JP2003508085A - 代謝制御の工学設計 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、代謝産物及び代謝産物流速の調節制御下で細胞の異種分子を生産する方法をその特徴とする。該方法は、異種ポリペプチド及び異種代謝産物の合成を高めることができる。
Description
【０００１】
（発明の背景）
組換ＤＮＡ技術の利用により、宿主細胞を工学設計し、ポリペプチドや二次代
謝産物のような所望の化合物を生産することが可能になっている。工学設計され
た細胞におけるポリペプチドの大規模生産により、製薬的用途のタンパク質及び
工業的用途の酵素が生産される。二次代謝産物は、その生物学的及び医薬として
の重要性で長く知られている天然由来の産物である。そのような分子の構造が本
来複雑であるために、従来の化学合成では、化合物を調製するために多大な努力
や高価な前駆体及び補因子の使用をしばしば必要とする。近年、細胞における異
種タンパク質の発現は、安価な開始物質から代謝産物を生産する、微生物におけ
る異種生合成経路の工学設計を促進した。この方法で、ポリケチド、β−ラクタ
ム系抗生物質、モノテルペン、ステロイド及び芳香族を始めとする様々な化合物
が生産されている。
謝産物のような所望の化合物を生産することが可能になっている。工学設計され
た細胞におけるポリペプチドの大規模生産により、製薬的用途のタンパク質及び
工業的用途の酵素が生産される。二次代謝産物は、その生物学的及び医薬として
の重要性で長く知られている天然由来の産物である。そのような分子の構造が本
来複雑であるために、従来の化学合成では、化合物を調製するために多大な努力
や高価な前駆体及び補因子の使用をしばしば必要とする。近年、細胞における異
種タンパク質の発現は、安価な開始物質から代謝産物を生産する、微生物におけ
る異種生合成経路の工学設計を促進した。この方法で、ポリケチド、β−ラクタ
ム系抗生物質、モノテルペン、ステロイド及び芳香族を始めとする様々な化合物
が生産されている。
【０００２】
（発明の概要）
本発明は、一部において、二次代謝産物（例えばアセチルリン酸）の濃度によ
り調節されるプロモーターを使用したポリペプチド（例えば生合成酵素）の調節
的発現により、異種ポリペプチド及び異種代謝産物の生産が高められるという発
見に基づいている。用語「異種」とは、技術を用いて導入されるポリペプチド又
は代謝産物のことを指す。異種ポリペプチド又は代謝産物は、天然に存在する内
因性物質と同一であってもよい。用語「代謝産物」とは、１又は複数の生化学反
応の産物である有機化合物のことを指す。代謝産物はそれ自体他の反応のための
前駆体であってもよい。二次代謝産物は、別の生化学反応に由来する代謝産物で
ある。
り調節されるプロモーターを使用したポリペプチド（例えば生合成酵素）の調節
的発現により、異種ポリペプチド及び異種代謝産物の生産が高められるという発
見に基づいている。用語「異種」とは、技術を用いて導入されるポリペプチド又
は代謝産物のことを指す。異種ポリペプチド又は代謝産物は、天然に存在する内
因性物質と同一であってもよい。用語「代謝産物」とは、１又は複数の生化学反
応の産物である有機化合物のことを指す。代謝産物はそれ自体他の反応のための
前駆体であってもよい。二次代謝産物は、別の生化学反応に由来する代謝産物で
ある。
【０００３】
従って、１つの態様では、本発明は、プロモーターと、異種ポリペプチドをコ
ードする核酸配列とを含む核酸配列を有する細菌宿主細胞をその特徴とする。 細菌宿主細胞の例としては、エシェリシア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）、バチルス サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）、
サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍｕ
ｍ）、アグロバクテリウム チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、サーマス サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びリゾビウム リグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）細胞が包含される。該核酸配列は、応答調節
タンパク質により制御されるプロモーターと機能的に連結される。言いかえれば
、核酸配列は、ヌクレオチド配列のインビトロ及びインビボでの発現発現を許容
する様式でプロモーター配列に連結される。「プロモーター」とは、遺伝子物質
の転写を指図する任意のＤＮＡ断片のことを指す。プロモーターは、応答調節タ
ンパク質（例えばＥ．ｃｏｌｉのｎｔｒＣ、ｐｈｏＢ、ｐｈｏＰ、ｏｍｐＲ、ｃ
ｈｅＹ、Ｅ ｃｒｅＢ、又はｔｏｒＲあるいは他の細菌種由来のその同族体）に
よって制御される。さらに応答調節タンパク質は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃ
ｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＣＯＧ／（Ｔａｔｕｓｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０００）；２８：３３−３６）に定義されるような
クラスターオルソロガスグループ（ＣＯＧ）ＣＯＧ０７４５の別のメンバーであ
り得る。ある実行では、プロモーターはＥ．ｃｏｌｉ ｎｔｒＣにより結合され
る。用語「ｎｔｒＣ」とは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｎｔｒＣタンパク質（ＳＷＩＳＳＰ
ＲＯＴ：Ｐ０６７１３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／）及び適
切な他の細菌におけるその同族体の両方を指す。本明細書で使用する場合、「結
合」とは、１００未満ｎＭ、好ましくは１ｎＭ未満の平衡結合定数（ＫD）を有
する物理的会合のことを指す。プロモーターの１例はＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｎＡｐ
２プロモーター（例えば公表されたＤＮＡ配列中の約９３〜約３２３の領域、Ｇ
ｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１０４２１（Ｒｅｉｔｚｅｒ＆Ｍａｇａｓａ
ｎｉｋ（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：１９
７９−１９８３））である。この領域は、ｇｌｎＡ遺伝子由来の非翻訳配列を含
んでいる。さらに、ｇＩｎＡのコード配列と異種ポリペプチドのコード配列の間
には翻訳の融合物を構築することができる。
ードする核酸配列とを含む核酸配列を有する細菌宿主細胞をその特徴とする。 細菌宿主細胞の例としては、エシェリシア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）、バチルス サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）、
サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍｕ
ｍ）、アグロバクテリウム チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、サーマス サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びリゾビウム リグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）細胞が包含される。該核酸配列は、応答調節
タンパク質により制御されるプロモーターと機能的に連結される。言いかえれば
、核酸配列は、ヌクレオチド配列のインビトロ及びインビボでの発現発現を許容
する様式でプロモーター配列に連結される。「プロモーター」とは、遺伝子物質
の転写を指図する任意のＤＮＡ断片のことを指す。プロモーターは、応答調節タ
ンパク質（例えばＥ．ｃｏｌｉのｎｔｒＣ、ｐｈｏＢ、ｐｈｏＰ、ｏｍｐＲ、ｃ
ｈｅＹ、Ｅ ｃｒｅＢ、又はｔｏｒＲあるいは他の細菌種由来のその同族体）に
よって制御される。さらに応答調節タンパク質は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃ
ｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＣＯＧ／（Ｔａｔｕｓｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０００）；２８：３３−３６）に定義されるような
クラスターオルソロガスグループ（ＣＯＧ）ＣＯＧ０７４５の別のメンバーであ
り得る。ある実行では、プロモーターはＥ．ｃｏｌｉ ｎｔｒＣにより結合され
る。用語「ｎｔｒＣ」とは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｎｔｒＣタンパク質（ＳＷＩＳＳＰ
ＲＯＴ：Ｐ０６７１３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／）及び適
切な他の細菌におけるその同族体の両方を指す。本明細書で使用する場合、「結
合」とは、１００未満ｎＭ、好ましくは１ｎＭ未満の平衡結合定数（ＫD）を有
する物理的会合のことを指す。プロモーターの１例はＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｎＡｐ
２プロモーター（例えば公表されたＤＮＡ配列中の約９３〜約３２３の領域、Ｇ
ｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１０４２１（Ｒｅｉｔｚｅｒ＆Ｍａｇａｓａ
ｎｉｋ（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：１９
７９−１９８３））である。この領域は、ｇｌｎＡ遺伝子由来の非翻訳配列を含
んでいる。さらに、ｇＩｎＡのコード配列と異種ポリペプチドのコード配列の間
には翻訳の融合物を構築することができる。
【０００４】
宿主細胞は、窒素飢餓がない状態でプロモーターがアセチルリン酸により調節
されるように遺伝子修飾される。例えば、宿主細胞は、ヒスチジンプロテインキ
ナーゼ（（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ＣＯＧ／；Ｔａｔｕｓｏｖら、前掲）により定義されるようなＣＯＧ０６４２の
メンバー、例えばｇｌｎＬ、ｐｈｏＲ、ｐｈｏＱ、ｃｒｅＣ、又はｅｎｖＺ）を
コードする遺伝子の欠失や突然変異により遺伝的に修飾される。別の例において
、ヒスチジンプロテインキナーゼは、プロモーターを制御する応答調節タンパク
質に対して特異性を有している。ヒスチジンプロテインキナーゼは、ｇｌｎＬ（
例えばＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｎＬ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ ＰＯ６７１２；ｈｔｔｐ
：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／））によりコードされ得る。
されるように遺伝子修飾される。例えば、宿主細胞は、ヒスチジンプロテインキ
ナーゼ（（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ＣＯＧ／；Ｔａｔｕｓｏｖら、前掲）により定義されるようなＣＯＧ０６４２の
メンバー、例えばｇｌｎＬ、ｐｈｏＲ、ｐｈｏＱ、ｃｒｅＣ、又はｅｎｖＺ）を
コードする遺伝子の欠失や突然変異により遺伝的に修飾される。別の例において
、ヒスチジンプロテインキナーゼは、プロモーターを制御する応答調節タンパク
質に対して特異性を有している。ヒスチジンプロテインキナーゼは、ｇｌｎＬ（
例えばＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｎＬ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ ＰＯ６７１２；ｈｔｔｐ
：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／））によりコードされ得る。
【０００５】
宿主細胞は、異種ポリペプチド又は代謝産物の発現のために、窒素飢餓がない
状態でプロモーターがアセチルリン酸により調節されるように遺伝子修飾される
が、宿主細胞は任意の所望の条件下で（例えば窒素飢餓状態、窒素が不十分な状
態、あるいは窒素が豊富な状態）増殖させることが可能である。
状態でプロモーターがアセチルリン酸により調節されるように遺伝子修飾される
が、宿主細胞は任意の所望の条件下で（例えば窒素飢餓状態、窒素が不十分な状
態、あるいは窒素が豊富な状態）増殖させることが可能である。
【０００６】
核酸配列によってコードされる異種ポリペプチドは、代謝産物の生産のために
必要な生合成酵素であり得る。異種ポリペプチドは、哺乳類のタンパク質（例え
ば分泌増殖因子、モノクローナル抗体、細胞外マトリックス成分）であり得る。
必要な生合成酵素であり得る。異種ポリペプチドは、哺乳類のタンパク質（例え
ば分泌増殖因子、モノクローナル抗体、細胞外マトリックス成分）であり得る。
【０００７】
さらに別の例では、異種ポリペプチドは、ワクチンに使用される所望の抗原（
例えばウイルス、細菌、真菌、原生生物病原体由来の表面タンパク質）であり得
る。
例えばウイルス、細菌、真菌、原生生物病原体由来の表面タンパク質）であり得
る。
【０００８】
本発明の別の態様は、応答調節タンパク質によって制御されるプロモーターを
有する核酸配列を含むキットをその特徴とする。該キットはさらに、窒素飢餓が
ない状態でプロモーターがアセチルリン酸により調節されるように遺伝子修飾さ
れる細菌宿主細胞を、任意に含む。キットはさらに、その使用に対する使用説明
書を提供できる。核酸配列は、制限酵素ポリリンカーに挿入された配列が、応答
調節タンパク質により制御されるプロモーターに機能的に連結するように、プロ
モーターに３’位置に配置された制限酵素ポリリンカーを含み得る。キットの１
つの実施では、プロモーターがＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｎＡｐ２プロモーターであり
、細菌宿主細胞はｇｌｎＬ遺伝子の変異か欠失を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
有する核酸配列を含むキットをその特徴とする。該キットはさらに、窒素飢餓が
ない状態でプロモーターがアセチルリン酸により調節されるように遺伝子修飾さ
れる細菌宿主細胞を、任意に含む。キットはさらに、その使用に対する使用説明
書を提供できる。核酸配列は、制限酵素ポリリンカーに挿入された配列が、応答
調節タンパク質により制御されるプロモーターに機能的に連結するように、プロ
モーターに３’位置に配置された制限酵素ポリリンカーを含み得る。キットの１
つの実施では、プロモーターがＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｎＡｐ２プロモーターであり
、細菌宿主細胞はｇｌｎＬ遺伝子の変異か欠失を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
【０００９】
本発明の別の態様は、第１の発現カセットを含む宿主細胞をその特徴とする。
第１の発現カセットは、上述したののうち任意のもののようなプロモーターと、
異種代謝産物の生合成に必要な酵素をコードする核酸配列とを有している。本明
細書で使用する場合、「酵素」とは、１つの化学反応か複数の反応を触媒する能
力を有するポリペプチドのことを指す。核酸配列は、窒素飢餓がない状態でアセ
チルリン酸により調節されるプロモーターに機能的に連結されている。宿主細胞
は、代謝産物の生合成に必要な他の酵素の発現のための追加の複数の核酸配列も
含み得る。そのような追加の配列は、内因性酵素を発現する内因性配列であって
もよいし、異種酵素を発現する導入配列であってもよい。
第１の発現カセットは、上述したののうち任意のもののようなプロモーターと、
異種代謝産物の生合成に必要な酵素をコードする核酸配列とを有している。本明
細書で使用する場合、「酵素」とは、１つの化学反応か複数の反応を触媒する能
力を有するポリペプチドのことを指す。核酸配列は、窒素飢餓がない状態でアセ
チルリン酸により調節されるプロモーターに機能的に連結されている。宿主細胞
は、代謝産物の生合成に必要な他の酵素の発現のための追加の複数の核酸配列も
含み得る。そのような追加の配列は、内因性酵素を発現する内因性配列であって
もよいし、異種酵素を発現する導入配列であってもよい。
【００１０】
１例において、異種代謝産物はイソプレノイド、ポリヒドロキシアルカン酸、
ポリケチド、β−ラクタム系抗生物質、芳香族、または前駆体（例えば上流代謝
産物）もしくはその誘導体（例えば下流代謝産物）である。例えば、イソプレノ
イドは、カロチノイド、ステロール、タキソール（商標）、ジテルペン、ジベレ
リン及びキノンであり得る。イソプレノイドの特定の例には、イソペンチル二リ
ン酸、ジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲ
ラニルゲラニル二リン酸及びフィトエンが包含される。カロチノイドの特定の例
には、β−カロテン、ζ−カロテン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、ゼア
キサンチン−β−グルコシド、フィトフルエン、ニューロスポレン、ルテイン及
びトルエンが包含される。所望の異種代謝産物がイソプレノイドである場合、異
種酵素はイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シン
ターゼ、または１−デオキシキシルロース ５−リン酸シンターゼであり得る。
所望の異種代謝産物がポリヒドロキシアルカン酸である場合、異種酵素は、３−
ケトアシル還元酵素またはポリ−３−ヒドロキシアルカン酸ポリメラーゼであり
得る。
ポリケチド、β−ラクタム系抗生物質、芳香族、または前駆体（例えば上流代謝
産物）もしくはその誘導体（例えば下流代謝産物）である。例えば、イソプレノ
イドは、カロチノイド、ステロール、タキソール（商標）、ジテルペン、ジベレ
リン及びキノンであり得る。イソプレノイドの特定の例には、イソペンチル二リ
ン酸、ジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲ
ラニルゲラニル二リン酸及びフィトエンが包含される。カロチノイドの特定の例
には、β−カロテン、ζ−カロテン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、ゼア
キサンチン−β−グルコシド、フィトフルエン、ニューロスポレン、ルテイン及
びトルエンが包含される。所望の異種代謝産物がイソプレノイドである場合、異
種酵素はイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シン
ターゼ、または１−デオキシキシルロース ５−リン酸シンターゼであり得る。
所望の異種代謝産物がポリヒドロキシアルカン酸である場合、異種酵素は、３−
ケトアシル還元酵素またはポリ−３−ヒドロキシアルカン酸ポリメラーゼであり
得る。
【００１１】
宿主細胞は細菌細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞）であり得る。上述したように
、宿主細胞は、遺伝子（例えばヒスチジンプロテインキナーゼをコードする遺伝
子）の欠失あるいは突然変異により任意に遺伝子修飾される。１つの特定の例に
おいて、宿主細胞はは、アセチルリン酸濃度により調節されたプロモーター（例
えばｇｌｎＡｐ２）に機能的に連結されたホスホエノールピルビン酸シンターゼ
をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットをさらに含む。
、宿主細胞は、遺伝子（例えばヒスチジンプロテインキナーゼをコードする遺伝
子）の欠失あるいは突然変異により任意に遺伝子修飾される。１つの特定の例に
おいて、宿主細胞はは、アセチルリン酸濃度により調節されたプロモーター（例
えばｇｌｎＡｐ２）に機能的に連結されたホスホエノールピルビン酸シンターゼ
をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットをさらに含む。
【００１２】
本発明の別の態様は、宿主細胞中で異種イソプレノイドを生産する方法をその
特徴とする。該方法は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼを過剰発現し、異
種イソプレノイドの合成に必要な生合成酵素を発現する工程から成る。１つの実
施では、ピルビン酸キナーゼまたはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
をコードする宿主細胞中の遺伝子が、遺伝子学的に削除されるか弱められる。別
の実施では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子
が宿主細胞中で過剰発現される。本発明のさらに別の態様は、宿主細胞でリコピ
ンを生産する方法をその特徴とする。該方法は次の異種酵素を発現する工程から
成る：ｌ−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸シンターゼ、ゲラニルゲラ
ニル二リン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、およびフィトエンサチュラー
ゼ。この方法の１つの実施では、例えばｇｌｎＡｐ２プロモーターを使用して、
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが過剰発現される。別の実施では、例えば
ｇｌｎＡｐ２プロモーターを使用して、ホスホエノールピルビン酸シンターゼが
過剰発現される。
特徴とする。該方法は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼを過剰発現し、異
種イソプレノイドの合成に必要な生合成酵素を発現する工程から成る。１つの実
施では、ピルビン酸キナーゼまたはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
をコードする宿主細胞中の遺伝子が、遺伝子学的に削除されるか弱められる。別
の実施では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子
が宿主細胞中で過剰発現される。本発明のさらに別の態様は、宿主細胞でリコピ
ンを生産する方法をその特徴とする。該方法は次の異種酵素を発現する工程から
成る：ｌ−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸シンターゼ、ゲラニルゲラ
ニル二リン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、およびフィトエンサチュラー
ゼ。この方法の１つの実施では、例えばｇｌｎＡｐ２プロモーターを使用して、
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが過剰発現される。別の実施では、例えば
ｇｌｎＡｐ２プロモーターを使用して、ホスホエノールピルビン酸シンターゼが
過剰発現される。
【００１３】
本発明の別の態様は、プロモーターと、第１の代謝産物の生産に必要な生合成
酵素をコードする配列とを含む核酸配列をその特徴とする。プロモーターは、該
配列に機能的に連結され、その濃度が第１の代謝産物の生合成のための前駆体の
有効性を示す第２の代謝産物によって調節される。１例において、第２の代謝産
物は、第１の代謝産物の生合成のための前駆体から生産された排泄物質である。
酵素をコードする配列とを含む核酸配列をその特徴とする。プロモーターは、該
配列に機能的に連結され、その濃度が第１の代謝産物の生合成のための前駆体の
有効性を示す第２の代謝産物によって調節される。１例において、第２の代謝産
物は、第１の代謝産物の生合成のための前駆体から生産された排泄物質である。
【００１４】
１つの実施では、第１の代謝産物がポリヒドロキシアルカン酸（例えばポリヒ
ドロキシブチル酸）であり、核酸配列は生合成酵素（例えば、３−ケトアシル補
酵素Ａ（ｃｏＡ）還元酵素またはポリ−３−ヒドロキシオクタノイル−ＣｏＡポ
リメラーゼ）をコードする。別の場合では、第１の代謝産物がポリケチド、β−
ラクタム系抗生物質、または芳香族である。さらに別の場合では、第１の代謝産
物がイソプレノイド（例えば本明細書で言及したイソプレノイド）である。核酸
配列は、イソプレノイドの生産に必要な整合性酵素（例えばイソペンテニル二リ
ン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、１−デオキシキシル
ロース ５−リン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、ファル
ネシル二リン酸シンターゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、フィトエン
シンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、リコピンシクラーゼ）をコードし得る
。イソプレノイドの前駆体の１つはピルビン酸であり得る。ピルビン酸濃度は酢
酸及びアセチルリン酸濃度と関係がある。従って、この例では、第２の代謝産物
はアセチルリン酸である。アセチルリン酸に応答するプロモーターは、応答調節
タンパク質（例えば上述した応答調節タンパク質）により制御され得る。そのよ
うなプロモーターは、特定の宿主細胞中のアセチルリン酸にしか応答しないよう
にし得る。特定の例において、アセチルリン酸濃度に応答するプロモーターは、
Ｅ．ｃｏｌｉ ｎｔｒＣ（例えばＥ．ｃｃｌｉ ｇｌｎＡｐ２プロモーター）に
より結合される。
ドロキシブチル酸）であり、核酸配列は生合成酵素（例えば、３−ケトアシル補
酵素Ａ（ｃｏＡ）還元酵素またはポリ−３−ヒドロキシオクタノイル−ＣｏＡポ
リメラーゼ）をコードする。別の場合では、第１の代謝産物がポリケチド、β−
ラクタム系抗生物質、または芳香族である。さらに別の場合では、第１の代謝産
物がイソプレノイド（例えば本明細書で言及したイソプレノイド）である。核酸
配列は、イソプレノイドの生産に必要な整合性酵素（例えばイソペンテニル二リ
ン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、１−デオキシキシル
ロース ５−リン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、ファル
ネシル二リン酸シンターゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、フィトエン
シンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、リコピンシクラーゼ）をコードし得る
。イソプレノイドの前駆体の１つはピルビン酸であり得る。ピルビン酸濃度は酢
酸及びアセチルリン酸濃度と関係がある。従って、この例では、第２の代謝産物
はアセチルリン酸である。アセチルリン酸に応答するプロモーターは、応答調節
タンパク質（例えば上述した応答調節タンパク質）により制御され得る。そのよ
うなプロモーターは、特定の宿主細胞中のアセチルリン酸にしか応答しないよう
にし得る。特定の例において、アセチルリン酸濃度に応答するプロモーターは、
Ｅ．ｃｏｌｉ ｎｔｒＣ（例えばＥ．ｃｃｌｉ ｇｌｎＡｐ２プロモーター）に
より結合される。
【００１５】
プロモーターはｃＡＭＰにより制御可能である。プロモーターは、ＣＡＰ（カ
タボライトアクチベータータンパク質）に結合する細菌プロモーターであり得る
。哺乳動物では、プロモーターが、ＣＲＥＢ、ＣＲＥＭあるいはＡＴＦ−１タン
パク質に結合するｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）を含むプロモーターであり
得る。酵母細胞では、プロモーターが、ｃＡＭＰにより調節されるプロモーター
か、Ｇｉｓｌ、Ｍｓｎ２またはＭｓｎ４タンパク質により結合されるプロモータ
ーであり得る。プロモーターの別の考えられる調節シグナルは、フルクトース
１−リン酸、またはフルクトース ６−リン酸であり得る。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｒ
ｕＲタンパク質はそのようなプロモーターを調節する。
タボライトアクチベータータンパク質）に結合する細菌プロモーターであり得る
。哺乳動物では、プロモーターが、ＣＲＥＢ、ＣＲＥＭあるいはＡＴＦ−１タン
パク質に結合するｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）を含むプロモーターであり
得る。酵母細胞では、プロモーターが、ｃＡＭＰにより調節されるプロモーター
か、Ｇｉｓｌ、Ｍｓｎ２またはＭｓｎ４タンパク質により結合されるプロモータ
ーであり得る。プロモーターの別の考えられる調節シグナルは、フルクトース
１−リン酸、またはフルクトース ６−リン酸であり得る。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｒ
ｕＲタンパク質はそのようなプロモーターを調節する。
【００１６】
核酸配列はプラスミドに含まれ得る。プラスミドはさらに、細菌の複製起点と
選択マーカーを含み得る。核酸配列はさらに、酵母や他の真核生物の複製起点と
適切な選択マーカーを含み、ゲノムへ組み込まれ得る。
選択マーカーを含み得る。核酸配列はさらに、酵母や他の真核生物の複製起点と
適切な選択マーカーを含み、ゲノムへ組み込まれ得る。
【００１７】
宿主細胞中の異種化合物の生合成の最適化は、細胞生理学のパラメータを感知
することと、生合成の調節のためにそのようなパラメータを利用すること依存し
ている。当該技術分野における１つの標準的技術は、細胞を成長させ、ユーザー
が所望の産物の生合成に必要な遺伝子をオンにするために外因的に薬剤（例えば
誘導物質）を加えることである。成長遅延及び代謝活性の減少を引き起こす組換
えタンパク質または経路の高レベルの誘導が広く観察された（Ｋｕｒｌａｎｄと
Ｄｏｎｇ（１９９６）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２１：１−４）。外因的に
誘導物質を供給する実施行為は経験的なものであり、生合成用の細胞の資源の有
効性をモニタしない。対照的に、天然経路はそのようなプロセスを制御するフィ
ードバック機構に依存する。特定のプロモーターと、本発明における特定の遺伝
学的に定義された宿主細胞及び異種ポリペプチドとを組み合わせると、細胞の代
謝期に応じて異種ポリペプチドや代謝産物合成への速度を調節する高度に精密か
つ用途の広い制御回路が期せずして得られる。確かに、動的に抑制された組換え
経路は、生産の増大と、最小限の成長遅延と、有害な副産物生成の減少とを提供
する。生理的状態に応じた遺伝子発現の調節は、遺伝子治療のような他の用途に
も有用であろう。
することと、生合成の調節のためにそのようなパラメータを利用すること依存し
ている。当該技術分野における１つの標準的技術は、細胞を成長させ、ユーザー
が所望の産物の生合成に必要な遺伝子をオンにするために外因的に薬剤（例えば
誘導物質）を加えることである。成長遅延及び代謝活性の減少を引き起こす組換
えタンパク質または経路の高レベルの誘導が広く観察された（Ｋｕｒｌａｎｄと
Ｄｏｎｇ（１９９６）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２１：１−４）。外因的に
誘導物質を供給する実施行為は経験的なものであり、生合成用の細胞の資源の有
効性をモニタしない。対照的に、天然経路はそのようなプロセスを制御するフィ
ードバック機構に依存する。特定のプロモーターと、本発明における特定の遺伝
学的に定義された宿主細胞及び異種ポリペプチドとを組み合わせると、細胞の代
謝期に応じて異種ポリペプチドや代謝産物合成への速度を調節する高度に精密か
つ用途の広い制御回路が期せずして得られる。確かに、動的に抑制された組換え
経路は、生産の増大と、最小限の成長遅延と、有害な副産物生成の減少とを提供
する。生理的状態に応じた遺伝子発現の調節は、遺伝子治療のような他の用途に
も有用であろう。
【００１８】
本発明の１又は複数の実施形態の詳細を、以下の詳細な説明で述べる。本発明
の他の特徴、目的及び利点が以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかと
なるであろう。
の他の特徴、目的及び利点が以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかと
なるであろう。
【００１９】
（詳細な説明）
本発明は、代謝制御を工学設計する方法（例えばタンパク質生産あるいは代謝
産物合成のいずれかのためのタンパク質発現を最適化するために特定宿主細胞中
のプロモーターを利用する方法）を提供する。
産物合成のいずれかのためのタンパク質発現を最適化するために特定宿主細胞中
のプロモーターを利用する方法）を提供する。
【００２０】
本発明の中心となる構成要素は、プロモーターと、発現が望まれる異種ポリペ
プチドをコードする核酸配列とを含む発現カセットである。発現カセットはコー
ドする核酸配列がプロモーターと機能的に連結される（例えばプロモーターによ
り調節される）ように、当該技術分野における標準的方法を用いて構築される。
プロモーターは、細胞生理学か細胞代謝期のパラメータによりプロモーターが調
節されるように選択される。様々なプロモーターを使用することが可能である。
いくつかの用途では、発現カセットが、細菌の複製起点と選択マーカーを備えた
細菌性プラスミドのようなプラスミド内に含まれる。発現カセットは当該技術分
野における標準的技術を使用して、細胞のゲノムへ組み込むことができる。
プチドをコードする核酸配列とを含む発現カセットである。発現カセットはコー
ドする核酸配列がプロモーターと機能的に連結される（例えばプロモーターによ
り調節される）ように、当該技術分野における標準的方法を用いて構築される。
プロモーターは、細胞生理学か細胞代謝期のパラメータによりプロモーターが調
節されるように選択される。様々なプロモーターを使用することが可能である。
いくつかの用途では、発現カセットが、細菌の複製起点と選択マーカーを備えた
細菌性プラスミドのようなプラスミド内に含まれる。発現カセットは当該技術分
野における標準的技術を使用して、細胞のゲノムへ組み込むことができる。
【００２１】
後期対数増殖期中または定常期中の異種ポリペプチドの調節的生産を工学設計
するために発現カセットが使用される場合、それに従ってプロモーターも選択さ
れ得る。例えば小分子シグナル（例えばセカンドメッセンジャー）（後期対数増
殖期中または定常期中にそのレベルは蓄積する）に応答するプロモーターが選択
される。セカンドメッセンジャーは、生化学経路の前駆体、中間体、または排泄
物質として蓄積する分子であり得る。細菌では、小分子シグナルが解糖の中間体
（例えばフルクトース １−リン酸、フルクトース ６−リン酸）、または解糖
の排泄物質（例えば酢酸、アセチルリン酸））であり得る。真核細胞では、ｃＡ
ＭＰ濃度が栄養状態の有名なシグナルである。
するために発現カセットが使用される場合、それに従ってプロモーターも選択さ
れ得る。例えば小分子シグナル（例えばセカンドメッセンジャー）（後期対数増
殖期中または定常期中にそのレベルは蓄積する）に応答するプロモーターが選択
される。セカンドメッセンジャーは、生化学経路の前駆体、中間体、または排泄
物質として蓄積する分子であり得る。細菌では、小分子シグナルが解糖の中間体
（例えばフルクトース １−リン酸、フルクトース ６−リン酸）、または解糖
の排泄物質（例えば酢酸、アセチルリン酸））であり得る。真核細胞では、ｃＡ
ＭＰ濃度が栄養状態の有名なシグナルである。
【００２２】
発現カセット中のプロモーターは、多量発現分析実験（例えば遺伝子チップ実
験）の結果に基いて選択することが可能である。アセチルリン酸により誘導され
る遺伝子は、酢酸で成長中の細胞より調製したマイクロアレイ標識ｃＤＮＡにハ
イブリダイズさせ、そのシグナルを基準シグナル（例えば初期対数成長期の細胞
より調製したｃＤＮＡに関して得られたシグナル）と比較することにより同定す
ることが可能である。その実験は、原核細胞と真核細胞の両方（例えば、細菌、
酵母、植物、哺乳類細胞）で実行できる。原核生物におけるそのような実験の例
については、Ｔａｌａａｔら（２０００） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １
８：６７９−８２とＯｈ＆Ｌｉａｏ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏ
ｇ．１６：２７８−８６を参照されたい。所望の条件下で発現されている遺伝子
がひとたび同定されると、そのプロモーターが発現カセットにて利用され得る。
代わりに、所望の分子（例えば代謝経路中の前駆体）の外因的追加により行われ
るか、実験条件（例えば後期対数期までの成長または生合成酵素が過剰生産され
ている間の成長）の操作により行われる。プロモーターは、誘導した遺伝子に基
づいて同定できる。
験）の結果に基いて選択することが可能である。アセチルリン酸により誘導され
る遺伝子は、酢酸で成長中の細胞より調製したマイクロアレイ標識ｃＤＮＡにハ
イブリダイズさせ、そのシグナルを基準シグナル（例えば初期対数成長期の細胞
より調製したｃＤＮＡに関して得られたシグナル）と比較することにより同定す
ることが可能である。その実験は、原核細胞と真核細胞の両方（例えば、細菌、
酵母、植物、哺乳類細胞）で実行できる。原核生物におけるそのような実験の例
については、Ｔａｌａａｔら（２０００） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １
８：６７９−８２とＯｈ＆Ｌｉａｏ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏ
ｇ．１６：２７８−８６を参照されたい。所望の条件下で発現されている遺伝子
がひとたび同定されると、そのプロモーターが発現カセットにて利用され得る。
代わりに、所望の分子（例えば代謝経路中の前駆体）の外因的追加により行われ
るか、実験条件（例えば後期対数期までの成長または生合成酵素が過剰生産され
ている間の成長）の操作により行われる。プロモーターは、誘導した遺伝子に基
づいて同定できる。
【００２３】
１例において、発現カセットは細菌細胞中の代謝産物の調節的生産を工学設計
するために使用される。その濃度が第１の代謝産物の生合成のための前駆体の有
効性を示す、第２の代謝産物により調節されるプロモーターを選択することが可
能である。例えば、第１の代謝産物が前駆体、ピルビン酸及びグリセルアルデヒ
ド ３−リン酸から合成されるイソプレノイドである場合、第２の代謝産物はア
セチルリン酸であり得る。豊富な環境では、細胞は、ピルビン酸の生成物である
アセチルＣｏＡの過剰量を生産する。過剰アセチルＣｏＡは、ＡＴＰと酢酸（排
泄物質として分泌される）を生産するために使用される。酢酸濃度は細胞密度と
共に増加する。酢酸、アセチルＣｏＡ、及びアセチルリン酸濃度は、以下の生化
学反応に相互に関連付けられる。 （１）アセチルＣｏＡ＋Ｐｉ＜−＞アセチルリン酸＋ＣｏＡ （２）アセチルリン酸＋ＡＤＰ＜−＞酢酸＋ＡＴＰ
するために使用される。その濃度が第１の代謝産物の生合成のための前駆体の有
効性を示す、第２の代謝産物により調節されるプロモーターを選択することが可
能である。例えば、第１の代謝産物が前駆体、ピルビン酸及びグリセルアルデヒ
ド ３−リン酸から合成されるイソプレノイドである場合、第２の代謝産物はア
セチルリン酸であり得る。豊富な環境では、細胞は、ピルビン酸の生成物である
アセチルＣｏＡの過剰量を生産する。過剰アセチルＣｏＡは、ＡＴＰと酢酸（排
泄物質として分泌される）を生産するために使用される。酢酸濃度は細胞密度と
共に増加する。酢酸、アセチルＣｏＡ、及びアセチルリン酸濃度は、以下の生化
学反応に相互に関連付けられる。 （１）アセチルＣｏＡ＋Ｐｉ＜−＞アセチルリン酸＋ＣｏＡ （２）アセチルリン酸＋ＡＤＰ＜−＞酢酸＋ＡＴＰ
【００２４】
このように、アセチルリン酸濃度が高いことは、アセチルＣｏＡとピルビン酸
が過剰であることを示す。ｇｌｎＬの欠失あるいは突然変異により遺伝子修飾さ
れた宿主細胞は、例えば、ｎｔｒＣ機能をアセチルリン酸依存的にさせる（Ｆｅ
ｎｇら、（１９９２）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７４：６０６１−６０７０）
。この方法では、ｎｔｒＣにより調節されるプロモーター（例えばｇｌｎＡｐ２
プロモーター）が、アセチルリン酸に応じて遺伝子発現を制御するために使用で
きる。ｇｌｎＡｐ２プロモーターは当該技術分野における標準的技術を使用して
得ることが可能である。例えば、ｇｌｎＡｐ２プロモーターとアニールするプラ
イマーを設計かつ合成することが可能である。ｇｌｎＡｐ２プロモーターを含む
核酸断片を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することが
可能である。この断片はここではさらなる構築のために使用できる。同様に、ヒ
スチジンプロテインキナーゼ遺伝子（例えばｇｌｎＬ）の欠失を含むＥ．ｃｏｌ
ｉ株を容易に調製できる。１つの考えられる方法に関する詳細な説明については
、Ｌｉｎｋら（１９９７）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｌ７９（２０）：６２２８
−６２３７を参照されたい。所望の異種ポリペプチドをコードする配列は、該配
列がｇｌｎＡｐ２プロモーターに機能的に連結されるように、ｇｌｎＡｐ２プロ
モーターの下流にクローニングすることが可能である。その後、不活性化された
ｇｌｎＬ遺伝子を備えた宿主細胞は、該配列で形質転換され得る。形質転換株を
成長させ、成長している経過中のポリペプチドの生産をモニタすることができる
。ＦａｒｍｅｒとＬｉａｏ（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：
５３３−５３７におけるように高い細胞密度では強いタンパク質発現を観察する
ことができる。上記文献の内容は参照により本明細書に組込まれる。
が過剰であることを示す。ｇｌｎＬの欠失あるいは突然変異により遺伝子修飾さ
れた宿主細胞は、例えば、ｎｔｒＣ機能をアセチルリン酸依存的にさせる（Ｆｅ
ｎｇら、（１９９２）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７４：６０６１−６０７０）
。この方法では、ｎｔｒＣにより調節されるプロモーター（例えばｇｌｎＡｐ２
プロモーター）が、アセチルリン酸に応じて遺伝子発現を制御するために使用で
きる。ｇｌｎＡｐ２プロモーターは当該技術分野における標準的技術を使用して
得ることが可能である。例えば、ｇｌｎＡｐ２プロモーターとアニールするプラ
イマーを設計かつ合成することが可能である。ｇｌｎＡｐ２プロモーターを含む
核酸断片を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することが
可能である。この断片はここではさらなる構築のために使用できる。同様に、ヒ
スチジンプロテインキナーゼ遺伝子（例えばｇｌｎＬ）の欠失を含むＥ．ｃｏｌ
ｉ株を容易に調製できる。１つの考えられる方法に関する詳細な説明については
、Ｌｉｎｋら（１９９７）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｌ７９（２０）：６２２８
−６２３７を参照されたい。所望の異種ポリペプチドをコードする配列は、該配
列がｇｌｎＡｐ２プロモーターに機能的に連結されるように、ｇｌｎＡｐ２プロ
モーターの下流にクローニングすることが可能である。その後、不活性化された
ｇｌｎＬ遺伝子を備えた宿主細胞は、該配列で形質転換され得る。形質転換株を
成長させ、成長している経過中のポリペプチドの生産をモニタすることができる
。ＦａｒｍｅｒとＬｉａｏ（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：
５３３−５３７におけるように高い細胞密度では強いタンパク質発現を観察する
ことができる。上記文献の内容は参照により本明細書に組込まれる。
【００２５】
ポリペプチドか代謝産物の生産のための宿主細胞として、哺乳類細胞を使用で
きる。プロモーターは、選択可能である（例えばｃＡＭＰに応答するプロモータ
ー）。そのようなプロモーターは、ＣＲＥＢ、ＣＲＥＭあるいはＡＴＦ−ｌタン
パク質に結合するｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）を含み得る。当該技術分野
における標準的技術を使用して、所望のコード配列を、プロモーターの制御下に
置き、哺乳類細胞中で形質転換することができる。いくつかの例では、構チク物
をウイルス（例えば不活性化ウイルス）に挿入できる。そのような実施により、
遺伝子治療シナリオにおいて異種生合成酵素により生産されるタンパク質または
代謝産物の調節的生産が許容される。植物細胞も宿主細胞として使用することが
可能である。繰り返し述べるが、適切なプロモーターは、選択可能である（例え
ば植物ホルモン、代謝産物、または所望の代謝産物の生産のための前駆体に応答
するプロモーター）。プロモーターはマイクロアレイ実験により同定することが
可能である。適切なベクターの所望のコード配列へ所望のプロモーターを融合さ
せた後に、その構築物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
へ電気穿孔して入れ、当該技術分野における標準的方法を使用して植物細胞を形
質転換するために使用することができる。また別の例では、酵母細胞を操作して
、代謝制御下で異種ポリペプチドまたは代謝産物を発現させることができる。例
えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロモーターは、ｃ
ＡＭＰにより調節されるプロモーター（例えばＧｉｓ１、Ｍｓｎ２またはＭｓｎ
４タンパク質により結合されるプロモーター）であり得る。様々な代謝条件に応
じたすべての酵母遺伝子の調節は、ますます詳しく研究されるようになっている
。例えばＤｅＲｉｓｉら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：６８０−６８６
は、様々な代謝条件下に設定されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ遺伝子のほぼ全体の転写プロファイルに続く実験について記載している
。そのようなデータに基づいて、所望の代謝産物により調節されるプロモーター
を選択できる。酵母プラスミドの生成及び酵母の形質転換は当該技術分野におい
て周知である。
きる。プロモーターは、選択可能である（例えばｃＡＭＰに応答するプロモータ
ー）。そのようなプロモーターは、ＣＲＥＢ、ＣＲＥＭあるいはＡＴＦ−ｌタン
パク質に結合するｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）を含み得る。当該技術分野
における標準的技術を使用して、所望のコード配列を、プロモーターの制御下に
置き、哺乳類細胞中で形質転換することができる。いくつかの例では、構チク物
をウイルス（例えば不活性化ウイルス）に挿入できる。そのような実施により、
遺伝子治療シナリオにおいて異種生合成酵素により生産されるタンパク質または
代謝産物の調節的生産が許容される。植物細胞も宿主細胞として使用することが
可能である。繰り返し述べるが、適切なプロモーターは、選択可能である（例え
ば植物ホルモン、代謝産物、または所望の代謝産物の生産のための前駆体に応答
するプロモーター）。プロモーターはマイクロアレイ実験により同定することが
可能である。適切なベクターの所望のコード配列へ所望のプロモーターを融合さ
せた後に、その構築物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
へ電気穿孔して入れ、当該技術分野における標準的方法を使用して植物細胞を形
質転換するために使用することができる。また別の例では、酵母細胞を操作して
、代謝制御下で異種ポリペプチドまたは代謝産物を発現させることができる。例
えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロモーターは、ｃ
ＡＭＰにより調節されるプロモーター（例えばＧｉｓ１、Ｍｓｎ２またはＭｓｎ
４タンパク質により結合されるプロモーター）であり得る。様々な代謝条件に応
じたすべての酵母遺伝子の調節は、ますます詳しく研究されるようになっている
。例えばＤｅＲｉｓｉら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：６８０−６８６
は、様々な代謝条件下に設定されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ遺伝子のほぼ全体の転写プロファイルに続く実験について記載している
。そのようなデータに基づいて、所望の代謝産物により調節されるプロモーター
を選択できる。酵母プラスミドの生成及び酵母の形質転換は当該技術分野におい
て周知である。
【００２６】
上述の発現技術を使用して、種々の代謝経路を再構築することができる。例え
ば、以下の遺伝子用の発現ベクターを構築することにより、リコピンを生産する
経路をＥ．ｃｏｌｉに導入することができる：Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｄｘｓ（１−
デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸シンターゼについてコードしている）
、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のｇｐｓ（ゲラニルゲラ
ニル二リン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼについてコードしている）及びＥｒｗｉｎ
ｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来のｃｒｔＢＩ（フィトエンシンターゼ及びデサチ
ュラーゼのそれぞれについてコードしている）。それらの遺伝子は、単一又は多
数のプラスミド上で存在できるか、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体内に組み込まれる。さら
に、ホスホエノールピルビン酸シンターゼは、どんな方法（例えばｇｌｎＡｐ２
プロモーターへの融合により）を使用しても、過剰発現させることができる。イ
ソペンチル二リン酸イソメラーゼは、どんな方法（例えばｇｌｎＡｐ２プロモー
ターへの融合により）を使用しても、過剰発現させることができる。
ば、以下の遺伝子用の発現ベクターを構築することにより、リコピンを生産する
経路をＥ．ｃｏｌｉに導入することができる：Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｄｘｓ（１−
デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸シンターゼについてコードしている）
、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のｇｐｓ（ゲラニルゲラ
ニル二リン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼについてコードしている）及びＥｒｗｉｎ
ｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来のｃｒｔＢＩ（フィトエンシンターゼ及びデサチ
ュラーゼのそれぞれについてコードしている）。それらの遺伝子は、単一又は多
数のプラスミド上で存在できるか、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体内に組み込まれる。さら
に、ホスホエノールピルビン酸シンターゼは、どんな方法（例えばｇｌｎＡｐ２
プロモーターへの融合により）を使用しても、過剰発現させることができる。イ
ソペンチル二リン酸イソメラーゼは、どんな方法（例えばｇｌｎＡｐ２プロモー
ターへの融合により）を使用しても、過剰発現させることができる。
【００２７】
別の例において、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）（例えばポリヒドロブ
チル酸）を生産する経路は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて実施できる。ＰＨＡは、様々
な熱可塑的性質と商業的用途を備えたヒドロキシ酸の線形ポリエステルのファミ
リーである。アセチルＣｏＡレベルがＰＨＡ合成用の前駆体有効性を示し得るた
め、３−ケトアシル補酵素Ａ還元酵素及びポリ−３ヒドロキシアルカン酸ポリメ
ラーゼをコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ遺伝子は、
所望のプロモーター（例えばｇｌｎＡｐ２）の制御下に置くことが可能である。
チル酸）を生産する経路は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて実施できる。ＰＨＡは、様々
な熱可塑的性質と商業的用途を備えたヒドロキシ酸の線形ポリエステルのファミ
リーである。アセチルＣｏＡレベルがＰＨＡ合成用の前駆体有効性を示し得るた
め、３−ケトアシル補酵素Ａ還元酵素及びポリ−３ヒドロキシアルカン酸ポリメ
ラーゼをコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ遺伝子は、
所望のプロモーター（例えばｇｌｎＡｐ２）の制御下に置くことが可能である。
【００２８】
さらに詳細に論じなくても、上記の記載は本発明を十分に実施可能にしている
と考えられる。以下の例は単に例証的なものであって、開示の残りを如何様にも
制限するものではないと解釈すべきである。本明細書に引用した刊行物はすべて
、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
と考えられる。以下の例は単に例証的なものであって、開示の残りを如何様にも
制限するものではないと解釈すべきである。本明細書に引用した刊行物はすべて
、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２９】方法
成長条件
すべてのＥ．ｃｏｌｉ株を、３７℃で、水浴振とう機（Ｇ７６型；Ｎｅｗ Ｂ
ｒｕｎｓｗｉｃｈ Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ社、ニュージャージー州Ｅｄｉｓｏｎ）
に入れて、指定培地を含む振とうフラスコ中で成長させた。培養物を、０．５％
（重量／体積）グルコースを含むＭ９規定塩類３４又は１．５％（重量／体積）
グルコースを含むＹＥ規定塩類から成る最小培地にて成長させた。ＹＥ規定塩類
は、（１リットル当たり）１４ｇ Ｋ2ＨＰＯ4、１６ｇ ＫＨ2ＰＯ4、５ｇ （
ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇ ＭｇＳＯ4及び１ｍｇ チアミンより構成された。細胞の
濁度を、５５０ｍｎにて分光光度計でモニタした。
ｒｕｎｓｗｉｃｈ Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ社、ニュージャージー州Ｅｄｉｓｏｎ）
に入れて、指定培地を含む振とうフラスコ中で成長させた。培養物を、０．５％
（重量／体積）グルコースを含むＭ９規定塩類３４又は１．５％（重量／体積）
グルコースを含むＹＥ規定塩類から成る最小培地にて成長させた。ＹＥ規定塩類
は、（１リットル当たり）１４ｇ Ｋ2ＨＰＯ4、１６ｇ ＫＨ2ＰＯ4、５ｇ （
ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇ ＭｇＳＯ4及び１ｍｇ チアミンより構成された。細胞の
濁度を、５５０ｍｎにて分光光度計でモニタした。
【００３０】
代謝産物測定
酢酸、ピルビン酸、及び他の有機酸を、６５℃に維持した有機酸カラム（Ａｍ
ｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カ
リフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）に載せてＨＰＬＣ（Ｃｏｎｓｔａｍｅｔｒｉ
ｃ ３５００ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＳｙｓｔｅｍとＳｐｅｃｔ
ｒｏｍｏｎｉｔｏｒ ３１００ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｄ
ｅｔｅｃｔｏｒ；ＬＤＣ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、フロリダ州Ｒｉｖｉｅｒａ
Ｂｅａｃｈ）を用いて測定した。流動相は０．０１ＮのＨ2ＳＯ4から成り、その
流量は０．６ｍｌ／分に維持した。カラムから離れたピークは、２１０ｎｍで検
出した。グルコースを、Ｓｉｇｍａキット３１５−１００番を用いて測定した。
リコピンの量を測定するために、１ｍｌの細菌培養物をアセトンで抽出し、遠心
し、上清の吸光度を４７４ｎｍで測定した。リコピン濃度を、標準曲線と吸光度
を比較することにより計算した。
ｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カ
リフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）に載せてＨＰＬＣ（Ｃｏｎｓｔａｍｅｔｒｉ
ｃ ３５００ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＳｙｓｔｅｍとＳｐｅｃｔ
ｒｏｍｏｎｉｔｏｒ ３１００ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｄ
ｅｔｅｃｔｏｒ；ＬＤＣ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、フロリダ州Ｒｉｖｉｅｒａ
Ｂｅａｃｈ）を用いて測定した。流動相は０．０１ＮのＨ2ＳＯ4から成り、その
流量は０．６ｍｌ／分に維持した。カラムから離れたピークは、２１０ｎｍで検
出した。グルコースを、Ｓｉｇｍａキット３１５−１００番を用いて測定した。
リコピンの量を測定するために、１ｍｌの細菌培養物をアセトンで抽出し、遠心
し、上清の吸光度を４７４ｎｍで測定した。リコピン濃度を、標準曲線と吸光度
を比較することにより計算した。
【００３１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び酵素分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対するプロトコルは、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）Ｎａｔ
ｕｒｅ ２２７：６８０−６８５に記述されている通りである。β−ガラクトシ
ダーゼ活性の測定は、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ
ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ ＮＹによって記述されている通りに本質的に行われた。
ｕｒｅ ２２７：６８０−６８５に記述されている通りである。β−ガラクトシ
ダーゼ活性の測定は、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ
ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ ＮＹによって記述されている通りに本質的に行われた。
【００３２】結果
異質融合物におけるｌａｃＺに対するＥ．ｃｏｌｉのｇｌｎＡｐ２プロモータ
ーの使用 アセチルリン酸レベルの増大は、過剰グルコース流出の指標である。本発明は
、過剰炭素流束を完全に利用し、かつ流束を有毒生成物である酢酸から遠ざけて
再誘導するための、宿主細胞、核酸配列、及び、所望の代謝経路中の速度制御酵
素の発現を調節するシグナルとしてのアセチルリン酸の使用方法をその特徴とす
る。
ーの使用 アセチルリン酸レベルの増大は、過剰グルコース流出の指標である。本発明は
、過剰炭素流束を完全に利用し、かつ流束を有毒生成物である酢酸から遠ざけて
再誘導するための、宿主細胞、核酸配列、及び、所望の代謝経路中の速度制御酵
素の発現を調節するシグナルとしてのアセチルリン酸の使用方法をその特徴とす
る。
【００３３】
生成物発現の動的制御物としてのｇｌｎＡｐ２の可能性を調べるために、電位
を検討するｇｌｎＡｐ２プロモーターに機能的に連結される異種ｌａｃＺ遺伝子
を含む核酸分子を構築した。プロモーターと２つのｎｔｒＣ−結合部位を含むｇ
ｌｎＡｐ２プロモーター領域は、当該技術分野で周知の標準方法により容易に得
ることが可能である。ｇｌｎＡｐ２プロモーターは、正方向プライマー５’−Ｃ
ＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＧＴＣＡＴＴＧＣＡＣＣＡＡＣ（工学設計されたＰｖｕＩ
Ｉ部位を含む）及び逆方向プライマー５’−ＧＧＴＡＣＣＡＧＴＡＣＧＴ−ＧＴ
ＴＣＡＧＣＧＧＡＣＡＴＡＣ（工学設計されたＫｐｎＩ部位を含む）を使用して
、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡよりＰＣＲ増幅した。これらの２つのプライマーは
、公表されたＤＮＡ配列１６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１０４２１
）の位置９３と３４３の間の領域を増幅した。
を検討するｇｌｎＡｐ２プロモーターに機能的に連結される異種ｌａｃＺ遺伝子
を含む核酸分子を構築した。プロモーターと２つのｎｔｒＣ−結合部位を含むｇ
ｌｎＡｐ２プロモーター領域は、当該技術分野で周知の標準方法により容易に得
ることが可能である。ｇｌｎＡｐ２プロモーターは、正方向プライマー５’−Ｃ
ＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＧＴＣＡＴＴＧＣＡＣＣＡＡＣ（工学設計されたＰｖｕＩ
Ｉ部位を含む）及び逆方向プライマー５’−ＧＧＴＡＣＣＡＧＴＡＣＧＴ−ＧＴ
ＴＣＡＧＣＧＧＡＣＡＴＡＣ（工学設計されたＫｐｎＩ部位を含む）を使用して
、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡよりＰＣＲ増幅した。これらの２つのプライマーは
、公表されたＤＮＡ配列１６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１０４２１
）の位置９３と３４３の間の領域を増幅した。
【００３４】
ｇｌｎＡｐ２ ＰＣＲ断片もｐＲＳ５５ｌのＥｃｏＲＩ部位に入れてクローニ
ングされ、それによりｐ２ＧＦＰｕｖが生成した。これは、プロモーターがない
ｌａｃＺ遺伝子の前にｇｌｎＡｐ２を含んでいる。ｇｌｎＡｐ２−ｌａｃＺ領域
は相同組換えを介してλＲＳ４５に移動され（Ｓｉｍｏｎら（１９８７）Ｇｅｎ
ｅ５３：８５−９６）、λｐ２ＧＦＰｕｖを生成した。ＪＣＬ１５９５とＪＣＬ
１５９６を、感染によりにｇｌｎＡｐ２−ｌａｃＺ融合物を組み込むことにより
構築し（ｓｉｌｈａｖｙら、（１９８４）、Ｅｘｐｅｒｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ）λｐ２ＧＦＰｕｖファージを染色体ＢＷｌ３７ｌ１（ｌａｃＸ７４）及び
ＢＷ１８３０２（ｌａｃＸ ｇｌｎＬ２００ｌ；Ｆｅｎｇら、前掲）へそれぞれ
組み込む。この株は、ｇｌｎＬコード配列のコドン２３〜１８２の間の内部欠失
から成り、おそらく無効突然変異が生じる（Ｆｅｎｇら、前掲）、ｇｌｎＬ２０
０ｌ対立遺伝子を含んでいる。
ングされ、それによりｐ２ＧＦＰｕｖが生成した。これは、プロモーターがない
ｌａｃＺ遺伝子の前にｇｌｎＡｐ２を含んでいる。ｇｌｎＡｐ２−ｌａｃＺ領域
は相同組換えを介してλＲＳ４５に移動され（Ｓｉｍｏｎら（１９８７）Ｇｅｎ
ｅ５３：８５−９６）、λｐ２ＧＦＰｕｖを生成した。ＪＣＬ１５９５とＪＣＬ
１５９６を、感染によりにｇｌｎＡｐ２−ｌａｃＺ融合物を組み込むことにより
構築し（ｓｉｌｈａｖｙら、（１９８４）、Ｅｘｐｅｒｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ）λｐ２ＧＦＰｕｖファージを染色体ＢＷｌ３７ｌ１（ｌａｃＸ７４）及び
ＢＷ１８３０２（ｌａｃＸ ｇｌｎＬ２００ｌ；Ｆｅｎｇら、前掲）へそれぞれ
組み込む。この株は、ｇｌｎＬコード配列のコドン２３〜１８２の間の内部欠失
から成り、おそらく無効突然変異が生じる（Ｆｅｎｇら、前掲）、ｇｌｎＬ２０
０ｌ対立遺伝子を含んでいる。
【００３５】
β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性の時間経過を、野生型及びｇｌｎＬ
突然変異体について測定した。ｇｌｎＡｐ２−β−ｇａｌ活性は、ｇｌｎＬ宿主
（ＪＣＬ１５９６）からの排泄された酢酸濃度と類似した時間依存的方法で増加
するが、同質遺伝子の野生型対照（ＪＣＬｌ５９５）に対してはプロモーター活
性の誘導は見出されなかった。
突然変異体について測定した。ｇｌｎＡｐ２−β−ｇａｌ活性は、ｇｌｎＬ宿主
（ＪＣＬ１５９６）からの排泄された酢酸濃度と類似した時間依存的方法で増加
するが、同質遺伝子の野生型対照（ＪＣＬｌ５９５）に対してはプロモーター活
性の誘導は見出されなかった。
【００３６】
【表１】
このように、ｇｌｎＬがないと、ｇｌｎＡｐ２は、酢酸排泄によって示される
過剰の炭素流出に応答できる。細胞が後期指数成長期に近づくにつれて、生合成
要求は減少し、酢酸生成の増加により実証されるように、細胞は過剰炭素流出を
示し始めた。約６時間目のこの時点で、ｇｌｎＡｐ２−β−ｇａｌ−活性は期せ
ずして上昇し始め（〜７００ｎｍｏｌ／分・ｍｇタンパク質、表１参照）たが、
野生型株（ＪＣＬ１５９５）のｇｌｎＡｐ２−β−ｇａｌ−活性は比較的低く、
始終一定に保たれた（〜１００ｎｍｏｌ／分・ｍｇタンパク質、表１）。１０時
間超過後、ｇｌｎＬがない場合のｇＩｎＡｐ２−β−ｇａｌ活性は著しかった（
１５００ｎｍｏｌ／分・ｍｇタンパク質、表１）。ｇｌｎＡｐ２の誘導プロフィ
ルは、さらにｌａｃプロモーター（Ｐlac）のそれと明確に対照的である。株Ｖ
ＪＳ６３２（ｌａｃ+）の染色体Ｐlac活性はＩＰＴＧ（イソプロピル）−β−Ｄ
−チオ−ガラクトピラノシド）による誘導後急速に増大し、細胞での一定レベル
の発現を達成した（〜５５０ｎｍｏｌ／分・ｍｇタンパク質、表１を参照）。こ
れは成長期とは無関係である。
過剰の炭素流出に応答できる。細胞が後期指数成長期に近づくにつれて、生合成
要求は減少し、酢酸生成の増加により実証されるように、細胞は過剰炭素流出を
示し始めた。約６時間目のこの時点で、ｇｌｎＡｐ２−β−ｇａｌ−活性は期せ
ずして上昇し始め（〜７００ｎｍｏｌ／分・ｍｇタンパク質、表１参照）たが、
野生型株（ＪＣＬ１５９５）のｇｌｎＡｐ２−β−ｇａｌ−活性は比較的低く、
始終一定に保たれた（〜１００ｎｍｏｌ／分・ｍｇタンパク質、表１）。１０時
間超過後、ｇｌｎＬがない場合のｇＩｎＡｐ２−β−ｇａｌ活性は著しかった（
１５００ｎｍｏｌ／分・ｍｇタンパク質、表１）。ｇｌｎＡｐ２の誘導プロフィ
ルは、さらにｌａｃプロモーター（Ｐlac）のそれと明確に対照的である。株Ｖ
ＪＳ６３２（ｌａｃ+）の染色体Ｐlac活性はＩＰＴＧ（イソプロピル）−β−Ｄ
−チオ−ガラクトピラノシド）による誘導後急速に増大し、細胞での一定レベル
の発現を達成した（〜５５０ｎｍｏｌ／分・ｍｇタンパク質、表１を参照）。こ
れは成長期とは無関係である。
【００３７】
ｐｐｓおよびａｒｏＧに対する異質融合物におけるＥ．ｃｏｌｉのｇｌｎＡｐ
２プロモーターの使用方法 ２つの異なる代謝性酵素である、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ｐｐ
ｓ）と３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプチュロソネート ７−リン酸（ＤＡＨＰ
）シンターゼ（ａｒｏＧ）をｇｌｎＡｐ２プロモーターの制御下に配置した。対
照として、これらの同じ２つのタンパク質を、同じ遺伝的背景及び環境要因下で
、静的制御を示すｔａｃプロモーター（Ｐtac）から過剰発現させた。ｐｐｓを
発現する標準的方法は、成長遅延（Ｐａｔｎａｉｋら（１９９２）Ｊ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ １７４：７５２７−７５３２）を引き起こす。
２プロモーターの使用方法 ２つの異なる代謝性酵素である、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ｐｐ
ｓ）と３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプチュロソネート ７−リン酸（ＤＡＨＰ
）シンターゼ（ａｒｏＧ）をｇｌｎＡｐ２プロモーターの制御下に配置した。対
照として、これらの同じ２つのタンパク質を、同じ遺伝的背景及び環境要因下で
、静的制御を示すｔａｃプロモーター（Ｐtac）から過剰発現させた。ｐｐｓを
発現する標準的方法は、成長遅延（Ｐａｔｎａｉｋら（１９９２）Ｊ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ １７４：７５２７−７５３２）を引き起こす。
【００３８】
プラスミドｐＡＲＯＧを、ｐＪＦ１１８ＥＨのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位へ
ａｒｏＧ ｐＲＷ５ｔｋｔを含むＰＣＲ断片を入れてクローニングすることによ
り構築した。プラスミドｐＰＳ７０６はＰａｔｎａｉｋら、前掲に上述した。両
方のプラスミドは、Ｐtacプロモーターの下で各遺伝子を発現する。ｇｌｎＡｐ
２プロモーターを含むＰＣＲ断片を、プラスミドｐＡＲＯＧおよびｐＰＳ７０６
のＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ部位に入れてクローニングし、ｇｌｎＡｐ２プロモー
ターの下に各遺伝子をそれぞれ含むプラスミドｐ２ＡＲＯＧ３及びｐＰＳＧ７０
６を生成した。
ａｒｏＧ ｐＲＷ５ｔｋｔを含むＰＣＲ断片を入れてクローニングすることによ
り構築した。プラスミドｐＰＳ７０６はＰａｔｎａｉｋら、前掲に上述した。両
方のプラスミドは、Ｐtacプロモーターの下で各遺伝子を発現する。ｇｌｎＡｐ
２プロモーターを含むＰＣＲ断片を、プラスミドｐＡＲＯＧおよびｐＰＳ７０６
のＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ部位に入れてクローニングし、ｇｌｎＡｐ２プロモー
ターの下に各遺伝子をそれぞれ含むプラスミドｐ２ＡＲＯＧ３及びｐＰＳＧ７０
６を生成した。
【００３９】
宿主株ＢＷ１８３０２（ｌａｃＸ ｇｌｎＬ２００ｌ）を４つのプラスミド全
部で形質転換した。各プラスミドを備えた株をＭ９塩類グルコース培地で成長さ
せた。成長を５時間後に比較した。
部で形質転換した。各プラスミドを備えた株をＭ９塩類グルコース培地で成長さ
せた。成長を５時間後に比較した。
【００４０】
【表２】
上に示したように、Ｐtac−ｐｐｓを用いたｐｐｓの過剰発現は顕著な成長遅
延を引き起こした。しかしながら、ｇｌｎＡｐ２の使用は、期せずして正常な成
長に近かった（表２）。１５時間後、タンパク質を各菌株より分離し、１０％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。ｐｐｓ遺伝子がｇｌｎＡｐ２プロモーターによ
って制御された時、Ｐtacプロモーターと比較して、少なくとも５００％多くの
ｐｐｓタンパク質が発現された。別の驚くべき発見では、ＡｒｏＧタンパク質（
その従来の過剰発現は明白に有害でない）も、発現のためのｇｌｎＡｐ２プロモ
ーターを利用する細胞からの抽出物において、Ｐtacプロモーターと比較して、
少なくとも３００％より豊富だった。
延を引き起こした。しかしながら、ｇｌｎＡｐ２の使用は、期せずして正常な成
長に近かった（表２）。１５時間後、タンパク質を各菌株より分離し、１０％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。ｐｐｓ遺伝子がｇｌｎＡｐ２プロモーターによ
って制御された時、Ｐtacプロモーターと比較して、少なくとも５００％多くの
ｐｐｓタンパク質が発現された。別の驚くべき発見では、ＡｒｏＧタンパク質（
その従来の過剰発現は明白に有害でない）も、発現のためのｇｌｎＡｐ２プロモ
ーターを利用する細胞からの抽出物において、Ｐtacプロモーターと比較して、
少なくとも３００％より豊富だった。
【００４１】
ｉｄｉ過剰発現によるＥ．ｃｏｌｉにおけるリコピンの生産
Ｅ．ｃｏｌｉ由来の（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸シンター
ゼをコードする）ｄｘｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来
の（ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼをコードする）ｇｐｓ、
およびＥｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来の（フィトエンシンターゼおよ
びデサチュラーゼをそれぞれコードする）ｃｒｔＢＩにおいて組換えリコピン経
路を再構築した。これらの遺伝子を低コピー数プラスミドであるｐＣＬ１９２０
に挿入してｐＣＷ９を形成し、同時に過剰発現させた。
ゼをコードする）ｄｘｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来
の（ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼをコードする）ｇｐｓ、
およびＥｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来の（フィトエンシンターゼおよ
びデサチュラーゼをそれぞれコードする）ｃｒｔＢＩにおいて組換えリコピン経
路を再構築した。これらの遺伝子を低コピー数プラスミドであるｐＣＬ１９２０
に挿入してｐＣＷ９を形成し、同時に過剰発現させた。
【００４２】
ｉｄｉ（イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ）の発現を制御するためにｇｌ
ｎＡｐ２プロモーターを使用した。ｉｄｉ遺伝子を含む構築物は、プロモーター
のないベクターであるｐＪＦｌ１８に由来するものであった。ｇｌｎＡｐ２プロ
モーターを挿入して、ｐ２ＩＤＩを形成した。対照として、Ｐtacプロモーター
を挿入してｐＴａｃＩＤＩを形成した。これらのプラスミドを、ｐＣＷ９を含む
ｇｌｎＬ株（ＢＷｌ８３０２）へ別々に導入した。Ｐ２ＩＤＩ含有株（ｇｌｎＡ
ｐ２−ｉｄｉ）はグルコースを含む規定培地において１００ｍｇ／Ｌリコピンを
生産した。他方、Ｐtac−ｊｄｉを含む株は、同一条件下では少量のリコピン（
＜５ｍｇ／Ｌ）しか生産しなかった。さらに、ｐ２ＩＤＩ株はｐＴａｃＩＤＩよ
りほぼ３倍少ない酢酸を生産したが、これは酢酸への炭素流出がリコピンに再び
向けられていることを示す。
ｎＡｐ２プロモーターを使用した。ｉｄｉ遺伝子を含む構築物は、プロモーター
のないベクターであるｐＪＦｌ１８に由来するものであった。ｇｌｎＡｐ２プロ
モーターを挿入して、ｐ２ＩＤＩを形成した。対照として、Ｐtacプロモーター
を挿入してｐＴａｃＩＤＩを形成した。これらのプラスミドを、ｐＣＷ９を含む
ｇｌｎＬ株（ＢＷｌ８３０２）へ別々に導入した。Ｐ２ＩＤＩ含有株（ｇｌｎＡ
ｐ２−ｉｄｉ）はグルコースを含む規定培地において１００ｍｇ／Ｌリコピンを
生産した。他方、Ｐtac−ｊｄｉを含む株は、同一条件下では少量のリコピン（
＜５ｍｇ／Ｌ）しか生産しなかった。さらに、ｐ２ＩＤＩ株はｐＴａｃＩＤＩよ
りほぼ３倍少ない酢酸を生産したが、これは酢酸への炭素流出がリコピンに再び
向けられていることを示す。
【００４３】
【表３】
リコピン生産を高めるためのｐｐｓの使用
別の適合性があるプラスミドであるｐＰＳＧ１８由来のｇｌｎＡｐ２からｐｐ
ｓを過剰発現させ、リコピン経路の残り（ｄｘｘ、ｇｐｓ、ｃｒｔＢＩ）をｐＣ
Ｌｌ９２０を用いて発現させた。リコピン経路に関するｐｐｓ及びｉｄｉの同時
発現は、リコピンの最終濃度を５０％増大し、その生産力を０．０５ｍｇ／（ｍ
Ｌ・ｈ）から０．１６ｍｇ／（ｍＬ・ｈ）まで３倍増大させた（表３）。これは
、生産量に有意な改良が観察されず実質的な成長阻害が起こらないｐｔａｃＩＤ
ＩおよびｐＰＳ１８４（Ｐtac−ｉｄｉ＋Ｐtac−ｐｐｓ）を共に含む菌株と対照
的である。
ｓを過剰発現させ、リコピン経路の残り（ｄｘｘ、ｇｐｓ、ｃｒｔＢＩ）をｐＣ
Ｌｌ９２０を用いて発現させた。リコピン経路に関するｐｐｓ及びｉｄｉの同時
発現は、リコピンの最終濃度を５０％増大し、その生産力を０．０５ｍｇ／（ｍ
Ｌ・ｈ）から０．１６ｍｇ／（ｍＬ・ｈ）まで３倍増大させた（表３）。これは
、生産量に有意な改良が観察されず実質的な成長阻害が起こらないｐｔａｃＩＤ
ＩおよびｐＰＳ１８４（Ｐtac−ｉｄｉ＋Ｐtac−ｐｐｓ）を共に含む菌株と対照
的である。
【００４４】
リコピン生産に対する追加の宿主細胞
２つの単一突然変異体（ＪＣＬ１６１０（ｐｙｋＦ）及びＪＣＬ１６１２（ｐ
ｙｋＡ））と１つの二重突然変異株（ＪＣＬ１６１３（ｐｙｋＦ ｐｙｋＡ）を
生成するために、ｐｙｋＦ：：ｃａｔ及びｐｙｋＡ：：ｋａｎ対立遺伝子を野生
型株に導入した（Ｐｏｎｃｅら（１９９５）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ｌ７７：
５７１９−５７２２）。二重突然変異株は約１４ｍｇリコピン／ｇ乾燥菌体の最
終リコピン濃度を達成することができたが、単一の突然変異株の各々は約２．５
ｍｇリコピン／ｇ乾燥菌体のリコピン濃度を得た。単一のｐｙｋ突然変異体は、
野生型菌株と同様のレベルの〜４ｍｇリコピン／ｇ乾燥菌体のリコピンを生産し
た。さらに、Ｐｃｋ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）の過剰発
現は、リコピンの採集濃度を約３倍増加させた。Ｐｐｃ（ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ）の過剰発現はリコピン生産を約３０％減少させた。
ｙｋＡ））と１つの二重突然変異株（ＪＣＬ１６１３（ｐｙｋＦ ｐｙｋＡ）を
生成するために、ｐｙｋＦ：：ｃａｔ及びｐｙｋＡ：：ｋａｎ対立遺伝子を野生
型株に導入した（Ｐｏｎｃｅら（１９９５）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ｌ７７：
５７１９−５７２２）。二重突然変異株は約１４ｍｇリコピン／ｇ乾燥菌体の最
終リコピン濃度を達成することができたが、単一の突然変異株の各々は約２．５
ｍｇリコピン／ｇ乾燥菌体のリコピン濃度を得た。単一のｐｙｋ突然変異体は、
野生型菌株と同様のレベルの〜４ｍｇリコピン／ｇ乾燥菌体のリコピンを生産し
た。さらに、Ｐｃｋ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）の過剰発
現は、リコピンの採集濃度を約３倍増加させた。Ｐｐｃ（ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ）の過剰発現はリコピン生産を約３０％減少させた。
【００４５】
他の実施形態
本発明の多くの実施形態を説明してきた。しかしながら、様々な修正が、本発
明の精神及び範囲から逸脱せずになされ得ることが理解される。従って、他の実
施形態が特許請求の範囲の範囲内にある。例えば、言及されたポリペプチド及び
遺伝子のすべての同族体は、本発明の範囲内に包含される。
明の精神及び範囲から逸脱せずになされ得ることが理解される。従って、他の実
施形態が特許請求の範囲の範囲内にある。例えば、言及されたポリペプチド及び
遺伝子のすべての同族体は、本発明の範囲内に包含される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:19）
Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA07 BA08 BA80 CA01
CA02 CA20 DA06 EA04 FA02
GA11 GA25
4B064 AB04 AB06 AC38 CA02 CA19
CC01 CC24 DA10 DA16
4B065 AA26X AA26Y AB01 AC14
BA02 BA16 CA03 CA09 CA27
CA41 CA43 CA52
Claims (35)
- 【請求項１】プロモーターと、異種ポリペプチドをコードする核酸配列とを
含む核酸配列を有する細菌の宿主細胞であって、前記核酸配列は応答調節タンパ
ク質によって制御される前記プロモーターに機能的に連結され、宿主細胞は窒素
飢餓がない状態でプロモーターがアセチルリン酸により調節されるように遺伝子
修飾されている、宿主細胞。 - 【請求項２】細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１に記載の宿主細
胞。 - 【請求項３】プロモーターが、ｎｔｒＣ、ｐｈｏＢ、ｐｈｏＰ、ｏｍｐＲ、
ｃｈｅＹ、ｃｒｅＢ及びｔｏｒＲから成るリストより選択された応答調節タンパ
ク質によって制御される、請求項１に記載の宿主細胞。 - 【請求項４】プロモーターがｎｔｒＣによって結合される、請求項３に記載
の宿主細胞。 - 【請求項５】プロモーターがｇｌｎＡｐ２である、請求項４に記載の宿主細
胞。 - 【請求項６】ヒスチジンプロテインキナーゼをコードする遺伝子の欠失また
は突然変異により宿主細胞が遺伝子修飾される、請求項１に記載の宿主細胞。 - 【請求項７】ヒスチジンプロテインキナーゼがｇｌｎＬによりコードされる
、請求項６に記載の宿主細胞。 - 【請求項８】異種ポリペプチドが代謝産物の生産に必要な生合成酵素である
、請求項１に記載の宿主細胞。 - 【請求項９】プロモーターと異種代謝産物の生合成に必要な第１の酵素をコ
ードする核酸配列とを含む第１の発現カセットを含む宿主細胞であって、核酸配
列は窒素飢餓がない状態でのアセチルリン酸により制御されるプロモーターに機
能的に連結され、複数の核酸配列が代謝産物の生合成に必要な他の酵素を発現し
ている、宿主細胞。 - 【請求項１０】代謝産物がイソプレノイドである、請求項９に記載の宿主細
胞。 - 【請求項１１】イソプレノイドがカロチノイドである、請求項１０に記載の
宿主細胞。 - 【請求項１２】イソプレノイドがリコピン、β−カロテン、アスタキサンチ
ン、またはそれらの前駆体の１つである、請求項１０に記載の宿主細胞。 - 【請求項１３】第１の酵素がイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニ
ルゲラニル二リン酸シンターゼ、または１−デオキシキシルロース ５−リン酸
シンターゼである、請求項１０に記載の宿主細胞。 - 【請求項１４】第１の酵素がホスホエノールピルビン酸シンターゼである、
請求項９に記載の宿主細胞。 - 【請求項１５】宿主細胞が細菌細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
- 【請求項１６】細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１５に記載の宿
主細胞。 - 【請求項１７】細胞が機能的ヒスチジンプロテインキナーゼ遺伝子を欠いて
いる、請求項１５に記載の宿主細胞。 - 【請求項１８】ｎｔｒＣ、ｐｈｏＢ、ｏｍｐＲ、ｃｈｅＹ、ｃｒｅＢ、ｐｈ
ｏＰまたはｔｏｒＲによりプロモーターが制御される、請求項１５に記載の宿主
細胞。 - 【請求項１９】プロモーターがｎｔｒＣにより結合される、請求項１８に記
載の宿主細胞。 - 【請求項２０】プロモーターがｇｌｎＡｐ２である請求項１９に記載の宿主
細胞。 - 【請求項２１】宿主細胞が、アセチルリン酸濃度により調節されるプロモー
ターに機能的に連結されたホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする核
酸配列を含む第２の発現カセットをさらに含んでいる、請求項１０に記載の宿主
細胞。 - 【請求項２２】宿主細胞中で異種イソプレノイドを生産する方法であって、 異種ホスホエノールピルビン酸シンターゼを過剰発現する工程と、 異種イソプレノイドの合成に必要な生合成酵素を発現する工程と から成る方法。
- 【請求項２３】宿主細胞中でリコピンを生産する方法であって、 異種１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸シンターゼ、異種ゲラニル
ゲラニル二リン酸シンターゼ、異種フィトエンシンターゼ及び異種フィトエンデ
サチュラーゼを発現する工程 から成る方法。 - 【請求項２４】プロモーターが一定の宿主細胞中でアセチルリン酸により調
節されるよう、応答調節タンパク質により制御されたプロモーターを有する核酸
配列を含むキットであって、前記一定の宿主細胞は、ヒスチジンプロテインキナ
ーゼ遺伝子の欠失あるいは突然変異により遺伝子修飾されている、キット。 - 【請求項２５】プロモーターと、第１の代謝産物の生産に必要な整合性酵素
をコードする配列とを含む核酸配列であって、前記配列は、その濃度が第１の代
謝産物の生合成のための前駆体の有効性を示す第２の代謝産物により調節される
プロモーターに機能的に連結される、核酸配列。 - 【請求項２６】前記第２の代謝産物が、第１の代謝産物の生合成のための前
駆体から生じた排泄物質である、請求項２５に記載の核酸配列。 - 【請求項２７】第１の代謝産物がイソプレノイドである、請求項２５に記載
の核酸配列。 - 【請求項２８】イソプレノイドがカロチノイドである、請求項２７に記載の
核酸配列。 - 【請求項２９】イソプレノイドがβ−カロテン、アスタキサンチン、または
それらの前駆体の１つである、前駆体の請求項２８に記載の核酸配列。 - 【請求項３０】第２の代謝産物がアセチルリン酸、ｃＡＭＰ、フルクトース
１−リン酸またはフルクトース ６−リン酸である、請求項２５に記載の核酸
配列。 - 【請求項３１】第２の代謝産物がアセチルリン酸である、請求項３０に記載
の核酸配列。 - 【請求項３２】ｎｔｒＣ、ｐｈｏＢ、ｏｍｐＲ、ｃｈｅＹ、ｃｒｅＢ、ｐｈ
ｏＰまたはｔｏｒＲによりプロモーターが制御される、請求項３１に記載の核酸
配列。 - 【請求項３３】プロモーターがｎｔｒＣにより結合される、請求項３２に記
載に記載の核酸配列。 - 【請求項３４】プロモーターがｇｌｎＡｐ２である請求項３３に記載の核酸
配列。 - 【請求項３５】生合成酵素がイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニ
ルゲラニル二リン酸シンターゼ、１−デオキシキシルロース ５−リン酸シンタ
ーゼ、またはホスホエノールピルビン酸シンターゼである、請求項２７に記載の
核酸配列。
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