JPH03280897A - 過酸化水素の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、例えば臨床検査において、過酸化水素を最終
測定物質として化学発光法により測定することにより、
生体成分を定量することに用いられる。

さら°に詳しくは、本発明では、酸化酵素反応で生成す
る過酸化水素を定量するにあたり、中性領域の緩衝液の
もと、ペルオキシダーゼを触媒として、過酸化水素と化
学発光物質であるフルオレッセイン、４’、５′−ジブ
ロモフルオレツセインまたは２′、７′−ジクロロフル
オレッセインとを反応させて、発生する化学発光強度を
測定することにより、過酸化水素の微量定量分析を行う
ものである。

（従来の技術） 酸化酵素反応で生成する過酸化水素の測定法としては、
比色法、蛍光法および化学発光法が知られている。これ
らの中で、化学発光法は簡便かつ高感度に過酸化水素を
測定でき、化学発光物質としてはルミノール及び蓚酸エ
ステルが広く用いられている。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、従来の化学発光法による過酸化水素の定
量法には下記の問題点がある。

（１）ルミノール化学発光反応では、強アルカリ条件で
行うため、酵素反応の至適ｐＨ条件とは異なる。そのた
め、酵素反応と化学発光反応とを同時に行うことはでき
ないので、逆ミセル系を用いることにより両者の反応を
同時に進行させてい杭 （２）蓚酸エステルを用いる化学発光反応では、反応の
至適ｐＨは中性条件であるが、蓚酸エステルが水に難溶
のために水と有機溶媒の混合溶液を用いたり、ミセル溶
液を用いる必要がある。

（課題を解決するための手段） 本発明は、上記の問題点を解決するため、ペルオキシダ
ーゼを触媒として、過酸化水素とフルオレッセイン、４
’、５′−ジブロモフルオレッセインまたは２’、７′
−ジクロロフルオレッセインとを、中性領域の緩衝液中
で化学発光させ、化学発光強度を測定することを特徴と
する過酸化水素測定を可能にする、化学発光法による過
酸化水素の測定法を提供するものである。

化学発光とは、化学反応の結果生じた励起状態の化学種
が、基底状態へ遷移する際に光を放射する現象であり、
このような反応を化学発光反応と呼んでいる。この反応
を分析法に応用できるのは、分析対象物質の濃度が変化
すると発光量も変化し、分析対象物質の濃度と発光量の
間に相関関係が成り立つことによる。

そこで、本発明における過酸化水素の化学発光法による
測定原理を、化学発光物質としてフルオレッセインを用
いた場合について説明する。

最初に、過酸化水素は触媒であるペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）と複合体を形成する。

Ｈ２０２＋Ｐ　ＯＤ　−Ｐ　ＯＤ　−Ｈｚ　Ｏ＊複合体
このＰＯＤ　　Ｈｉｎｔ複合体は化学発光物質であるフ
ルオレッセイン（Ｆ）を酸化し、励起状態のフルオレッ
セイン（Ｆｏ）が生成する。つぎに、励起状態のフルオ
レッセイン（Ｆｌ）が基底状態のフルオレッセイン（Ｆ
）に遷移する際に光を放出する。

ＰＯＤ−８，０２複合体 Ｆ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
Ｆ”Ｆ”　　　　　　　　　　　　　Ｆ＋ｈ　ν放出さ
れた光は光電子倍増管を内蔵したフォトカウンターで検
出される。本発明においては、放出される光の量（発光
量）が過酸化水素の濃度に依存することから、発光量を
測定することにより、過酸化水素の定量が可能となる。

本発明に用いる化学発光物質は、キサンチン系色素に属
するフルオレッセイン、２’　、７′−ジクロロフルオ
レッセインまたは４′　５′−ジブロモフルオレッセイ
ンである。これらの化合物の構造式を下記に示す。

フルオレッセイン　　　２’、　７’−ジクロロフルオ
レッセイン４’、　５’−ジブロモフルオレッセイン本
発明における過酸化水素の定量に用いる上記フルオレッ
セイン等の濃度範囲は２ｘｌＯ−”Ｍから２．　２Ｘ　
１０−”Ｍ　、また用いるペルオキシダーゼの１１度範
囲は２ｘ　１０−’Ｍ　か６１．７ＸＩ　Ｏ−’Ｍが望
ましい。緩衝液は３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスル
ホン酸（以下、ＭＯＰＳと略称する）／水酸化ナトリウ
ム、２−　（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・モノ
ハイドレート（以下ＭＥＳと略称する）／水酸化ナトリ
ウム、イミダゾール／塩酸またはリン酸緩衝液が好まし
い。これら緩衝液の濃度範囲は０．０１〜０．５Ｍ、ｐ
Ｈは中性領域、具体的にはｐＨ６，５から７．９の範囲
が好ましい。

本発明における化学発光反応の至適ｐＨは、多くの酵素
反応における至適ｐＨと一致することから、本発明にお
ける化学発光反応を利用して、酵素反応で生成した過酸
化水素の濃度を定量することにより、基質の濃度の定量
が可能となる。

例としてグルコースの定量法を述べる。グルコ−又はグ
ルコースオキシダーゼと反応して、グルコン酸と過酸化
水素に変換される。

グルコースオキシダーゼ グ、、ヨー、２．　　　　　　　　　　ル□→グルコン
酸十Ｈ２０□ 生成する過酸化水素の濃度はグルコースの濃度に比例す
ることから、生成した過酸化水素濃度を本発明における
化学発光分析法を用いて定量することにより、グルコー
スの濃度を求めることができる。

本発明の方法は、グルコースオキシダーゼの他に、コレ
ステロールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ウ
リカーゼ、ポリアミンオキシダーゼ等の酸化酵素反応で
生じる過酸化水素の測定にも用いることができる。

（実施例） 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ ０．１ＭＭ０ＰＳ／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，
０）を用いて、３．６Ｘ１０−”Ｍのフルオレッセイン
溶液、２′、７′−ジクロロフルオレッセイン溶液及び
４’、５′−ジブロモフルオレッセイン溶液をそれぞれ
調製した。同様の緩衝液を用いて１．７Ｘ１０−’Ｍペ
ルオキシダーゼ溶液、及び１．６Ｘ１０−’Ｍ過酸化水
素溶液をそれぞれ調製した。

ガラスキュベツトに、上記で調製したフルオレッセイン
、２’、７’　−ジクロロフルオレッセインまたは４′
、５’　−ジプロモフルオレッセイン溶液４０４、ベル
オキシグーゼ溶液６０ｄ、緩衝溶液５００４および過酸
化水素溶液５００７Ｊを順次加え、０〜３分間の化学発
光フォント数を測定した６ 実施例２ ｐＨ６，９から７．９の範囲に調製した０、１ＭＭ０　
Ｐ　Ｓ／水酸化ナトリウム緩衝溶液を用いて、６．６Ｘ
１０−’Ｍのフルオレッセインと５．０×１０−８Ｍの
ペルオキシダーゼを含む溶液、及び１．９Ｘ１０−６Ｍ
の過酸化水素溶液をそれぞれ調製した。

ガラスキュベツトに、上記で調製したフルオレッセイン
とペルオキシダーゼを含む溶液５００４および過酸化水
素溶液５００ｉ１１を順次加え、０〜３分間の化学発光
フォント数を測定した。

実施例３ ｐＨ７，０のＯ，ＩＭＭＯＰＳ／水酸化ナトリウム緩衝
溶液を用いて、４．０Ｘ１０−”Ｍから１゜０ＸＩＯ−
’Ｍの過酸化水素溶液、及び６．６×１０−’Ｍ　（７
）７Ｊｌ／オＬｚツセインと５．０ｘｌＯ−”Ｍのペル
オキシダーゼを含む溶液をそれぞれ調製後した。

ガラスキュベツトに、上記で調製したフルオレッセイン
とペルオキシダーゼを含む溶液５００４および過酸化水
素溶液５００４を順次加え、０〜３分間の化学発光フォ
ント数を測定した。

実施例４ ｐＨ７，０のＯ，ＩＭＭＯＰＳ／水酸化ナトリウム緩衝
溶液を用いて、６．６Ｘ１０−’Ｍのフルオレッセイン
、５．０Ｘ１０−”Ｍのペルオキシダーゼ及び１６．５
ユニツトのグルコースオキシダーゼを含む溶液、また２
、０Ｘ１０−’Ｍのグルコース溶液をそれぞれ調製した
。

ガラスキュベツトに、上記で調製したフルオレッセイン
、ペルオキシダーゼとグルコースオキシダーゼを含む溶
液５０ＯＮ！およびグルコース溶液５００ＩＬ１を順次
加え、０〜３分間の反応時間中に化学発光フォント数を
測定した。

比較例１ 実施例１のフルオレッセイン溶液の代わりに、０、ＩＭ
ＭＯＰＳ／水酸化ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７，０）を
ブランク溶液として用い、実施例１と同様の方法で化学
発光フォント数を測定した。

比較例２ 実施例１のフルオレッセインの代わりに、ニオシンＹを
用いて実施例１と同様の方法で化学発光フォント数を測
定した。

エオシンＹはキサンチン系色素に属する化合物であり、
その構造式を下記に示す。

エオシンＹ 実施例５ ｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸緩衝液、０．１ＭＭ０　Ｐ
　Ｓ／水酸化ナトリウム緩衝溶液、０．１Ｍイミダゾー
ル／塩酸緩衝溶液及び０．１ＭＭＥｓ／水酸化ナトリウ
ム緩衝溶液をそれぞれ用いて、３．６Ｘ１０−”Ｍのフ
ルオレツセイン溶液、１．７Ｘ１０−”Ｍのペルオキシ
ダーゼ溶液、及び２．４Ｘ１０−’Ｍの過酸化水素溶液
を調製した。

ガラスキュベツトに、上記で調製したフルオレッセイン
溶液４４、ペルオキシダーゼ溶液６０μ、緩衝溶液４３
６ｐＪ！および過酸化水素溶液５００μを順次加え、０
〜３分間の化学発光フォント数を測定した。

以下、上記実施例及び比較例について、過酸化水素の定
量に、化学発光試薬としてフルオレツセイン、４′、５
′−ジブロモフルオレッセイン及び２’、７’　−ジク
ロロフルオレッセインを用いた検討結果及びグルコース
とグルコースオキシダーゼの酵素反応で生成する過酸化
水素の測定結果を示して、本発明の詳細な説明する。な
お、化学発光フォトン数の測定は、ケミルミネッセンス
カウンターＴＤ−３Ａ　（東北電子産業製）を用いて行
った。

（１）過酸化水素の測定 過酸化水素の測定を実施例１及び比較例１及び２につい
て行い、測定感度について比較検討実験を行った。第１
表にそれぞれの化学発光強度を示した。

第　　１　　表 フルオレッセイン ５４゜ ５４ ２′、７′−ジクロロ フルオレッセイン ２１゜ ６６ ４’　、５′−ジブロモ フルオレッセイン ３７゜ 　１８ エオシンＹ（比較例２） ブランク（比較例１） ３゜ ２゜ ９４ ５４ 第１表から明らかなように、 実施例１で反応量 始後３分間に観測されるフォトン数は、比較例１の測定
で観測されるフォトン数と比較して有意に増加し、化学
発光強度はフルオレッセイン、４′　５′　−ジブロモ
フルオレッセイン、２′、７’　−ジクロロフルオレッ
セインの順に増大した。エオシンＹは、キサンチン系色
素に属するが、比較例２で観測されるその化学発光強度
は、実施例１のフルオレッセインで観測される発光強度
の１／１４であった。

（２）至適ｐＨ条件の検討 過酸化水素の測定を実施例２及び実施例５について行い
、測定感度について比較検討実験を行った。第１図に実
施例２による化学発光強度を示す。横軸はｐＨ１縦軸は
化学発光強度である。第２表に実施例５による化学発光
強度を示す。

第２ 表 リン酸 ＯＰＳ ＥＳ イミダゾール １３、　６４５ ９、　３０３ ３、　８２５ ４、７３８ 第１図から明らかなように、フルオレツセインの化学発
光強度はｐＨ７，０において最大となった。また、第２
表から明らかなように、種々のｐＨ７、Ｏの緩衝溶液を
用いて、フルオレツセインの化学発光強度を比較した結
果、０．１Ｍリン酸緩衝溶液を用いた場合、化学発光の
強度は最も大きかった。

以上の結論を要約すると、過酸化水素の定量には化学発
光試薬としてフルオレツセインを用い、化学発光反応は
０．１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，０）中で行うことが
、過酸化水素の定量分析に対して最も好ましいことが明
らかとなった。

（３）過酸化水素の検量線の作成 過酸化水素の測定を実施例３について行い、過酸化水素
の検量線を作成した。第２図に過酸化水素の検量線図を
示した。横軸は過酸化水素濃度、縦軸は化学発光強度で
ある。

第２図から明らかなように、過酸化水素の検出下限は４
．０Ｘ１０−”Ｍであり、定量範囲は４．０Ｘ１０−”
Ｍから１、ＯＸ　１０−’Ｍであった。

（４）酵素反応への応用 グルコースとグルコースオキシダーゼの酵素反応により
生成する過酸化水素の測定を実施例４について行い、第
３図に過酸化水素の生成曲線を示した。横軸は反応時間
、縦軸は化学発光強度である。

第３図から明らかなように、グルコースとグルコースオ
キシダーゼとの酵素反応により生成する過酸化水素が逐
次フルオレッセインと反応していくことがわかる。また
、化学発光強度の変化から酵素反応が約２分で終了して
いることがわかる。

酵素反応が終了した時点での化学発光強度はグルコース
の濃度に依存することから、その化学発光強度を測定す
ることにより、グルコースの定量ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＨと化学発光強度との関係を示すグラフで
あり、第２図は、過酸化水素濃度と化学発光強度との関
係を示すグラフであり、第３図は、酵素反応時間と化学
発光強度との関係を示すグラフである。 ｐＨ 第 図 第 図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ペルオキシダーゼを触媒として、過酸化水素とフルオレ
   ッセイン、４′，５′−ジブロモフルオレッセインまた
   は２′，７′−ジクロロフルオレッセインとを、中性領
   域の緩衝液中で化学発光させ、化学発光強度を測定する
   ことを特徴とする過酸化水素の化学発光法による測定法
   。