JPH03277278A

JPH03277278A - シュードモナス・アエルギノーザ由来アルカリプロテアーゼ遺伝子

Info

Publication number: JPH03277278A
Application number: JP4008090A
Authority: JP
Inventors: Yuji Shibano; 裕次柴野; Kazuyuki Morihara; 森原　和之; Kenji Okuda; 研爾奥田; Atsushi Fukushima; 淳福島
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1990-02-21
Filing date: 1990-02-21
Publication date: 1991-12-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のアルカ
リプロテアーゼ遺伝子およびその遺伝子が組み込まれた
組換えベクターならびにその利用に関する。

（従来技術および発明が解決すべき線題）シュードモナ
ス・アエルギノーザは、脆弱な宿主において致命的な感
染を引き起こしうる日和見感染病原体である。　例えば
、シュードモナス・アエルギノーザにより引き起こされ
る肺炎が、火傷、癌および嚢胞性繊維症に罹患している
患者ならびに呼吸器についての術後患者において報告さ
れている。

シュードモナス・アエルギノーザ感染において、該細菌
は感染部位にて増殖して重篤な敗血症を引き起こす。そ
の有毒性に関係する数種の代謝物が同定され、かつ、特
性付けられている［パブ口フスキー、オー・アールおよ
びレトリンド、ビーメディカル・マイクロバイオロジー
［１巻、　「シュードモナス・アエルギノーザ毒素」、
イースモンおよびジエルジャスツェピッチ編、アカデミ
ツク・プレス、ニューヨーク（Ｐａｖｌｏｖｓｋｉｓ、
Ｏ，Ｒ，ａｎｄＷｒａｔｌｉｎｄ、Ｂ−：　Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ｔｏｘｉｎｓ。

ｉｎ　”Ｍｅｄｉｃａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、
　ｖｏｌ、１”、　Ｅａｓｓ＋ｏｎ　ａｎｄＪｅｌｊａ
ｓｚｅｗｉｃｚ　Ｅｄ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　。

１９８２．　ｐｐ、９７−１２８］。それらのうちでも
研究の進んでいるものの１つはアルカリプロテアーゼで
あり、それは、１９６３年にモリハラにより精製され、
かつ、特性付けられている［そりハラ、ケイ、バイオケ
ミ力・バイオロジカルＭｏｒｉｈａｒａ、に、、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、Ａｃｔａ）、７３゜１１３−１２４　（１９６３
）：モリハラ、ケイおよびホンマ。

ジェイ・ワイ、「細菌酵素およびビルレンス」、ホルダ
ー、アイ・エイ編、ＣＲＣプレス、ポカ・レイトン（Ｍ
ｏｒｉｈａｒａ、に、　ａｎｄ　Ｈｏ＋＋ｎａ、Ｊ、Ｙ
、、　ｉｎ’Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｅｎｚｙ＋＊ｅｓ　
ａｎｄ　Ｖｉｒｕｌａｎｃｅｓ”、Ｈｏ１ｄｅｒ、Ｉ。

Ａ、　Ｅｄ、、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａ
ｔｏｎ）、　１９８５．　ｐｐ４１−７９１゜シュードモナス・アエルギノーザ・アルカリプロテアー
ゼは金属プロテアーゼの１種であり、コバルトイオンの
添加によって数倍の活性増強がみられる　［モリハラ、
ケイおよびツズキ、エイチ、アグリカルチュラル・アン
ド・バイオロジカル・ケミストリー（Ｍｏｒｉｈａｒａ
、に、　ａｎｄ　Ｔｓｕｚｕｋｉ、Ｈ，。

Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）、　３８．６
２１”６２６　（１９７４）］　。

ゼラチンに対して高い活性を示し、コラゲナーゼの合成
基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ａｌａ）に作用するが、天然のコラーゲンには作用しな
い［モリハラ、ケイ、ツズキ、エイチおよびオカ、ティ
、バイオケミ力・バイオロジカルＭｏｒｉｈａｒａ、　Ｋ、、　Ｔｓｕｚｕｋｉ、　Ｈ，
ａｎｄ　Ｏｋａ、　Ｔ、、　Ｂｉｏ−ｃｈｉａ＋、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、３０９．４１４−４２９　
（１９７３）］。

アルカリプロテアーゼの致死率は、シュードモナス・ア
エルギノーザ・エキソトキシンＡのそれと比べてかなり
低い。それにもかかわらず、アルカリプロテアーゼ産生
株はアルカリプロテアーゼ非産生株よりもかなりの毒性
を示すことが明らかにされている。これは、アルカリプ
ロテアーゼ非産生株の毒性が微量のアルカリプロテアー
ゼをシュードモナス感染の実験動物モデルに加えること
により増加するという「アグレッシン活性」により説明
しうる［モリハラ、ケイおよびホンマ。

ジェイ・ワイ、「細菌酵素およびビルレンス」、ホルダ
ー、アイ・エイ編、ＣＲＣプレス、ポカ・レイトン（Ｍ
ｏｒｉｈａｒａ、に、　ａｎｄ　Ｈｏｍｍａ、Ｊ、Ｙ、
、　ｉｎ”ＢａｃＬｅｒｉａｌ　Ｅｎｚｙａ＋ａｓ　ａ
ｎｄ　Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｓ　、　Ｈｏ１ｄｅｒ、Ｉ。

Ａ、　Ｅｄ、、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａ
ｔｏｎ）、　　１９８５．　ｐｐ４１−７９］。このア
グレッシン活性は、アルカリプロテアーゼ産生および非
産生株の間の血液中における増殖の差異または補対成分
、ヒトイムノグロブリンＧ１ヒト血漿ａ１−プロテイナ
ーゼインヒビタ、ヒト気管支粘膜プロテイナーゼインヒ
ビターヒト気道リゾチーム、ヒト多形核白血球、ヒト好
中球ルミネッセンス、ヒトナチュラルキラー細胞活性等
のような身体における種々の生物学的に重要なタンパク
質の不活性化のいずれかに起因しうる。それゆえ、ホン
マら［ホンマ、ジェイ・ワイ、メディカル・マイクロバ
イオロジー第１ｔｋ、　　ｒ’ｙニードモナス・アエル
ギノーザ感染に対する新しいワクチンの開発に関する展
望」、イースモンおよびジェルジスツェピッチ編、アカ
デミツク・プレス、ニューヨーク（Ｈｏ閤＋ｉａ、Ｊ、
Ｙ−：　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｖａｃｃｉｎ
ｅ　ａｇａｉｎｓｔＰｓｅｕｄｏ＋５ｏｎａｓ　　ａａ
ｒｕｇｉｎｏｓａ　　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ、　　ｉｎ”
Ｍｅｄｉｃａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ
、ｌ”、　Ｅａｓｍｏｎ　ａｎｄＪｅｌｊａｓｚｅｗｉ
ｃｚ　Ｅｄ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ）。

１９８２、　ｐｐ−３９８−４３２；　　ホンマ、ジエ
イ・ワイおよびタニモト、エフ、アンチバイオティック
ス・ケミテラピー（Ｈｏ＋＋＋＋ｉａ、　Ｊ、Ｙ、　ａ
ｎｄ　Ｔａｎｉｍｏｔｏ、Ｆ、。

Ａｎｔｉｂｉｏｔ、　Ｃｈｅ＋ｗｏｔｈｅｒ、）、　３
９．２１５−２２１　（１９８７）］は、アルカリプロ
テアーゼ・トキソイドを含有するシュドモナス感染に対
する多成分ワクチンを開発した。

このワクチンを製造するためには、シュードモナス・ア
エルギノーザを培養し、その培養液よりアルカリプロテ
アーゼを回収、精製する必要があった。しかし、当該ア
ルカリプロテアーゼの産生量は充分ではなく、当該シュ
ードモナス・アエルギノーザが非常に毒性の高いエキソ
トキシンＡを同時に産生ずること、および当該細菌自体
が病原性を有することが、ワクチン製造上の問題点であ
った。また、当該アルカリプロテアーゼ遺伝子の構造に
ついての知見がないため、当該酵素を大量に生産させる
べき、遺伝子工学的手段を講じることができない状況に
あった。

（１１題を解決するための手段）本発明者らは、これらの問題を解決すべく鋭意研究を重
ねた。その結果、シュードモナス・アエルギノーザ由来
のアルカリプロテアーゼ遺伝子を含む２．４ｋｂのＤＮ
Ａ断片の全塩基配列を決定し、当該アルカリプロテアー
ゼ遺伝子の構造が明らかとなり、それと共に当該アルカ
リプロテアーゼタンパク質の構造（アミノ酸配列）が明
らかとなり、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、（１）下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列、または式
（Ｉ）と実質的に生物学的に同等なアミノ酸配列を有す
るシュードモナスΦアエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のアルカリプロテ
アーゼ。

式（Ｉ）ニ − ＧＲ５ＤＡＹＴＱＶＤ　ＮＦＬＨＡＹＡＲＧＧ　ＤＥＬ
ＶＮＧＨＰＳＹ　ＴＶＤＱＡＡＥ（ＨＬＲＥＱＡＳＷＱ
ＫＡＰ　ＧＤＳＶＬＴＬＳＹＳ　ＦＬＴＫＰＮＤＦＦＮ
　ＴＰＩＦＫＹＶＳＤｒＹＳＬＧＫＦＳＡＦＳＡ　ＱＱ
ＱＡＱＡｉＳＬ　ＱＳＷＳＤＶＴＮＩＨＦＶＤＡＧＱＧ
ＨＯＧＡＴＹＡＥＤＴＪ？ＡＹ　ＳＶＭＳＹＷＥＥＱＮ
　ＴＧＱＤＦＫＧＡＹＳ　５ＡＰＬＬＤＤＩＡＡＩＡＡ
ＧＶＴＶＥＮＡ　ＩＧＧＳＧＳＤＬＬＹ　ＧＮＤＶＡＮ
ＶＬ）ＩＧ　ＧＡＧＮＤＩＬＹＧＧＬＧＡＤＱＬＷＧＧ
Ａ　ＧＡＤＴＦＶＹＡＩＳ　ＰＳＰＰＲＡＰＤＴＬ　Ｒ
ＤＦＶＳＧＱＤＫＩＤＬＳＧＬＤＡＦＶＮ　ＧＧＬＶＬ
ＱＹＶＤＡ　ＦＡＧＮＡＱＧ４ＬＳ　ＹＤＡＡＳＫＡＧ
ＳＬＡＶＩ）ＦＳＧＤＲＨＡ　ＤＦＡＩＮＬＩＧＱＡ　
ＴＱＡＤＩ％’Ｌ但し、式（Ｉ）中、Ｘは、水素原子ま
たは次式（Ｉ）で表されるポリペプチドを示す。

式（ＩＩ　）　：　ＭＳＳＮＳＬＡＬＫまた、式（Ｉ）
、（ＩＩ）中のアルファベットは、下のアミノ酸を示す
。

Ａ：アラニン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｅ：グルタミン１
ｍ、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチ
ジン、工：イソロイシン、Ｋ：リシン、Ｌ：ロイシン、
Ｍ：メチオニン、Ｎ：アスパラギン、Ｐ：プロリン、Ｑ
：グルタミン、Ｒ：アルギニン、Ｓ：セリン、Ｔ：スレ
オニン、ｖ：バリン、Ｗニトリプトファン、Ｙ：チロシ
ン：（２）式Ｃ１＞で表されるアミノ層配列、または式（１
）と実質的に生物学的に同等なアミノ酸配列を有するア
ルカリプロテアーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子
；（３）下記式（１）で表される塩基配列または式（ＩＩ
）と実質的に生物学的に同等な塩基配列を有する生物学
的ｊ：ｐ化されたシュードモナス・アエルギノーザ由来
のアルカリプロテアーゼ遺伝子。

式（Ｍ）ニ − ＴＣＧＣＴＧＧＧＣＡ　ＡＧＴＴＣＡＧＣＧＣＣＴＴＴ
ＴＣＣＧｃｃＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ；ＣＣＣＡＧＧＣＣ
ＡＡ　ＧＴＴＧＴＣＧＣＴＧ　ＣＡＡＴＣＣＴＧＧＴ　
ＣＧＧＡＣＧＴＣＡＣＧＣＴＡＣＣＴＡＣＧ　ＣＣＧＡ
ＧＧＡＣＡＣＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴ　ＴＣＧＧＴＧＡＴ
ＧＡＡＴＣＣＡＧＡＡＧＣＴＣＴＡＣＧＧＧＧＣＣＡＡ
ＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＧＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＡＣＧ
ＧＴ　ＧＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＡ　Ｃ
ＣＧＡＧＣＧＣＧ＾ＧＣＴＣＡＡＧＧＧＣにＧＣＧＣＣ
ＧＧＣＡ　ＡＣＧＡＣＡＴＣＣＴ　ＣＴＡＣＧＧＣＧＧ
ＣＣＴＣ（、ＧＣＧＣＧＧ　　ＡＣＣＡＧＴ丁ＧＴＧ　
　ＧＧＧＣＧＧＣＧＣＧ　　ＧＧＧＧＣＣＧＡＣＡＣ但し、式（ＩＩＩ）中、２はなしか、または式（ＩＶ）
で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドを示す。

式（ＩＶ　）　：　ＡＴＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＣＴＣ
ＴＴＧＣＡＴＴＧＡＡＡ　。

（４）前記（２）項の遺伝子を含有する組換えベクター
；（５）前記（２）項の遺伝子を含有するプラスミドによ
り形質転換された宿主細胞−および（６）前記（５）項
の宿主細胞を培養し、その菌体ないしは培養液から酵素
を回収するシュードモナス・アエルギノーザ由来のアル
カリプロテアーゼの製造法を提供するものである。

本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子の取得に用いるシ
ュードモナス・アエルギノーザは特に限定するものでは
なく、アルカリプロテアーゼ生産菌であればいずれでも
よく、例えば、大阪市淀用区十三本町２−１７−８５、
財団法人発酵研究所より入手できるシュードモナス・ア
エルギノーザ夏Ｆ０　３４５５株を用いることができる
。

また、目的とするＤＮＡの塩基配列およびアルカリプロ
テアーゼのアミノ酸配列は、公知の方法に従って細菌Ｄ
ＮＡの単離、遺伝子ライブラリーの作製、スクリーニン
グ、クローニング、ハイブリダイゼーシ１ン、サブクロ
ーニング、ＤＮＡ塩基配列の決定等を行なうことにより
決定できる。

宿主細胞としては大腸菌、枯草菌等の細菌類、望ましく
は大腸菌ＨＢＩＯＩ％ＪＭ１０９株等を用いることがで
き、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣｌ　ｇ、ｐ
Ｕｃ１９、ｐＵＢｌｌＯなどが使用できる。

得られたアルカリプロテアーゼ遺伝子を含有するプラス
ミドで形質転換された宿主細胞を用いてアルカリプロテ
アーゼを製造するには、公知の方法に従って、適当な炭
素源、窒素源および微量の金属元素等を含む培地中で、
該細胞を培養することにより行なえる。アルカリプロテ
アーゼは菌体の内外に産生されるので、菌体、培養液両
方から回収できる。例えば、当該アルカリプロテアーゼ
を含む画体破砕液ないしは培養液から硫安分画、ＤＥＡ
Ｅ−セルロース及びセファデックスＧ−１００等による
クロマトグラフィーを行うことにより、所望のアルカリ
プロテアーゼが得られる。

得られたアルカリプロテアーゼは前記のような公知の方
法に従って、シュードモナス・アエルギノーザ感染に対
するワクチン製造に用いることができる。

（実施例）以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１遺伝子ライブラリーの作製財団法人発酵研究所より入手した緑膿舊、シュードモナ
ス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏ■ｏｎａｓａｅｒｕ
ｇｉｎｏｓａ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ３４５５から法により全Ｄ
ＮＡを単離した。細菌ＤＮＡの単離法としては、例えば
サイトウ・ミウラ法［サイトウ、エイチおよびミウラ、
ケイ、バイオケミ力・バイオロジー・アクタ（Ｓａｉｔ
ｏ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｍｉｕｒａ、　Ｋ、、　Ｂｉｏｃ
ｈｉｇ＋−Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、　７２．６
１９　（１９６３）］が挙げられる。

このＤＮＡを制限酵素ｓｐｈ　Ｉで切断し、アガロース
電気泳動法により分画し、４ｋｂ以上のＤＮＡ断片を回
収した。このＤＮＡ断片を、ｓｐｈ　１で切断したベク
ターｐＵｃ１ＢとＴ４リガーゼで結合し、大腸菌ＨＢＩ
ＯＩを形質転換して、アンピシリン耐性形質転換体とし
て緑膿菌の遺伝子ライブラリーを作成した。大腸菌の形
質転換は常法、例えば、マンデル・ヒガの方法〔マンデ
ル、エムおよびビガ、エイ、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Ｍａｎｄｅｌ、　Ｌ　ａｎｄ　
Ｈｉｇａ、　Ａ−。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、　５３．１５４　（１
９７０）］を用いた。

実施例２遺伝子ライブラリーのスクリーニング形質転換体からアルカリプロテアーゼ遺伝子を持つクロ
ーンを選択するために、アルカリプロテアーゼの抗体を
常法（例えば、続生化学実験法、第５１！、■−２５頁
、日本生化学全編、１９８６年、東京化学同人）により
作成した。すなわち、緑膿菌結晶アルカリプロテアーゼ
（長間生化学工業社ＩＬ）０．４ｍｇをホルマリンで不
活性化し、不完全７０インドアジユバントと混和して、
ウサギの皮下に注射して免疫した。さらに、１週間毎に
３回、同様の操作を行い、追加免疫した。４週間目に全
血を採取、硫安分画によりＩｇＧ１２分を調製し、この
抗体をパーオキシダーゼで酵素標識した。

抗体の酵素標識は、例えば、過よう素酸ナトリウムによ
る方法が利用可能であるが、詳細は「免疫実験操作法■
（日本免疫学全編）　Ｊ　、１８３５頁に記載されてい
る。

この酵素標識した抗アルカリプロテアーゼ抗体を用いて
、前記緑膿菌遺伝子ライブラリーの中から、抗アルカリ
プロテアーゼ抗体と反応する抗原を発現しているクロー
ンとして、プラスミドｐＡＰＩＯＩを持つクローンを選
択した。

ｐＡＰｌｏｌは５．３ｋｂの緑膿菌由来のＤＮＡ挿入断
片を持つ。ｐＡＰ　ｌ　０１の挿入ＤＮＡ断片の制限酵
素地図を添付の８１図に示した。

実施例３遺伝子のサブクローニング前記プラスミドｐＡＰ　１０１を、大腸菌エキソヌクレ
アーゼ■を利用した一方向に欠失が挿入されたプラスミ
ドの作成法を用いてサブクローニングを行った。エキソ
ヌクレアーゼ■を利用した一方向欠失挿入プラスミドの
作成法に関しては、［１ｉＩｅ生化学実験講座、第１巻
、遺伝子研究法■」の２８９−３０５頁に詳しく記載さ
れている。前記の方法により得られた一方向に欠失が挿
入されたプラスミドｐＡＰ１０１を、大腸菌ＨＢＩＯＩ
に形質転換してライブラリーを作成した。このライブラ
リーから、実施例２に記載した方法により、まず、抗ア
ルカリプロテアーゼ抗体と反応する抗原を発現している
クローンを選択し、次にこれらの選択されたクローンの
中から実施例５に記載する方法でアルカリプロテアーゼ
活性を持つクローンを選択した。このようにして選択さ
れたクローンのプラスミドを調製し、その挿入ＤＮＡ断
片の長さを調べた。その結果、最も短い挿入ＤＮＡ断片
を持つプラスミドとしてｐＡＰＤＳ２があった。

ｐＡＰＤＳ２は％２　、３　ｋｂの緑膿菌由来の挿入Ｄ
ＮＡ断片を持つ、その制限酵素地図を第１図に示した。

前記、ｐＡＰＤＳ２の２．０ｋｂＤＮＡ断片の塩基配列
を決定したところ、当該アルカリプロテアーゼのＮ−末
端アミノ酸１５債分に相当する部分が無いことがわかつ
た。そこで、当該アルカリプロテアーゼの全領域をコー
ドするＤＮＡ断片の取得を行った。シュードモナス・ア
エルギノーザｌＰＯ３４５５株より調製したＤＮＡを、
制限酵素５ａｕ３Ａ１で部分分解した。アガロースゲル
電気泳動で分画し、５ｋｂ以上の両分をアガロースゲル
より回収した。回収したＤＮＡ断片を大腸菌のベクター
ｐＵｃ１８のＢａｍＨＩサイトに挿入し、得られた組換
えプラスミドで大腸菌ＪＭＩＯＩを形質転換して、遺伝
子ライブラリーを作成した。

前記ｐＡＤＰＳ２中のＥｃｏＲＶ断片（０、９ｋｂ）を
プローブとして、公知のコロニーハイブリダイゼーシッ
ン法［グルンステイン、エムおよびホグネス、デイ・ニ
ス、プロシーデインダス・ナシ３ナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス・ニー・ニスゝエイ（Ｇｒｕｎｓｔｅｉ
ｎ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｈｏｇｎｅｓｓ、Ｄ、Ｓ、、Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。ＵＳＡ）、　７２．
３９６１−３９６５　（１９７５）］により、当該アル
カリプロテアーゼの全領域を含むＤＮＡ断片が挿入され
た組換えプラスミドｐＡＰＳ９３を含有するクローンを
得た。

ｐＡＰｓ９３は、約７ｋｂのン二一ドモナス・アエルギ
ノーザ由来のＤＮＡ挿入断片を持ち、当該挿入断片の制
限酵素地図（第１図）を、前記ｐＡＰＩＯＩおよびｐＡ
ＰＤＳ２の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図と比較した結
果、王者の制限酵素地図はその共通部分で完全に一致し
た。

なお、ｐＡＰｓ９３を含む大腸１１ＳＡＭ１５１２は、
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）　Ｓ　ＡＭ１５１２　と命名され、平成２年１月９
日に工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号：微工
研薗寄嬉１１１８０号（ＦＥＢＮ　Ｐ−１１１８のとし
て寄託されている。

実施例４形質転換体のアルカリプロテアーゼ活性緑膿菌アルカリ
プロテアーゼ遺伝子を含有する大腸菌組換え体のアルカ
リプロテアーゼ活性を測定した。アルカリプロテアーゼ
の活性はロングらの方法［ロング、ニスら、ジャーナル
ψオプ・ジェネラル・マイ、クロバイオロジー（Ｌｏｎ
ｇ、　Ｓ、。

ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、）、　１２７．１９３−１９９　（１９８１）］を若
干改良して行った。

１ｍｍの試料を２ｍｍのアゾカゼイン（シグマ社製）１
％溶液と混合し、３７℃で１０分間反応させた後、１０
％トリクロロ酢酸を加えた。１０分間氷冷した後、遠心
により上溝両分を採取し、等量の０．４規定ＮａＯＨを
加え、４４０ｎｍでの吸光度を測定した。活性は、４４
０ｎｍでの吸光度で示した。

アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む大腸菌ＨＢ１０１、
対照としてベクターｐＵＣ１８を含む大腸菌ＨＢ　ｌ　
０１及びプラスミドを持たない大腸菌ＨＢＩＯＩをＬブ
ロス中で、３７℃で２４時間培養した。遠心により菌体
を集めた後、超音波処理により菌体を破砕し、超遠心分
離（４２０００ｘｇ、１０分間）を行った後、上溝を上
溝両分とした。沈澱は８Ｍ尿素に溶解した後、超遠心（
４２０００ｘ　ｇ、１０分間）によって分離した上滑を
、トリス緩衝液に透析したものを沈澱画分とした。

第１表に示すように、アルカリプロテアーゼ遺伝子を含
むプラスミドｐＡＰ　Ｉ　ＯｌおよびｐＡＰＤＳ２を含
有する大腸菌ＨＢＩＯＩの沈澱画分に、高いプロテアー
ゼ活性が認められた。これらのアルカリプロテアーゼ遺
伝子を含む大腸菌の上清画分および対照とした大腸菌中
には、プロテアーゼ活性はほとんど認められなかった。

また、前記プロテアーゼ活性の認められた沈澱画分のプ
ロテアーゼ活性は、抗アルカリプロテアーゼ抗体の添加
によりほぼ完全に消失した。

第１表　大腸菌組換え体のプロテアーゼ活性プラスミド
　　　プロテアーゼ活性上溝画分　　　沈澱画分ｐＡＰｌｏｌ　　　０．０８５　　１．４２２ｐＡＰＤ
Ｓ２　　０．０７０　　１．３４４ｐＵｃ１８　　　０
．０４６　　０．０５０な　　し　　　測定せず　　０
．０４３プラスミド：表記したプラスミドを含有する大
腸菌ＨＢＩＯＩのプロテアーゼ活性を示した。

プロテアーゼ活性：４４０ｎｍの吸光度で示した。

また、当該大腸薗組換え体が緑膿菌アルカリプロテアー
ゼを産生していることをオフテロニー法によって確認し
た（第２図）。当該大腸菌組換え体を超音波処理によっ
て菌体を破砕し、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）を含む０，１５Ｍリン際緩衝液に溶解した後、抗ア
ルカリプロテアーゼ抗体と反応させた。第２図に示すよ
うに、プラスミドｐＡＰ１０１を含む大腸菌の粗抽出液
（Ｃ）は、抗アルカリプロテアーゼ抗体（Ａｂ）に対し
て、精製した緑膿菌アルカリプロテアーゼ（Ｂ）と全く
同一の沈降線を示した。この沈降線は、ベクターｐＵｃ
１８を含む大腸菌の粗抽出液と抗アルカリプロテアーゼ
抗体との間には認められなかった（第２図）。

以上の結果から、プラスミドｐＡＰ　１０１およびｐＡ
ＰＤＳ２はアルカリプロテアーゼ遺伝子を含有すること
、および当該遺伝子産物であるアルカリプロテアーゼは
、大腸菌中では不溶性の顆粒として存在することが明ら
かになった。

実施例５遺伝子産物の解析組換え体大腸菌内での！膿菌アルカリプロテアーゼ遺伝
子産物を、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法及び
ウェスターンプロット法によって解析した。ウェスター
ンプロット法はバーネットの方法［バーネット、ダブリ
ユウ・エヌ、アナリティカル・バイオケミストリー（Ｂ
ｕｒｎｅｔｔａ、　Ｗ、Ｎ、。

Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、　１１２．６８０−６
８５．　（１９８１）］　を改良して行った。

前記ｌＯ％ＳＤＳで可溶化し六大腸曹粗抽出液対照の精
製アルカリプロテアーゼおよびアルカリプロテアーゼ遺
伝子を含まない大腸菌粗抽出液を１０％５ＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動により分画した。ウェスターンブ
ロフト法により、分画されたタンパク質をニトロセルロ
ース膜に移した螢、ウサギより調製した抗アルカリプロ
テアーゼ抗体と反応した。アルカリプロテアーゼタンパ
ク質と反応した抗体だけを、パーオキシダーゼ標識した
抗つサギＩｇＧ抗体と反応させ、アルカリプロテアーゼ
のバンドだけを発色させた。第３図に示すように、精製
アルカリプロテアーゼは主成分として４９．５キロダル
トン（ｋｄ）に相当するバンドと、ｒｉｉｔ分として分
子量４９ｋｄのバンドが認められた。プラスミドｐＡＰ
　Ｉ　ＯＩを持つ大腸曹組換え体中には、４９．５ｋｄ
のアルカリプロテアーゼと同等の分子量のタンパク質が
認められたが、ベクターであるｐＵｃ１８を含む大腸菌
中には、抗アルカリプロテアーゼ抗体と反応するタンパ
ク質は全（認められなかった（第３図）。以上の結果は
、アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む大腸菌中では、緑
ｍ＊アルカリプロテアーゼと、分子量的にも、免疫学的
にも同等のタンパク質が生産されていることを示してい
る。

実施例６ＤＮＡ塩基配列の決定前記プラスミドｐＡＰｓ９３の約７ｋｂの挿入断片のう
ち、約２．３ｋｂのＤＮＡ断片について、サンガーらの
方法【サンガー、エフら、プロシーデインダス・オブ・
ナシゴナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニー・ニ
ス・エイ（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ。

ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、　７４．５４６３−５４６７　
（１９７７）］によってその全塩基配列を決定した（！
［４図参照）、決定した塩基配列は２３３１塩基対から
なり、アルカリプロテアーゼの全領域を含んでいる。塩
基配列（第４図）申には、３０２番目のＡＴＧから始ま
り、１７２９番目のＴＧＡで終わる１４２８塩基対のア
ルカリプロテアーゼに対応するオープンリーディングが
存在する。

ＡＴＧ開始フドンの８塩基対前にＡＧＧＧＡのリポソー
ムパインディングサイトが存在する。又、オープンリー
ディングフレームに対応するペプチドのＣ−末端から２
０ｂｐ下流には、転写におけるターミネータ−として機
能しうる逆方向反復配列が認められる。

実施例７アミノ酸配列決定されたアルカリプロテアーゼ遺伝子の塩基配列から
推定されるアミノ酸配列（第１図）から、アルカリプロ
テアーゼ前駆体酵素は、４７６アミノ酸残基からなり、
成熟型の酵素は、４６７アミノ酸残基からなる分子量４
９４９４ダルトンの酵素であると考えられた。この値は
モリハラらＥイノウニ、エイチ、ナカガワ、エイおよび
モリハラ、ケイ、バイオケミ力・バイオフィジカ・アク
タ（Ｉｎｏｕｅ、Ｈ，、Ｎａｋａｇａｗａ、Ｔ、　ａｎ
ｄ　Ｍｏｒｉｈａｒａ、に、。

Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、　７
３．１２５−１３１　（１９６３）］による値４８４０
０ダルトンとよく一致する。

このアミノ酸配列中には、精製したアルカリプロテアー
ゼを、各種プロテアーゼで切断して得られたペプチド断
片のアミノ酸配列、及び精製酵素のＮ−末端アミノ酸配
列と一致するアミノ酸配列が認められる。第４図におい
て、一致したアミノ酸配列の領域を破線のアンダーライ
ンで示した。

アルカリプロテアーゼのＤＮＡ塩基配列より計算された
成熟タンパク質のアミノ酸組成は、モリハラらによって
報告された精製＃素のアミノ酸組成［モリハラ、ケイ、
ヨシダ、エヌおよびクリャマ、ケイ、バイオケミ力・バ
イオフイジカ・アクタ（Ｉｊｏｒｉｈａｒａ、に、、　
Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｎ、　ａｎｄ　Ｋｕｒｉｙａ＋ｉａ、
に、。

Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、　
９２．３６１　（１９６４）］とよく一致した（第２表
）。

第２表アミノ酸組成アミノＭ：酵素１分子当りの残基数で表した。

ＤＮＡ：ＤＮＡ塩基配列より計算した値。

精製酵素：成熟型酵素のアミノ酸分析値。

（発明の効果）本発明によれば、シュードモナス・アエルギノーザ由来
のアルカリプロテアーゼ遺伝子を含む２゜４ｋｂのＤＮ
Ａ断片の全塩基配列を決定し、当該アルカリプロテアー
ゼの遺伝子構造、さらにはタンパク質構造（アミノ酸配
列）が明らかになり、アルカリプロテアーゼを、例えば
、遺伝子工学的手法により改良することや、適当な宿主
で大量に生産することができるようになる。これにより
、シュードモナス感染に対するワクチン製造上の問題が
解消される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、緑膿菌アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む組
換えプラスミドの制限酵素地図を示す図面である。図中
、太線は、アルカリプロテアーゼ遺伝子を含有する挿入
ＤＮＡ断片を示す。矢印は、アルカリプロテアーゼをコ
ードする領域を示す。１１２図は、オフテロニー法による組換え体大腸菌中の
アルカリプロテアーゼの検出結果を示す図面である。！３ｒＪ！Ｊは、ウェスターンプロット法による大腸菌
内でのアルカリプロテアーゼ遺伝子産物の解析を行った
結果を示す図面である。図中、矢印は同時に泳動を行っ
た分子量マーカーの泳動位置を示す。第４図は、シュードモナス・アエルギノーザＩＦ０３４
５５株より単離された、アルカリプロテアーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ断片の全塩基配列および上記塩基配列より推
定されるアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列を示す。図中、東線のアンダーラインを付した領域は、分泌に関
与するシグナルペプチドを示し、破線のアンダーライン
は、精製酵素のアミノ酸配列き一致する部分を示す。Ｓ
Ｄはリポソームパインディングサイトを示す。

Claims

【特許請求の範囲】（１）下記式（ I ）で表されるアミノ酸配列、または
式（ I ）と実質的に生物学的に同等なアミノ酸配列を
有するシュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のアルカリプ
ロテアーゼ。式（ I ）：【遺伝子配列があります。】但し、式（ I ）中、Ｘは、水素原子または次式（II）
で表されるポリペプチドを示す。式（II）：ＭＳＳＮＳＬＡＬＫまた、式（ I ）、（II）中のアルファベットは、下の
アミノ酸を示す。Ａ：アラニン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｅ：グルタミン酸
、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジ
ン、Ｉ：イソロイシン、Ｋ：リシン、Ｌ：ロイシン、Ｍ
：メチオニン、Ｎ：アスパラギン、Ｐ：プロリン、Ｑ：
グルタミン、Ｒ：アルギニン、Ｓ：セリン、Ｔ：スレオ
ニン、Ｖ：バリン、Ｗ：トリプトファン、Ｙ：チロシン
。（２）請求項第１項記載の式（ I ）で表されるアミノ
酸配列、または式（ I ）と実質的に生物学的に同等な
アミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼのアミノ酸
配列をコードする遺伝子。（３）下記式（III）で表される塩基配列または式（II
I）と実質的に生物学的に同等な塩基配列を有する生物
学的に純化されたシュードモナス・アエルギノーザ由来
のアルカリプロテアーゼ遺伝子。式（III）：【遺伝子配列があります。】但し、式（III）中、Ｚはなしか、または式（IV）で表
される塩基配列を有するポリヌクレオチドを示す。式（IV）：ＡＴＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＣ
ＡＴＴＧＡＡＡ（４）請求項第２項記載の遺伝子を含有
する組換えベクター。（５）請求項第２項記載の遺伝子を含有するプラスミド
により形質転換された宿主細胞。（６）請求項第５項記載の組換え体宿主細胞を培養し、
その菌体ないしは培養液から酵素を回収することを特徴
とするシュードモナス・アエルギノーザ由来アルカリプ
ロテアーゼの製造法。