いられるＤＮＡ鎖となる。この遺伝子群としては
、それぞれのＤＮＡ鎖が、一つのＤＮＡ鎖上に存在する
もの、各ＤＮＡ鎖が互いに別々のＤＮＡ鎖どして存在す
るもの、必要に応じて前記したような両者の絹合せによ
って構成されるもの、がある。

一つのＤＮＡ鎖上に複数のＤＮＡ鎖が存在する場合には
、上記の■、■、■および■のＤＮＡ鎖の並ぶ順序およ
び方向は、その遺伝情報か発現可能な状態、すなわち、
宿主内で各々遺伝子が適切に転写、翻訳される状態であ
りさえすれば、どの１９ ような順序、どのような方向であっても構わない。

大腸菌でのβ−カロチンの生合成経路は次のように説明
される。すなわち、もともと大腸菌内に存在している基
質であるゲラニルゲラニルピ口リン酸は、■のＤＮＡ鎖
がコードする酵素によりプレフィトエンピ口リン酸に転
換され、これは、■のＤＮＡ鎖かコードする酵素により
フィトエン（　ｐｈｙｔｏｃｎｅ）に転換され、さらに
フィトエンは、■のＤＮＡ鎖かコードする酵素によりリ
コピンに転換され、さらに、リコピンは、■の ＤＮＡ鎖かコードする酵素によりβ−カロチンに転換さ
れるのである（第８図参照）。

β−カロチンは黄色〜橙色を呈する代表的カロチンで、
ニンジンの根や植物の緑葉に多量に存在する橙色色素で
あり、食用として全く安全なものである。β−カロチン
の有用性は、３，発明の詳細な説明〔発明の背景〕く先
行技術〉の中で述べた通りである。なお、後記の丈験例
において本発明によるＤＮＡ鎖により合或されたβ−カ
ロチンは、ニンジンの根や値物の緑巣に広＜７１在する
β２Ｕ カロチンと、立体構造的に同一のものであった。

この遺伝子群および個々のＤＮＡ鎖の代表的な存在形態
の一つは（］）で上記した通りである。

（３）　セアキサンチンの合Ｊ戊に用いられる遺伝子群 黄色〜橙色を呈するカロチノイドであるゼアキサンチン
（ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ）の合成に用いられるＤＮＡ鎖
は、上記の■、■、■、■および■のＤＮＡ鎖を含むＤ
ＮＡ鎖である。すなわち、βカロチンの合成に用いられ
るＤＮＡ鎖である■、■、■および■のＤＮＡ鎖を含む
ＤＮＡ鎖に、■のＤＮＡ鎖を加えることによって、ゼア
キザンチンの合成に用いられるＤＮＡ鎖となる。この遺
伝子群としては、それぞれのＤ　Ｎ　Ａ　鎖が一つのＤ
ＮＡ鎖上に存在するもの、各ＤＮＡ鎖か互いに別々のＤ
ＮＡ鎖としてイｆ在ずるもの、必要に応じて前記したよ
うな両者の組合せによって描成されるもの、がある。

一つのＤＮＡ鎖上に複数のＤＮＡ鎖が存在する場合には
、上記の■、■、■、■および■のＤＮＡ鎖の並ぶ順序
および方向は、その遺伝情報が発現可能な状態、すなわ
ち、宿主内で各々の遺伝子が適切に転写、翻訳される状
態でありさえすれば、どのような順序、とのような方向
であっても構わない。

大腸菌でのゼアキサンチンの生合或経路は次のように説
明される。すなわち、もともと大腸菌内に存在している
基質であるゲラニルゲラニルピ口リン酸は、■のＤＮＡ
鎖かコードする酵素によりプレフィトエンピロリン酸に
転換され、これは、■のＤＮＡ鎖がコードする酵素によ
りフィトエンに転換され、さらにフィトエンは、■のＤ
ＮＡ鎖がコードする酵素によりリコピンに転換され、さ
らに、リコピンは、■のＤＮＡ鎖がコードする酵素によ
りβ−カロチンに転換され、さらに、βカロチンは、■
のＤＮＡ鎖かコードする酵素によりゼアキサンチンに転
換されるのである（第８図参照）。

ゼアキサンチンは黄色〜橙色を呈するキサントフィル（
ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌ　Ｉ）で、トウモロコシの種子に
２３ 存在する黄色色素であり、食用として全く安全なもので
ある。ゼアキサンチンは、ニワトリ、錦鯉等の飼料中に
含まれており、これらの着色のための色素源として重要
なものである。なお、後記の実験例において本発明によ
るＤＮＡ鎖により合成されたゼアキザンチンは、上記ゼ
アキザンチンと、立体構造的に同一のものであった。

この遺伝子群および個々のＤＮＡ鎖の代表的な存在形態
の一つは（１）で上記した通りである。

（４）　ゼアキサンチン−ジグルコシドの合戊に用いら
れる遺伝子群 黄色〜橙色を呈するカロチノイドであるゼアキサンチン
−ジグルコシド （ｚｅａｘａｎｔｈｊｎ−ｄｊｇｌｕｃｏｓｊｄｅ）の
合或に用いられるＤＮＡ鎖は、上記の■から■までのＤ
ＮＡ鎖を含むＤＮＡ鎖である。すなわち、ゼアキサンチ
ンの合或に用いられるＤＮＡ鎖である■、■、■、■お
よび■のＤＮＡ鎖を含むＤＮＡ鎖に、■のＤＮＡ鎖を加
えることによって、ゼアキサンチン−ジグルコシドの合
戊に用いられるＤＮＡ鎖とな２４ る。この遺伝子群としては、それそれのＤＮＡ鎖が一つ
のＤＮＡ鎖上に存在するもの、各ＤＮＡ鎖が互いに別々
のＤＮＡ鎖として存在するもの、必要に応じて前記した
ような両者の組合せによって構成されるもの、がある。

一つのＤＮＡ鎖上に複数のＤＮＡ鎖が存在する場合には
、上記の■から■までのＤＮＡ鎖の並ぶ順序および方向
は、その遺伝情報が発現可能な状態、すなわち、宿主内
で各々の遺伝子が適切に転写、翻訳される状態でありさ
えすれば、どのような順序、どのような方向であっても
構わない。

この遺伝子群および個々のＤＮＡ鎖の代表的な存在形態
の一つは（１）で上記した通りである。

大腸菌でのゼアキサンチン−ジグルコシドの生合成経路
は次のように説明される。すなわち、もともと大腸菌内
に存在している基質であるゲラニルゲラニルピロリン酸
は、■のＤＮＡ鎖がコードする酵素によりプレフィトエ
ンピロリン酸に転換され、これは、■のＤＮＡ鎖かコー
ドする酵素によりフィトエンに転換され、さらにフィ！
・エンは、■のＤＮＡ鎖がコードする酵素によりリコピ
ンに転換され、さらに、リコピンは、■のＤＮＡ鎖がコ
ードする酵素によりβ−カロチンに転換され、さらに、
β−カロチンは、■のＤＮＡ鎖がコードする酵素により
ゼアキサンチンに転換され、さらに、ゼアキサンチンは
、■のＤＮＡ鎖がコードする酵素によりゼアキサンチン
−ジグルコシドに転換されるのである（第８図参照）。

ゼアキサンチン−ジグルコシドは、黄色〜橙色を呈する
、水溶性の高いカロチノイド配糖体で、室温の水に十分
量溶け、鮮明な黄色を与える色素である。一般にカロチ
ノイド色素は疎水性であるため、それが食品等の天然着
色料として使用する際の制約となっている。したがって
、ゼアキサンチン−ジグルコシドはカロチノイド色素の
この欠点を克服するものである。また、ゼアキサンチン
ジグルコシドは、食用植物サフラン（ｓａｆＴｒｏｎ，
Ｃｒｏｃｃｕｓ　ｓａｔｉｖｕｓ　）から単離されてお
り（Ｐｕｒｅ　＆Ａｐｐｌ．　Ｃｈｅｍ．＋　４７，１
２１−１２８（１９７ｆｉ））、食用として安全性が確
認されていると考えられる。したがって、ゼアキザンチ
ンージグルコシドは食品等の黄色天然着色料として有望
なものである。なお、ゼアキサンチンージグルコンドの
微生物から単離の報告は従来は無かったものである。

なお、本発明によるＤＮＡ鎖によって、リコピン、β−
カロチン、ゼアキザンチンおよび、ゼアキサンチン−ジ
グルコシドなどの力ロチノイド色素を産生させる場合、
宿主が大腸曲である場合には、それそれ、−Ｌ記の■、
■および■のＤＮＡ鎖、■、■、■および■のＤＮＡ鎖
、■、■、■、■および■のＤＮＡ鎖、および、■から
■までのＤＮＡ鎖が必要であるか、他の宿主、特にカロ
チノーｒドを産牛できる牛物、を利用する場合には、そ
れらの宿主内に生答或におけるさらに下流の力ロチノイ
ド前駆体まで含まれている可能性か高いので、」二記の
■、■および■のＤＮＡ鎖（リコピン産生の場合）、■
、■、■および■のＤＮＡ鎖（β−カロチン庁生の場合
）、■、■、■、■および■のＤＮＡ鎖（セアキザンチ
ン産生の場合）、あるいは、■から■まてのＤＮＡ鎖（
セアキサンチンージグルコシド産生の場合）すべてか必
要であるとは限らない。

すなわち、この場合は宿主内に存在する最もド流のカロ
チノイド前駆体から目的の力口チノイド色素の生成反応
に関−！ｊするＤＮＡ鎖のみ（１つまたは複数）の使用
でもよいことになり、従って、たとえばフィ１・エンが
すでに存で「シている宿主に口的のカロチノイド色素と
してリコピンを庁生させる場合には、本発明ＤＮＡ鎖■
、■、■のうちのＤＮＡ鎖■のみの使用でもよいという
ことになる。

なお、本発明ＤＮＡ鎖■のみを使用してゲラニルゲラニ
ルピロリン酸からプレフィトエンピロリン酸を、また、
本発明ＤＮＡ鎖■および■を使用してもしくは宿主中に
プレフィトエンピ口リン酸が存在する場合にはＤＮＡ鎖
■のみを使用してフィ１・エンを、目的の力ロチノイド
色素関連化合物として宿主に産生させることもできる。

＜ＤＮＡ鎖の取得〉 上記の各酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有
する■〜■のＤＮＡ鎖を取得する一つの手段は、核酸合
成の方法に従ってその鎖長の少なくとも一部を化学合戊
することであるが、結合アミノ酸か多数であるというこ
とを考えれば、この化学合成法よりもエルビニア・ウレ
トポラ２０Ｄ３　　ＡＴＣＣ１．９３２１のトータルＤ
ＮＡを適当な制限酵素で消化したものを用いて大腸菌で
ライブラリーを作製し、このライブラリーから遺伝子工
学の分野で慣用されている方法、例えば適当なプローブ
によるハイブリダイセイション法、によりこれを取得す
る方が好ましいといえる。

これにより各ＤＮＡ鎖あるいはこれらのすべてを含むＤ
ＮＡ鎖か得られる。

く形質転換体〉 」二記のようにして取得されるＤＮＡ鎖を用いて、ＤＮ
Ａ鎖■〜■のうちの複数の組合わせによる前記遺伝子Ｐ
Ｊを構成することができる。このようにして得られるＤ
ＮＡ鎖は力ロチノイドの生戊反応に関与する酵素蛋白を
つくるための遺伝情報を含んでいるので、これを生物工
学的手法によって適当な宿主に導入して形質転換体をつ
くり、この形質転換体に酵素蛋白、ひいては力ロチノイ
ド色素ないしは力ロチノイド色素関連化合物をつくらせ
ることができる。

（１）宿主 適当な宿主・ベクター系か存在する限り、植物および各
種の微生物が上記ＤＮＡ鎖を構戊員として含むベクター
により形質転換の対象となりうるが、少なくとも宿主に
おいて本発明ＤＮＡ鎖を用いたカロチノイド合成の出発
となる酵素の基質化合物であるゲラニルゲラニルビ口リ
ン酸あるいはそれより下流の化合物が存在Ｉ７ているも
のである必要がある。

ゲラニルゲラニルピ口リン酸は、カロチノイドだけでな
くステロール（ｓｔｃｒｏｌ）やテルペン（　ｔｅｒｐ
ｅｎｅ）の生合成の初期段階における共通の酵素である
ジメチルアリルトランスフェラーゼ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ
ａｌ　Ｉｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）により合戊され
ることが知られている（Ｊ．　Ｂｊｏｃｈｃｍ．，　７
２．　１１（Ｈ１．１（１Ｂ（１９７２））。したがっ
て、カロチノイドを合戊できない細胞でも、ステロール
またはテルペンを合成することができれば、細胞にゲラ
ニルゲラニルビ口リン酸が存在しているはずである。ス
テロールとテルペンの両方を有さない細胞はほとんど存
在しないと考えられる。

したがって、理論的には、適当な宿主・ベクター系が存
在する限り、ほとんどすべての宿主において、本発明Ｄ
ＮＡ鎖を用いたカロチノイド合成が可能であると考えら
れる。

宿主・ベクター系が存在するものは、植物では、（２）
形質転換 前記のように本発明ＤＮＡ鎖の持つ遺伝子情報が微生物
中で発現したということは本発明によってはじめて確認
されたことであるが、形質転換体の作製（およびそれに
よる酵素、ひいてはカロチ３１ ノイド色素ないしはカロチノイド色素関連化合物の産生
）のための手順ないし方法そのものは、分子生物学、生
物工学ないし遺伝子工学の分野において慣用されている
ものでありうるので、本発明においても下記したところ
以外のものについてはこれら慣用技術に準じて実施すれ
ばよい。

宿主中で本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を発現させるためには
、まずその宿主中に導入するためのベクター中にこの遺
伝子をつなぎかえる必要がある。

この際用いられるベクターは、植物の（タバコ、ペチュ
ニア）に対してはｐＢＩ１２１など、大腸菌に対しては
ｐＵｃ１９、ｐＡＣＹＣ１８４など、ザイモモナス属細
菌に対してはｐＺＡ２２　（特開昭６２−２２８２７８
号公報参照）など、酵母に対してはＹＥｐｌ３など種々
知られているものすべてが用いられる。

一方、本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を宿主で発現させるため
には、そのＤ　Ｎ　Ａ　７ｉ−ｍ　Ｒ　Ｎ　Ａへ転写さ
せる必要がある。そのためには、転写のためのシグナル
であるプロモーターを本発明ＤＮＡ鎖の５′３２ 側上流に組込めばよい。このプロモーターについてはＣ
ａＭＶ３５Ｓ，ＮＯＳ，ＴＲＩ’、ＴＲ２’　　（以上
、植物用）、１ａＣ１ＴＣｒＣＡＴ，ｔ　ｒｐ　（以上
、大腸菌用）、ＴＣｒＣＡＴ　（以上、ザイモモナス属
細菌用）、ＡＤＨ１、ＧＡＬ７、ＰＧＫ，ＴＲＰＩ　（
以上、酵母用）等種々知られており、本発明でもこれら
のいずれをも利用することができる。

また、原核生物の場合、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させる段
階て蛋白合戊の場てあるリポソームが翻訳開始部位の先
端に結合するために必要な配列、すなわちボソーム結合
部位（大腸菌ではＳＤ配列と呼ばれる）を、蛋白合成の
開始信号であるＡＴＧの数塩基上流につけておく必要が
ある。

さて、一般的には、上記酵素蛋白を作ろうとすれば、上
記のような操作が必要であるが、酵素蛋白をつくる場合
に各酵素活性さえ保持されれば、第１〜６図の特定範囲
に示されているポリペプチド（たとえば第１図に示され
ているＡ−Ｂのポリペプチド）に１個以上のアミノ酸を
挿入または付加するか、あるいは１個以上のアミノ酸を
欠落させるかまたは別のアミノ酸で置換してもよいこと
は前記したところである。

このようにしてつくったプラスミドによる宿主の形質転
換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されてい
る合目的的な任意の方法によって行うことができる。そ
の一般的な事項については適当な成書または総説、たと
えば微生物の形質転換であればＴ．　Ｍａｎ４ａｔ４ｓ
，　Ｅ．Ｆ．　Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ：　ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＪ　，　　Ｃｏｌｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
，（１９８２）、を参照することができる。

形質転換体は、本発明ＤＮＡ鎖によって導入された遺伝
情報による新しい形質（すなわちカロチノイド生成反応
に関与する酵素の産生及びその酵素によるカロチノイド
等の合成）および使用ベクター由来の形質ならびに場合
によって生じているかも知れない遺伝子組換時の使用ベ
クターからの一部の遺伝情報の欠落による対応遺伝子の
欠落を除けば、そのジェノタイプないしフェノタイプあ
るいは菌学的性質において使用宿主と同じである。

本発明による形質転換体の一例Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉＪＭ王０９（ｐｃＡＲ］．）は、微工研条寄
第２３７７月（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２３７７）として寄
託されている。

く遺伝情報の発現／カ口チノイドの牛産〉上記のように
して得られる形質転換体のクローンは、これを培養すれ
ば主として形質転換体中にカロチノイド生成反応に関与
する酵素を産生ずると共に、これらの酵素によって種々
のカロチノイドないしはカロチノイド色素関連化合物が
合成される。

形質転換体の培養ないし培養条件は、使用宿主に対する
それと本質的には疫らない。

力ロチノイドの回収は、例えば後記実験例３および４に
示される方法によって行なうことが可能である。

また、本発明ＤＮＡ鎖によってコードされる酵素蛋白は
、例えば大腸菌を形質転換した場合には主として菌体内
に産生されるか、これらは合口的的な方法により回収す
ることがｉ’ｉＪ能である。

く丈験例〉 以下の丈験例において使用した菌株は、すべて、ＡＴＣ
Ｃ，その他の寄託機関のカタログに掲載されていて、自
由に入手可能なものである。

実験例］：　黄色色素の牛合成に関与する遺伝子群（以
下、黄色色素合成遺伝子群）のクローニング （１）ｌ−一タルＤＮＡの調製 トータルＤＮＡは、エルビニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉ
ｎｉａ　ｕｒｅｄｏｖｏｒａ　）　２　０　Ｄ　３　　
Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ１９３２１を１．．　Ｏ　Ｏミリリッｌ
・ル（ｍ１）のＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イ
ーストエキス１・ラクト、１％Ｎａ　Ｃ　１）で定常期
前期まで増殖させた菌体から調製した。集菌の１−時間
前にベニンリンＧ（明治製菓製）を５０ユニット／ｍｌ
になるように加えた。集菌後、ＴＥＳｉ衝Ｇ（２０ｍＭ
トリス、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ，０．１ＭＮａＣ１，ｐ
Ｈ８）で洗浄し、６８℃で１５分間熱処理した後、５ｍ
ｇ／ｍｌリゾチーム（生化学工業３５ ？）と１．ＯＯμｇ／ｍｌ　　ＲＮａｓｅ　　Ａ（シグ
マ社製）を含むＩ７ｉｋ（５０ｍＭグルコース、２　５
　ｍ　Ｍ　ｌ＝リス、１．０ｍＭ　　ＥＤＴＡＳ　ｐＨ
８）に懸濁した。３７°Ｃで３０分から１■、Ｙ間イン
キユベートした後、２５０μｇ／ｍｌになるようにブロ
ナーゼＥ（科研製薬製）を加え、３７℃で１０分間イン
キユベートした。さらに、最終濃度が１％になるように
サルコシール（Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｊｎｅ
・Ｎａ）　　（半井化学製）を加え、よく混合した後、
３７°Ｃで数時間インキュベ−１−　Ｌた。さらに、フ
ェノール／クロロホルム抽出を数回行った後、２倍量の
エタノールをゆっくりと加えながら、析出してきたトー
タルＤＮＡをガラス棒に巻き｛＝Ｊけ、７０％エタノー
ルでリンスした後、２ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　　
ｔ■リス、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ，ｐＨ８）に溶解して、
トータルＤＮＡ調製液とした。

（２）大腸閑コスミドライブラリーの作製および黄色を
呈する大腸菌形質転換株の取得 トータルＤＮＡ調製波５０μ１に対して、１ユ３６ ニットの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用い、３７℃、３０分
間インキユベートした後、６８℃、１０分間の処理で制
限酵素を失活させた。この条件で４０キロ塩基対（ｋ　
ｂ）イ」近に多くのＳ　ａ　ｕ　３Ａ１部分分解断片が
得られた。この反応液のエタノール沈澱を行った後、こ
の半量を用いて、コスミドｐＪＢ８をＢａｍＨＩ消化後
アルカリフォスファターゼ処理したもの２．”Ｈｔｇ，
および、ｐＪＢ８をＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化後右アー
ム（小さい方の断片）をゲルから回収したちの０．　　
２μｇと混ぜ、全量４０μ１で１２℃、２日間、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼにより連結反応を行った。

なお、コスミドｐＪＢ８は、以前にアマーシャム社から
購入したものである。また、制限酵素および遺伝子操作
に用いる酵素類は、ベーリンガー・マンハイム社、宝酒
造■または和光純薬玉業■から購入した。この連結反応
を行ったＤＮＡを用い、ギガパック・ゴールド（Ｇｉｇ
ａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ　）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製
、フナコシ販売）によりインビトロ・パッケージングを
行い、コスミド・ライブラリーを作るに十分量のファー
ジ粒子を得た。このファージ粒子を大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｊａ　ｃｏｌ　ｊ）ＤＨＩ．（ＡＴＣＣ３３８
４９）に感染させた後、１プレート当り数百コロニーに
なるように希釈し、ＬＢプレートにプレーティングし、
３７°Ｃで１晩培養後、さらに３０℃で６時間以上イン
キユベートした。その結果、このコスミド・ライブラリ
ーから約１１００株に１株の割合で、黄色を呈する大腸
菌形質転換株が出現した。これらの黄色を呈する大腸菌
形質転換株には、ｐＪＢ８に３３から４７ｋｂのＳａｕ
３ＡＩ部分分解断片が挿入されたプラスミドが含まれて
いた。

（３）黄色色素合成遺伝子群を含む断片の縮小化黄色色
素合成遺伝子群は、ｐＪＢ８に３３から４７ｋｂのＳａ
ｕ３Ａ１部分分解断片として挿入されていたので、この
中の１つのものを用い、Ｓａｕ３ＡＩによりさらに部分
分解し、大腸菌ベクターｐＵｃ１９　（宝酒造より購入
）のＢａｍＨＩ部位に連結し、大腸菌ＪＭ１０９　（宝
酒造製）を形質転換することによって、黄色色素合戊遺
伝３９ 子群を含む断片の縮小化（ロー力ライゼーション）を試
みた。アンピシリンを含むＬＢプレートに出現した黄色
を呈する大腸菌形質転換株５０株からプラスミドＤＮＡ
を調製し、分析した結果、その中で最も小さな挿入断片
を有するものは８．２ｋｂであった。このプラスミドを
ｐＣＡＲ１と名づけ、このプラスミドを有する大腸菌Ｊ
Ｍ１０９をＥｓｃｈｅｒｊｃｈｉａｃｏｌｉ　　ＪＭ１
０９（ｐｃＡＲ１）と名づけた。この株は、エルビニア
・ウレドボラと同じ黄色色素を産生じた。この８．２ｋ
ｂの断片のｌａｃプロモーター側の末端近くにＫｐｎＩ
部位が、反対側の末端近くにＨｉｎｄｍ部位が存在した
ので、ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩ［Ｉ　（Ｈｉｎｄ■は部分
分解、この８．２ｋｂ断片にはＨｉｎｄｕ部位が２カ所
存在した。）で二重消化後、この連結し（このハイブリ
ッドプラスミドをｐ　ＣＡＲ１５と名づけた。）、大腸
菌ＪＭ１０９を形質転換したところ、この大腸菌形質転
換株は黄色を呈４０ し、エルビニア・ウレドボラと同し黄色色素を産生じた
。したがって、黄色色素合戊に必要な遺伝子群は、この
Ｋｐｎ　Ｉ−Ｈｉｎｄｍ断片（６．９ｋｂ）に存在する
ことが明らかとなった。すなわち、黄色色素合成遺伝子
群は６．９ｋｂ断片まで縮小することができた。

実験例２：黄色色素合成遺伝子群の解析（１）黄色色素
合或遺伝子群の塩基配列決定黄色色素合戊遺伝子群を含
むＫｐｎＩ Ｈｉｎｄ■　６．９ｋｂ断片の全塩基配列を、キロシー
クエンス用デレーションキット（宝酒造製）を用いたキ
ロシークエンス法およびＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．　Ｓｃｊ．　ＵＳＡ，　７４．　５４６３−５４６
７（１９７７）に基づいたダイデオキシ法により決定し
た。その結果、この黄色色素合成遺伝子群を含む断片（
ＤＮＡ鎖）は、６９１８塩基対（ｂ　ｐ）からなり、Ｇ
Ｃ含量は５４％であることが明らかとなった。この全塩
基配列を第７図（イ）〜（ト）に示した。Ｋｐｎ１部位
を塩基番号１として示されている。

（２）黄色色素合戊遺伝子群の確定 キロシークエンス用デレーションキットを用いて、黄色
色素合成遺伝群を含む６９１８ｂｐの断片（ＤＮＡ鎖）
（第７図）のＨｉｎｄＩ［［側（第７図右末端側）を欠
失させた。Ｈｉｎｄｍ側から６５０４ｂｐまで欠失させ
た断片、すなわち、塩基番号１から６５０３までの断片
をＰＵＣ１９に挿入したハイブリッドプラスミド（ｐＣ
ＡＲ２５と名づけられた）を有する大腸菌ＪＭ１０９　
（以後、大腸菌（ｐＣＡＲ２５）と表示する。）は、黄
色を呈し、エルビニア・ウレドボラと同じ黄色色素を産
生じた。したがって、黄色色素の合成には、第７図にお
ける塩基番号６５０４から６９１８の領域は不要である
と考えられた。この黄色色素合成遺伝子群を含む６　９
　１．　８　ｂ　ｐのＤＮＡ鎖における塩基番号１から
６５０３までの領域の塩基配列の解析を行った。その結
果、６個のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ
）が存在することが明らかとなった。すなわち、塩基番
号２２５から１１３０までの分子量３２５８３のタンパ
ク質をコードするＯＲＦ（ＯＲＦＩとする。第１図、第
７図におけるＡからＢに対応している。）、塩基番号］
１４３から２４３５までの分子ｍ４７２４１のタンパク
質をコードするＯＲＦ　（ＯＲＦ２とする。第２図、第
７図におけるＣからＤに対応している。）、塩基番号２
４２２から３５６７までの分子量４３０４７のタンパク
質をコードずるＯＲＦ（ＯＲ．Ｆ３とする。第３図、第
７図におけるＥからＦに対応している。）、塩基番号３
５８２から５０５７までの分子ｍ　５　５　０　０　７
のタンパク質をコードするＯＲＩ”（ＯＲＦ４とする。

第４図、第７図におけるＧからＨに対応している。）、
塩基番号５０９６から５９８３までの分子量３　３　０
　５　０のタンパク質をコードするＯＲＦ（ＯＲＦ５と
する。第５図、第７図におけるＩからＪに対応している
。）、塩基番号６４５２から５９２８までの分子４２１
９８１６のタンパク質をコードするＯＲＦ　（ＯＲＦ６
とする。第６図、第７図におけるＫからＬに対応してい
る。このＯＲＦ６のみ他のＯＲＦと方向が逆向きである
。）であった。なお、これら６個のＯＲＦの各開始コド
ンの数塩基上流には、大腸菌の１６８リボゾムＲＮＡの
３′領域と相同性のあるＳ　Ｄ　（Ｓｈｉｎｅｐａ１ｇ
ａｒｎｏ）配列が存在した。したがって、これら６個の
ＯＲＦにより、大腸閑で実際にタンパク質が合威されて
いるど考えられた。このことは、下記のイン・ビトロ転
写・翻訳実験によって確認された。

すなわち、ＯＲＦ　１からＯＲＦ６までを含むプラスミ
ド　ｐＣＡＲ２５を３ｃａＩで消化したＤＮＡ，及び、
ＯＲＦｉからＯＲＦ６までの各ＯＲＦ　（ＳＤ配列を含
む）を適当な制限酵素で切り出すことによって単離した
ものをｐ　Ｕ　Ｃ　１　９またはｐ　Ｕ　Ｃ　１．　８
にＩａｃプロモーターの転写のリードスルーを受けるよ
うに挿入して作製された各種ハイブリッドプラスミドを
Ｓｅａ　］で消化したＤＮＡを用いて、イン・ビトロ転
写・翻訳による解析を行った。この実験には、アマシャ
ム社のＤＮＡ発現キットを用いた。その結果、転写・翻
ｌ↓づ 訳産物として、上記の各ＯＲＦに対応ずるタンパク質の
バンｌ・が生じることを確認することかできた。

また、後述（実験例３，４．５）のように、エルビニア
・ウレドボラと同じ黄色色素を産生ずるのに、これら６
つのＯＲＦはすべて必要であった。

以上の結果から、ＯＲＦＩ．，　○ＲＦ２，ＯＲＦＢ，
ＯＲＦ４，ＯＲＦ５，および、○ＲＦ６を、それなお、
第１図から第６図での塩基番号は、第７図におけるＫｐ
ｎＩ部位を塩越番号１として示されたものであり、互い
に対応している。また、第１−図から第６図まてにおけ
るＡからＬまでの記号は、第７図のＡからＬまでの記号
に対応している。

また、第６図におけるＫからＬまでのＤＮＡ鎖は、第７
図におけるＫからＬまでのＤＮＡ鎖の相補鎖を読んだも
のである。すなわち、第６図に示されたＤＮＡ鎖は、第
１図から第５図までのＤＮＡ鎖と、もとのＤＮＡ鎖（第
７図）に於いて転写の方４４ 向が逆向きになっている。

（３）　　ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法に
よる相同性の分析 エルビニア●ハービコラ（ｌＥｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂ
ｊｃｏｌａ　）ＥｈｏｌＯ　　ＡＴＣＣ３９３６８のト
ータルＤＮＡを、実験例１　（１）と同様の方法により
調製した。第７図のＤＮＡ鎖を含む７．６ｋｂ断片を、
ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ１より亙」ト』ユ■消
化により切り出し、ＤＩＧＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によるＤＮ
Ａラベリング＆ディテクション◆キット（ベーリンガー
・マンハイム社製）により標識し、プローブＤＮＡとし
た。このプローブＤＮＡを用いて、エルビニア・ハービ
コラＥｈｏｌ．Ｏ　　ＡＴＣＣ３９３６８及びエルビニ
ア・ウレドボラ　２０Ｄ３　　ＡＴＣＣ１９３２１のト
ータルＤＮＡ　（そのまま及びＫｐｎｌ消化したもの）
のアガロースゲル電気泳動法を行ったものについて、前
述のＤＮＡラベリング＆ディテクション・キッｌ・を用
いたＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法による分
析を行った。その結果、プローブＤＮＡは、後者のエル
ビニア・ウレドボラ２０Ｄ３　　ＡＴＣＣ１．９３２１
のトータルＤＮＡと、強くハイブリダイズしたのに対し
て、前者のエルビニア・ハービコラＥ　ｈ　ｏ　１　０
ＡＴＣＣ３９３６８のトータルＤＮＡとハイブリダイズ
するところは全く無かった。また、第７図のＤＮＡ鎖か
ら示される制限酵素切断点地図は、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒ
ｊｏｌ．，　１６８，　８０７−６１２　（１９８Ｇ）
により報告されている制限酵素切断点地図と全く異なっ
ていた。以上の結果より、第７図のＤＮＡ鎖、すなわち
、本発明によるカロチノイドの合成に有用なＤ　Ｎ　Ａ
　鎖は、エルビニア・ハービコラＥｈｏｌＯ　　ＡＴＣ
Ｃ３９３６８の黄色系色素合成遺伝子群を含むＤＮＡ鎖
と相同性を示さないと結論した。

実施例３：　黄色色素の分析 大腸菌（ｐＣＡＲ２５）は、エルビニア・ウレドボラ　
２０Ｄ３　　ＡＴＣＣ１９Ｂ２１およびエルビニア・ハ
ービコラ　ＥｈｏｌＯ　　ＡＴＣＣ３９３６８と同じ黄
色色素を産生じ、その生産量Ａ７ は、前者の５倍、後者の６倍であった（乾重量当り）。

大腸菌（ｐＣＡＲ２５）（黄色を呈している）の８リッ
トル２ＸＹＴ　（１．　　６％トリプトン、１％イース
トエキストラクト、０．５％ＮａＣ１）培養液より集菌
した菌体を、メタノールにより、１．２リッ１・ルで１
回抽出した。これを濃縮乾固し、メタノールに溶解後、
メルク社製のシリカゲル６０（クロロホルム：メタノー
ル４：１で展開）を用いた薄層クロマトグラフィ（Ｔ　
Ｌ　Ｃ）を行った。この黄色色素は、このＴＬＣにより
、Ｒｆ値０．９３、０．６２および０．３０の３スポッ
トに分かれた。黄色色素全体の４９％に相当する、最も
濃いＲｆ値０．３０の黄色（〜橙色）色素をＴＬＣプレ
ートから、かきとり、少量のメタノールで抽出後、セフ
ァデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（３０
ｃｍＸ３．Ｏｃｍ（φ））にかけメタノールで展開溶出
することにより純品４ｍｇを得た。得られた黄色（〜橙
色）色素はメタノール以外の有機溶媒に難溶性であり、
水溶性が強いことからカロチノイド配糖体の可能性が示
唆された。ＦＤ−ＭＳスペクトルによる分子量８９２も
これを支持した（ゼアキサンチン（後述）からグルコー
ス２個分増えている）。そこで本物質をＩＮのＨＣＩで
１００℃、１０分間加水分解した結果、ゼアキサンチン
が得られた。そこで常法に従い、アセチル化を行った。

すなわち、１０ｍｌのピリジンに本物質を溶解し、大過
剰の無水酢酸を加え、室温で攪はん、一晩放置した。反
応終了後、水を加えクロロホルムで抽出し、濃縮後、シ
リカゲルカラムクロマトグラフイ　（３０ｃｍＸ３．Ｏ
ｃｍ　（φ））にかけ、クロロホルムで展開溶出した。

’Ｈ−ＮＭＲを測定したところ、ゼアキサンチンーβ−
ジグルコシドのテトラアセチル体と一致するスペクトル （Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ，　
５７．　１６４１−１６５１（１９７４））を与えたた
め、本物質をゼアキサンチンβ−ジグルコシド（ｚｅａ
ｘａｎｔｈｉｎ−βｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ　）　　（
構造は下記式）と同定した。

この生産量は、１．１■／ｇ乾重量であった。

本物質は、１００ｍｌの水及びメタノールに少なくとも
２■は溶解したが、溶解度はメタノールより、むしろ水
の方が上であった。また、クロロホルム及びアセトンに
対する本物質の溶解度は低く、室温で１００ｍｌに対す
る溶解度は、両者とも０．　　５■であった。

実験例４：　カ口チノイド中間代謝産物の分１７（１）
　各種デレーションブラスミドの作製キロシークエンス
用デレーションキッ１・を用いて、黄色色素合成遺伝子
群を含む６９１８ｂｐの断片（ＤＮＡ鎖）（第７図）の
ＨｉｎｄＴＩＩ側（第７図の右末端側）から６０１０ｂ
ｐまで欠失させた断片、すなわち、塩基番号１から６０
０９までの断片をｐ　Ｕ　Ｃ　１　９に挿入したハイブ
リッドブラスミド（ｐｃＡＲ１．６と名づけられた）を
作製した。ｐｃＡＲ１６は、ｚｅｘＡからｚｅｘＥまで
の遺伝子を含んでいる。これと、前述したｐＣＡＲ２５
　（ｚｅｘＡからｚｅｘＦまでの遺伝子を含んでいる）
を土台として、第１−表に示すように、各種デレーショ
ンプラスミドを作製した。

５４ （２）　ゼアキサンチンの同定 大腸菌（ｐＣＡＲ２５ｄｅ　ＩＢ）（橙色を呈している
）の３リットル２ＸＹＴ培養液より集菌した菌体を、低
温下、アセトンにより、４００ｍｌずつ２回抽出し、濃
縮後、クロロホルム：メタノール９：１で抽出し、濃縮
乾固した。これをシリカゲル力ラムクロマトグラフィー
（３０ｃｍＸ３，Ｑｃｍ　（φ））にかけクロロホルム
でカラムを洗浄した後、クロロホルム：メタノール１０
０：１で橙色バンドを溶出した。これをエタノールに溶
解し、低温で再結晶を行い、純品８■を得た。紫外一可
１ 視吸収スペクトル、　Ｈ−ＮＭＲ、”’Ｃ−ＮＭＲ、Ｆ
Ｄ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｅ５６８）の結果より、本物
質は、ゼアキサンチンと同一の平面構造を持つもの（β
，β−ｃａｒｏｔｅｎｅ　−　３　，　３゜−　ｄｊｏ
ｌ）であることが明らかとなった。そこで、ジェチルエ
ーテル：イソペンタン：エタノール　５：５：２に溶解
し、ＣＤスペクトルを測定した結果、３Ｒ，３’　Ｒの
立体構造（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２７．　
３ＢＯ５−３６０９　（１９８８）　）をとることがわ
かったため本物質をゼアキサンチン（ｚｅａｘａｎｔｈ
ｉｎ　，β，β一ｃａｒｏｔｅｎｅ　−３Ｒ，３’，Ｒ
−ｄｉａｌ）　　（構造は下記式）と同定した。この生
産量は２．２■／ｇ乾重量であった。本物質は、実験例
４（１）のＲｆ値０．９３の黄色（〜橙色）色素に相当
した。

（３）　β−カロチンの同定 大腸菌（ｐｃＡＲ１６）（橙色を呈している）の３リッ
トルＬＢ培養戒より集菌した菌体を、低温下、冷メタノ
ールにより、５００ｍｌずつ３回抽出し、さらに、メタ
ノール抽出液を１．５リットルのヘキサンにより抽出し
た。ヘキサン層を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー（３０ｃｍｘ３．ｏｃｍ（φ））にかけ、ヘキ
サン：酢酸エチル５０：１で展開溶出し、橙色バンドを
集めた。

橙色フラクションを濃縮し、エタノール中から再結晶を
行い、８ｍｇ（水分を除いた換算値）を得た。

本物質は、紫外＝可視吸収スベクｌ・ルよりβ−カロチ
ンに属するものと推定され、ＦＤ−ＭＳスペクトルによ
る分子量５３６もこの推定を支持した。

そこでβ−カロチンの標準品（シグマ社製）と、１３Ｃ
−ＮＭＲによる比較を行った粘果、炭素のケミカルシフ
１・かすべで一致したため本物質をβカロチン（β−ｃ
ａｒｏｔｅｎｅ，　ａｌ　ｌ−ｔｒａ．ｎｓ−β，βｃ
ａｒｏｔｅｎｅ）　　（構逍（』下記式）と同定した。

また、類似の方法によって、大腸菌（ｐｃＡＲ１６ｄｅ
ＩＢ）も、」二記と同一のβ−カロチンを蓄積すること
を確認した。この生産量は、２．０ｍｇ／ｇ乾重量であ
った。これは、紹織培養１３、３７９−３８２（１９８
７）で報告された、ギントキニンジン培養細胞における
全力ロチノイド生１”１１　ｆｔの２〜８倍の値であっ
た（乾重量当り）。

５７ （４）　リコピンの同定 大腸菌（ｐｃＡＲ１６ｄｅ　ＩＣ）（赤色を呈している
）の３リッ１・ルＬＢ培養液より集菌した菌体を、低温
下、冷メタノールにより、５００ｍｌで１回抽出し、こ
れを遠心分離した沈殿物を、１．５リットルのクロロホ
ルムにより抽出した。

クロロホルム層を濃縮し、シリカゲル力ラムクロマトグ
ラフィ−（３０ｃｍＸ３．Ｏｃｍ　（φ））にかけ、ヘ
ギザン：クロロホルム１：１で展開溶出し、赤色バンド
を集め、このフラクンヨンを濃縮した。

本物質は、紫外一可視吸収スペクｌ・ルよりリコピンに
属するものと推定され、ＦＤ−ＭＳスペク１・ルによる
分子Ｍ５３６もこの推定を支持した。そこで、リコピン
の標準品（シグマ社製）を用いて、’Ｈ−ＮＭＲの比較
を行った結果、水素のケミカルシフＩ・がすべで一致し
、また、メルク社製のシリカゲル６０（ヘキザン：クロ
ロホルム５０：１で展開）及びＲＰ−１８（メタノール
：クロロホルム４：１で展開）を用いた薄層クロマトグ
ラフィーを行ったところ、移動鉗離が完全に一致したた
め・木物質をリコビン（　Ｉｙｃｏｐｅｎｃ，　ａｌ　
ｌ−ｔｒａｎｓψ，ψ一ｃａｒｏｔｅｎｅ）　　（構造
は下記式）と同定した。

また、類似の方法によって、大腸菌（ｐＣＡＲＡＤＥ）
　、及び、大腸菌（ｐｃＡＲ−ＡＤＥＦ）も、上記と同
一のリコピンを蓄槓することを確認した。前者の牛産量
は、２，Ｑｍｇ／ｇ乾重量であった。これは、組織培養
１３、３７９−３８２（１９８７）で報告された、キン
トキニンジン培養細胞の高リコピン産生累株におけるリ
コピン生産量の２倍の値であった（乾重量当り）。

（５）　フィｌ・エンの同定 大腸菌（ｐＣＡＲ−ＡＥ）の１．５リッｌ・ル２ＸＹＴ
培養戒より集菌した菌体を、アセｌ・ンにより、２００
ｍｌづつ２同抽出し濃縮後、１００ｍｌのヘキザンで２
同抽出ｔ７、濃縮乾固した。これをシリカゲル力ラムク
ロマトグラフィー（３０ｃｍｘ３．Ｏｃｍ（φ））にか
け、ヘキザン：クロロホルム１：１で展開溶出し、強い
紫外部吸収を有するバンドを分けとり、紫外部吸収スペ
クトルを測定してフィ１・エンであることを確認した。

さらにセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフ
ィ−　（３　０ｃｍＸ　３．　　Ｏｃｍ　（φ））にか
けクロロホルム：メタノール１：１で展開溶出すること
により純品４■を得た。’Ｈ−ＮＭＲスペク１・ルを測
定し、トランス及びシスフィトエンのスペクトル（Ｊ．
　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ．　１０．　
４３−５０　（１９７３）　）と比較した結果、本物質
は、ｌ・ランスとシスの混合物であることが判明した。

シスからトランスへの異性化は起こりにくいので、これ
は、精製の途中でトランスーシス異性化が起こったため
であると判断した。したがって、元のフィトエンは、ト
ランス型フイトエン（ａｌ　ｌ−ｔｒａｎｓ−ｐｈｙｔ
ｏｅｎｅ）　　（構造は下記式）であったと結論した。

また、類似の方法によって、大腸菌（ｐＣＡＲ２５ｄ　
ｅ　ＩＤ）も、上記と同一のフィトエンを蓄積すること
を確認した。

実験例５：　カロチノイド合成遺伝子群の同定大腸菌（
ｐＣＡＲ２５）がゼアキサンチン−ジグルコシドを生産
し、ｐＣＡＲ２５からｚｅｘＢ遺伝子が除かれたプラス
ミドを有する大腸菌（ｐＣＡＲ２５ｄｅ　ＩＢ）がゼア
キサンチンを蓄積することから、ｚｅｘＢ遺伝子は、ゼ
アキサンチンをゼアキサンチン−ジグルコシドに変換で
きる酵素であるグリコシル化酵素（ｇｌｙｃｏｓｙｌａ
ｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ）をコードしていることが明らか
となった。

同様に、ｐＣＡＲ２５ｄｅ　ＩＢからｚｅｘＦ遺伝子が
除かれたプラスミドを有する大腸菌（ｐｃＡＲ１６ｄｅ
　Ｉ　Ｂ）がβ−カロチンを蓄積することから、ｚｅｘ
Ｆ遺伝子は、β−カロチンをゼアキサンチンに変換する
酵素である水酸化酵素（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ　
ｅｎｚｙｍｅ）をコードしていることが明らかとなった
。同様に、ｐｃＡＲ１６ｄｅＩＢからｚｅｘＣ遺伝子が
除かれたプラスミドを有する大腸菌（ｐＣＡＲ−ＡＤＥ
）がリコピンを蓄積することから、ｚｅＸＣ遺伝子は、
リコピンをβ−カロチンに変換する酵素である環化酵素
（ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ）をコードし
ていることが明らかとなった。また、リコピン合戊に必
要な遺伝子であるｚｅｘＡ，ｚｅｘＤＳｚｅｘＥ，及び
、水酸化酵素をコードするｚｅｘＦの両方の遺伝子を有
する大腸菌（ｐＣＡＲ−ＡＤＥＦ）は、リコピンしか合
成できなかった。これは、カロチノイド合成における水
酸化は環化反応の後に起こるということを、直接実証す
るものである。さらに、大腸菌（ｐＣＡＲ−ＡＤＥ）が
リコピンを生産し、ｐＣＡＲ−ＡＤＥからｚｅｘＤ遺伝
子が除かれたプラスミドを有する大腸菌（ｐＣＡＲ−Ａ
Ｅ）がフィトエンを蓄積することから、ｚｅｘＤ遺伝子
は、フィトエンをリコピンに変換する酵素である脱水素
酵素（ｄｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　）を
コードしていることが明らかとなった。また、大腸菌（
ｐＣＡＲ−Ａ）及び大腸菌（ｐＣＡＲ−　Ｅ）は、フィ
トエンを合戊することができなかった。このことにより
、大腸菌にフィトエンを合成させるには、ｚｅｘＡとｚ
ｅｘＥの両方が必要であると考えられた。光合成細菌ロ
ドバクター・キャプスラタスのカロチノイド合成遺伝子
であるｃｒｔＢとｃｒｔＥ遺伝子産物とのアミノ酸配列
（Ｈｏｔ．　Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，　２１８，２５４
−２８８　（１９８８））を比較することにより、ｚｅ
ＸＥが、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ｇｅｒａｎｙｌ
ｇｅｒａｎｙｌ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）からプ
レフイトエンピ口リン酸（ｐｒｅｐｌ１ｙｔｏｅｎｅ　
ｐｙｒｏｐｂｏｓｐｈａｔｅ）への変換酵素を、ｚｅｘ
Ａが、プレフィトエンピ口リン酸からフィトエンへの変
換酵素をコードすることが明らかとなった。以上の分析
により、６つのｚｅｘ遺伝子すべてが同定されたととも
に、カロチノイドの生合成経路が明らかになった。これ
らは、第８図にまとめられている。

大腸菌（ｐＣＡＲ２５ｄｅ　ＩＥ）からカロチノイド中
間代謝産物は検出てきなかったが、大腸菌（ｐＣＡＲ２
５ｄｅ　ＩＡ）及び大腸菌（ｐ　ＣＡＲＣＤＥ）は、微
量のカロチノイドを合戊することができた。すなわち、
大腸菌（ｐＣＡＲ２５ｄｅｌＡ）及び大腸菌（ｐＣＡＲ
−ＣＤＥ）は、大腸菌（ｐＣＡＲ２５）及び大腸菌（ｐ
　ＣＡＲ１６ｄｅｌＢ）と比較して、それぞれ、４％の
ゼアキサンチンーグルコシド及び２％のβ−カロチンを
合戊した。この結果は、プレフィトエンピ口リン酸から
フィトエンへの反応は、微量であるけれども、非酵素的
に起こるかもしれないということを示唆するものである
。

以上のように、一般的かつ有名なカロチノイドである、
リコピン、β−カロチン及びゼアキサンチン、及び、水
溶性のカロチノイドであるゼアキサンチン−ジグルコシ
ドを含むカロチノイドの詳細な生合成経路を初めて明ら
かにしたとともに、これらの生合成に有用な遺伝子群を
初めて取得することができた。なお、前記実験例におい
て本遺伝子群により合戊されたリコピン、β−カロチン
、及び、ゼアキサンチンは、高等植物からのちの（Ｔ．
Ｗ．　　Ｇｏｏｄｗｉｎ：　　ｒＰｌａｎｔ　Ｐｉｇｍ
ｅｎｔｓＪ　，　　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　（１
９８ｇ））と立体構造的に同一であった。

また、セアキザンチン−ジグルコシドは、植物から単離
の報告（Ｐｕｒｅ　＆　Ａｐｐｌ．　Ｃｈｅｍ．．　４
７．　１２１１２８　（１９７Ｂ））があるのみで、微
生物からは従来単離されていなかったものである。

実験例６：　ザイモモナス属細菌でのカロチノイドの合
或 サイモモナス属細ｍ　（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉ
ｌｉｓ　）は、通性嫌気性のエタノール生産細菌である
。エタノール生成速度が酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ　ｃｅｒｃｖｉｓｉａｃ）より速いので、将来の燃
料用アルコール生産菌として有望視されている。また、
サイモモナス属細菌は、解糖系ではなく、エントナー・
ドゥドルフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆ　ｆ’）
という特殊な代謝系を有しており、カロチノイドは全く
産生ずることができない。このザイモモナス属細菌に付
加価値を与える目的で、カロチノイド合戊遺伝子群のザ
イモモナス属細菌への導入を行った。

第７図のＤＮＡ鎖を含む７．６ｋｂ断片を、ハ６５ イブリッドプラスミドｐＣＡＲ１よりＫ　Ｔ）　ｎ　Ｉ
消化により切り出し、そのＤＮＡポリメラーセ■（Ｋｌ
ｅｎｏｗ　ｅｎｚｙｍｅ　）処理したものを、サイモモ
ナス属細菌のクローニングベクターであるｐＺＡ２　２
　（Ａｇｒｊｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．＋　５０．
　３２０１−３２０３（１９８Ｇ）、及び、特開昭６２
−２２８２７８号公報参照）のＥｃｏＲＶ部位に連結す
ることにより、ハイブリッドプラスミドｐＺＡｃＡＲ１
を作製した。また、第７図のＤＮＡ鎖における１−６０
０９断片を、ｐ　ＣＡＲ　１　６よりＫｐｎＩ／Ｅｃｏ
ＲＩ消化により切り出し、そのＤＮＡポリメラーゼＩ処
理したものを、サイモモナス属細菌のクローニングベク
ターであるｐＺＡ２２のＥｃｏＲＶ部位に連結すること
により、ハイブリッドプラスミトｐＺＡｃＡＲ１６を作
製した。これらのブラスミドにおける挿入断片の方向は
、第７図の方向を順方向とすると、Ｔｃｒ遺伝子の方向
と逆向きに挿入されていた。これらのブラスミドは、ヘ
ルパプラスミドｐＲＫ２０１３　（ＡＴＣＣ３７１５９
）を用いた接合伝達法により、Ｚ．　ｍｏｂｉｌｉｓ　
ＮＲＲＬ　Ｂ−１４０２３株に導入され、安定に保持さ
れた。

ｐＺＡＣＡＲ１　、及び、ｐＺＡｃＡＲ１．６が導入さ
れたＺ．　ｍｏｂｉｌｉｓ　ＮＲＲＬ　１３−１４０２
３は、黄色を呈し、それぞれ、０．２８ｍｇ／ｇ乾重量
のセアギザンチンージグルコシド、及び、０．１４ｍｇ
／ｇ乾重量のβ−カロチンを合成した。したがって、本
発明による力ロチノイド合成遺伝子群により、ザイモモ
ナス属細菌にカロチノイドを合戊させることに戊功した
。

微生物の寄託 本発明に関係する微生物は、工業技術院微生物工業技術
研究所に下記の通りに寄託されている。

微生物　　　　　　受託番号　　　　　　受託年月日Ｅ
ｓｃｈｅｒｊｃｈｉａ　ｃｏｌ４　　微工研条寄第２３
７７号　・Ｖ成元年ＪＭ１０９（ｐｃＡＲ１）　　　　
（ＰＥＲＭ　ＢＰ−２３７７）　　　　４月１１日

【図面の簡単な説明】

第１図から第６図は、それぞれコーディング領域のＤＮ
Ａ鎖■〜■の塩基配列とコードされるタンパク質のアミ
ノ酸配列を示すものである。 第７図は、エルビニア・ウレドボラ ２０Ｄ３　　ＡＴＣＣ１９３２］−から取得した力ロチ
ノイドの生合成に関ちするＫ　ｐ　ｎ　Ｉ　−　Ｈ　ｊ
ｎ　ｄ■断片、すなわち、第１図から第６図までのＤＮ
Ａ鎖を含む６９１８塩基対のＤＮＡ鎖の全塩基配列を示
すものである。 第８図は、上記のＤＮＡ鎖■〜■がコードずるポリペプ
チドの機能を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プレフィトエンピロリン酸をフィトエンに転換する
   酵素活性を有していてアミノ酸配列が実質的に第１図（
   イ）および（ロ）に示されているＡからＢまでのアミノ
   酸配列であるポリペプチドをコードする塩基配列を有す
   るＤＮＡ鎖。 ２、ゼアキサンチンをゼアキサンチン−ジグルコシドに
   転換する酵素活性を有していてアミノ酸配列が実質的に
   第２図（イ）および（ロ）に示されているＣからＤまで
   のアミノ酸配列であるポリペプチドをコードする塩基配
   列を有するＤＮＡ鎖。 ３、リコピンをβ−カロチンに転換する酵素活性を有し
   ていてアミノ酸配列が実質的に第３図（イ）および（ロ
   ）に示されているＥからＦまでのアミノ酸配列であるポ
   リペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖。 ４、フィトエンをリコピンに転換する酵素活性を有して
   いてアミノ酸配列が実質的に第４図（イ）、（ロ）およ
   び（ハ）に示されているＧからＨまでのアミノ酸配列で
   あるポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ
   鎖。 ５、ゲラニルゲラニルピロリン酸をプレフィトエンピロ
   リン酸に転換する酵素活性を有していてアミノ酸配列が
   実質的に第５図（イ）および（ロ）に示されているＩか
   らＪまでのアミノ酸配列であるポリペプチドをコードす
   る塩基配列を有するＤＮＡ鎖。 ６、β−カロチンをゼアキサンチンに転換する酵素活性
   を有していてアミノ酸配列が実質的に第６図に示されて
   いるＫからＬまでのアミノ酸配列であるポリペプチドを
   コードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖。