JPH03271261A

JPH03271261A - 抗プロモーター作用を有する新規化合物およびその製造方法、並びにこれを含有する抗腫瘍薬

Info

Publication number: JPH03271261A
Application number: JP6985390A
Authority: JP
Inventors: Ichiro Honda; 一郎本多; Harukuni Tokuda; 春邦徳田; Houyoku Nishino; 輔翼西野; Shigeo Yoshida; 茂男吉田; Mutsuo Kozuka; 小塚　睦夫
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1990-03-22
Filing date: 1990-03-22
Publication date: 1991-12-03

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、抗プロモーター作用に基づく抗腫瘍活性をも
った新規化合物およびその製造方法に関する。また、活
性成分としてこの化合物を含有する抗腫瘍剤に関する。

〔従来技術〕

癌の発生機構としては、未分化細胞の増殖、外来因子に
よる癌遺伝子の発現、ウィルス等による細胞の形質変換
（癌遺伝子の導入）等が知られている。

このうち、外来因子の影響により発癌する場合の一例と
して、例えば次のようなものが知られている。即ち、マ
ウスの背部皮膚に、少量の発癌剤（イニシエーター）を
−回塗布する。さらに、この部分に、クロトン油または
この有効性分である１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボ
ール−１３−アセテ−）　（ＴＰＡ）を塗布し続けると
、腫瘍が発生する。

この場合、イニシエーターの塗布のみでは今だ発癌には
至らないが、これによって細胞は遺伝毒性効果を受ける
。この前癌細胞は潜在的腫瘍細胞と呼ばれる。クロトン
油、ＴＰＡ等のような物質はこの潜在的腫瘍細胞を腫瘍
細胞へと促進し、腫瘍形成を促進する物質であり、発癌
プロモーターといわれている。

一方、抗腫傷薬としては、抗腫瘍化学療法薬と抗腫瘍性
免疫化学療法薬が従来から広く用いられている。抗腫瘍
化学療法薬にはアルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍性抗
生物質が含まれ、また抗腫瘍性免疫化学療法薬としては
、免疫不活性療法剤がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、抗腫傷薬として広く用いられている上記
の抗腫瘍性化学療法剤は一般的に毒性が強く、突然変異
性その他の重篤な副作用を呈する欠点がある。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、より毒性が
弱く、突然変異原性を示さない抗腫傷薬を提供するもの
である。

そのために、本発明は抗プロモーター作用による抗腫瘍
活性を有する新規化合物およびその製造方法を提供し、
かつこの化合物を含有する抗腫瘍剤を提供することを課
題とする。

〔課題を解決するための手段〕

上記課題を解決するために鋭意検討した結果、上記説明
した抗プロモーター作用を有し、腫瘍発生を防止する効
果を有する新規化合物を見出した。

この化合物は、下記一般式（Ｉ）で表される３−ニトロ
−２，４，６−）リヒドロキシ安息香酸エステルである
。

ルである。）本発明の３−ニトロ−２．４，６−トリヒドロキシ安息
香酸エステルは、以下の方法によって製造することがで
きる。

（ａ）まず公知の化合物であるフロログルシンカルボン
酸（ＩＩ）を、適当な濃度、例えば６０％（ｖ／ｖ）の
硫酸中で、１〜３等量、好ましくはｉ〜１．５等量の濃
硝酸（比重ｌ、３５〜１．３８）と反応させ、中間体（
ＩＩＩ）を得る。この反応では、少量の水溶性の不純物
を生じるが（５〜１５％）、通常８０％以上の収率で（
ｍ）を得ることができる。

＋１１０２（１）（式中、Ｒは炭素数が１ないし１５個の直鎖アルキルま
たは炭素数１ないし３個のフェニルアルキＮＯ□ （ＩＩ）　　　　　　　　（ｍ）（ｂ）次ぎに、工程（ａ）で得られた中間体（ＩＩＩ）
を適当な非水溶媒、例えば、ジエチルエーテル、ジオキ
サン、テトラヒドロフラン中で適当な縮合剤、例えば、
ジシクロへキシルヵルボジイミド（ＤＣＣ）を用い、１
〜２等量、好ましくは等量のアルコールＲ−Ｏｒ（と０
〜ｌＯ℃で２〜４時間反応させることにより高収率で目
的とする３−ニトロ−２゜４，６−トリヒドロキシ安息
香酸エステル（Ｉ）を得ることができる。

ＮＯ２Ｎ０２（ＩＩＩ）　　　　　　　　　　　　（Ｉ　）（式中、
Ｒは上記の通りである。）後述の実施例で説明するように、上記３−ニトロ−２，
４，８−トリヒドロキシ安息香酸エステル（１）は、強
力な発癌プロモーターとして知られる１２−０−テトラ
デカノイルホルボール−１３−アセテート（Ｔ　Ｐ　Ａ
）の作用を抑制する効果を有する。従って、この化合物
（１）はビタミンＡ酸およびその関連化合物の作用にみ
られると同様の抗腫瘍効果を奏することができる。即ち
、化合物（Ｉ）によれば、前癌状態にある組織の正常組
織への分化を促進し、また前癌細胞の悪性細胞への転換
を阻止することによって、更に発癌プロモーションを抑
制することによって抗腫瘍効果を得ることができる。

なお、ＴＰＡは発癌プロモーション作用が最も強いプロ
モーターの一つである。従って、ＴＰＡの作用を抑制で
きることから、他のプロモーターに対しても同様の効果
が得られるものと思われる。

そのような他のプロモーターとしては、例えば、ＨＨＰ
Ａ（１２−ｏ−ヘキサデカノイル−１６−ヒドロキシ−
ホルボールー１３−アセチイト）、メゼライン、テレオ
シジン等が知られている（医薬のあゆみ、１３４巻。

１３号、Ｐ１１６２．１９８０）。

本発明による抗腫傷薬は、活性成分として有効量の上記
化合物（Ｉ）を含有するものである。その投与量は、患
者の年齢および症状等に応じて適宜窓められる。成人に
対する一日当りの投与量は、通常、体重１ｋｇ当り１■
〜１００■である。

投与経路は、経口、皮下注射、静脈注射、局所注射等が
望ましいが、とくに限定されるものではない。

また、投与する剤形としては、製剤学的に許容可能な賦
形剤とともに、常法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプ
セル剤、注射剤、外用剤等に調剤することもできる。

〔実施例〕

以下、実施例に基づいて本発明の詳細な説明する。

く化合物の合成〉まず、３−ニトロ−２，４，８−トリヒドロキシ安息香
酸エステル（１）の製造方法について説明すれば、次ぎ
の通りである。なお、以下の説明において、物性データ
におけるＮＭＨの溶媒は特に断らない限りＣＤＣｌ３．
７ＭＳ基準を使用した。

工程（ａ）機械式かき混ぜ器を備えた５００ｍ１容の四つロフラス
コに、２００　ｍｌの６０％（ｖ／ｖ）硫酸をいれ、氷
冷した。ここに、１８．８ｇ　（０，１モル）のフロロ
グルシンカルボン酸（Ｉｆ）を徐々に加え、均一になる
まで（約１５分程度）撹拌した。ここに、６０％硝酸１
５．８ｍｌを徐々に加え、水冷を保ちながら、約３時間
撹拌した。

これを、２００ｇの氷の上にあけ、生じた沈殿を濾取し
た。これを、氷冷した塩酸性飽和食塩水で洗浄した後、
５００ｍ１の熱メタノールで溶解し、不溶物は濾別後減
圧下濃縮乾燥し、収量２０ｇで化合物（ｍ）の組成物を
得た。これは未精製のままで工程（ｂ）に用いることが
できる。この実施例においても未精製のまま使用した。

より精製する場合には、以下の方法に従って行う。

この粗製物５ｇをアセトンを溶媒とする活性炭のカラム
により精製し、熱酢酸エチルより再結晶すると、はぼ純
粋な中間体（ＩＩＩ）　３　ｇが得られた。

その物性データは以下の通りである。

融点１７０℃（分解）、ＮＭＲ（δ　値、　ＤＭＳＯ−ｄ６　　、ｐｐｇｇ）　
　５．８（ＩＨ９ｓ）工程（ｂ）この工程におけるエステル化は、各アルコールにおいて
同一のものであり、以下代表的なものについてその反応
条件を示す。

（Ａ）メチルエステル化合物の合成塩化カルシウム乾燥管をつけた良く乾燥した２００ｍ１
容のフラスコ中、工程（ａ）で得られた中間体（ＩＩＩ
）の粗結晶８６０１ｇ（４ミリモル）を無水メタノール
３２０■（１０ミリモル）とともに無水ＴＨＦ１００ｍ
ｌに、室温にて溶解し、その後氷冷した。

ここに、８３０　ｍｇ　（４ミリモル）のＤＣＣのＴＨ
Ｆ溶液を徐々に加えた。このまま約２０分間撹拌を続け
、その後室温に戻し、３時間撹拌した。

反応液の不溶物をひだおり濾紙によって濾過し、減圧下
濃縮後、ヘキサン：酢酸エチル：ギ酸−５００：１００
：ｌを用いるシリカゲルカラムを用いて精製した。

これから、熱へキサンを用いて再結晶し、メチル側鎖を
有する化合物３−ニトロ−２．４．８−１−リヒドロキ
シ安息香酸メチルエステル（Ｉ、Ｒ−メチル）を得た。

物性データは以下の通りである。

融点１５２〜１５５℃、ＮＭＲ（δ値、ＣＤＣｌ３．ｐＩ）ｌ）４．０（３）１
．ｓ）　、８．２（１）１．５）、１１．５（１）１．
ｂｒ）　。

１２．５（ＩＨ，ｂｒ）　、１３．０（ＬＨ，ｂｒ）（
Ｂ）アルキルエステル化合物またはフェニルアルキルエ
ステル化合物の合成上記（Ａ）において使用したメタノールに代えて、エタ
ノール、ブタノール、ヘキサノール、オクタツール、ノ
ナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール
、トリデカノール、ペンタデカノール、フェノール、ベ
ンジルアルコールおよびフェニルプロピルアルコールを
それぞれ１０ミリモルを使用した他は、（Ａ）と同様に
して、それぞれ対応するアルキルエステル化合物または
フェニルアルキルエステル化合物を得た。これらの化合
物の物性データは以下のとおりである。

・化合物　Ｂ−１（Ｒ−エチル基）融点９３〜９４℃、ＮＭＩ？（δ　値、　　ＣＤＣ１１、Ｉ）ｐ厘）１．５
（３Ｈ，ｔ、Ｊ−７１１ｚ）、４．５（２Ｈ，Ｑ、Ｊ−
７Ｈｚ）。

６．１（ＬＨ，ｓ）、１１．５（ＬＨ，ｂｒ）、１２．
９（ＩＨ，ｂｒ）・化合物　Ｂ−２（Ｒ−ブチル基）融点７０〜７１”Ｃ１ＮＭＲ（δ値、　ＣＤＣ１１，ｐＩ）ｌ）１．０（３）
１．ｔ、Ｊ−７Ｈｚ）、１．６（２Ｈ，ｓ）、１．９（
２Ｈ，ｇ）。

４．５（２１，ｔ、Ｊ−７Ｈｚ）、１１．８（ＬＨ，ｂ
ｒ）。

１２．７（ＩＨ，ｂｒ）、１３．０（ＬＨ，ｂｒ）・化
合物　Ｂ−３（Ｒ−ヘキシル基）融点３８〜４０℃、ＮＭＩ？　（δ値、　ＣＤＣｌ３．ｐｐｍ）０．９（３
Ｈ，ｔ、Ｊ−７Ｈｚ）、１．３−１．７（８Ｈ）。

１．９（２８，１）、４．４（２Ｈ，ｔ、Ｊ−７Ｈｚ　
）、６．２（ＩＨ，ｓ）。

１２．５（ＩＨ，ｂｒ）・化合物　Ｂ−４（Ｒ−オクチル基）融点４７〜４９℃、ＮＮＲ（δ値、　ＣＤＣｌ３−ｐｐｍ）０．９（３Ｈ，
ｔ、Ｊ−７１１ｚ）、１．３−１．７（ＩＯＨ）。

１．９（２Ｈ，ｗ）、４．４（２Ｈ，ｔ、Ｊ−７馳）、
６．２＜ＩＨ，Ｓ）。

１１．５（ＩＨ，Ｓ）、　１２．７（ＬＨ，ｂｒ）、１
２．９（ｌＨ，ｓ）・化合物　Ｂ−５（Ｒ−ノニル基）融点５１〜５２℃、ＮＭＲ（δ値、　ＣＤＣｈ、Ｉ）ｐｌ）０．９（３Ｈ，
ｔ、Ｊ−７Ｈｚ）、１．３−１．７（１２Ｈ）　。

Ｊ、９（２Ｈ，ｍ）、４．４（２Ｈ，ｔ、Ｊ−７Ｈｚ）
、６．２（ＩＨ，ｓ）　。

１１．５（１）１．ｓ＞、　１２．７（１）１．ｂｒ）
、１２．９（ＩＨ，ｓ）・化合物　Ｂ−６（Ｒ−デシル
基）融点５４〜５５℃、ＮＭＲ（δ値、　ＣＤＣｌ３　、Ｉ）Ｉ）ｍ）０．９（
３）１．ｔ、Ｊ−７Ｈｚ）、１．３−１．７（１４Ｈ）
。

１．９（２Ｈ，＋ａ）　、４．４（２１１，ｔ、Ｊ−７
Ｈｚ）、６．２（ＩＩＩ、ｓ）　。

１１．５（ＩＨ，ｓ）、　１２．７（ＬＨ，ｂｒ）、１
２．９（ＬＨ，ｓ）・化合物　Ｂ−７（Ｒ−ウンデシル
基）融点５６〜６０℃、ＮＭＲ（δ値、　ＣＤＣｈ、ｐｌ）ｌ）０．９（３Ｈ，
ｔ、Ｊ−７Ｈｚ）、ＩＪ−１，７（１８Ｈ）。

１．９（２Ｈ，ｍ）、４．４（２Ｈ，ｔ、Ｊ−７Ｈｚ）
、８．２（ｌＨ，ｓ）　。

１１．５（ＬＨ，ｓ）、　１２．７（ＬＨ，ｂｒ）、１
２．９（ＩＨ，ｓ）・化合物　Ｂ−８（Ｒ−ドデシル基
）融点６８〜６５℃、ＮＭＲ（δ値、　ＣＤＣｌ３　、ｐｌ）＠）０．９（３
Ｈ，ｔ、Ｊ−７１１ｚ）、１．３−１．７（１８Ｈ）。

１．９（２Ｈ，ｍ）　、４．４（２Ｈ，ｔ、Ｊ−７Ｈｚ
）、６．２（ｌＨ，ｓ）。

１１．５（ｌＨ，ｓ）、　１２．７（ＩＨ，ｂｒ）、１
２．９（ｌＨ，ｓ）・化合物　Ｂ−９（Ｒ−トリデシル
基）融点７０〜７１℃、ＮＭＲ（δ値、　ＣＤＣｌ３　、ｐｐｌ）０．９（３Ｈ
，ｔ、Ｊ−７Ｈｚ　）　、１．３−１．７（２０Ｈ）　
。

１．９（２Ｈ，−）、４．４（２８，ｔ、Ｊ−７Ｈｚ）
、８．２（ＬＨ，ｓ）。

１１．５（ｌＨ，ｓ）、、　１２．７（ｌＨ，ｂｒ）、
１２．９（ｌＨ，ｓ）・化合物　Ｂ−１０（Ｒ−ペンタ
デシル基）融点７１〜７２℃、ＮＭＩ？　（δ値、　ＣＤＣｌ３　、Ｉ）Ｉ）ｌ）０．
９（３Ｈ，ｔ、Ｊ−７七）、１．３−１．７（２４Ｈ）
。

１．９（２Ｈ，１１）、４．４（２Ｈ，ｔ、Ｊ−７Ｈｚ
）、８．２（ｌＨ，ｓ）。

１１．５（ＩＨ，ｓ）、　１２．７（ＩＨ，ｂｒ）、１
２．９（１Ｂ、ｓ）・化合物　Ｂ−１１（Ｒ−フェニル
基）融点１２１−１２３℃、ＮＭＲ（δ値、　ＣＤＣｌ３　、ｐｌ）Ｉ）６．２（Ｉ
Ｈ，Ｓ）、７．２−７．６（５Ｈ）、１１．５（ＩＨ，
Ｓ）。

１２．６（ＬＨ，ｂｒ）、１３．２（ｌＨ，ｓ）・化合
物　Ｂ−１２（Ｒ−ベンジル基）融点９１〜９３℃、ＮＭＲ（δ値、　ＣＤＣ１１、ｐｐｍ）５．５（２１，
ｓ）、６．２（ＬＨ，ｓ）、７．２−７．６（５Ｈ）。

１１．５（ＬＨ，ｓ）、１２．７（ＩＨ，ｂｒ）、１３
．０（ＬＨ，ｓ）・化合物　Ｂ−１３（Ｒ−フェニルプ
ロピル基）融点８３〜８４℃、ＮＭＲ（δ値、　ＣＤＣｌ３　、Ｉ）ｐ■〉２．１（２
Ｈ，ｔ、ｔ、Ｊ−７Ｈｚ、７Ｈｚ）。

２．８（２Ｈ，ｔ、Ｊ−７Ｈｚ　）、４．４（２Ｈ，ｔ
、Ｊ−７Ｈｚ　）。

６．２（ｌＨ，ｓ）　、７．２−７．５（５Ｈ）　、　
１１．５（ｌＨ，ｓ）　。

１２．８（ｌＨ，ｂｒ）　、　１３．０（ＩＨ，ｂｒ）
く生物学的検定〉次ぎに、本発明の化合物が抗腫傷薬として有用であるこ
とを確認するために、上記化合物について、伊藤らの方
法（Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、１３（１９８１）
。

２９−３７）によって抗プロモーター作用の有無を調べ
た。すなわち、この検定では、次ぎのようなエプスタイ
ン・バー−ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ　ＢａｒｒＶｌｒ
ｕｓ；　ＥＢＶ　　）初期抗原（ＥＡ）産生抑制試験を
用いた。

培地の調製粉末ＲＰＭＩ−１８４０培地を表１に示す組成で混合し
、脱塩後二度蒸留した蒸留水に溶解した。この際、小指
の先程のドライアイスを加えｐＨを６，０程度まで下げ
溶解を容易にした。粉末が完全に溶解した後、緩衝剤と
して炭酸水素ナトリウム（０，５６ｇ　／　１０１００
Ｏ）を、抗生物質としてペニシリンＧカリウム　（２０
万単位）および硫酸ストレプトマイシン（２５０■）を
加えた。この溶液を滅菌濾過し、ＲＰＭＩ−１６４０培
地とした。この培地にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を、細胞
培養用には８％になるように、ＥＢＶ−ＥＡ産生抑制試
験用には４％になるように加え、基礎培地として実験に
用いた。

表フェノ−！レレットｂ、ＯＨラージ細胞（Ｒａｊｉ　ｃｅｌｌ　）の培養エプスタイ
ン・バー・ウィルス（ＥＢＶ）初期抗原（ＥＡ）産生指
示細胞であるラージ細胞を培養する。ポリスチレン製２
７０ｍ１容（７５ｃｊ）細胞培養フラスコを使用し、８
％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１８４０培地を用いて、ＣＯ
２インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ２存在下で
培養した。細胞数が１　ｍｌあたり１〜２Ｘ１０６個に
なった時点で、これを約５倍に稀釈して継代的に培養し
た。なおこの植え継ぎ操作は３〜４日に１度の頻度で行
った。ＥＢＶ−ＥＡ産生抑制試験には細胞数が１　ｍｌ
あたり１〜２Ｘ１０’個になったステージの細胞を用い
た。

ラージ細胞の保存および解凍ラージ細胞は適宜以下に示すような方法で凍結保存した
。すなわち、細胞数が１　ｍｌあたりｌ〜２Ｘ１０６個
になった時点で、細胞を含む培養液を１５０Ｘｇで１０
分間遠心した。上滑を除いた後、細胞にジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）を１０％含む８％ＰＢＳ／ＲＰＭＩ
−１８４０培地を加え、１　ｍｌあたり細胞数が１．５
Ｘ１０’個になるように懸濁させ、−１１０’Ｃで冷凍
保存した。凍結した細胞の解凍は３０℃の水浴上で行っ
た。解凍後細胞を８％ＰＢＳ／ｌ？ＰＭ＋−１６４０培
地で三回洗浄した後、保存したときの５倍量の８％ＰＢ
Ｓ／ＲＰ旧−１６４０培地で培養した。

被験化合物溶液の調製被験化合物溶液の調製は実験の直前に行った。

溶媒にはＤＭＳＯを用い、培養液中の最終的なりＭＳＯ
の濃度が、早期抗原産生に影響を与えない１，０％以下
になるように調製した。

ＴＰＡ溶液ならびにｎ−酪酸溶液の調製発癌プロモータ
ーであるＴＰＡを１■／　ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解
し、これを原液として一２０℃で保存し、使用の際には
２０ｎｇ／　ｍｌの濃度になるようにＲＰＭＩ−１ｆｉ
４０培地で稀釈して使用した。ＴＰＡによるＥＡ発現率
を上げ、検出感度を高めるために用いいるｎ−酪酸は０
．５Ｍの無菌溶液として４℃で保存した。

ＥＢＶ−Ｅへ発現抑制試験４％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ｌチューブ
あたり１ｍ１）にｎ−酪酸（４ｓＭ）およびＴＰＡ（２
０ｎｇ／　ｍｌ　）を加え、さらに所定量の被験化合物
溶液をプラスチック試験管に加えてアッセイ用培地とし
た。あらかじめ８％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地で
培養しておいた検索用の指示細胞のあるラージ細胞を遠
心分離操作で集め、これを１　ｍｌ当りの細胞数がＩＸ
Ｉ（１６個になるようにアッセイ培地に懸濁した。この
懸濁液を３７℃、５％ＣＯ２存在したで４８時間培養後
、遠心を行ない上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（
ＰＢＳ（−）（ＭＣＩ２００ｆｆ１ｇ／］、　ＫＨ２Ｐ
Ｏ４２００ｍ１ｇ／Ｉ、ＮａＣｌ３　ｇ／ｌ、Ｎａ２　
　ＨＰＯ４１，１５ｇ／Ｉ）０．１　ｍｌで懸濁した。

この細胞懸濁液をＥＢＶ−ＥＡ発現抑制試験および指示
細胞の生存率の試験に使用した。

ＥＡ発現細胞率の測定ＥＢＡ−ＥＡ発現細胞率の測定は以下に示すとおり間接
螢光抗体法で行なった。１．０ｍｌのアッセイ用培地で
反応させた細胞を１５０Ｘｇで１０分間遠心分離し、上
清を除いた後ＰＢＳ（−）を０．１ｍｌ加え細胞を懸濁
した。この懸濁液を無螢光スライドグラスに塗抹し、風
乾した後、このスライドグラスをアセトン中に１０分間
浸漬して細胞をスライドグラス表面に完全固定し、これ
を検鏡用の試料として用いた。

一次抗体として、ＥＢＶのＥＡ抗体価が高い上咽頭癌（
ＮＰＣ；ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ　ｃａｒｃｉｎ
ｏｉａ）患者の血清［ＥＡ　（＋）　、カップシト抗原
（ｖｆｒａｌ　ｃａｐｓｆｄ　ａｎｔｉｇｅｎ；ｖＣ＾
）（＋）］をあらかじめ反応に最適な抗体価となるよう
にＰＢＳ　（−）で稀釈調整しておいた。これをスライ
ドグラス上の各スポットに載せた後、水を含ませたペー
パータオルを入れたシャーレ内に置き、３７℃で４５分
間抗原抗体反応を行なわせた。反応終了後、スライドグ
ラスを約１００ｍ１のＰＢＳ（−）に浸漬し、容器ごと
に３０秒秒間上ぅ洗浄を行なった。この洗浄操作を２回
行った後にスライドグラスを風乾、つづいて二次抗体と
して、ＰＢＳ（−）で２０倍に稀釈したＰＩＴＣ（フル
オレセインイソチオシアネート）標識ヒトＩｇＧ抗体（
ヤギ）を同スポットにのせ、−次抗体反応と同様に３７
℃で４５分間反応させた。

反応終了後、ＰＢＳ　（−）で２回洗浄し、無蛍光グリ
セリンを２０％含むＰＢＳ（−）で封入を行ない、螢光
顕微鏡で細胞を観察した。Ｅ＾産生細胞はＰＩＴＣの螢
光を発するため容易に判断することができる。ＴＰＡの
みを加えたＥＡ発現細胞（陽性細胞）を対照として各被
験化合物を加えた陽性細胞を観察しその割合を百分率で
表して抑制効果として記録した。各処理については、最
低２５０個の細胞を観察し、二連で行ない、結果はその
平均値で示した。

細胞生存率の測定細胞生存率の測定はトリバンブルー染色法によって行な
った。すなわち、細胞懸濁液０．０５ｍ１に、トリバン
ブルーを０．２５％含むＰＢＳ（−）溶液０．０５ｍ１
を加え軽く攪拌後、懸濁液の一部を血球計算板にとり、
生細胞数と、トリパンブルーによって染まっている死細
胞数をそれぞれ計測した。なお結果は二連での平均値で
示した。

以上の結果を表２にまとめて示した。被験化合物はその
活性に差があるもののいづれも発癌プロモーターである
ＴＰＡによるＥＢＶ−ＥＡ発現を抑制し抗腫瘍性を持つ
化合物であることが明らかとなった。

なお、表中で被験化合物は、ＴＰＡ濃度（モル）に対し
て１０００倍濃度１ｌ００倍濃１、ｌＯ倍濃度の場合に
ついて試験を行った。

表〔発明の効果〕本発明の抗腫傷薬は、高い抗腫瘍効果を有し、その正常
細胞に対する毒性も弱く、突然変異原性も示さない。従
って、癌の発生が疑われる場合の癌の予防効果、癌の存
在が確認された場合の抗腫瘍効果、癌組織切除後の癌再
発防止効果を目的として長期にわたり安全に使用するこ
とができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記一般式（ I ）で表される３−ニトロ−２，
４，６−トリヒドロキシ安息香酸エステル。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）（式中、Ｒは炭素数が１ないし１５個の直鎖アルキルま
たは炭素数１ないし３個のフェニルアルキルである。）
（２）請求項１記載の３−ニトロ−２，４，５−トリヒ
ドロキシ安息香酸エステルを製造する方法であって、（
ａ）下記反応式に従い、フロログルシンカルボン酸（I
I）をニトロ化して中間体（III）を得る工程と、 ▲数式、化学式、表等があります▼（II）▲数式、化学
式、表等があります▼（III）（ｂ）下記反応式に従い、前記中間体（III）とアルコ
ール（IV）とを、縮合剤の存在下で縮合させてエステル
（ I ）を得る工程 ▲数式、化学式、表等があります▼（III）▲数式、化
学式、表等があります▼（ I ）（式中、Ｒは炭素数が１ないし１５個の直鎖アルキルま
たは炭素数１ないし３個のフェニルアルキルである。）とを具備したことを特徴とする方法。
（３）縮合剤としてジシクロヘキシカルボジイミドを用
いることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
（４）活性成分として、請求項１記載の３−ニトロ−２
，４，５−トリヒドロキシ安息香酸エステルを含有する
ことを特徴とする抗腫瘍剤。