JPH03503604A - スブチリシンの安定化のための突然変異の組合せ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 スブチリシンの安定化のための突然変異の組合せ関連出願に対する相互参照 本出願は、米国出願Ｎ　ｏ、　８２８．５４５（１９８６年２月１２日出願）、 米国出願Ｎ　ｏ、　０３４．９６５（１９８７年４月６日出願）、米国出願Ｎ　 ｏ、　０３４．９６４（１９８７年４月６日出願）、および米国出願Ｎ　ｏ、　 １８０．７５７（１９８８年４月１２日出願）の一部継続出願であり、それぞれ の内容はすべて本明細書の一部を構成する。

発明の分野 本発明は、増強された熱安定性を有する改良型のスブチリシン酵素、および該ス ブチリシン酵素をコードしている遺伝子に関する。

発明の背景 タンパク質はアミノ酸の線状ポリマーである。タンノくり質を生成する重合反応 によってそれぞれのアミノ酸から水１分子が失われると表現されることが多い。

天然のタンパク質分子は２０種はどの異なるアミノ酸残基を含むことができ、そ のそれぞれは特有の側鎖を含有している。タンパク質中のアミノ酸配列はタン／ ＜り質の１次構造を指定している。

タンパク質は３次元構造に折り畳まれている。この折り畳みは、アミノ酸の配列 によって、およびタンパク質の周囲環境によって決まる。タンパク質の顕著な性 質は、このタンパク質の３次元の立体配座に直接依存している。即ち、この立体 配座が、酵素の活性または安定性、結合タンパク質の能力および特異性、ならび に受容体分子の構造的特性を決定している。

タンパク質の３次元構造は多数の方法で調べることができる。タンパク質の構造 を調べるための最良の既知の方法には、恐らくＸ線結晶学的方法の使用が含まれ る。この方法の優れた概説を、Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ［Ｖａｎ　Ｈｏ１ｄｅ、　Ｋ、　Ｅ、　（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、　ＮＪ 　（１９７１）　ｐｐQ ２１−２３９）　；この文献は本明細書の一部を構成するコに見ることができる 。この方法を用いて、極めて精度高く３次元構造を解明することができる。また 、円偏光二色性、光散乱を用いて、または放射エネルギーの吸収および放出を測 定することによって、タンパク質の３次元構造を精査することができる［Ｖａｎ 　Ｈｏ１ｄｅ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｐｒｅｎｔｉ ｃｅ−Ｈａｌｌ、　ＮＪ　（１９７１）コ。さらに、中性子デフラクションの技 術を用いて、または核磁気共鳴によって、タンパク質の構造を調べることができ る［Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　４ｔｈ　Ｅｄ、　Ｍｏｏｒｅ、 　Ｗ、　Ｊ、　、　Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、ＮＪ　（１９７２）　；この 文献は本明細書の一部を構成する］。

移しい数の天然タンパク質の３次元構造を調べることによって、多数の繰返しパ ターンが明らかになった。αヘワックス、平行βシート、および非平行βシート が、観察される最も普通のパターンである。このようなタンパク質パターンの優 れた記述は、Ｄ　１ｃｋｅｒｓｏｎ。

Ｒ，Ｅ、等がＴｈｅ　Ｓ　ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ ｒｏｔｅｉｎｓ［Ｗ、Ａ、Ｂｅｎｊａａｋｉｎ、　Ｉｎｃ、　、　ＣＡ　（１９ ６９）コに記載している。各アミノ酸をこれらパターンの１つに割り当てると、 タンパク質の２次構造が決まる。タンパク質の２次構造のへワックス、シートお よび折り返しが一緒になってタンパク質の３次元構造が生じる。多くのタンパク 質の３次元構造は、内部表面（タンパク質が通常見い出される水性環境から離れ るように配向している）および外部表面（水性環境にすぐ近接して存在する）を 有するものと特徴付けることができる。多数の天然タンパク質の研究により、疎 水性残基（トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、インロイ シン、バリン、またはメチオニンなど）は、タンパク質分子の内部表面に最も多 く見い出されることがわかった。対照的に、親木性残基（アスパラギン酸、アス パラギン、グルタメート、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリ ン、トレオニン、グリシン、およびプロリンなど）は、外部タンパク質表面に最 も多く見い出される。アミノ酸アラニン、グリシン、セリンおよびトレオニンは 、内部および外部タンパク質表面の両方に等しい頻度で見い出される。

タンパク質は、折り畳まれた秩序ある状態と折り畳まれていない無秩序の状態の 間の動的平衡の状態で存在する。この平衡の一部は、タンパク質の構造を安定化 させる傾向にあるポリペプチド鎖の異なるセグメント間の短い範囲の相互作用、 およびその一方の、分子のランダム化を促進する傾向にある熱力学的な力を反映 するものである。

天然タンパク質の最大の群は酵素を構成している。通常、それぞれの酵素は別種 の化学反応を触媒し、その機能が極めて特異的であるのが普通である。酵素が研 究され、酵素の３次元構造とその活性または安定性の間の関係が調べられた。

酵素のアミノ酸配列が酵素の性質を決定し、酵素のアミノ酸配列は該酵素をコー ドしている遺伝子のヌクレオチド配列によって指定される。酵素のアミノ酸配列 を変化させると、アミノ酸配列中の変化の位置、性質および／または強さに応じ て、程度を変えつつ酵素の性質を変化させることができ、また、酵素を不活性に することすらできる。

ある生物種内の別種類の天然酵素においてわずかな変異が存在することがあるが 、通常、同一の種の生物によって産生される特定の種類の酵素は、基質特異性、 熱安定性、種々の条件下（例えば、温度およびｐＨ）での活性レベル、酸化安定 性などについては実質的に同一である。このような天然あるいは「野生型」酵素 の性質は・酵素の天然環境外で利用する際には、必ずしも最適なものではない。

従って、酵素の天然の性質を変えて酵素のある種の性質を特定の使用のために、 または特定の環境において使用するために最適化することが望ましいこともある 。

久五史ｌ麹 本発明は、増強された熱安定性を有する改良型のスブチリシン酵素に関する。こ の改良型のスブチリシン酵素は、増強された熱安定性を付与する少なくとも２ま たはそれ以上のアミノ酸突然変異を有する。スブチリシンにおいて個々の安定化 突然変異を組合せると、熱安定性が加酸的に増加する結果になることが多いこと がわかった。

さらに、本発明は、増強された熱安定性を与える少なくとも２つのアミノ酸置換 を有するスブチリシン物質をコードしているクローンされた突然変異遺伝子に関 する。

図面の簡単な説明 第１図は、ＩＣ）＋Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）中での野生型スブチリシンの融 解プロフィールを示すグラフである。

第２図は、５７℃、ｐＨ８，０（Ａ）および２５°Ｃ，ｐＨ１２，０（Ｂ）で測 定した、野生型および突然変異株８３２４の不活性化の動力学を示すグラフであ る。

定義 本発明を説明する際に次の定義を用いる。

タンパク質：タンパク質は生細胞によって産生され、アミノ酸によって構成され るヘテロポリマーである。通常のタンパク質は１００−１０００個のアミノ酸か らなる。アミノ酸の正確な配列がタンパク質の構造および機能を決定する。

アミノ酸ニアミノ酸はタンパク質のビルディングブロックである天然の化合物で ある。通常、天然アミノ酸は３文字または１文字のどちらかに短縮して表される 。最も普通のアミノ酸とそれらの記号を第１表に挙げる。アミノ酸は頭部から尾 部に結合されて長い主鎖を形成する。それぞれのアミノ酸種は異なった側鎖を有 している。

アミノ酸　　　　　　　３文字コード　　　１文字コードアスパラギン酸　　　 　　　　Ａｓｐ　　　　　　　　Ｄアスパラギン　　　　　　　　Ａｓｎ　　　 　　　　　Ｎシスティン　　　　　　　　　Ｃｙｓ　　　　　　　　Ｃグルタミ ン酸　　　　　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　　　　Ｅメチオニン　　　　　　　 　　Ｍｅｔ　　　　　　　　Ｍ應工冬：すへてのアミノ酸は主鎖に同じ原子を有 し、側鎖においてのみ異なっている。主鎖の原子は１個の窒素、２個の炭素、お よび１個の酸素である。最初の原子は窒素であり、Ｎで示される。次の原子は炭 素であり、α−炭素と呼ばれる。側鎖の基はこのα−炭素に結合している。α− 炭素はＣで示されるカルボニル炭素に結合している。Ｃはカルボニル酸素（Ｏで 示される）に結合し、そして次の残基のＮに結合している。側鎖基の原子には、 元素記号（ＣＳＯ。

Ｎ、Ｓ）、ギリシャ文字（α、β、γ、δ、ε、ζおよびη）、そして側鎖基が 分岐しているときには恐らくはアラビア数字からなる名称が与えられる。

発明の詳細な説明 本発明は、スブチリシン酵素をフードしている種々のヌクレオチド配列に突然変 異を加えることによって修飾したスブチリシン酵素に関する。本発明の修飾され たスブチリシン酵素は増強された熱安定性を有している。

本発明のスブチリシン酵素は、プロテアーゼとして知られている酵素群に属する 。プロテアーゼは、ペプチド結合の切断のための触媒である。この切断の例を以 下に挙げるニブロチアーゼの１種はセリンプロテアーゼである。セリンプロテア ーゼは、活性部位に必須のセリン残基が存在しているペプチド結合の加水分解を 触媒する。セリンプロテアーゼは、フェニルメタンスルホニルフルオリドによっ て、およびジイソプロピルフルオロホスフェートによって阻害することができる 。

スブチリシンはグラム陽性細菌または菌類によって産生されるセリンプロテアー ゼである。７種のスブチリシンのアミノ酸配列が知られている。これらには、バ シラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株由来の５種のスブチリシンが含まれる（スブチリ シンＢＰＮ’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンＤＹ、スブチリシ ン・アミロサラカリチフス、およびメセンチコペブチダーゼ）［ｒ　Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来の中性プロテアーゼおよびア ルカリプロテアーゼの遺伝子はシグナル配列と成熟タンパク質をコードしている 領域の間に大きいオーブン・リーディング・フレームを含有しているＪ　（Ｖａ ｓａｎｔｈａ　ｅｔａｌ、、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５９　：　８１１ −８１９（１９８４））　；　ｒＢａｃｉｌｌｕｓ　１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒＩＩ ｌｉｓ由来のスブチリシン・カールスバーグの発現およびクローニング配列決定 Ｊ　（Ｊａｃｏｂｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　 １３：　８９１３−８９２６（１９８５））；ｒスブチリシンＤＹの全アミノ酸 配列の決定ならびにスブチリシンＢＰＮ’、カールスバーグおよびアミロサ１． カリチクスの一次構造との比較Ｊ　（Ｎｅｄｋｏｖ　ｅｔ　ａｌ、　＋　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｔ　Ｈｏｐｐｅ−８ｅｙｌｅｒ　３６６：　４２１−４３０（１９ ８５））　：　　ｒスブチリシン・アミロサ・ノカリチクスＪ　（Ｋｕｒｉｈａ ｒａ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２４７　：　５６１ ９−５６３１（＋９７２））　：および「アルカリ・メセンテリコペブチダーゼ の全アミノ酸配列Ｊ　（Ｓｖｅｎｄｓｅｎｅｔ　ａｌ、、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、 　　１９６：　２２ｇ−２３２（１９８６））］。

Ｔ　ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｕ１ｇａｒｉｓ由来のスブチリシン 争す−ミターゼノアミノ酸配列も既知である［　［ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ ｙｃｅｓ　ｖｕ１ｇａｒｉｓ由来のサーミターゼの全１次構造およびズブチリシ ン型プロテアーゼ類に対する構造的特徴Ｊ　（Ｍｅｌｏｕｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｆ ＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、摩：　１９５−２００（１９８５））］。

次の２種類の菌類プロテアーゼのアミノ酸配列が既知である：即ち、Ｔ　ｒｉｔ ｉｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ由来のブロテイナーゼＫ　［ｒＴｒｉｔｉｒａｃ ｈｉｕｍｈｅａ　ｐｕｌｃｈｅｌｌａ由来のサーモミコラーゼ［［エンドペプチ ダーゼ類：サーモミコリンＪ　（Ｇａｕｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　４５　：　４１５−４３３（１９７６））コである。

これらの酵素は、それらの１欠配列および酵素的性質によってだけでなく、Ｘ線 結晶学データの比較によっても、スブチリシンＢＰＮ′に関連していることがわ かった［「スブチリシン・カールスノイーグと複合したヒル由来の阻害物質ニグ リンの結晶および分子構造」（ＭｃＰｈａｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＦＥＢＳ　Ｌ ｅｔｔ、　　１８８　：　５５−５８（１９８５））ならびに［菌類のブロテイ ナーゼにの３次元構造は細菌性スブチリシンとの類似性を示すＪ　（Ｐａｈｌｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、　３　＋　１３１１−１３１４（１９８４）） ］。

「突然変異が為されたか、または修飾が加えられたスブチリシン酵素（群）」な る用語は、本発明で用いるときには、増強された熱安定性を有し、本発明のスブ チリシン酵素と相同な、突然変異が為されたセリンプロテアーゼを含むものとす る。また、本明細書ではこの突然変異が為されたか、または修飾が加えられたス ブチリシン酵素を・、「スブチリシン物質」とも記載する。本明細書で用いる際 には、および突然変異が為されたかもしくは修飾が加えられたスブチリシン酵素 またはスブチリシン物質の定義のもとでは、本発明の突然変異は、上に参照を挙 げたスブチリシンＢＰＮ’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンＤＹ 、スブチリシン・アミロサラカリチフス、メセンチコペプチダーゼ、サーミター ゼ、ブロテイナーゼに１またはサーモミコラーゼの配列と少なくとも５０％、好 ましくは８０％のアミノ酸配列相同性を有し、従って相同とみなすことができる あらゆるセリンプロテアーゼ中に導入してよい。

本発明の突然変異が為されたスブチリシン酵素は、天然あるいは野生型スブチリ シンを凌ぐ増強された熱安定性を有している。熱安定性は、タンパク質の全般的 な強靭さの良好な指標である。熱安定性の高いタンパク質は、カオトロピック物 質、デタージェントの存在下で、およびタンパク質を不活性化する傾向にあるそ の他の条件下で安定であることが多い。従って、熱的に安定なタンパク質は、高 温、厳しい溶媒条件に対する耐性、または長期の貯蔵寿命が要求される多くの工 業および治療分野で有用であると予想される。

さらに、スブチリシンにおいて個々の安定化突然変異を組合わせると、多くの場 合、安定化の自由エネルギーがほぼ加酸的に増加する結果になることが見い出さ れた。また、熱力学的安定性が、高温および高ｐＨでの不可逆的な不活性化に対 する耐性にも関係していることがわかった。本発明の単一部位の変化は、それぞ れ、折り畳みの自由エネルギーに対して１　、５　Ｋ　ｃａ１１モルの寄与を越 えることはない。しかし、これらの安定化の自由エネルギーの小さな漸増増加は 、突然変異がｍ合せられたときには、はとんどのタンパク質の折り畳みの全自由 エネルギーが５　１５Ｋｃａ１１モルの範囲にあるので、全体の安定性の劇的な 増加につながる［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｔ、　Ｅ、　、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　 ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ 、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｗｐａｎｙ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ（１ ９８４）コ。

いくつかの組合せ突然変異体のＸ線結晶学分析によって、それぞれの突然変異に 付随する立体配座の変化は、骨格構造の最少の歪みを伴って局所化される傾向が 高いことがわかった。即ち、３次タンパク質構造に劇的な変化を伴わず、代わ１ ２に、アミノ酸配列に小さな独立した変化を伴って、安定性の極めて大きな増加 を達成することができる。これまでに示唆されていたように［）ｌｏｌｍｅｓ、 　Ｍ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｍａｔｔｈｅｗｓ、　Ｂ、　Ｗ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１． 　Ｂｉｏｌ、　１６０　：　６２３（１９８２）］、安定化の自由エネルギーに 対する寄与は、折り畳まれた形態での疎水性相互作用および水素結合の改善なら びに折り畳まれていない酵素の鎖エントロピーの減少を含む多くの異なる方法に よって得ることができる。

通常、熱安定性酵素は全温度で長（なった半減期を有し、それによってバイオリ アクターおよび貯蔵寿命の点で改善される。触媒としての性質を犠牲にすること なくスブチリシンＢＰＮ’を好熱性の酵素に変換し得るということは、同じ逐一 的な方法によって多くのタンパク質の安定性を劇的に改善し得ることを示すもの である。

第２表に挙げたそれぞれのアミノ酸突然変異は、熱的に安定化する突然変異であ ることがわかった。即ち、本発明の突然変異スプチリシン酵素は、熱安定性を高 めるこれら特定のアミノ酸位置の置換を少な（とも２つ有している。第２表にお いては、天然のアミノ酸およびその位置数が最初に示されており、右側への矢印 がアミノ酸置換を示している。突然変異はスブチリシンＢＰＮ’を用いて行った 。しかし、本明細書中で説明するように、これらの突然変異を、オリゴヌクレオ チド−指向性の突然変異誘発を用いて他のセリンプロテアーゼ中の同様の位置に 導入することができる。

２　　　Ｔｈｒ　２２　　−＋　Ｃｙｓ、　　Ｓｅｒ　８７　　−＄　Ｃｙｓ３ 　　　Ｔｈｒ　２２　　−＋　Ｌｙｓ、　　Ａｓｎ　７６　　−＋　Ａｓｐ４　 　　　Ｍｅｔ　　５０　　−”　　Ｐｈｅ５　　　　Ｓｅｒ　５３　　　→Ｔｈ ｒ６　　　Ｓｅｒ　６３　４　Ａｓｐ、　　Ｔｙｒ　２１７−”　Ｌｙｓ９　　 　Ｔｙｒ　１０４−＋　Ｖａｌ、　Ｇｌｙ　１２８−＋　５ｅｔ１４　　　　Ｇ ｌｙ　　１６９　　→Ａｌａ１８　　　ＧＩｎ　２０６　−”　Ｃｙｓ１９　　 　　Ｇ１ｎ２０６−”Ｔｙｒ ２０　　　ＡＩａ２１６　→ｃｙｓ、ＧＩｎ２０６−＋Ｃｙｓ２３　　　　Ａｓ ｎ　　２１８　−”　　Ａｓｐ２４　　　ＧＩｎ　２０６　　→Ｔｙｒ２５　　 　Ｓｅｒ　２４８−”　ＡｓｐＳＳｅｒ　２４９　→Ａｒｇ２６　　　Ｔｈｒ　 ２５４　　→Ａｌａ２７　　　　Ｇｉｎ　２７１　　→Ｇｌｕ熱不活熱化活性化 る耐性は、２組の代表的な条件下での熱不活性化に対する耐性によって測定した 。第１のものは１０ｍＭの塩化カルシウムの存在下、６５°Ｃであり、第２のも のは溶液から遊離のカルシウムを除去する１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下、４５° Ｃである。

カルシウムはスブチリシンを安定化することが知られている。これら両極端のカ ルシウム濃度のもとでの安定性の測定は、安定なスブチリシンの可能性ある産業 上の利用には量の異なるカルシウムが存在する条件が含まれるために行ったもの である。野生型ＢＰＮ’スブチリシンのＴ１／２は、１０ｍＭＣａＣ（，６５℃ では５９±３分であり、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、４５°Ｃでは１４．４±０．０５分 である。

突然変異が為されたスブチリシンの熱安定性は、Ｔｌ／２（突然変異体）をＴｌ ／２（野生型）で割った比で表示する。

第３表は突然変異が為されたスブチリシン酵素を分泌する宿主細胞の菌株の名称 を挙げ、それらの半減期を野生型と比較するものである。

箪旦人突然変異スブチリシンＢＰＮ’酵素１０ｍＭ　ＣａＣＱ　　１．　ＯＬＩ ＩＭ　ＥＤＴＡＧＸ７１３０　　野生型　　　　　　　　　　　　　１．０　　 　　　　１．０ＧＸ７１７４　　ＶＡＬ　８　　　→ＩＬＥ　　　　　２．０　 　　　　　０．８ＧＸ７１７５　　ＧＬＹ　　１６９→ＡＬＡ　　　　　５．９ 　　　　　　１．ＩＧＸ７１８１　　　ＡＳＮ２１８→ＡＳＰ　　　　　５．２ 　　　　　　４．０ＴＨＲ２２→ＣＹＳ ＳＥＲ８７→ＣＹＳ ＧＸ７１８６　　ＡＳＮ２１８→ＳＥＲ２９５，３ＴＨＲ２２→ＣＹＳ ＳＥＲ８７→ＣＹＳ ＧＬＹ　　１６９→ＡＬＡ ＧＸ７１９５　　ＴＹＲ２１７→ＬＹＳ　　　　　３．３　　　　　　２．７Ｇ Ｘ７１９９　　ＴＨＲ２２→ＣＹＳ　　　　　１０ＳＥＲ８７→ＣＹＳ ＧＬＹ　　１６９→ＡＬＡ ＰＲＯ１７２→ＡＳＰ ＧＸ８３０３　　ＭＥＴ　５Ｑ　　→ＰＨＥ　　　　　Ｏ，７６１，４ＧＸ８３ ０９　　ＳＥＲ２４８→ＡＳＰ　　　　　１．５　　　　　　０．７５ＳＥＲ２ ４９→ＡＲＧ ＧＸ８３１４　　ＧＬＮ　２０６→ＣＹＳ　　　　　２．４　　　　　　５．Ｉ ＧＸ８３２１　　Ｔ）（Ｒ２２→ＣＹＳ　　　　　　　　　　　　　　３６ＳＥ Ｒ８７→ＣＹＳ ＧＬＹ　　１６９→ＡＬＡ ＭＥＴ　５０　　→ＰＨＥ ＴＹＲ２１７→ＬＹＳ ＡＳＮ２１８→５ＥＲ ＧＸ８３２４　　ＴＨＲ２２→ＣＹＳ　　　　　　　　　　　　　１６８ＳＥＲ ８７→ＣＹＳ ＧＬＹ　　１６９→ＡＬＡ ＭＥＴ５０　　→ＰＨＥ ＴＹＲ２１７→ＬＹＳ ＡＳＮ２１８→５ＥＲ ＧＬＮ　２０６→ＣＹＳ ＧＸ８３３０　　ＴＹＲ２１７→ＬＥＵ　　　　　２．０　　　　　　１．８Ｇ Ｘ８３３６　　ＧＬＮ　２０６→ＴＹＲ１，１１，７ＧＸ８３５０　　ＭＥＴ　 ５０　　→ＰＨＥ　　　　　　　　　　　　４００ＧＬＹ　　１６９→ＡＬＡ ＧＬＮ　２０６→ＣＹＳ ＴＹＲ２１７→ＬＹＳ ＡＳＮ２１８→５ＥＲ ＡＳＮ　７６　　→ＡＳＰ ＧＸ８３５２　　ＳＥＲ６３→ＡＳＰ　　　　　６．３　　　　　　　−ＴＹＲ ２１７→ＬＹＳ ＧＸ８３５４　　ＧＬＮ　２７１→ＧＬＵ　　　　　１．３　　　　　　−ＧＸ ８３６３　　ＴＨＲ２２→ＬＹＳ　　　　　１．３　　　　　　２．１ＡＳＮ　 ７６　　→ＡＳＰ ＧＸ８３７２　　ＭＥＴ５０　　→ＰＨＥ　　　　　　　　　　　　６３０ＴＹ Ｒ２１７→ＬＹＳ ＡＳＮ　７６　　→ＡＳＰ ＳＥＲ７８→ＡＳＰ ＡＳＮ２１８→５ＥＲ ＧＸ８３７６　　ＴＹＲ１０４→ＶＡＬ　　　　　５．０　　　　　　１．６Ｇ ＬＹ１２８→５ＥＲ ＧＸ７１４８　　ＧＬＹ１３１→ＡＳＰ　　　　　１．５　　　　　０．９ＧＸ ７１５０　　ＡＳＮ２１８→ＳＥＲ３，５２，６ＧＸ７１６４　　ＡＳＮ　２１ ８→ＡＳＰ　　　　　１．９　　　　　　１．５ＧＸ７１７８　５ＥＲ１８８→ ＰＲＯ１，８ＧＸ７１８８　　ＡＬＡ　１１６→ＧＬＵ　　　　１．３　　　　 　１・０５ＧＸ７１８９　　ＬＥＵ　１２６→ＩＬＥ　　　　１．４　　　　　 １．ＩＧＸ８３０１　　ＡＳＮ　２１８→ＳＥＲ７，４ＧＬＹ　　１６６→５Ｅ Ｒ ＧＸ８３０５　　ＳＥＲ５３→ＴＨＲ２，０ＧＸ８３０６　　ＡＳＮ　２１８→ ＳＥＲ７，０ＴＨＲ２５４→ＡＬＡ ＧＸ８３１５　　ＡＳＮ　２１８→ＳＥＲ１１，４ＧＬＹ　　１３１　＋ＡＳＰ ＴＨＲ２５４→ＡＬＡ ＧＸ７１５９　　ＴＨＲ２２→ＣＹＳ　　　　　１．０５　　　　　１．５ＳＥ Ｒ８７→ＣＹＳ ＧＸ８３０７　ＧＬＮ２０６→ｃｙｓ ＳＥＲ８７→ＣＹＳ ＧＬＮ　２０６→ＣＹＳ ＧＬＮ　２０６→ＣＹＳ ＡＬＡ２１６→ＣＹＳ ＧＸ７１７２　　ＰＲＯ１７２→ＡＳＰ　　　　　１．５　　　　　　１．ＩＧ Ｘ８３１２　　ＰＲＯ１７２→ＧＬＵ　　　　　２．０　　　　　　１．０ＧＸ ８３４７　　ＡＳＮ　７６　　→ＡＳＰ　　　　　　　　　　　　　２．５ＧＸ ８３６４　　ＳＥＲ７８→ＡＳＰ１．５ＧＸ８３７３　　ＡＳＮ　２１８→ＡＳ Ｐ　　　　　　　　　　　　４００ＭＥＴ　５０　　→ＰＨＥ ＧＬＹ　　１６９→ＡＬＡ ＧＬＮ　２０６→ＣＹＳ ＴＹＲ２１７→ＬＹＳ ＡＳＮ　７６　　→ＡＳＰ ＳＥＲ７８→ＡＳＰ 第２表および第３表のスブチリシン酵素突然変異の情報を用いて、例えばスブチ リシン・カールスバーグなどの密接に関連した他のプロテアーゼ類を改良するこ とができる。関連の深さはアミノ酸配列の比較によって調べる。タンパク質配列 を並べる方法は多数存在するが、関速度がかなり小さいときにそれらの相違が明 白になるにすぎない０Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐ　ｒｏｔｅｉｎ　Ｓ　ｅｑｕｅｎｃ ｅ　ａｎｄ　Ｓ　ｔｒｕｃｔｕｒｅ［ＭａｒｇａｒｅｔＯ，Ｄａｙｈｏｆｆ編、 Ｖｏｌ、５５ｕｐｐｌｅＩＩｌｅｎｔ　２．１９７６、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉ ｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｇｅｏｒｇｅｔ ｏｖｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ、　１ａｓｈｉ ｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，、ｐ、３ｆｆ、標題５ＥＡＲＣＨａｎｄ　ＡＬＩＧＮ ］に記載されている方法は関速度を定義している。当分野で周知であるように、 関連タンパク質は、鏡上のアミノ酸の数ならびに各アミノ酸の種類において異な ることができる。即ち、２つの構造を酷似性が最大になるように並べたときに削 除または挿入が存在し得る。例えば、スブチリシン・カールスバーグは２７４個 のアミノ酸を有しているが、一方、スブチリシンＢＰＮ’は２７５個のアミノ酸 を有している。この２つの配列を並べると、カールスバーグはスブチリシンＢＰ Ｎ’のＡＳＮ　５６に対応する残基を含んでいないことがわかる。このように、 カールスバーグのアミノ酸配列は、位置５６にギヤノブが示されていなければ、 ＢＰＮ’とは非常に違って見えるであろう。

従って、例えばスブチリシン・カールスバーグの位１２１８においてＡＳＮの代 わりにＳＥＲを置換すると熱安定性が増大するであろうことを、高い信頼度で予 想することができる（ただし、カールスバーグ中の残基はＢＰＮ”との相同性１ ４よって数が付されているものとする）。

２つの相同なスブチリシンの一方がギャップを有しているときには、その位置で 構造が異なっていると推論するにちがいない。そのような相違の例は当分野では 周知である。これらの局所的な相違の故に、どちらかのスブチリシンが突然変異 の部位に、またはその部位にすぐ隣接してギャップを有しているときには、安定 化突然変異を移すべきではない。従って、アミノ酸配列を並べた後に、ギャップ での、またはギャップの次の突然変異を望ましい突然変異のリストからはずし、 突然変異を行わない。

この方法を用いて、本明細書に記載した熱安定性突然変異の全てを他の相同なセ リンプロテアーゼに移すことができる。

簡単に説明すると、本発明の増強された熱安定性突然変異（群）を導入するため には、通常、所望のスブチリシン物質をコードしている遺伝子を始めにその天然 の供給源から単離し、クローニングベクター中にクローンする。別法によれば、 所望の遺伝子から転写されるｌｌｌＲＮＡを供給源細胞から単離し、クローニン グベクター中に挿入するために逆転写によってｃＤＮＡに変換する。クローニン グベクターはファージまたはプラスミドであってよく、通常、微生物のゲノムと は独立した微生物中のベクターの自律的な複製のためのレプリコンを含有してい る。クローニングベクターは、ベクターで形質転換された微生物の選択を助ける ために、１またはそれ以上の抗生物質耐性をコードしているＤＮＡなどの表現型 マーカーを含有しているのが好都合である。

ＤＮＡまたはｃＤＮＡをクローニング用のベクター中に挿入するための方法は当 分野で周知である。通常、これらの方法は、スブチリジン物質をコードしている 遺伝子をベクター中の開裂された制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することを 含み、この遺伝子の末端にデオキシヌクレオチドのホモポリマー尾部を付加して この遺伝子を相補性のホモポリマー尾部を有するクローニングベクターの開裂さ れた末端に結合させることを含むこともある。次いで、オリゴヌクレオチド指向 性の突然変異誘発によってスブチリシン遺伝子に突然変異を行うことができる。

部位指向性の突然変異誘発とも呼ばれるオリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘 発はＢ　ｒｙａｎ等［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３　：　３７４３−３７４５（１９８６）　 ；この文献の開示は本明細書の一部を構成する］が詳細に記載している。

本発明の突然変異スブチリシン物質は、クリーニング、特に布類のクリーニング に用いられる清浄剤などの洗浄調製物への添加物として用いることができる。本 発明の突然変異スブチリシン物質は野生型のスプチリシン物質よりも熱的に安定 であり、従って清浄剤を含む溶液中で保存したとき、あるいはクリーニングで使 用中に高温にかけたときに野生型と同じように早く活性を失うことはない。本発 明の突然変異スブチリシン物質を洗浄調製物の添加物として用いることによって 、織物のタンパク質性の汚れの除去が改善される。

洗浄調製物への添加物として用いることができる突然変異スブチリシン物質の量 は、当分野で周知であり、通常の実験によって容易に確かめることができる。酵 素濃度の最適範囲が、酵素のコストおよび要求されるクリーニング結果に関係し ているのは勿論である。通常、洗浄調製物に添加される突然変異スブチリシン物 質の量は、約２０００〜約４０００　　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｄｅｌｆｔ　Ｕｎｉ ｔｓ／洗浄調製物の重量（ＡＤＵ／９）であろう。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、これらは本発明を限定するものでは ない。

実施例１　熱安定性の検討 より安定なタンパク質に加工し得る可能性は、多くの工業用および治療用用途を 広げるはずである。はとんどのタンパク質は恐らく進化の過程を越えては安定性 が最適化されていないと考えられるので、安定性を実質的に増加させる加工は、 出発構造の比較的小さい修飾によって達成できることが多い。実験結果はこの点 においてこの考えと一致しているようである。スブチリシン［Ｂｒｙａｎ　ｅｔ 　ａｌ、。

ヌクレアーゼ［５ｈｏｒｔｌｅ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｌｉｎ、　Ｂ、　、　Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ　１１０　：　５３９（１９８５）］、ジヒドロ葉酸還元酵素［Ｖｉ ｌｌａｆｒａｎｃａ　ｅｔ　ａｌ、＋５ｃｉｅｎｃｅ　２２２　：　７ｇ２（１ ９８３）］、λリプレッサー［ＩＴｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｔｅｉ ｎｓ　：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｆｕｎｃｔｉ。

ルトランスフェラーゼ［Ｌｉａｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２３　：　 ３５６（１９８６）コを含むいくつかのタンパク質のより安定な変形型が開示さ れていた。最近の結晶学的研究によって、微妙な局所性の高い構造的相違が親の タンパク質と安定突然変異体を区別しているにすぎないことが一般的に示された ［Ｂｒｙａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）、上記；　Ｍａｔｔｈｅｗｓ　ｅｔ 　ａｌ、　（１９８７）、上記；およびＡｌｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒ ｅ　３３０　：　４１（１９８７）］。さらに、ランダム突突然変異遺伝子によ って、安定化突然変異の現象がかなり普通のものであることがわかった。スブチ リシンにおいて化学的突然変異原によって生成する１％のオーダーのアミノ酸変 化により、非折り畳みの自由エネルギーが０．５Ｋｃａ１１モルまたはそれ以上 増加する。

安定化突然変異は一般的なものであると考えられるが、タンパク質構造中の安定 化修飾の設計は試行錯誤的なものであった。実際のところ、これまでの最も成功 した設計法は、特定のアミノ酸変化が折り畳み構造に及ぼす作用の正確な知識に 基づくものではな（、むしろ、非折り畳み形態に及ぼすその推定の作用によるも のであった。

例えば、非折り畳み形態のタンパク質の立体配置のエントロピーおよびそれによ る非折り畳みのエントロピーは、プロリン残基においてグリシン残基を置換する ことによって、またはジスルフィド架橋を導入することによって減少させること ができる［Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ　ｅｔａｌ、　（１９８７）、上記；　Ｍａｔ ｔｈｅｗｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）、上記；　Ｈｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ、 　（１９８６）、上記］。

ある突然変異が折り畳まれた状態の自由エネルギーに及ぼす作用は正確に予測す ることはできないが、それでも安定性の大きな増加を得ることができることを本 明細書に示した。本明細書にスブチリシンＢＰＮ’のいくつかの独立して単離し た変異体を示すが、これらのそれぞれは、非折り畳みの自由エネルギーおよび不 可逆的な熱不活性化に対する耐性が有意に増加している。これらの個々の安定化 突然変異を組合せると、例えば、高温または高ｐＨで野生型のスブチリシンＢＰ Ｎ’に比べて２００倍長い熱不活性化半減期を有し、１５．７°高く融解する変 異体が得られる結果になる。熱量測定データによって、個々の安定化突然変異を 組合せることによって得られる安定化の自由エネルギーのそれぞれの漸増増加が 、全体の安定性のほぼ加酸的な増加につながることがわかった。従って、スブチ リシンの安定性を逐一的な方法で増加させることができた。安定化突然変異を設 計するか、またはランダム突然変異誘発とスクリーニングによって同定し、次い でこれを組合せて個々の変化のそれぞれから生じる安定性増加を有するスブチリ シンを得た。

Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａａｉｅｎｓ（スブチリシンＢＰ Ｎ’）由来のスブチリシン遺伝子をクローンし、予め配列決定し、Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓにおいてその天然のプロモーター配列から高レベルで発 現させた［Ｖａｓａｎｔｈａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５９　 ：　８８１（１９８４）；　Ｙｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１　：　７９１１（１９８３）コ。これによって、プラス ミドにコードされているスジチリシン遺伝子中にインビトロで突然変異を導入す ること、および変化させた酵素の熱安定性に及ぼすそれらの作用を都合良く分析 することが可能になった。全ての突然変異遺伝子をｐＵＢｌｌｏに基づく発現プ ラスミド［Ｂｒｙａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔｕｒ ｅ、　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１　：　３２６（１９８ ６）］中に再クローンし、これを用いてＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓを形質転換した。

宿主として用いるＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ株はそのスブチリシン遺伝子の染色体欠 失を含んでおり・従ってツマツクグラウンドの野生型活性を生成しない。全ての 突然変異酵素がこのベクターから効率的に発現され、約１９／ρの濃度で培養培 地に分泌された。この系ではスブチリシンが主な分泌タンパク質であり、全細胞 外タンパク質のほぼ８０％を構成する。野突然変異および野生型酵素の相対的な 熱力学的安定性を示差スキャニング熱量測定法（ＤＳＣ）を用いて測定した。温 度としてタンパク質試料が吸収する過剰の熱量は、非折り畳みのエンタルピーを 直接測定するときには、一定圧力で折り畳みから非折り畳み状態に至る遷移を経 て増加する［Ｐｒ１ｖａｌｏｖ　ａｎｄ　Ｐｏｔｅｋｈｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

ｇｙ　１３１　：　４（１９８６）　；　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ａｎｄ　５ｔｕ ｒｔｅｖａｎｔ＋　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０　：　U １８５（１９８１）］。しかし、スブチリシンを用いると、非折り畳み過程を伴 う自己分解がこの分析を複雑にする。本明細書に報告する研究においては、この 問題を、競合阻害物質Ｎ−ダン／ルー３−アミンベンゼンボロン酸（ｐＨ８，０ でＫｉ＝２μＭを有する）の添加によっである程度まで防止１７た［Ｐｈ１ｌｉ ｐ　ａｎｄ　Ｍａｒｕｐｕｒｉ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１３３　：　３Ｇ（１ ９８１）」。しかし、残存する少量の自己分解活性が熱量測定によるΔＨの正確 な測定を妨げた。それにもかかわらず、ここで用いた条件のもとでは、熱による 非折り畳みの速度は、自己分解および／または集合が天然および変性状態の平衡 から非折り畳み分子を除去する速度に比べると早いようである。従って、熱によ る非折り畳み遷移の中間点Ｔｍは、折り畳みと非折り畳み状態の濃度がほぼ等し い温度を正確に反映している（即ち、ΔＧ＝０）。即ち、安定化突然変異によっ て得られるＴ＋ａの増大を用いて、非折り畳み反応のΔＧの増大を計算すること ができる。

１０＋ａＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０中での野生型スブチリシンの融解プロフィー ルを第１図に示す。次の理由により、ＥＤＴＡの存在下で得られた結果を報告す ることを選択した。スブチリシンＢＰＮ“は、その２つのカルシウム結合部位が 占有されているときには、大きく安定化される。溶液から遊離のカルシウムを除 去するためにＥＤＴＡを用いることによって、酵素の固有の安定性に及ぼす突然 変異の作用を、カルシウム結合親和性に及ぼすそれらの作用とは別に測定するこ とができる。第２に、スブチリシンの主な産業用用途が金属キレート化剤を含む クリーニング業の清浄剤への添加物としてのものであるので、遊離カルシウム濃 度の低い条件下での安定性の測定がこのような利用に則している。

ＤＳＣ分析のためのコンピュータープログラムを用いて、スブチリシンの融解プ ロフィールを、種々の非折り畳みのモデルと比較した。野生型のデータ（第１図 ）は、２−状態モデルに極めて適合性が高い。この２−状態モデルに基づいて、 温度補正したファントホフΔＨを計算した。３回の独立した融解実験に対して、 計算δＨは９４．１００±５０００ｃａ１１モルであった。ΔＧ＝Ｏである温度 （５４，８±０．２°）の融解遷移の中間点を用いると、ΔＳは２８６　ｃａｌ ／温度・モルと計算される。

全ての単一および組合せ突然変異の融解温度およびそれに関連する自由エネルギ ーの変化を第４表にまとめる。個々の突然変異体の非折り畳みの自由エネルギー と組合せ突然変異体のそれとの比較によって、個々の変化のそれぞれに伴われる 自由エネルギー変化は、それらが同一分子中で組合わされるときには、通常、は ぼ加酸的なものになることが示された。

第４表 一二二二二二一一−−一一一一一−−一一一一−−−−−−−−−−−−−−− −一一一一一一一一一一−−−−−−菌　株　　　　　突然変異　　　　　　　 ΔＴｍ　　　ΔΔＧ　ΔΔＧ（合計）野生型ＢＰＮ’　　　　−−−−−−−− −７１５０Ｎ２１８５　　　　　　　４．９°　　　１．４　　　−７１５９　 　　　７２２０％５８７Ｃ２，６°　　０．７　　　−７１７５　　　　　Ｇ１ ６９Ａ　　　　　　　　　１．６°　　０．４　　　−８３０３　　　　　Ｍ５ ０Ｆ　　　　　　　　　２．３°　　０．６７１９５　　　　　Ｙ２１７Ｋ　　 　　　　　　３．４°　　０．９８３１４　　　　　Ｑ２０６Ｃｏｘ　　　　　 　　５．４°　　　１．５＊ΔＴｍ＝ΔΔＧｍｕｔ−野生型／ΔＳの関係から計 算した［Ｂｅｃｋｔｅｌ、　Ｗ、　Ｊ、　ａｎｄＳｃｈｅｌｌｅａｎ、Ｊ、Ｌ　 、　β１９Ｐ９１χ！９工！　２６　：　　１８５９（１９ｇ？）コ不可逆的な 不活性化の動力学 ２組の太き（異なる条件下で、熱力学的安定性と不可逆的な不活性化に対する耐 性の間の関係の可能性について調べようとした。野生型および突然変異体株８３ ２４の不活性化の動力学を・５７℃・ｐＨ８，０（Ａ）、および２５°Ｃ，ｐＨ １２，０（Ｂ）の両方で測定した（第２図）。

プロテアーゼの不可逆的な熱不活性化の正確な機序は複雑であり、恐らくは、非 折り畳み、集合、自己分解およびその他の要素が関与している。しかし、ここで 用いた条件のもとでは、野生型および変異体８３２４の熱不活性化の速度は４半 減期にわたって１次の動力学に従い、過程における律速段階が単分子であること を示す。

この８３２４組合せ変異体は５７°、ｐＨ８，０および２５°、ｐＨ１２，０の 両方で野生型よりも２００倍遅いように不活性化された（第２図）。高ｐＨおよ び高温での不可逆的な不活性化に対する耐性は、熱力学的安定性の増加に関係し ているようである。このことは、高温および高ｐＨの条件下での野生型および８ ３２４の不活性化過程における最大のエネルギー障壁が、非折り畳み現象に関係 したものであることを示唆している。

Ｘ線結晶構造 ６つの安定化修飾の間の構造的関係を分析するために、６つの高分解結晶構造を 比較した。ぶら下がりの滴中の５５％アセトンに対する蒸気拡散によって結晶を 成長させ［Ｂｒｙａｎ等、上記コ、２〜７日以内に野生型および突然変異スブチ リシンの大きな単結晶を得た。

この結晶は、Ｄ　ｒｅｎｔｈおよびＨｏ１［Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　２８：　 ５４３（１９６７）］によって報告されている単斜結晶形と同形であり、セル寸 法ａ＝４１．６人、ｂ＝７９．５人、Ｃ＝３７．３人、およびｄ＝１１４．５人 を有する空間群Ｐ２１に属していた。

Ｅｌｌｉｏｔｔ　ＧＸ−２１Ｘ線源を用いる改良型Ｓ　ｕｐｐｅｒ振動カメラに 装着したＸ　ｅｎｔｒｏｎｉｃｓ画像比例計数管を用いて回折強度を測定した。

単結晶を用い、１．８人の分解能にセットして各データを集めた。

最初のモデルをＦ　ｏｕｒｉｅｒ示差分析によって測定し、次いで制限最小２乗 法を用いて厳密な結晶学的精製を行った。全ての非水素タンパク質原子、１８４ の秩序正しい水分子、２つのアセトン分子、および２つのカルシウム原子が精製 において含まれていた。Ｎ２１８Ｓ変異体（７１５０）および野生型の詳細な構 造比較は以前に報告されている。これら２種類の酵素の構造は、Ｃ位置に対して は０．０７人および全原子に対しては０．１０に重ね合わせ得ることがわかった 。２倍以上にこれらの値からはずれる唯一の領域は、残基２１８のすぐ近くであ った。次いで、２２−８７ＣＳＳ２１８変異体（７１８１）の構造を測定し、同 一の基準により、置換した残基２２および８７の周辺においてのみ７１５０変異 体と異なっていることがわかった。このことは、変異体７１８６．８３２１およ び８３２４の構造を決定し、比較したときにも言えることがわかった。

これらの突然変異は、折り畳まれた形態における水素結合および疎水性相互作用 の改善ならびに折り畳まれていない酵素の鎖エントロピーの減少など、様々な方 法で安定化の自由エネルギーに寄与する。構造レベルにおいてこれら突然変異の 作用は、少なくとも１゜８人のＸ線結晶構造によって測定され得る限りにおいて は独立しており、高度に局在化されていることが、本明細書に報告した比較によ ってわかる。これら修飾のそれぞれに伴われる構造的変化の微妙さの故に、８３ ２４などの大きく変えられ、そして安定な変異体であってもその基本の構造は、 なお野生型に類似性が高い。

でペプチド基質スクシニル−（Ｌ）−Ａｌａ−（Ｌ）−Ａｌａ−（Ｌ）−Ｐｒ。

（Ｌ）　　Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（ＳＡＡＰＦ−ｐＮＡ）の０．１＋Ｍ溶 液の加水分解をモニターすることによってスブチリシン活性を検定した。動力学 的パラメーターを第５表に示す。突然変異の大部分が５ＡＡＰＦに対する触媒パ ラメーターの改善につながる。しかし、アゾカゼインに対する相対的なブロテイ ナーゼ活性は、野生型のものに比べて５０％はど低い。ブロテイナーゼ活性の損 失の大部分は、それ自体が野生型に比べて活性が２５％低い５２１８突然変異に 起因するものと考えることができる。好熱性生物由来の酵素が、通常、中温生物 の対応物と同じほど２５℃で活性ではないにしても［Ｂｒｏｃｋ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　＋　１３２（１９８５）］、安定化突然変異が触媒活 性に必ずしも悪影響を及ぼすものでないことは明らかである。好熱性酵素は効率 の高い触媒であることが進化において強要されていないようであるが、これは、 反応が行われるのが高温であるためであろう。それぞれがブロテイナーゼ活性に 比較的小さな作用を有している安定化突然変異だけを組合せるように選択してい るので、いくつかの組合せ変異体の活性は野生型の活性に類似したままである。

野生型　　　　　　　１７２±２　　４６．８±０．２　１．０ＯＮ２１８Ｓ　 　　　　　１１５＋４　　６１±４　　　０．７５±０．０２７２２Ｃ，５８７ Ｃ２０９±１７４７±３　　　０．９５±０．０３Ｇ１６９Ａ　　　　　　８６ ±９　　６０±３　　　０．９３±０．０２Ｍ５０Ｆ　　　　　　　９４±２　 ４４±２　　　０．９７±０．０２Ｙ２１７Ｋ　　　　　　９９±４　５９±３ 　　　１．１８±０．０４Ｑ２０６Ｃｏｘ　　　　　　　　　　　　　　　　　 Ｏ，９９±０．０５７１８１　　　　　　　　　　　　　　　　　０．７３±０ ．０２７１８６６４±１　６４±３　　　０．６８±０．０１８３１６　　　　 　　　　　　　　　　　　　０．５４±０．０４８３２１　　　　　１７３　　 １５０　　　　　０．７２±０．０６本発明者等は、スブチリシンにおいて個々 の安定化突然変異を組合せると、安定化の自由エネルギーがほぼ加酸的に増加す る結果になり得ることを見い出した。また、熱力学的安定性が、高温および高ｐ Ｈでの不可逆的な不活性化に対する耐性に関連して（Ｘることもわかった。熱力 学的な分析によって、それぞれの修飾が安定化の自由エネルギーに対してそれぞ れ０．４−１．５　ｋｃａ１１モルで寄与していることが示された。実際のとこ ろ、単離された２０以上の安定化単一部位変異のうち、どの変異も折り畳みの自 由エネルギーに対して１．５Ｋｃａ１１モルの寄与を越えることがなかった。は とんどのタンパク質の折り畳みの全自由エネルギーは５−１５　ｋｃａ１１モル の範囲内である［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｔ、　Ｅ、　、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　 ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、 　Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅ＋ａａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ （１９８４）］。しかし、安定化の自由エネルギーにおけるこれらの小さい増加 は、突然変異が組合わされたときには全体の安定性に劇的な増加をもたらす。８ ３２４変異体は、野生型スブチリシンＢＰＮ’に比べて４，４Ｋｃａ１１モル以 上安定である。

いくつかの組合せ突然変異体のＸ線結晶学的分析により、それぞれの突然変異に 伴われる立体配座の変化は、骨格構造の歪みが最少のままで局在化される傾向が 高いことがわかった。従って、３次タンパク質構造に劇的な変化を伴うことなく 、代わりに、アミノ酸配列に小さな独立した変化を伴って、極めて大きな安定性 の増加を達成することができる。これまでに示唆されていたように［Ｈｏｌｍｅ ｓ、　Ｍ。

Ａ、　ａｎｄ　Ｍａｔｔｈｅｗｓ、　Ｂ、　Ｗ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ ｌ、　１６０　：　６２３（１９ｇ２）］、安定化の自由エネルギーへの寄与は 、折り畳み形態における水素結合および疎水性相互作用の改善、ならびに非折り 畳み酵素の鎖エントロピーの減少を含む多くの異なる方法で得ることができる。

８３２４突然変異体は野生型よりも１５．７°高い融解温度を有し、高温および 高ｐＨの両方で２００倍長い半減期を有している。通常、熱安定性酵素は全温度 で長くなった半減期を有し、それによってバイオリアクターおよび貯蔵寿命の点 で改善する。ここで示した触媒としての性質を犠牲にすることなくスブチリシン ＢＰＮ’を好熱性の酵素に変換し得るということは、本発明者等が行ったものと 同じ逐一的な過程によって多くのタンパク質の安定性を劇的に改善することがで きることを示すものである。

実施例２ ２０以上の変異体が、熱不活性化に対する耐性の増加を保持して単離された（第 ６表）。これらの安定な変異体では、スブチリシンの熱不活性化の半減期は個々 の突然変異によって１．３倍〜５倍に増加する。しかし、安定化突然変異を組合 せることによって、一般に、個々の突然変異のそれぞれから得られる安定性を有 する変異体を得ることができることがわかった。即ち、逐一的な方法によって極 めて安定な変異体を構築することができる。個々に分離した安定化突然変異を組 合せることによって、通常、熱不活性化の半減期にほぼ積算的な増加が得られる ことになる（第６表）。

例えば、ある構築では、２２−８７ジスルフイド突然変異（ＧＸ７１５９）をＡ ＳＮ２１８−５ＥＲ突然変異（ＧＸ７１５０）と組合せて変異体ＧＸ７１８１を 得る。このＡＳＮ２１８−３ＥＲ突然変異はそれ自体が野生型に比べて熱不活性 化のＴ１／２を２．６倍に増加させ、２２−８７ジスルフイドは１，５倍増加さ せる。この２重の突然変異体は２つの個々の変化のほぼ合計の安定性を示し、野 生型の４．０倍の熱不活性化のＴ１／２を有している。

この原理に基づく６つの別の例を第６表に挙げる。

これら突然変異体のいくつかのＸ線結晶学および熱力学分析によって、構造中の 微妙かつ局所性の高い変化が安定性の有意な増加につながり得ることがわかった 。示差スキャニング熱量分析による安定化突然変異体の分析によって、どれもが 折り畳みの自由エネルギーに対して１　、５　ｋｃａ１１モル以上では寄与しな いことが示された。はとんどのタンパク質の非折り畳みの全自由エネルギーは５ −１５ｋｃａ１１モルの範囲内であるので、この安定化の量は意味がある。即ち 、個々の安定化突然変異を組合せることによって得られる安定化の自由エネルギ ーの小さな加算増加により、全体の安定性が劇的に増加する結果になる。これら の安定性の増加は、３次タンパク質構造に劇的な変化を伴うことなく、代わりに 、アミノ酸配列に小さな独立した変化を伴って達成することができる。

安定化突然変異を組合せることは、はとんどのタンパク質において安定性の大き な増加を得るための一般的な方法となるはずである。

通常、熱安定性酵素は全温度および溶媒条件で長くなった半減期を有し、それに よってバイオリアクターおよび貯蔵寿命の点で改善するので、これらの発見は産 業との重要な関係を有している。

！昼前独立して見い出された安定化突然変異の組合せ例１０５ＭＣａＣｅ　　１ ．ＯｍＭＥＤＴＡＧＸ７１３０　　野生型　　　　　　　　　　　　１・０　　 　　　　１．０５ＥＲ８７→ＣＹＳ ＧＬＹ　　１６９→ＡＬＡ ＧＬＹ　　１６９→ＡＬＡ ＰＲｏ　　１７２→ＡＳＰ ＭＥＴ　５０　　→ＰＨＥ ＴＹＲ２１７→ＬＹＳ ＡＳＮ２１８→５ＥＲ ＧＬＹ　　１６９→ＡＬＡ ＭＥＴ　５０　　→ＰＨＥ ＴＹＲ２１７→ＬＹＳ ＡＳＮ２１８→５ＥＲ ＧＬＮ　２０６→ＣＹＳ ＧＬＮ　２０６→ＣＹＳ ＴＹＲ２１７→ＬＹＳ ＡＳＮ２１８→５ＥＲ ＡＳＮ　７６　　→ＡＳＰ ＴＹＲ２１７→ＬＹＳ ＡＳＮ２１８→５ＥＲ ＡＳＮ　７６　　→ＡＳＰ ＳＥＲ７８→ＡＳＰ ＳＥＲ７８→ＡＳＰ 上記の発明を明確にし、理解を助けるために例を示して説明したが、ある種の変 化および修飾を本発明の範囲内で行うことができることは明らかであり、本発明 は添付の請求の範囲によってのみ限定されるものである。

不ミ翫１）７ｉイ乙　（５７″′ｐＨ８，０）不ミ翫村しイ乙（２５”、ＰＨｔ ２．ｏ）時　藺（全） 国際調査報告 ＋Ｒ市＃＋Ｒａ１ｎｌｌｎｌ＾””−〇”０ＰＣＴ／ＵＳ８９１０１４７４

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．以下に挙げるアミノ酸置換の少なくとも２つを含有する、突然変異スブチリ シン遺伝子によってコードされているスブチリシン物質： アミノ酸位置８にイソロイシン； アミノ酸位置２２にシステインおよびアミノ酸位置８７にシステイン； アミノ酸位置２２にリジンおよびアミノ酸位置７６にアスパラギン酸； アミノ酸位置５０にフェニルアラニン；アミノ酸位置５３にトレオニン； アミノ酸位置６３にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２１７にリジン； アミノ酸位置７６にアスパラギン酸； アミノ酸位置７８にアスパラギン酸； アミノ酸位置１０４にバリンおよびアミノ酸位置１２８にセリン；アミノ酸位置 １１６にグルタミン酸； アミノ酸位置１２６にイソロイシン； アミノ酸位置１３１にアスパラギン酸；アミノ酸位置１６６にセリン； アミノ酸位置１６９にアラニン； アミノ酸位置１７２にアスパラギン酸；アミノ酸位置１７２にグルタミン酸； アミノ酸位置１８８にプロリン； アミノ酸位置２０６にシステイン： アミノ酸位置２０６にチロシン； アミノ酸位置２１６にシステインおよびアミノ酸位置２０６にシステイン； アミノ酸位置２１７にリジン； アミノ酸位置２１７にロイシン； アミノ酸位置２１８にアスパラギン酸；アミノ酸位置２１８にセリン； アミノ酸位置２４８にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２４９にアルギニン； アミノ酸位置２５４にアラニン；またはアミノ酸位置２７１にグルタミン酸。
2. ２．スブチリシン物質が３またはそれ以上のアミノ酸置換を含有している請求項 １記載のスブチリシン物質。
3. ３．スブチリシン物質がスブチリシンに相同な突然変異セリンプロテアーゼであ る請求項１記載のスブチリシン物質。
4. ４．スブチリシンがＢＰＮ′、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンＤ Ｙ、スブチリシン・アミロサッカリトリクス、およびメセンテリコペブチダーゼ からなる野生型スブチリシン群から選ばれる請求項１または２に記載のスブチリ シン物質。
5. ５．オリゴヌクレオチド突然変異誘発によってスブチリシン物質に突然変異を誘 発して以下に挙げるアミノ酸置換の少なくとも２つを行うことを特徴とする、ス ブチリシン物質の安定化方法：アミノ酸位置８にイソロイシン； アミノ酸位置２２にシステインおよびアミノ酸位置８７にシステイン； アミノ酸位置２２にリジンおよびアミノ酸位置７６にアスパラギン酸； アミノ酸位置５０にフェニルアラニン；アミノ酸位置５３にトレオニン； アミノ酸位置６３にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２１７にリジン； アミノ酸位置７６にアスパラギン酸； アミノ酸位置７８にアスパラギン酸； アミノ酸位置１０４にバリンおよびアミノ酸位置１２８にセリン；アミノ酸位置 １１６にグルタミン酸； アミノ酸位置１２６にイソロイシン； アミノ酸位置１３１にアスパラギン酸；アミノ酸位置１６６にセリン； アミノ酸位置１６９にアラニン； アミノ酸位置１７２にアスパラギン酸；アミノ酸位置１７２にグルタミン酸； アミノ酸位置１８８にプロリン； アミノ酸位置２０６にシステイン； アミノ酸位置２０６にチロシン； アミノ酸位置２１６にシステインおよびアミノ酸位置２０６にシステイン； アミノ酸位置２１７にリジン； アミノ酸位置２１７にロイシン； アミノ酸位置２１８にアスパラギン酸；アミノ酸位置２１８にセリン； アミノ酸位置２４８にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２４９にアルギニン； アミノ酸位置２５４にアラニン；またはアミノ酸位置２７１にグルタミン酸。
6. ６．請求項１または２に記載のスブチリシン物質を２，０００〜４，０００Ａｌ ｋａｌｉｎｅ　Ｄｅｌｆｔ　Ｕｎｉｔｓの濃度で含有する洗浄調製物。
7. ７．織物を請求項６記載の洗浄調製物と接触させ、該洗浄調製物で汚れた織物を クリーニングすることを特徴とする、織物のタンパク質性の汚れの除去を改善す るための方法。
8. ８．Ａｓｎ２１８のＡｓｐへの、Ｔｈｒ２２のＳｙｓへの、およびＳｅｒ８７の Ｃｙｓへのアミノ酸置換を有するスブチリシン７１８１。
9. ９．Ａｓｎ２１８のＳｅｒへの、Ｔｈｒ２２のＣｙｓへの、Ｓｅｒ８７のＣｙｓ への、およびＧｌｙ１６９のＡｌａへのアミノ酸置換を有するスブチリシン７１ ８６。
10. １０．Ｔｈｒ２２のＣｙｓへの、Ｓｅｒ８７のＣｙｓへの、ＧＩｙ１６９のＡｌ ａへの、およびＰｒｏ１７２のＡｓｐへのアミノ酸置換を有するスブチリシン７ １９９。
11. １１．Ｔｈｒ２２のＣｙｓへの、Ｓｅｒ８７のＣｙｓへの、Ｇｌｙ１６９のＡｌ ａへの、Ｍｅｔ５０のＰｈｅへの、Ｔｙｒ２１７のＬｙｓへの、およびＡｓｎ２ １８のＳｅｒへのアミノ酸置換を有するスブチリシン８３２１。
12. １２．Ｔｈｒ２２のＣｙｓへの、Ｓｅｒ８７のＣｙｓへの、Ｇｌｙ１６９のＡＩ ａへの、Ｍｅｔ５０のＰｈｅへの、Ｔｙｒ２１７のＬｙｓへの、Ａｓｎ２１８の Ｓｅｒへの、およびＧｌｎ２０６のＣｙｓへのアミノ酸置換を有するスブチリシ ン８３２４。
13. １３．Ｍｅｔ５０のＰｈｅへの、Ｇ１ｙ１６９のＡｌａへの、Ｇｌｎ２０６のＣ ｙｓへの、Ｔｙｒ２１７のＬｙｓへの、Ａｓｎ２１８のＳｅｒへの、およびＡｓ ｎ７６のＡｓｐへのアミノ酸置換を有するスブチリシン８３５０。
14. １４．Ｍｅｔ５０のＰｈｅへの、Ｇｌｙ１６９のＡｌａへの、Ｇｌｎ２０６のＣ ｙｓへの、Ｔｙｒ２１７のＬｙｓへの、Ａｓｎ２１８のＳｅｒへの、Ａｓｎ７６ のＡｓｐへの、Ｓｅｒ７８のＡｓｐへのアミノ酸置換を有するスブチリシン８３ ７２。
15. １５．Ａｓｎ２１８のＡｓｐへの、Ｍｅｔ５０のＰｈｅへの、Ｇｌｙ１６９のＡ ｌａへの、Ｇｌｎ２０６のＣｙｓへの、Ｔｙｒ２１７のＬｙｓへの、Ａｓｎ７６ のＡｓｐへの、およびＳｅｒ７８のＡｓｐへのアミノ酸置換を有するスブチリシ ン８３７３。
16. １６．（ａ）スブチリシンのアミノ酸配列を得；（ｂ）該スブチリシンのアミノ 酸配列をスブチリシンＢＰＮ′のアミノ酸配列と並べ； （ｃ）突然変異が（ａ）のスブチリシンのアミノ酸配列中のギャップのところに 、またはギャップの隣に来ないような条件のもと、該スブチリシンをオリゴヌク レオチド指向性の突然変異誘発によって突然変異させて、以下に示す突然変異の 少なくとも２つを組合せ：アミノ酸位置８にイソロイシン； アミノ酸位置２２にシステインおよびアミノ酸位置８７にシステイン； アミノ酸位置２２にリジンおよびアミノ酸位置７６にアスパラギン酸； アミノ酸位置５０にフェニルアラニン；アミノ酸位置５３にトレオニン； アミノ酸位置６３にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２１７にリジン； アミノ酸位置７６にアスパラギン酸； アミノ酸位置７８にアスパラギン酸； アミノ酸位置１０４にバリンおよびアミノ酸位置１２８にセリン；アミノ酸位置 １１６にグルタミン酸； アミノ酸位置１２６にイソロイシン； アミノ酸位置１３１にアスパラギン酸；アミノ酸位置１６６にセリン； アミノ酸位置１６９にアラニン； アミノ酸位置１７２にアスパラギン酸；アミノ酸位置１７２にグルタミン酸； アミノ酸位置１８８にプロリン； アミノ酸位置２０６にシステイン； アミノ酸位置２０６にチロシン； アミノ酸位置２１６にシステインおよびアミノ酸位置２０６にシステイン； アミノ酸位置２１７にリジン； アミノ酸位置２１７にロイシン； アミノ酸位置２１８にアスパラギン酸：アミノ酸位置２１８にセリン； アミノ酸位置２４８にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２４９にアルギニン； アミノ酸位置２５４にアラニン；またはアミノ酸位置２７１にグルタミン酸；そ して（ｄ）熱的に安定な突然変異スブチリシン物質を製造すること；によって得 られる熱的に安定な突然変異スブチリシン物質。
17. １７．以下に挙げるアミノ酸置換の少なくとも２つを含有するスブチリシン物質 をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子：アミノ酸位置８にイソロイシン ； アミノ酸位置２２にシステインおよびアミノ酸位置８７にシステイン； アミノ酸位置２２にリジンおよびアミノ酸位置７６にアスパラギン酸； アミノ酸位置５０にフェニルアラニン；アミノ酸位置５３にトレオニン； アミノ酸位置６３にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２１７にリジン； アミノ酸位置７６にアスパラギン酸； アミノ酸位置７８にアスパラギン酸； アミノ酸位置１０４にバリンおよびアミノ酸位置１２８にセリン；アミノ酸位置 １１６にグルタミン酸； アミノ酸位置１２６にイソロイシン； アミノ酸位置１３１にアスパラギン酸；アミノ酸位置１６６にセリン； アミノ酸位置１６９にアラニン； アミノ酸位置１７２にアスパラギン酸；アミノ酸位置１７２にグルタミン酸； アミノ酸位置１８８にプロワン； アミノ酸位置２０６にシステイン； アミノ酸位置２０６にチロシン； アミノ酸位置２１６にシステインおよびアミノ酸位置２０６にシステイン； アミノ酸位置２１７にリジン； アミノ酸位置２１７にロイシン； アミノ酸位置２１８にアスパラギン酸；アミノ酸位置２１８にセリン； アミノ酸位置２４８にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２４９にアルギニン； アミノ酸位置２５４にアラニン；またはアミノ酸位置２７１にグルタミン酸。
18. １８．スブチリシン物質が３またはそれ以上のアミノ酸置換を含有している請求 項２２記載の突然変異スブチリシン遺伝子。