JP5419829B2 - 代謝制御の工学設計 - Google Patents
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Description
細菌宿主細胞の例としては、エシェリシア コリ(Escherichia coli)、バチルス サブチリス(Bacillus subutilis)、サルモネラ チフィムリウム(Salmonella typhimurimum)、アグロバクテリウム
チュメファシエンス(Agrobacterium
tumefaciens)、サーマス サーモフィルス(Thermus thermophilus)及びリゾビウム リグミノサルム(Rhizobium leguminosarum)細胞が包含される。該核酸配列は、応答調節タンパク質により制御されるプロモーターと機能的に連結される。言いかえれば、核酸配列は、ヌクレオチド配列のインビトロ及びインビボでの発現発現を許容する様式でプロモーター配列に連結される。「プロモーター」とは、遺伝子物質の転写を指図する任意のDNA断片のことを指す。プロモーターは、応答調節タンパク質(例えばE.coliのntrC、phoB、phoP、ompR、cheY、E creB、又はtorRあるいは他の細菌種由来のその同族体)によって制御される。さらに応答調節タンパク質は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/(Tatusovら、Nucleic Acids Res.(2000);28:33−36)に定義されるようなクラスターオルソロガスグループ(COG)COG0745の別のメンバーであり得る。ある実行では、プロモーターはE.coli ntrCにより結合される。用語「ntrC」とは、E.c
oli ntrCタンパク質(SWISSPROT:P06713、http://www.expasy.ch/)及び適切な他の細菌におけるその同族体の両方を指す。本明細書で使用する場合、「結合」とは、100未満nM、好ましくは1nM未満の平衡結合定数(KD)を有する物理的会合のことを指す。プロモーターの1例はE.coli g
lnAp2プロモーター(例えば公表されたDNA配列中の約93〜約323の領域、GenBankアクセッション番号M10421(Reitzer&Magasanik(1985)Proc Nat Acad Sci USA 82:1979−1983))である。この領域は、glnA遺伝子由来の非翻訳配列を含んでいる。さらに、gInAのコード配列と異種ポリペプチドのコード配列の間には翻訳の融合物を構築することができる。
本発明の別の態様は、応答調節タンパク質によって制御されるプロモーターを有する核酸配列を含むキットをその特徴とする。該キットはさらに、窒素飢餓がない状態でプロモーターがアセチルリン酸により調節されるように遺伝子修飾される細菌宿主細胞を、任意に含む。キットはさらに、その使用に対する使用説明書を提供できる。核酸配列は、制限酵素ポリリンカーに挿入された配列が、応答調節タンパク質により制御されるプロモーターに機能的に連結するように、プロモーターに3’位置に配置された制限酵素ポリリンカーを含み得る。キットの1つの実施では、プロモーターがE.coli glnAp2プロモーターであり、細菌宿主細胞はglnL遺伝子の変異か欠失を含むE.coli細胞である。
シンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、リコピンシクラーゼ)をコードし得る。イソプレノイドの前駆体の1つはピルビン酸であり得る。ピルビン酸濃度は酢酸及びアセチルリン酸濃度と関係がある。従って、この例では、第2の代謝産物はアセチルリン酸である。アセチルリン酸に応答するプロモーターは、応答調節タンパク質(例えば上述した応答調節タンパク質)により制御され得る。そのようなプロモーターは、特定の宿主細胞中のアセチルリン酸にしか応答しないようにし得る。特定の例において、アセチルリン酸濃度に応答するプロモーターは、E.coli ntrC(例えばE.ccli glnAp2プロモーター)により結合される。
(詳細な説明)
本発明は、代謝制御を工学設計する方法(例えばタンパク質生産あるいは代謝産物合成のいずれかのためのタンパク質発現を最適化するために特定宿主細胞中のプロモーターを利用する方法)を提供する。
ターを使用することが可能である。いくつかの用途では、発現カセットが、細菌の複製起点と選択マーカーを備えた細菌性プラスミドのようなプラスミド内に含まれる。発現カセットは当該技術分野における標準的技術を使用して、細胞のゲノムへ組み込むことができる。
Prog.16:278−86を参照されたい。所望の条件下で発現されている遺伝子がひとたび同定されると、そのプロモーターが発現カセットにて利用され得る。代わりに、所望の分子(例えば代謝経路中の前駆体)の外因的追加により行われるか、実験条件(例えば後期対数期までの成長または生合成酵素が過剰生産されている間の成長)の操作により行われる。プロモーターは、誘導した遺伝子に基づいて同定できる。
(1)アセチルCoA+Pi<−>アセチルリン酸+CoA
(2)アセチルリン酸+ADP<−>酢酸+ATP
このように、アセチルリン酸濃度が高いことは、アセチルCoAとピルビン酸が過剰であることを示す。glnLの欠失あるいは突然変異により遺伝子修飾された宿主細胞は、例えば、ntrC機能をアセチルリン酸依存的にさせる(Fengら、(1992)J Bacteriol 174:6061−6070)。この方法では、ntrCにより調節されるプロモーター(例えばglnAp2プロモーター)が、アセチルリン酸に応じて遺伝子発現を制御するために使用できる。glnAp2プロモーターは当該技術分野における標準的技術を使用して得ることが可能である。例えば、glnAp2プロモーターとアニールするプライマーを設計かつ合成することが可能である。glnAp2プロモーターを含む核酸断片を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用することが可能である。この断片はここではさらなる構築のために使用できる。同様に、ヒスチジンプロテインキナーゼ遺伝子(例えばglnL)の欠失を含むE.coli株を容易に調製
できる。1つの考えられる方法に関する詳細な説明については、Linkら(1997)J Bacteriol.l79(20):6228−6237を参照されたい。所望の異種ポリペプチドをコードする配列は、該配列がglnAp2プロモーターに機能的に連結されるように、glnAp2プロモーターの下流にクローニングすることが可能である。その後、不活性化されたglnL遺伝子を備えた宿主細胞は、該配列で形質転換され得る。形質転換株を成長させ、成長している経過中のポリペプチドの生産をモニタすることができる。FarmerとLiao(2000)Nat.Biotechnol 18:533−537におけるように高い細胞密度では強いタンパク質発現を観察することができる。上記文献の内容は参照により本明細書に組込まれる。
商業的用途を備えたヒドロキシ酸の線形ポリエステルのファミリーである。アセチルCoAレベルがPHA合成用の前駆体有効性を示し得るため、3−ケトアシル補酵素A還元酵素及びポリ−3ヒドロキシアルカン酸ポリメラーゼをコードするPseudomonas
aeruginosa遺伝子は、所望のプロモーター(例えばglnAp2)の制御下に置くことが可能である。
方法
成長条件
すべてのE.coli株を、37℃で、水浴振とう機(G76型;New Brunswich Scietific社、ニュージャージー州Edison)に入れて、指定培地を含む振とうフラスコ中で成長させた。培養物を、0.5%(重量/体積)グルコースを含むM9規定塩類34又は1.5%(重量/体積)グルコースを含むYE規定塩類から成る最小培地にて成長させた。YE規定塩類は、(1リットル当たり)14g K2HP
O4、16g KH2PO4、5g (NH4)2SO4、1g MgSO4及び1mg チア
ミンより構成された。細胞の濁度を、550mnにて分光光度計でモニタした。
代謝産物測定
酢酸、ピルビン酸、及び他の有機酸を、65℃に維持した有機酸カラム(Aminex
HPX−87H、Bio−Rad Laboratories社、カリフォルニア州Hercules)に載せてHPLC(Constametric 3500 Solvent Delivery SystemとSpectromonitor 3100 Variable Wavelength Detector;LDC Analytical、フロリダ州Riviera Beach)を用いて測定した。流動相は0.01NのH2SO4から成り、その流量は0.6ml/分に維持した。カラムから離れたピークは、210nmで検出した。グルコースを、Sigmaキット315−100番を用いて測定した。リコピンの量を測定するために、1mlの細菌培養物をアセトンで抽出し、遠心し、上清の吸光度を474nmで測定した。リコピン濃度を、標準曲線と吸光度を比較することにより計算した。
SDS−PAGE及び酵素分析
SDS−PAGEに対するプロトコルは、Laemmli(1970)Nature 227:680−685に記述されている通りである。β−ガラクトシダーゼ活性の測定は、Miller(1992)A Short Course
in Bacterial Genetics、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor NYによって記述されている通りに本質的に行われた。
結果 異質融合物におけるlacZに対するE.coliのglnAp2プロモーターの使用
アセチルリン酸レベルの増大は、過剰グルコース流出の指標である。本発明は、過剰炭素流束を完全に利用し、かつ流束を有毒生成物である酢酸から遠ざけて再誘導するための、宿主細胞、核酸配列、及び、所望の代謝経路中の速度制御酵素の発現を調節するシグナルとしてのアセチルリン酸の使用方法をその特徴とする。
CAAC(工学設計されたPvuII部位を含む)及び逆方向プライマー5’−GGTACCAGTACGT−GTTCAGCGGACATAC(工学設計されたKpnI部位を含む)を使用して、E.coliゲノムDNAよりPCR増幅した。これらの2つのプライマーは、公表されたDNA配列16(GenBankアクセッション番号M10421)の位置93と343の間の領域を増幅した。
JS632(lac+)の染色体Plac活性はIPTG(イソプロピル)−β−D−チオ−ガラクトピラノシド)による誘導後急速に増大し、細胞での一定レベルの発現を達成した(〜550nmol/分・mgタンパク質、表1を参照)。これは成長期とは無関係である。
2つの異なる代謝性酵素である、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(pps)と3−デオキシ−D−アラビノヘプチュロソネート 7−リン酸(DAHP)シンターゼ(aroG)をglnAp2プロモーターの制御下に配置した。対照として、これらの同じ2つのタンパク質を、同じ遺伝的背景及び環境要因下で、静的制御を示すtacプロモーター(Ptac)から過剰発現させた。ppsを発現する標準的方法は、成長遅延(Patn
aikら(1992)J Bacteriol 174:7527−7532)を引き起こす。
pRW5tktを含むPCR断片を入れてクローニングすることにより構築した。プラスミドpPS706はPatnaikら、前掲に上述した。両方のプラスミドは、Ptac
プロモーターの下で各遺伝子を発現する。glnAp2プロモーターを含むPCR断片を、プラスミドpAROGおよびpPS706のEcoRV−EcoRI部位に入れてクローニングし、glnAp2プロモーターの下に各遺伝子をそれぞれ含むプラスミドp2AROG3及びpPSG706を生成した。
延を引き起こした。しかしながら、glnAp2の使用は、期せずして正常な成長に近かった(表2)。15時間後、タンパク質を各菌株より分離し、10%SDS−PAGEゲルで分析した。pps遺伝子がglnAp2プロモーターによって制御された時、Ptac
プロモーターと比較して、少なくとも500%多くのppsタンパク質が発現された。別の驚くべき発見では、AroGタンパク質(その従来の過剰発現は明白に有害でない)も、発現のためのglnAp2プロモーターを利用する細胞からの抽出物において、Ptac
プロモーターと比較して、
少なくとも300%より豊富だった。
E.coli由来の(1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸シンターゼをコードする)dxs、Archaeoglobus fulgidus由来の(ゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)シンターゼをコードする)gps、およびErwinia u
redovora由来の(フィトエンシンターゼおよびデサチュラーゼをそれぞれコードする)crtBIにおいて組換えリコピン経路を再構築した。これらの遺伝子を低コピー数プラスミドであるpCL1920に挿入してpCW9を形成し、同時に過剰発現させた。
を挿入してpTacIDIを形成した。これらのプラスミドを、pCW9を含むglnL株(BWl8302)へ別々に導入した。P2IDI含有株(glnAp2−idi)はグルコースを含む規定培地において100mg/Lリコピンを生産した。他方、Ptac−
jdiを含む株は、同一条件下では少量のリコピン(<5mg/L)しか生産しなかった。さらに、p2IDI株はpTacIDIよりほぼ3倍少ない酢酸を生産したが、これは酢酸への炭素流出がリコピンに再び向けられていることを示す。
別の適合性があるプラスミドであるpPSG18由来のglnAp2からppsを過剰発現させ、リコピン経路の残り(dxx、gps、crtBI)をpCLl920を用いて発現させた。リコピン経路に関するpps及びidiの同時発現は、リコピンの最終濃度を50%増大し、その生産力を0.05mg/(mL・h)から0.16mg/(mL・h)まで3倍増大させた(表3)。これは、生産量に有意な改良が観察されず実質的な成長阻害が起こらないptacIDIおよびpPS184(Ptac−idi+Ptac−pps)を共に含む菌株と対照的である。
リコピン生産に対する追加の宿主細胞
2つの単一突然変異体(JCL1610(pykF)及びJCL1612(pykA))と1つの二重突然変異株(JCL1613(pykF pykA)を生成するために、pykF::cat及びpykA::kan対立遺伝子を野生型株に導入した(Ponceら(1995)J Bacteriol l77:5719−5722)。二重突然変異株は約14mgリコピン/g乾燥菌体の最終リコピン濃度を達成することができたが、単一の突然変異株の各々は約2.5mgリコピン/g乾燥菌体のリコピン濃度を得た。単一のpyk突然変異体は、野生型菌株と同様のレベルの〜4mgリコピン/g乾燥菌体のリコピンを生産した。さらに、Pck(ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ)の過剰発現は、リコピンの採集濃度を約3倍増加させた。Ppc(ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ)の過剰発現はリコピン生産を約30%減少させた。
他の実施形態
本発明の多くの実施形態を説明してきた。しかしながら、様々な修正が、本発明の精神
及び範囲から逸脱せずになされ得ることが理解される。従って、他の実施形態が特許請求の範囲の範囲内にある。例えば、言及されたポリペプチド及び遺伝子のすべての同族体は、本発明の範囲内に包含される。
Claims (5)
- 大腸菌(E.coli)宿主細胞であって、
アセチルリン酸により制御されるglnAp2プロモーターと、異種代謝産物の生合成に必要な第1の酵素をコードする核酸配列であって前記glnAp2プロモーターに機能的に連結された該核酸配列と、を含む第1の発現カセットと、
前記代謝産物の生合成に必要な他の酵素の発現のための複数の核酸配列とを含み、
機能的ヒスチジンプロテインキナーゼglnL遺伝子を欠いており、
前記第1の酵素が、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、または1−デオキシキシルロース 5−リン酸シンターゼである、宿主細胞。 - 代謝産物がイソプレノイドである、請求項1に記載の宿主細胞。
- イソプレノイドがカロチノイドである、請求項2に記載の宿主細胞。
- イソプレノイドがリコピン、β−カロテン、アスタキサンチン、またはそれらの前駆体の1つである、請求項2に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞が、アセチルリン酸濃度により調節されるglnAp2プロモーターに機能的に連結されたホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする核酸配列を含む第2の発現カセットをさらに含んでいる、請求項2に記載の宿主細胞。
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