JP2003508085A - 代謝制御の工学設計 - Google Patents
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Abstract
Description
謝産物のような所望の化合物を生産することが可能になっている。工学設計され
た細胞におけるポリペプチドの大規模生産により、製薬的用途のタンパク質及び
工業的用途の酵素が生産される。二次代謝産物は、その生物学的及び医薬として
の重要性で長く知られている天然由来の産物である。そのような分子の構造が本
来複雑であるために、従来の化学合成では、化合物を調製するために多大な努力
や高価な前駆体及び補因子の使用をしばしば必要とする。近年、細胞における異
種タンパク質の発現は、安価な開始物質から代謝産物を生産する、微生物におけ
る異種生合成経路の工学設計を促進した。この方法で、ポリケチド、β−ラクタ
ム系抗生物質、モノテルペン、ステロイド及び芳香族を始めとする様々な化合物
が生産されている。
り調節されるプロモーターを使用したポリペプチド(例えば生合成酵素)の調節
的発現により、異種ポリペプチド及び異種代謝産物の生産が高められるという発
見に基づいている。用語「異種」とは、技術を用いて導入されるポリペプチド又
は代謝産物のことを指す。異種ポリペプチド又は代謝産物は、天然に存在する内
因性物質と同一であってもよい。用語「代謝産物」とは、1又は複数の生化学反
応の産物である有機化合物のことを指す。代謝産物はそれ自体他の反応のための
前駆体であってもよい。二次代謝産物は、別の生化学反応に由来する代謝産物で
ある。
ードする核酸配列とを含む核酸配列を有する細菌宿主細胞をその特徴とする。 細菌宿主細胞の例としては、エシェリシア コリ(Escherichia c
oli)、バチルス サブチリス(Bacillus subutilis)、
サルモネラ チフィムリウム(Salmonella typhimurimu
m)、アグロバクテリウム チュメファシエンス(Agrobacterium
tumefaciens)、サーマス サーモフィルス(Thermus t
hermophilus)及びリゾビウム リグミノサルム(Rhizobiu
m leguminosarum)細胞が包含される。該核酸配列は、応答調節
タンパク質により制御されるプロモーターと機能的に連結される。言いかえれば
、核酸配列は、ヌクレオチド配列のインビトロ及びインビボでの発現発現を許容
する様式でプロモーター配列に連結される。「プロモーター」とは、遺伝子物質
の転写を指図する任意のDNA断片のことを指す。プロモーターは、応答調節タ
ンパク質(例えばE.coliのntrC、phoB、phoP、ompR、c
heY、E creB、又はtorRあるいは他の細菌種由来のその同族体)に
よって制御される。さらに応答調節タンパク質は、http://www.nc
bi.nlm.nih.gov/COG/(Tatusovら、Nucleic
Acids Res.(2000);28:33−36)に定義されるような
クラスターオルソロガスグループ(COG)COG0745の別のメンバーであ
り得る。ある実行では、プロモーターはE.coli ntrCにより結合され
る。用語「ntrC」とは、E.coli ntrCタンパク質(SWISSP
ROT:P06713、http://www.expasy.ch/)及び適
切な他の細菌におけるその同族体の両方を指す。本明細書で使用する場合、「結
合」とは、100未満nM、好ましくは1nM未満の平衡結合定数(KD)を有
する物理的会合のことを指す。プロモーターの1例はE.coli glnAp
2プロモーター(例えば公表されたDNA配列中の約93〜約323の領域、G
enBankアクセッション番号M10421(Reitzer&Magasa
nik(1985)Proc Nat Acad Sci USA 82:19
79−1983))である。この領域は、glnA遺伝子由来の非翻訳配列を含
んでいる。さらに、gInAのコード配列と異種ポリペプチドのコード配列の間
には翻訳の融合物を構築することができる。
されるように遺伝子修飾される。例えば、宿主細胞は、ヒスチジンプロテインキ
ナーゼ((例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/
COG/;Tatusovら、前掲)により定義されるようなCOG0642の
メンバー、例えばglnL、phoR、phoQ、creC、又はenvZ)を
コードする遺伝子の欠失や突然変異により遺伝的に修飾される。別の例において
、ヒスチジンプロテインキナーゼは、プロモーターを制御する応答調節タンパク
質に対して特異性を有している。ヒスチジンプロテインキナーゼは、glnL(
例えばE.coli glnL(SWISSPROT PO6712;http
://www.expasy.ch/))によりコードされ得る。
状態でプロモーターがアセチルリン酸により調節されるように遺伝子修飾される
が、宿主細胞は任意の所望の条件下で(例えば窒素飢餓状態、窒素が不十分な状
態、あるいは窒素が豊富な状態)増殖させることが可能である。
必要な生合成酵素であり得る。異種ポリペプチドは、哺乳類のタンパク質(例え
ば分泌増殖因子、モノクローナル抗体、細胞外マトリックス成分)であり得る。
例えばウイルス、細菌、真菌、原生生物病原体由来の表面タンパク質)であり得
る。
有する核酸配列を含むキットをその特徴とする。該キットはさらに、窒素飢餓が
ない状態でプロモーターがアセチルリン酸により調節されるように遺伝子修飾さ
れる細菌宿主細胞を、任意に含む。キットはさらに、その使用に対する使用説明
書を提供できる。核酸配列は、制限酵素ポリリンカーに挿入された配列が、応答
調節タンパク質により制御されるプロモーターに機能的に連結するように、プロ
モーターに3’位置に配置された制限酵素ポリリンカーを含み得る。キットの1
つの実施では、プロモーターがE.coli glnAp2プロモーターであり
、細菌宿主細胞はglnL遺伝子の変異か欠失を含むE.coli細胞である。
第1の発現カセットは、上述したののうち任意のもののようなプロモーターと、
異種代謝産物の生合成に必要な酵素をコードする核酸配列とを有している。本明
細書で使用する場合、「酵素」とは、1つの化学反応か複数の反応を触媒する能
力を有するポリペプチドのことを指す。核酸配列は、窒素飢餓がない状態でアセ
チルリン酸により調節されるプロモーターに機能的に連結されている。宿主細胞
は、代謝産物の生合成に必要な他の酵素の発現のための追加の複数の核酸配列も
含み得る。そのような追加の配列は、内因性酵素を発現する内因性配列であって
もよいし、異種酵素を発現する導入配列であってもよい。
ポリケチド、β−ラクタム系抗生物質、芳香族、または前駆体(例えば上流代謝
産物)もしくはその誘導体(例えば下流代謝産物)である。例えば、イソプレノ
イドは、カロチノイド、ステロール、タキソール(商標)、ジテルペン、ジベレ
リン及びキノンであり得る。イソプレノイドの特定の例には、イソペンチル二リ
ン酸、ジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲ
ラニルゲラニル二リン酸及びフィトエンが包含される。カロチノイドの特定の例
には、β−カロテン、ζ−カロテン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、ゼア
キサンチン−β−グルコシド、フィトフルエン、ニューロスポレン、ルテイン及
びトルエンが包含される。所望の異種代謝産物がイソプレノイドである場合、異
種酵素はイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シン
ターゼ、または1−デオキシキシルロース 5−リン酸シンターゼであり得る。
所望の異種代謝産物がポリヒドロキシアルカン酸である場合、異種酵素は、3−
ケトアシル還元酵素またはポリ−3−ヒドロキシアルカン酸ポリメラーゼであり
得る。
、宿主細胞は、遺伝子(例えばヒスチジンプロテインキナーゼをコードする遺伝
子)の欠失あるいは突然変異により任意に遺伝子修飾される。1つの特定の例に
おいて、宿主細胞はは、アセチルリン酸濃度により調節されたプロモーター(例
えばglnAp2)に機能的に連結されたホスホエノールピルビン酸シンターゼ
をコードする核酸配列を含む第2の発現カセットをさらに含む。
特徴とする。該方法は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼを過剰発現し、異
種イソプレノイドの合成に必要な生合成酵素を発現する工程から成る。1つの実
施では、ピルビン酸キナーゼまたはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
をコードする宿主細胞中の遺伝子が、遺伝子学的に削除されるか弱められる。別
の実施では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子
が宿主細胞中で過剰発現される。本発明のさらに別の態様は、宿主細胞でリコピ
ンを生産する方法をその特徴とする。該方法は次の異種酵素を発現する工程から
成る:l−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸シンターゼ、ゲラニルゲラ
ニル二リン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、およびフィトエンサチュラー
ゼ。この方法の1つの実施では、例えばglnAp2プロモーターを使用して、
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが過剰発現される。別の実施では、例えば
glnAp2プロモーターを使用して、ホスホエノールピルビン酸シンターゼが
過剰発現される。
酵素をコードする配列とを含む核酸配列をその特徴とする。プロモーターは、該
配列に機能的に連結され、その濃度が第1の代謝産物の生合成のための前駆体の
有効性を示す第2の代謝産物によって調節される。1例において、第2の代謝産
物は、第1の代謝産物の生合成のための前駆体から生産された排泄物質である。
ドロキシブチル酸)であり、核酸配列は生合成酵素(例えば、3−ケトアシル補
酵素A(coA)還元酵素またはポリ−3−ヒドロキシオクタノイル−CoAポ
リメラーゼ)をコードする。別の場合では、第1の代謝産物がポリケチド、β−
ラクタム系抗生物質、または芳香族である。さらに別の場合では、第1の代謝産
物がイソプレノイド(例えば本明細書で言及したイソプレノイド)である。核酸
配列は、イソプレノイドの生産に必要な整合性酵素(例えばイソペンテニル二リ
ン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、1−デオキシキシル
ロース 5−リン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、ファル
ネシル二リン酸シンターゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、フィトエン
シンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、リコピンシクラーゼ)をコードし得る
。イソプレノイドの前駆体の1つはピルビン酸であり得る。ピルビン酸濃度は酢
酸及びアセチルリン酸濃度と関係がある。従って、この例では、第2の代謝産物
はアセチルリン酸である。アセチルリン酸に応答するプロモーターは、応答調節
タンパク質(例えば上述した応答調節タンパク質)により制御され得る。そのよ
うなプロモーターは、特定の宿主細胞中のアセチルリン酸にしか応答しないよう
にし得る。特定の例において、アセチルリン酸濃度に応答するプロモーターは、
E.coli ntrC(例えばE.ccli glnAp2プロモーター)に
より結合される。
タボライトアクチベータータンパク質)に結合する細菌プロモーターであり得る
。哺乳動物では、プロモーターが、CREB、CREMあるいはATF−1タン
パク質に結合するcAMP応答エレメント(CRE)を含むプロモーターであり
得る。酵母細胞では、プロモーターが、cAMPにより調節されるプロモーター
か、Gisl、Msn2またはMsn4タンパク質により結合されるプロモータ
ーであり得る。プロモーターの別の考えられる調節シグナルは、フルクトース
1−リン酸、またはフルクトース 6−リン酸であり得る。E.coli Fr
uRタンパク質はそのようなプロモーターを調節する。
選択マーカーを含み得る。核酸配列はさらに、酵母や他の真核生物の複製起点と
適切な選択マーカーを含み、ゲノムへ組み込まれ得る。
することと、生合成の調節のためにそのようなパラメータを利用すること依存し
ている。当該技術分野における1つの標準的技術は、細胞を成長させ、ユーザー
が所望の産物の生合成に必要な遺伝子をオンにするために外因的に薬剤(例えば
誘導物質)を加えることである。成長遅延及び代謝活性の減少を引き起こす組換
えタンパク質または経路の高レベルの誘導が広く観察された(Kurlandと
Dong(1996)Mol Microbiol 21:1−4)。外因的に
誘導物質を供給する実施行為は経験的なものであり、生合成用の細胞の資源の有
効性をモニタしない。対照的に、天然経路はそのようなプロセスを制御するフィ
ードバック機構に依存する。特定のプロモーターと、本発明における特定の遺伝
学的に定義された宿主細胞及び異種ポリペプチドとを組み合わせると、細胞の代
謝期に応じて異種ポリペプチドや代謝産物合成への速度を調節する高度に精密か
つ用途の広い制御回路が期せずして得られる。確かに、動的に抑制された組換え
経路は、生産の増大と、最小限の成長遅延と、有害な副産物生成の減少とを提供
する。生理的状態に応じた遺伝子発現の調節は、遺伝子治療のような他の用途に
も有用であろう。
の他の特徴、目的及び利点が以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかと
なるであろう。
産物合成のいずれかのためのタンパク質発現を最適化するために特定宿主細胞中
のプロモーターを利用する方法)を提供する。
プチドをコードする核酸配列とを含む発現カセットである。発現カセットはコー
ドする核酸配列がプロモーターと機能的に連結される(例えばプロモーターによ
り調節される)ように、当該技術分野における標準的方法を用いて構築される。
プロモーターは、細胞生理学か細胞代謝期のパラメータによりプロモーターが調
節されるように選択される。様々なプロモーターを使用することが可能である。
いくつかの用途では、発現カセットが、細菌の複製起点と選択マーカーを備えた
細菌性プラスミドのようなプラスミド内に含まれる。発現カセットは当該技術分
野における標準的技術を使用して、細胞のゲノムへ組み込むことができる。
するために発現カセットが使用される場合、それに従ってプロモーターも選択さ
れ得る。例えば小分子シグナル(例えばセカンドメッセンジャー)(後期対数増
殖期中または定常期中にそのレベルは蓄積する)に応答するプロモーターが選択
される。セカンドメッセンジャーは、生化学経路の前駆体、中間体、または排泄
物質として蓄積する分子であり得る。細菌では、小分子シグナルが解糖の中間体
(例えばフルクトース 1−リン酸、フルクトース 6−リン酸)、または解糖
の排泄物質(例えば酢酸、アセチルリン酸))であり得る。真核細胞では、cA
MP濃度が栄養状態の有名なシグナルである。
験)の結果に基いて選択することが可能である。アセチルリン酸により誘導され
る遺伝子は、酢酸で成長中の細胞より調製したマイクロアレイ標識cDNAにハ
イブリダイズさせ、そのシグナルを基準シグナル(例えば初期対数成長期の細胞
より調製したcDNAに関して得られたシグナル)と比較することにより同定す
ることが可能である。その実験は、原核細胞と真核細胞の両方(例えば、細菌、
酵母、植物、哺乳類細胞)で実行できる。原核生物におけるそのような実験の例
については、Talaatら(2000) Nat Biotechnol 1
8:679−82とOh&Liao(2000)Biotechnol Pro
g.16:278−86を参照されたい。所望の条件下で発現されている遺伝子
がひとたび同定されると、そのプロモーターが発現カセットにて利用され得る。
代わりに、所望の分子(例えば代謝経路中の前駆体)の外因的追加により行われ
るか、実験条件(例えば後期対数期までの成長または生合成酵素が過剰生産され
ている間の成長)の操作により行われる。プロモーターは、誘導した遺伝子に基
づいて同定できる。
するために使用される。その濃度が第1の代謝産物の生合成のための前駆体の有
効性を示す、第2の代謝産物により調節されるプロモーターを選択することが可
能である。例えば、第1の代謝産物が前駆体、ピルビン酸及びグリセルアルデヒ
ド 3−リン酸から合成されるイソプレノイドである場合、第2の代謝産物はア
セチルリン酸であり得る。豊富な環境では、細胞は、ピルビン酸の生成物である
アセチルCoAの過剰量を生産する。過剰アセチルCoAは、ATPと酢酸(排
泄物質として分泌される)を生産するために使用される。酢酸濃度は細胞密度と
共に増加する。酢酸、アセチルCoA、及びアセチルリン酸濃度は、以下の生化
学反応に相互に関連付けられる。 (1)アセチルCoA+Pi<−>アセチルリン酸+CoA (2)アセチルリン酸+ADP<−>酢酸+ATP
が過剰であることを示す。glnLの欠失あるいは突然変異により遺伝子修飾さ
れた宿主細胞は、例えば、ntrC機能をアセチルリン酸依存的にさせる(Fe
ngら、(1992)J Bacteriol 174:6061−6070)
。この方法では、ntrCにより調節されるプロモーター(例えばglnAp2
プロモーター)が、アセチルリン酸に応じて遺伝子発現を制御するために使用で
きる。glnAp2プロモーターは当該技術分野における標準的技術を使用して
得ることが可能である。例えば、glnAp2プロモーターとアニールするプラ
イマーを設計かつ合成することが可能である。glnAp2プロモーターを含む
核酸断片を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用することが
可能である。この断片はここではさらなる構築のために使用できる。同様に、ヒ
スチジンプロテインキナーゼ遺伝子(例えばglnL)の欠失を含むE.col
i株を容易に調製できる。1つの考えられる方法に関する詳細な説明については
、Linkら(1997)J Bacteriol.l79(20):6228
−6237を参照されたい。所望の異種ポリペプチドをコードする配列は、該配
列がglnAp2プロモーターに機能的に連結されるように、glnAp2プロ
モーターの下流にクローニングすることが可能である。その後、不活性化された
glnL遺伝子を備えた宿主細胞は、該配列で形質転換され得る。形質転換株を
成長させ、成長している経過中のポリペプチドの生産をモニタすることができる
。FarmerとLiao(2000)Nat.Biotechnol 18:
533−537におけるように高い細胞密度では強いタンパク質発現を観察する
ことができる。上記文献の内容は参照により本明細書に組込まれる。
きる。プロモーターは、選択可能である(例えばcAMPに応答するプロモータ
ー)。そのようなプロモーターは、CREB、CREMあるいはATF−lタン
パク質に結合するcAMP応答エレメント(CRE)を含み得る。当該技術分野
における標準的技術を使用して、所望のコード配列を、プロモーターの制御下に
置き、哺乳類細胞中で形質転換することができる。いくつかの例では、構チク物
をウイルス(例えば不活性化ウイルス)に挿入できる。そのような実施により、
遺伝子治療シナリオにおいて異種生合成酵素により生産されるタンパク質または
代謝産物の調節的生産が許容される。植物細胞も宿主細胞として使用することが
可能である。繰り返し述べるが、適切なプロモーターは、選択可能である(例え
ば植物ホルモン、代謝産物、または所望の代謝産物の生産のための前駆体に応答
するプロモーター)。プロモーターはマイクロアレイ実験により同定することが
可能である。適切なベクターの所望のコード配列へ所望のプロモーターを融合さ
せた後に、その構築物をAgrobacterium tumefaciens
へ電気穿孔して入れ、当該技術分野における標準的方法を使用して植物細胞を形
質転換するために使用することができる。また別の例では、酵母細胞を操作して
、代謝制御下で異種ポリペプチドまたは代謝産物を発現させることができる。例
えば、Saccharomyces cerevisiaeプロモーターは、c
AMPにより調節されるプロモーター(例えばGis1、Msn2またはMsn
4タンパク質により結合されるプロモーター)であり得る。様々な代謝条件に応
じたすべての酵母遺伝子の調節は、ますます詳しく研究されるようになっている
。例えばDeRisiら(1997)Science 278:680−686
は、様々な代謝条件下に設定されたSaccharomyces cerevi
siae遺伝子のほぼ全体の転写プロファイルに続く実験について記載している
。そのようなデータに基づいて、所望の代謝産物により調節されるプロモーター
を選択できる。酵母プラスミドの生成及び酵母の形質転換は当該技術分野におい
て周知である。
ば、以下の遺伝子用の発現ベクターを構築することにより、リコピンを生産する
経路をE.coliに導入することができる:E.coli由来のdxs(1−
デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸シンターゼについてコードしている)
、Archaeoglobus fulgidus由来のgps(ゲラニルゲラ
ニル二リン酸(GGPP)シンターゼについてコードしている)及びErwin
ia uredovora由来のcrtBI(フィトエンシンターゼ及びデサチ
ュラーゼのそれぞれについてコードしている)。それらの遺伝子は、単一又は多
数のプラスミド上で存在できるか、E.coli染色体内に組み込まれる。さら
に、ホスホエノールピルビン酸シンターゼは、どんな方法(例えばglnAp2
プロモーターへの融合により)を使用しても、過剰発現させることができる。イ
ソペンチル二リン酸イソメラーゼは、どんな方法(例えばglnAp2プロモー
ターへの融合により)を使用しても、過剰発現させることができる。
チル酸)を生産する経路は、E.coliにおいて実施できる。PHAは、様々
な熱可塑的性質と商業的用途を備えたヒドロキシ酸の線形ポリエステルのファミ
リーである。アセチルCoAレベルがPHA合成用の前駆体有効性を示し得るた
め、3−ケトアシル補酵素A還元酵素及びポリ−3ヒドロキシアルカン酸ポリメ
ラーゼをコードするPseudomonas aeruginosa遺伝子は、
所望のプロモーター(例えばglnAp2)の制御下に置くことが可能である。
と考えられる。以下の例は単に例証的なものであって、開示の残りを如何様にも
制限するものではないと解釈すべきである。本明細書に引用した刊行物はすべて
、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
runswich Scietific社、ニュージャージー州Edison)
に入れて、指定培地を含む振とうフラスコ中で成長させた。培養物を、0.5%
(重量/体積)グルコースを含むM9規定塩類34又は1.5%(重量/体積)
グルコースを含むYE規定塩類から成る最小培地にて成長させた。YE規定塩類
は、(1リットル当たり)14g K2HPO4、16g KH2PO4、5g (
NH4)2SO4、1g MgSO4及び1mg チアミンより構成された。細胞の
濁度を、550mnにて分光光度計でモニタした。
inex HPX−87H、Bio−Rad Laboratories社、カ
リフォルニア州Hercules)に載せてHPLC(Constametri
c 3500 Solvent Delivery SystemとSpect
romonitor 3100 Variable Wavelength D
etector;LDC Analytical、フロリダ州Riviera
Beach)を用いて測定した。流動相は0.01NのH2SO4から成り、その
流量は0.6ml/分に維持した。カラムから離れたピークは、210nmで検
出した。グルコースを、Sigmaキット315−100番を用いて測定した。
リコピンの量を測定するために、1mlの細菌培養物をアセトンで抽出し、遠心
し、上清の吸光度を474nmで測定した。リコピン濃度を、標準曲線と吸光度
を比較することにより計算した。
ure 227:680−685に記述されている通りである。β−ガラクトシ
ダーゼ活性の測定は、Miller(1992)A Short Course
in Bacterial Genetics、Cold Spring H
arbor Laboratory Press,Cold Spring H
arbor NYによって記述されている通りに本質的に行われた。
ーの使用 アセチルリン酸レベルの増大は、過剰グルコース流出の指標である。本発明は
、過剰炭素流束を完全に利用し、かつ流束を有毒生成物である酢酸から遠ざけて
再誘導するための、宿主細胞、核酸配列、及び、所望の代謝経路中の速度制御酵
素の発現を調節するシグナルとしてのアセチルリン酸の使用方法をその特徴とす
る。
を検討するglnAp2プロモーターに機能的に連結される異種lacZ遺伝子
を含む核酸分子を構築した。プロモーターと2つのntrC−結合部位を含むg
lnAp2プロモーター領域は、当該技術分野で周知の標準方法により容易に得
ることが可能である。glnAp2プロモーターは、正方向プライマー5’−C
AGCTGCAAAGGTCATTGCACCAAC(工学設計されたPvuI
I部位を含む)及び逆方向プライマー5’−GGTACCAGTACGT−GT
TCAGCGGACATAC(工学設計されたKpnI部位を含む)を使用して
、E.coliゲノムDNAよりPCR増幅した。これらの2つのプライマーは
、公表されたDNA配列16(GenBankアクセッション番号M10421
)の位置93と343の間の領域を増幅した。
ングされ、それによりp2GFPuvが生成した。これは、プロモーターがない
lacZ遺伝子の前にglnAp2を含んでいる。glnAp2−lacZ領域
は相同組換えを介してλRS45に移動され(Simonら(1987)Gen
e53:85−96)、λp2GFPuvを生成した。JCL1595とJCL
1596を、感染によりにglnAp2−lacZ融合物を組み込むことにより
構築し(silhavyら、(1984)、Experments with
Gene Fusions,Cold Spring Harbor Labo
ratory Press,ニューヨーク州Cold Spring Harb
or)λp2GFPuvファージを染色体BWl37l1(lacX74)及び
BW18302(lacX glnL200l;Fengら、前掲)へそれぞれ
組み込む。この株は、glnLコード配列のコドン23〜182の間の内部欠失
から成り、おそらく無効突然変異が生じる(Fengら、前掲)、glnL20
0l対立遺伝子を含んでいる。
突然変異体について測定した。glnAp2−β−gal活性は、glnL宿主
(JCL1596)からの排泄された酢酸濃度と類似した時間依存的方法で増加
するが、同質遺伝子の野生型対照(JCLl595)に対してはプロモーター活
性の誘導は見出されなかった。
過剰の炭素流出に応答できる。細胞が後期指数成長期に近づくにつれて、生合成
要求は減少し、酢酸生成の増加により実証されるように、細胞は過剰炭素流出を
示し始めた。約6時間目のこの時点で、glnAp2−β−gal−活性は期せ
ずして上昇し始め(〜700nmol/分・mgタンパク質、表1参照)たが、
野生型株(JCL1595)のglnAp2−β−gal−活性は比較的低く、
始終一定に保たれた(〜100nmol/分・mgタンパク質、表1)。10時
間超過後、glnLがない場合のgInAp2−β−gal活性は著しかった(
1500nmol/分・mgタンパク質、表1)。glnAp2の誘導プロフィ
ルは、さらにlacプロモーター(Plac)のそれと明確に対照的である。株V
JS632(lac+)の染色体Plac活性はIPTG(イソプロピル)−β−D
−チオ−ガラクトピラノシド)による誘導後急速に増大し、細胞での一定レベル
の発現を達成した(〜550nmol/分・mgタンパク質、表1を参照)。こ
れは成長期とは無関係である。
2プロモーターの使用方法 2つの異なる代謝性酵素である、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(pp
s)と3−デオキシ−D−アラビノヘプチュロソネート 7−リン酸(DAHP
)シンターゼ(aroG)をglnAp2プロモーターの制御下に配置した。対
照として、これらの同じ2つのタンパク質を、同じ遺伝的背景及び環境要因下で
、静的制御を示すtacプロモーター(Ptac)から過剰発現させた。ppsを
発現する標準的方法は、成長遅延(Patnaikら(1992)J Bact
eriol 174:7527−7532)を引き起こす。
aroG pRW5tktを含むPCR断片を入れてクローニングすることによ
り構築した。プラスミドpPS706はPatnaikら、前掲に上述した。両
方のプラスミドは、Ptacプロモーターの下で各遺伝子を発現する。glnAp
2プロモーターを含むPCR断片を、プラスミドpAROGおよびpPS706
のEcoRV−EcoRI部位に入れてクローニングし、glnAp2プロモー
ターの下に各遺伝子をそれぞれ含むプラスミドp2AROG3及びpPSG70
6を生成した。
部で形質転換した。各プラスミドを備えた株をM9塩類グルコース培地で成長さ
せた。成長を5時間後に比較した。
延を引き起こした。しかしながら、glnAp2の使用は、期せずして正常な成
長に近かった(表2)。15時間後、タンパク質を各菌株より分離し、10%S
DS−PAGEゲルで分析した。pps遺伝子がglnAp2プロモーターによ
って制御された時、Ptacプロモーターと比較して、少なくとも500%多くの
ppsタンパク質が発現された。別の驚くべき発見では、AroGタンパク質(
その従来の過剰発現は明白に有害でない)も、発現のためのglnAp2プロモ
ーターを利用する細胞からの抽出物において、Ptacプロモーターと比較して、
少なくとも300%より豊富だった。
ゼをコードする)dxs、Archaeoglobus fulgidus由来
の(ゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)シンターゼをコードする)gps、
およびErwinia uredovora由来の(フィトエンシンターゼおよ
びデサチュラーゼをそれぞれコードする)crtBIにおいて組換えリコピン経
路を再構築した。これらの遺伝子を低コピー数プラスミドであるpCL1920
に挿入してpCW9を形成し、同時に過剰発現させた。
nAp2プロモーターを使用した。idi遺伝子を含む構築物は、プロモーター
のないベクターであるpJFl18に由来するものであった。glnAp2プロ
モーターを挿入して、p2IDIを形成した。対照として、Ptacプロモーター
を挿入してpTacIDIを形成した。これらのプラスミドを、pCW9を含む
glnL株(BWl8302)へ別々に導入した。P2IDI含有株(glnA
p2−idi)はグルコースを含む規定培地において100mg/Lリコピンを
生産した。他方、Ptac−jdiを含む株は、同一条件下では少量のリコピン(
<5mg/L)しか生産しなかった。さらに、p2IDI株はpTacIDIよ
りほぼ3倍少ない酢酸を生産したが、これは酢酸への炭素流出がリコピンに再び
向けられていることを示す。
sを過剰発現させ、リコピン経路の残り(dxx、gps、crtBI)をpC
Ll920を用いて発現させた。リコピン経路に関するpps及びidiの同時
発現は、リコピンの最終濃度を50%増大し、その生産力を0.05mg/(m
L・h)から0.16mg/(mL・h)まで3倍増大させた(表3)。これは
、生産量に有意な改良が観察されず実質的な成長阻害が起こらないptacID
IおよびpPS184(Ptac−idi+Ptac−pps)を共に含む菌株と対照
的である。
ykA))と1つの二重突然変異株(JCL1613(pykF pykA)を
生成するために、pykF::cat及びpykA::kan対立遺伝子を野生
型株に導入した(Ponceら(1995)J Bacteriol l77:
5719−5722)。二重突然変異株は約14mgリコピン/g乾燥菌体の最
終リコピン濃度を達成することができたが、単一の突然変異株の各々は約2.5
mgリコピン/g乾燥菌体のリコピン濃度を得た。単一のpyk突然変異体は、
野生型菌株と同様のレベルの〜4mgリコピン/g乾燥菌体のリコピンを生産し
た。さらに、Pck(ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ)の過剰発
現は、リコピンの採集濃度を約3倍増加させた。Ppc(ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ)の過剰発現はリコピン生産を約30%減少させた。
明の精神及び範囲から逸脱せずになされ得ることが理解される。従って、他の実
施形態が特許請求の範囲の範囲内にある。例えば、言及されたポリペプチド及び
遺伝子のすべての同族体は、本発明の範囲内に包含される。
Claims (35)
- 【請求項1】プロモーターと、異種ポリペプチドをコードする核酸配列とを
含む核酸配列を有する細菌の宿主細胞であって、前記核酸配列は応答調節タンパ
ク質によって制御される前記プロモーターに機能的に連結され、宿主細胞は窒素
飢餓がない状態でプロモーターがアセチルリン酸により調節されるように遺伝子
修飾されている、宿主細胞。 - 【請求項2】細菌細胞がE.coli細胞である、請求項1に記載の宿主細
胞。 - 【請求項3】プロモーターが、ntrC、phoB、phoP、ompR、
cheY、creB及びtorRから成るリストより選択された応答調節タンパ
ク質によって制御される、請求項1に記載の宿主細胞。 - 【請求項4】プロモーターがntrCによって結合される、請求項3に記載
の宿主細胞。 - 【請求項5】プロモーターがglnAp2である、請求項4に記載の宿主細
胞。 - 【請求項6】ヒスチジンプロテインキナーゼをコードする遺伝子の欠失また
は突然変異により宿主細胞が遺伝子修飾される、請求項1に記載の宿主細胞。 - 【請求項7】ヒスチジンプロテインキナーゼがglnLによりコードされる
、請求項6に記載の宿主細胞。 - 【請求項8】異種ポリペプチドが代謝産物の生産に必要な生合成酵素である
、請求項1に記載の宿主細胞。 - 【請求項9】プロモーターと異種代謝産物の生合成に必要な第1の酵素をコ
ードする核酸配列とを含む第1の発現カセットを含む宿主細胞であって、核酸配
列は窒素飢餓がない状態でのアセチルリン酸により制御されるプロモーターに機
能的に連結され、複数の核酸配列が代謝産物の生合成に必要な他の酵素を発現し
ている、宿主細胞。 - 【請求項10】代謝産物がイソプレノイドである、請求項9に記載の宿主細
胞。 - 【請求項11】イソプレノイドがカロチノイドである、請求項10に記載の
宿主細胞。 - 【請求項12】イソプレノイドがリコピン、β−カロテン、アスタキサンチ
ン、またはそれらの前駆体の1つである、請求項10に記載の宿主細胞。 - 【請求項13】第1の酵素がイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニ
ルゲラニル二リン酸シンターゼ、または1−デオキシキシルロース 5−リン酸
シンターゼである、請求項10に記載の宿主細胞。 - 【請求項14】第1の酵素がホスホエノールピルビン酸シンターゼである、
請求項9に記載の宿主細胞。 - 【請求項15】宿主細胞が細菌細胞である、請求項9に記載の宿主細胞。
- 【請求項16】細菌細胞がE.coli細胞である、請求項15に記載の宿
主細胞。 - 【請求項17】細胞が機能的ヒスチジンプロテインキナーゼ遺伝子を欠いて
いる、請求項15に記載の宿主細胞。 - 【請求項18】ntrC、phoB、ompR、cheY、creB、ph
oPまたはtorRによりプロモーターが制御される、請求項15に記載の宿主
細胞。 - 【請求項19】プロモーターがntrCにより結合される、請求項18に記
載の宿主細胞。 - 【請求項20】プロモーターがglnAp2である請求項19に記載の宿主
細胞。 - 【請求項21】宿主細胞が、アセチルリン酸濃度により調節されるプロモー
ターに機能的に連結されたホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする核
酸配列を含む第2の発現カセットをさらに含んでいる、請求項10に記載の宿主
細胞。 - 【請求項22】宿主細胞中で異種イソプレノイドを生産する方法であって、 異種ホスホエノールピルビン酸シンターゼを過剰発現する工程と、 異種イソプレノイドの合成に必要な生合成酵素を発現する工程と から成る方法。
- 【請求項23】宿主細胞中でリコピンを生産する方法であって、 異種1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸シンターゼ、異種ゲラニル
ゲラニル二リン酸シンターゼ、異種フィトエンシンターゼ及び異種フィトエンデ
サチュラーゼを発現する工程 から成る方法。 - 【請求項24】プロモーターが一定の宿主細胞中でアセチルリン酸により調
節されるよう、応答調節タンパク質により制御されたプロモーターを有する核酸
配列を含むキットであって、前記一定の宿主細胞は、ヒスチジンプロテインキナ
ーゼ遺伝子の欠失あるいは突然変異により遺伝子修飾されている、キット。 - 【請求項25】プロモーターと、第1の代謝産物の生産に必要な整合性酵素
をコードする配列とを含む核酸配列であって、前記配列は、その濃度が第1の代
謝産物の生合成のための前駆体の有効性を示す第2の代謝産物により調節される
プロモーターに機能的に連結される、核酸配列。 - 【請求項26】前記第2の代謝産物が、第1の代謝産物の生合成のための前
駆体から生じた排泄物質である、請求項25に記載の核酸配列。 - 【請求項27】第1の代謝産物がイソプレノイドである、請求項25に記載
の核酸配列。 - 【請求項28】イソプレノイドがカロチノイドである、請求項27に記載の
核酸配列。 - 【請求項29】イソプレノイドがβ−カロテン、アスタキサンチン、または
それらの前駆体の1つである、前駆体の請求項28に記載の核酸配列。 - 【請求項30】第2の代謝産物がアセチルリン酸、cAMP、フルクトース
1−リン酸またはフルクトース 6−リン酸である、請求項25に記載の核酸
配列。 - 【請求項31】第2の代謝産物がアセチルリン酸である、請求項30に記載
の核酸配列。 - 【請求項32】ntrC、phoB、ompR、cheY、creB、ph
oPまたはtorRによりプロモーターが制御される、請求項31に記載の核酸
配列。 - 【請求項33】プロモーターがntrCにより結合される、請求項32に記
載に記載の核酸配列。 - 【請求項34】プロモーターがglnAp2である請求項33に記載の核酸
配列。 - 【請求項35】生合成酵素がイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニ
ルゲラニル二リン酸シンターゼ、1−デオキシキシルロース 5−リン酸シンタ
ーゼ、またはホスホエノールピルビン酸シンターゼである、請求項27に記載の
核酸配列。
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