JPH0347192A

JPH0347192A - 乳または乳製品由来のリン脂質画分を分画精製する方法

Info

Publication number: JPH0347192A
Application number: JP2103645A
Authority: JP
Inventors: Mototake Murakami; 元威村上; Kenji Matsumoto; 賢司松本; Masami Kawanari; 川成　真美
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1989-04-25
Filing date: 1990-04-19
Publication date: 1991-02-28
Anticipated expiration: 2013-09-30
Also published as: JP2805522B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】主粟上皇肌■豆艷本発明は、乳中に含有されるリン脂質、すなわち、ホス
ファチジルコリン（以下、ＰＣという）、ホスファチジ
ルエタノールアミン（以下、ＰＥという）、スフィンゴ
ミエリン（以下、ＳＰＭという）をそれぞれ効率よく高
純度に分画、精製する方法に関する。

従迷勿潜１Ｌ天然にはグリ七ロリン脂質に属するＰＣ，ＰＥやスフィ
ンゴリン脂質に属するＳＰＭなどのリン脂質が存在する
。代表的なリン脂質の原料としては、ＰＣを多く含む卵
黄やＰＣ，ＰＥ、、Ｐｌ　　（ホスファチジルイノシト
ール）を比較的均等に含む大豆などがある。また、牛乳
もＰＣ，ＰＥを含み、かつ臓器に広く分布する以外は他
の原料には殆ど見られないＳＰＭも比較的多量に含んで
いる特徴がある。

ＰＣは天然に最も広く分布しているリン脂質であって、
界面活性作用があるので乳化剤として食品添加物など、
或いは医薬、その他の工業用原料として広く利用されて
いる。また、ＰＥＳＳＰＭなども生理活性を有すること
が知られている。特にＳＰＭはＰ　Ａ　Ｆ　（Ｐｌａｔ
ｅｌｅｔ　Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ）の血
小板凝集に対するアンタゴニストとして注目され始めて
いる［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６２．１３
１７４（１９８７）　］。

従って、今後の医薬、或いは試薬としての利用が期待さ
れている。

以下に各原料のリン脂質の構成比を示す。

これらのリン脂質は、主に卵黄、大豆などから溶剤で抽
出し、これを分画精製していた。また、リン脂質の一部
は化学的に合成もされていた。

一方、乳中には、例えば牛乳中０．０３％程度と比較的
多量のリン脂質を包含しており、このリン脂質中のＰＣ
，ＰＥ、ＳＰＭのカラムクロマトグラフなどによる分画
定量に関する研究は以前から行われてきている。しかし
、乳中からこれらのリン脂質を産業的に利用する目的で
分画精製しようとする試みは未だなされていない。

［Ｉ（ｎ゛シよ゛　　るｉ本発明は、このように乳中に比較的多量含まれているに
もかかわらず、未だ有効に利用されていなかったリン脂
質を各両分に効率よく高純度に分画精製し、乳化剤、或
いは医薬、試薬などとして利用しようとするものである
。また、特に、バター製造の際に副生されるバターミル
ク中やチーズ製造の際に副生されるホエー中、或いは脱
脂乳中に含有されているリン脂質に注目し、これを各成
分に分画し、有効に利用しようとするものである。

量　　　”°　るための本発明は上記課題を解決するために鋭意研究を進めた結
果、最近、微量成分の分離のために開発された遠心液々
分配クロマトグラフ（ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＰａｒｔ
ｉｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｓ＋ａｔｏｇｒａｐｈ）　　（以
下、ＣＰＣという）を乳、乳製品、特にバターミルク粉
やホエー蛋白濃縮物、或いは脱脂粉乳に適用し、その際
に適当な溶媒を選択することによって効率よ＜ＰＣｌＰ
Ｅ、ＳＰＭを分画することが出来るという知見に基づい
て成されたものである。

従来から使用していた溶媒系では、ＰＥ画分とＰＣ及び
ＳＰＭ混合画分の分離は良好であったが、ＰＣとＳＰＭ
は、その極性が近い為、同時に溶出され、分離すること
は困難であった。しかし、中間の極性を示すエーテルを
適当量添加するこケによってＰＣの溶出を速め、ＳＰＭ
の溶出を遅延させることによってＰＣとＳＰＭを良好に
分離することに成功したものである。

遠心液々分配クロマトグラフは、例えば特開昭５９−６
２３１２号公報に記載されているように、二層に分離さ
れる二層分離液を溶媒として使用し、そのうち一方を固
定相として遠心力により保持しつつ、他方を移動相とし
て連続的に固定相内を通過させて移動相内に注入された
試料を分画精製する方法である。

本発明においては、このような試料（原料）として乳、
乳製品、特にバターミルク粉、ホエー蛋白濃縮物、或い
は脱脂粉乳を使用する。バターミルク粉、ホエー蛋白濃
縮物、或いは脱脂粉乳などはエーテル抽出を行い、エー
テル不溶分の糖脂質、糖蛋白質を分別し、エーテル可溶
分のみを使用する。エーテル可溶分には中性脂質、リン
脂質が含有されており、この前処理を行うことにより、
ＣＰＣに対する負荷を軽減し、処理時間を短縮すること
が出来る。

混合溶媒は、りン脂質の分画精製をすることが出来、安
価で食品工業などに異和感のないものから選定される。

このような観点から、飽和炭化水素、アルコール、水よ
りなる混合溶媒或いは、飽和炭化水素、エーテル、アル
コール、水よりなる混合溶媒が用いられる。飽和炭化水
素では、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどが望ましく
、エーテルとしては、ジエチルエーテルが望ましく、ア
ルコールとしては、メタノール、エタノールが望ましい
。特にＰＥＩ次画分とＰＣＳＳＰＭ混合画分との分画及
びＰＥ２次画分への精製には、ヘキサン：エタノール：
水混合溶媒が、ＰＣとＳＰＭとの分画及びＰＣ２次画分
への精製にはヘキサン：ジエチルエーテル：メタノール
：水混合溶媒が、ＳＰＭ２ＰＣ２次画分製には、ヘキサ
ン：メタノール：水混合溶媒が使用されることが望まし
い。

そして、前述したように、ＰＣ及びＳＰＭ混合画分から
ＰＣ画分とＳＰＭ画分とに分画する場合、あるいはＰＣ
１次画分をさらに精製する場合には、ジエチルエーテル
を加えることが望ましい。

またＣＰＣ処理は、下層液を固定相、−上層液を移動相
として用いる上昇法、上層液を固定相、下層液を移動相
として用いる下降法のどちらかの分離方法を選択して行
われる。更に、溶出は目的物を移動相に分配させる正溶
出、もしくは固定相に分配させる反転溶出のどちらか選
択して行われる。

本発明の乳または乳製品由来リン脂質の分画、精製方法
の概略を好適条件を挙げて図で示すと第１図のようにな
る。

まず、工程（１）において乳または乳製品由来脂質成分
としてバターミルク粉またはホエー蛋白濃縮物、脱脂粉
乳などの乳製品をクロロホルム：メタノール：水の比率
が４：８：３の溶媒で抽出した抽出物が用いられる。工
程（２）においてこの溶媒抽出物を濃縮する。工程（３
）においてこの濃縮物を１１２０倍量のエーテルで抽出
し、中性脂質及びリン脂質を含むエーテル可溶分を採取
する。そして、工程（４）においてアセトン抽出を行い
中性脂質を含むアセトン可溶分とリン脂質を含むアセト
ン不溶分とに分画し、このリン脂質を含むアセトン不溶
分を本発明における出発物質とする。

なお、本発明の出発物質を得るまでの工程（１）〜（４
）はその工程の全てを実施する必要はなく、必要に応じ
てこれらの工程を適宜選択して実施したり、あるいは他
のリン脂質採取手段を用いて実施することができる。

このようにして得られた乳または乳製品由来のリン脂質
画分を、工程（５）において、凛々分配クロマトグラフ
（ＣＰＣ）で飽和炭化水素、アルコール及び水の混合溶
媒、好適にはヘキサン、エタノール及び水の混合溶媒を
用いて上昇法でＰＥ１次画分とＰＣ及びＳＰＭ混合画分
とに分画する。上記混合液溶媒の組成は、ヘキサン；エ
タノール；水＝１００：９０〜１００：０〜ｌＯが好ま
しい。

得られたＰＥ１次画分を、工程（６）において工程（５
）と同様の溶媒を用いＣＰＣ処理を正溶出で行って高純
度のＰＥ２次画分を得る。

一方、ＰＣ及びＳＰＭ混合画分を、工程（７）において
ＣＰＣ処理してＰＣ１次画分とＳＰＭ１ＰＣ２次画分す
る。この際使用する溶媒は、ヘキサン、ジエチルエーテ
ル、メタノール及び水の混合溶媒を使用し、上昇法で行
う、上記混合溶媒の組成は、ヘキサン；ジエチルエーテ
ルし；メタノ−ＪＬ／　：水工４０〜８５７１５〜６０
　：　３０〜５０：０〜２０が望ましい。

このようにして分画されたＳＰＭ１次画分を、工程（８
）においてヘキサン、エタノール及び水の混合溶媒を用
いてＣＰＣ処理する。ＣＰＣ処理は、反転溶出によって
行う。

上記混合溶媒の組成は、ヘキサン：エタノール：水＝２
００　：　９０−１００　：　Ｏ〜ｌＯが望ましい、こ
のようにすると高純度のＳＰＭ２次画分を得ることがで
きる。

一方、分画されたＰＣＩＣ両次を、工程（９）において
工程（７）と同様の溶媒を用い、ＣＰＣ処理を正溶出で
行って高純度のＰＣ２次画分を得る。

なお、図中の重量表示はアセトン不溶分６．５ｇを出発
成分として各画分の収量を表したものである。

１星■ 以下に実施例を示して本発明及びその効果を具体的に説
明する。

実施例１ここでは、第１図に基づいて本発明の工程をさらに具体
的に説明する。

バターミルク粉４００ｇをクロロホルム：メタノール：
水の比率を４：８：３に調整した溶媒５０００ａｅで脂
質の抽出を行い、濃縮乾固して得た約２５ｇをアセトン
５００ｄで抽出〔工程（４））Ｌ、得られたアセトン不
溶分の中から６．５ｇを出発原料とした。この出発原料
をヘキサン：エタノール：水−１００；９０：１０の比
率にし、その下層を固定相とし、移動相を上層とした溶
媒系を用いＣＰＣに供給した〔工程（５））、この時の
運転条件は流速Ｒｃ　＝　１７ａｄ！／ｓｉｎ、流Ｉ　
Ｑ　−５０００−であった、この操作により、正溶出で
ＰＥＩ次画分（純度８８％）及びＰＣ−３ＰＭ混合画分
をそれぞれ１．２８Ｓ１．１ｇずつ得た。このＰＥ１次
画分をさらに同様の溶媒系を用いＣＰＣで正溶出させ純
度９８％、０．８ｇのＰＥ２次画分を得た〔工程（６）
）。

また、ＰＣ−ＳＰＭ混合両分をヘキサン：ジエ“チルエ
ーテル：メタノール；水−１００：１００：８０：２０
の比率にし、その下層を固定相とし、上層を移動相とし
た溶媒系を用いＣＰＣに供給した〔工程ａ）〕。

この時の運転条件は流速Ｒｃ＝１７ｓｄ！／＋ｗｉｎ、
流量Ｑ−５０００ｄであった。この操作により、正溶出
でＰＣ１次画分（純度８３％、収量０．６ｇ）　、反転
溶出でＳＰＭ１次画分（純度８７％、収量０．５ｇ）を
得た。それぞれ得られた１次画分を濃縮した後、ＰＣに
ついては工程（７）と同様の溶媒系で（工程（９））、
またはＳＰＭについてはヘキサン：メタノール、：水−
２００：９０：　１０の比率にし、その下層を固定相と
し、上層を移動相とした溶媒系で再分離〔工程（８）〕
を行い、ＰＣ２次画分（純度９６％、収量０．４ｇ）及
びＳＰＭ２次画分（純度９６％、収量０．４ｇ）を得た
。

実施例２１０％（Ｗ／Ｎ）濃度のホエー蛋白濃縮物水溶液５５０
ｄをアクチナーゼで処理して蛋白質加水分解物水溶液を
調製し、これを６Ｊ）’Ｃに加熱して４時間保持するこ
とによって酵素活性を失活させた後、１０倍に濃縮した
濃縮液をクロロホルム：メタノール：水の比率を４：８
：３に調整した溶媒で抽出を行い、抽出液を濾過した。

そして、この抽出濾液をＤＥＡＥセファデックスカラム
（ＣＭ、ＣＯＯ型）にかけ、０．５ＭＣＨｓＣＯＯＮａ
／メタノール液を流下させて未吸着画分を得、減圧濃縮
して乾固物４．５ｇを得た。この乾固物を１０〜２０倍
量のエーテル中で数時間撹拌し、固形分を濾別して脂質
成分を抽出した。この抽出液を０〜５°Ｃで一昼夜静置
し、再度、濾過して析出される固形分を除去し、抽出液
をＷＡ１ｉｌシて、濃縮液の２０倍量のアセトン中に撹
拌しながら滴下した後、３０００Ｇ、　１５分間、遠心
分離を行って固形分を乾固し、２．７ｇを出発原料とし
た。この出発原料をヘキサン；エタノール：水＝１００
：９０：１０の比率にし、その下層を固定相とし、移動
相を上層とした混合溶媒系を用いＣＰＣに供給した。

この時の運転条件は流速Ｒｃ＝３１１１１！／■ｉｎ、
流量Ｑ＝６００ｄであった。この操作により、正溶出Ｐ
Ｅ１次画分（純度９１％）及びＰＣ−３ＰＭ混合両分を
それぞれ４８５■、４６５ｍｇ得た。このＰＥ１次画分
を、さらに同様の溶媒系を用いＣＰＣで正溶出させ、純
度９８％、３８５■のＰＥ２次画分を得た。

また、ＰＣ−３ＰＭ混合画分をヘキサン：ジエチルエー
テル：メタノール：水＝　１００：１００：８０：２０
の比率にし、その下層を固定相とし、上層を移動相とし
た混合溶媒系を用いＣＰＣに供給した。この時の運転条
件は流速Ｒｃ＝３Ｊｄ、／ｗｉｎ、流ｆｆｉ　Ｑ　＝　
１０００ｄであった。この操作により、正溶出でＰＥＩ
次画分　（純度９３％、収量２６５■）、反転溶出でＳ
ＰＭ１次画分（純度８７％、収量１６０ＩＩＩｇ）を得
た。

それぞれ得られた１次画分を濃縮した後、ＰＣについて
はＰＣ−３ＰＭ混合画分の分離と同様の溶媒系で、また
ＳＰＭについてはヘキサン：ジエチルエーテル：メタノ
ール：水−８０：１２０：８０：２０の比率にし、その
下層を固定相とし、上層を移動相とした混合溶媒系で再
分離を行い、ＰＣ２次両分（純度９９％、収量２３０■
）及びＳＰＭ２次画分（純度９９％、収量１４０ｍｇ）
を得た。

実施例３脱脂粉乳１ｋｇをクロロホルム：メタノール：水の比率
を４：８：３に調整した溶媒５０００ｄで脂質の抽出を
行い、濃縮乾固して得た約１０ｇをアセトン２００ｍ１
で抽出し、得られたアセトン不溶分の中から１．９ｇを
出発原料とした。この出発原料をヘキサン：エタノール
：水＝１００：９０：１０の比率にし、その下層を固定
相とし、移動相を上層とした混合溶媒系を用いＣＰＣに
供給した。

コノ時の運転条件は流速Ｒｃ＝１５ＩＩｉ／ｓｉｎ、流
ｆｆ１Ｑ−４５００ｄであった。この操作により、正溶
出でＰＥ１次画分（純度９１％）及びＰＣ−３ＰＭ混合
画分をそれぞれ０．４５ｇ％０．３９ｇ得た。このＰＥ
Ｉ次画分を、さらに同様の溶媒系を用いＣＰＣで正溶出
させ純度９９％、０．３８ｇのＰＥ２次画分を得た。

また、ＰＣ−ＳＰＭ混合画分をヘキサン：ジエチルエー
テル：メタノール：水・１００：１００：８０：２０の
比率にし、その下層を固定相とし上層を移動相とした混
合溶媒系を用いＣＰＣに供給した。この時の運転条件は
流速Ｒｃ−１４ｄ／ｗｉｎ、流ｆｆｔＱ＝４０００ｍで
あった。この操作により、正溶出でＰＣ１次画分（純度
７９％、収量０．２１ｇ）、反転溶出でＳＰＭ１次画分
（純度８０％、収１０．１８ｇ）を得た。それぞれ得ら
れた１次画分を濃縮した後、ＰＣについてはＰＣ−３Ｐ
Ｍ混合画分の分離と同様の溶媒系で、またＳＰＭについ
てはヘキサン：メタノール：水＝２００：９０：１０の
比率にし、その下層を固定相とし上層を移動相とした混
合溶媒系で再分離を行い、ＰＣ２次画分（純度９７％、
収量０．１８ｇ）及びＳＰＭ２次画分（純度９８％、収
量０．１５ｇ）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明における乳または乳製品由来のリン脂
質画分を分画精製する方法の概略を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）乳または乳製品由来のリン脂質画分を、飽和炭化
水素、アルコール及び水の混合液を或いは、飽和炭化水
素、エーテル、アルコール及び水の混合液を溶媒として
用いて遠心液々分配クロマトグラフにかけてホスファチ
ジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィ
ンゴミエリンに分画し、これを精製することよりなる乳
または乳製品由来のリン脂質画分を分画精製する方法。
（２）乳製品がバターミルク粉である請求項（１）に記
載の乳または乳製品由来のリン脂質画分を分画精製する
方法。
（３）乳製品がホエー蛋白濃縮物である請求項（１）に
記載の乳または乳製品由来のリン脂質画分を分画精製す
る方法。
（４）乳製品が脱脂粉乳である請求項（１）に記載の乳
または乳製品由来のリン脂質画分を分画精製する方法。
（５）乳または乳製品由来のリン脂質画分を、ヘキサン
、エタノール及び水の混合液を溶媒として用いて遠心液
々分配クロマトグラフにかけてホスファチジルコリン、
スフィンゴミエリン混合画分とホスファチジルエタノー
ルアミン画分とに分画し、該混合画分をヘキサン、ジエ
チルエーテル、メタノール及び水の混合液を溶媒として
用いて遠心液々分配クロマトグラフにかけてホスファチ
ジルコリンとスフィンゴミエリンとに分画し、これらの
各画分を精製することよりなる乳または乳製品由来のリ
ン脂質画分を分画精製する方法。