JP6931889B2 - 白血病幹細胞のニッチ形成抑制活性を有する海洋生物由来の抽出物、化合物及び医薬組成物 - Google Patents
白血病幹細胞のニッチ形成抑制活性を有する海洋生物由来の抽出物、化合物及び医薬組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6931889B2 JP6931889B2 JP2017561166A JP2017561166A JP6931889B2 JP 6931889 B2 JP6931889 B2 JP 6931889B2 JP 2017561166 A JP2017561166 A JP 2017561166A JP 2017561166 A JP2017561166 A JP 2017561166A JP 6931889 B2 JP6931889 B2 JP 6931889B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- steriferin
- fraction
- compound
- extract
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 0 CCC[C@@](C(C)C)C(C)C=CC=C(C)C(C*=C(C)C)=*[C@]1NC1 Chemical compound CCC[C@@](C(C)C)C(C)C=CC=C(C)C(C*=C(C)C)=*[C@]1NC1 0.000 description 7
- DTQDUMSNGZFZEM-PSJPBPQSSA-N CC(C)(C(CC1)[C@](C)(CC2)[C@H](CC(C3)=O)[C@@]1(C)/C3=C(\C)/C=C/C=C(\C)/C(CC=C(C)C)O)[C@@H]2OC(C)=O Chemical compound CC(C)(C(CC1)[C@](C)(CC2)[C@H](CC(C3)=O)[C@@]1(C)/C3=C(\C)/C=C/C=C(\C)/C(CC=C(C)C)O)[C@@H]2OC(C)=O DTQDUMSNGZFZEM-PSJPBPQSSA-N 0.000 description 1
- JQQLGYJOHJVUFP-SOBFQGAKSA-N C[C@](CC1)([C@@H](CC2=O)[C@@](C)(CC3)[C@@H]1C(C)(C)[C@H]3OC(C)=O)/C2=C(\C)/C=C/C=C(\C)/[C@H](CC=C(C)C)O Chemical compound C[C@](CC1)([C@@H](CC2=O)[C@@](C)(CC3)[C@@H]1C(C)(C)[C@H]3OC(C)=O)/C2=C(\C)/C=C/C=C(\C)/[C@H](CC=C(C)C)O JQQLGYJOHJVUFP-SOBFQGAKSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
- A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
- A61K35/655—Aquatic animals other than those covered by groups A61K35/57 - A61K35/65
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
- C07C69/74—Esters of carboxylic acids having an esterified carboxyl group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
- C07C2603/02—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems
- C07C2603/04—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings
- C07C2603/06—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings containing at least one ring with less than six ring members
- C07C2603/10—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings containing at least one ring with less than six ring members containing five-membered rings
- C07C2603/12—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings containing at least one ring with less than six ring members containing five-membered rings only one five-membered ring
- C07C2603/16—Benz[e]indenes; Hydrogenated benz[e]indenes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oceanography (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
R1はテルペン基であり、
R2はH又はアセチル基から選択され、
R3及びR4は、それぞれ独立して、H、-OH、メチル基、カルボキシル基又はヒドロキシメチル基から選択される。
(I) 海綿動物からの水溶性アルコール系溶媒による抽出物に対して、非水溶性有機溶媒で脂溶性画分を抽出するステップ、
(II) 前記ステップ(I)における脂溶性画分に対して、高濃度の水溶性アルコール系溶媒/水溶液及び非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒を加えて、液−液抽出し、非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒層(画分2-1)を回収するステップ、
(III) 前記ステップ(II)における高濃度の水溶性アルコール系溶媒/水溶液層を濃縮又は溶媒留去後、中濃度の水溶性アルコール系溶媒/水溶液及び塩素系炭化水素溶媒で液−液抽出し、塩素系炭化水素溶媒画分(画分2-2)を回収するステップ、及び、
(IV) 前記画分2-1及び前記画分2-2を濃縮又は溶媒留去するステップを含むことによって製造される場合がある。
(I’) 海綿動物からの水溶性アルコール系溶媒による抽出物に対して、水と非水溶性有機溶媒で脂溶性画分を液−液抽出するステップ、
(II’) 前記ステップ(I’)における脂溶性画分に対して、90%水溶性アルコール系溶媒/水溶液及び非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒を加えて、液−液抽出し、非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒層(画分2-1)を回収するステップ、
(III’) 前記ステップ(II’)における90%水溶性アルコール系溶媒/水溶液層に水を添加して希釈した60%水溶性アルコール系溶媒/水溶液及び塩素系炭化水素溶媒で液−液抽出し、塩素系炭化水素溶媒画分(画分2-2)を回収するステップ、及び、
(IV’) 前記画分2-1及び前記画分2-2を濃縮又は溶媒留去するステップ
を含むことによって製造される抽出物である場合がある。
(i) 海綿動物からの水溶性アルコール系溶媒による抽出物に対して、水と塩素系炭化水素溶媒で液−液抽出を行い、塩素系炭化水素溶媒画分を回収するステップ、
(ii) 前記(i)のステップで得る水溶性画分に対して、非水溶性アルコール系溶媒で液−液抽出を行うステップ、
(iii) 前記ステップ(i)の塩素系炭化水素溶媒層と、前記ステップ(ii)の非水溶性アルコール系溶媒層とを混合し濃縮又は溶媒留去後、高濃度の水溶性アルコール系溶媒水溶液及び非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒を加えて、液−液抽出し、非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒層を回収するステップ、
(iv) 前記ステップ(iii)における高濃度の水溶性アルコール系溶媒/水溶液層に水を添加して希釈した中濃度の水溶性アルコール系溶媒/水溶液及び塩素系炭化水素溶媒で液−液抽出し、塩素系炭化水素溶媒画分を回収するステップ、及び、
(v) 上記ステップ(iii)の非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒層及び上記ステップ(iv)の塩素系炭化水素溶媒層のそれぞれの画分を濃縮又は溶媒留去するステップを含むことによって製造される場合がある。
(i’) 海綿動物からの水溶性アルコール系溶媒による抽出物に対して、水と塩素系炭化水素溶媒で液−液抽出を行い、塩素系炭化水素溶媒画分を回収するステップ、
(ii’) 前記(i)のステップで得る水溶性画分に対して、非水溶性アルコール系溶媒で液−液抽出を行うステップ、
(iii’) 前記ステップ(i’)の塩素系炭化水素溶媒層と、前記ステップ(ii’)の非水溶性アルコール系溶媒層とを混合し濃縮又は溶媒留去後、90%水溶性アルコール系溶媒水溶液及び非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒を加えて、液−液抽出し、非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒層を回収するステップ、
(iv’) 前記ステップ(iii’)における90%水溶性アルコール系溶媒/水溶液層に水を添加して希釈した60%水溶性アルコール系溶媒/水溶液及び塩素系炭化水素溶媒で液−液抽出し、塩素系炭化水素溶媒画分を回収するステップ、及び、
(v’) 上記ステップ(iii’)の非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒層及び上記ステップ(iv’)の塩素系炭化水素溶媒層のそれぞれの画分を濃縮又は溶媒留去することによって製造される場合がある。
(vi) 前記ステップ(IV)、(IV’)、(v)又は(v’)に記載の非脂溶性脂肪族炭化水素系溶媒で抽出された脂溶性画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで非極性溶媒、非極性溶媒と極性溶媒との混合溶媒、さらに、極性溶媒と水の混合溶媒の順で順次溶出し、腫瘍細胞のニッチ形成に対して抑制作用を有する画分を取得するステップ、
(vii) さらに、前記ステップ(vi)の前又は後に、任意に、ODS系逆相高速液体クロマトグラフィーでメタノールと水の混合溶媒でのグラジエントクロマトグラフィーで精製し、腫瘍細胞のニッチ形成に対して抑制作用を有する画分を取得するステップ、及び、
(viii) 前記ステップ(vi)又は(vii)で得られる腫瘍細胞のニッチ形成に対して抑制作用を有する画分を、さらに、高速液体クロマトグラフィーで分画するステップ。
(a) ODS逆相系高速液体クロマトグラフィーで、以下の条件:
固定相:COSMOSILR5C18 AR II
固定相サイズ:内径10 mm x 長さ250 mm
移動相: 80%メタノール水溶液
流速:2.0 mL/min
で保持時間30分、34分に得られる画分を取得し、
・保持時間30分より得られる画分の溶媒留去するステップを含むことにより、ステリフェリン化合物を70%以上含有し、
・保持時間34分より得られる画分の溶媒留去するステップを含むことにより、ステリフェリン化合物を70%以上含有し、
又は、
(b) ODS逆相系高速液体クロマトグラフィーで、以下の条件:
固定相:COSMOSILR 5C18 AR II
固定相サイズ:内径10 mm x 長さ250 mm
移動相:85%メタノール水溶液
流速:2.0 mL/min
・保持時間40〜42分より得られる画分を溶媒留去するステップを含むことにより取得される。
R1はテルペン基であり、
R2はH又はC1〜4のアシル基、好ましくは、H又はアセチル基から選択され、
R3及びR4は、それぞれ独立して、H、-OH、好ましくはメチル基であるC1〜6のアルキル基、好ましくはヒドロキシメチル基であるヒドロキシアルキル基、又は、カルボキシル基若しくはそのエステル誘導体から選択される。
前記脂溶性画分は、
(I) 海綿動物からの水溶性アルコール系溶媒による抽出物に対して、非水溶性有機溶媒で脂溶性画分を抽出するステップ、
(II) 前記ステップ(I)における脂溶性画分に対して、高濃度の水溶性アルコール系溶媒/水溶液及び非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒を加えて、液−液抽出し、非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒層(画分2-1)を回収するステップ、
(III) 前記ステップ(II)における高濃度の水溶性アルコール系溶媒/水溶液層に水を添加して希釈した中濃度の水溶性アルコール系溶媒/水溶液及び塩素系炭化水素溶媒で液−液抽出し、塩素系炭化水素溶媒画分(画分2-2)を回収するステップ、及び
(IV) 前記画分2-1及び前記画分2-2を濃縮又は溶媒留去するステップを含むことによって製造できる。
前記脂溶性画分は、
(I) 海綿動物からの水溶性アルコール系溶媒による抽出物に対して、非水溶性有機溶媒で脂溶性画分を抽出するステップ、
(II) 前記ステップ(I)における脂溶性画分に対して、高濃度の水溶性アルコール系溶媒/水溶液及び非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒を加えて、液−液抽出し、非水溶性脂肪族炭化水素系溶媒層(画分2-1)を回収するステップ、
(III) 前記ステップ(II)における高濃度の水溶性アルコール系溶媒/水溶液層に水を添加して希釈した中濃度の水溶性アルコール系溶媒/水溶液及び塩素系炭化水素溶媒で液−液抽出し、塩素系炭化水素溶媒画分(画分2-2)を回収するステップ、及び、
(IV) 前記画分2-1及び前記画分2-2を濃縮又は溶媒留去するステップを含むことによって製造できる。
(VI) さらに、前記ステップ(V)の前又は後に、任意に、ODS系逆相高速液体クロマトグラフィーでメタノールと水の混合溶媒でのグラジエントクロマトグラフィーで精製し、腫瘍細胞のニッチ形成に対して抑制作用を有する画分を取得するステップ、及び、
(VII)前記ステップ(V)又は(VI)で得られる腫瘍細胞のニッチ形成に対して抑制作用を有する画分をさらに高速液体クロマトグラフィーで分画し、単離精製することによりステリフェリン化合物を76.3%以上含有する抽出物を取得できる。
(i) ODS逆相系高速液体クロマトグラフィーで、以下の条件:
固定相:COSMOSILR5C18 AR II
固定相サイズ:内径10 mm x 長さ250 mm
移動相:80%メタノール水溶液
流速:2.0 mL/min
で保持時間30分、34分に得られる画分を取得し、
・保持時間30分より得られる画分の溶媒留去するステップを含み、ステリフェリン化合物を76.9%以上含有する抽出物を取得する、若しくは、
・保持時間34分より得られる画分の溶媒留去するステップを含み、ステリフェリン化合物を73.9%以上含有する抽出物を取得する、
又は、
(ii) ODS逆相系高速液体クロマトグラフィーで、以下の条件:
固定相:COSMOSILR 5C18 AR II
固定相サイズ:内径10 mm x 長さ250 mm
移動相:85%メタノール水溶液
流速:2.0 mL/min
・保持時間40〜42分より得られる画分の溶媒留去し、ステリフェリン化合物を76.9%含有する抽出物を取得する。
(i) 海綿動物からのメタノールによる抽出物に対して、水とジクロロメタン又はクロロホルムを含む塩素系炭化水素溶媒で液−液抽出を行い、塩素系炭化水素溶媒画分を回収するステップ、
(ii) 前記(i)のステップで得る水溶性画分に対して、n-ブタノールで液−液抽出を行うステップ、
(iii) 前記ステップ(i)の塩素系炭化水素溶媒層と、前記ステップ(ii)のn-ブタノール層とを混合し濃縮又は溶媒留去後、高濃度のメタノール水溶液及びn-ヘキサンを加えて、液−液抽出し、n-ヘキサン層を回収するステップ、
(iv) 前記ステップ(iii)における高濃度のメタノール層に水を添加して希釈した中濃度のメタノール及び塩素系炭化水素溶媒で液−液抽出し、塩素系炭化水素溶媒画分を回収するステップ、及び、
(v) 上記ステップ(iii)のn-ヘキサン及び上記ステップ(iv)の塩素系炭化水素溶媒層のそれぞれの画分を濃縮又は溶媒留去するステップを含むことによって製造できるが、これらに限定されない。
(vi) 前記ステップ(v)に記載の非水溶性溶媒で抽出された脂溶性画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで非極性溶媒、非極性溶媒と極性溶媒との混合溶媒、さらに、極性溶媒と水の混合溶媒の順で、非極性溶媒から極性溶媒に変化させて順次溶出し、溶出過程で一定量の画分を分取し、その画分の腫瘍細胞のニッチ形成に対する抑制作用を評価することにより、該活性を有する画分を取得するステップ、
(vii) さらに、前記ステップ(vi)の前又は後に、任意に、ODS系逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して、メタノールと水の混合溶媒でのグラジエントクロマトグラフィーで順次メタノール含量を増加させて溶出し、所定量の画分を分取し、腫瘍細胞のニッチ形成に対する抑制作用を示す画分を取得することにより、前記脂溶性画分に含まれる活性化合物を含む画分を精製するステップ、及び、
(viii) さらに、前記ステップ(vi)又は(vii)で得られる腫瘍細胞のニッチ形成に対して抑制作用を有する画分を、ODS逆相系高速液体クロマトグラフィーで分画するステップを含むことにより、新規なステリフェリン化合物(コード番号S09226.15-4)を76.3%以上含有する抽出物として取得できる。
(a) ODS逆相系高速液体クロマトグラフィーで、以下の条件:
固定相:COSMOSILR 5C18 AR II
固定相サイズ:内径10 mm x 長さ250 mm
移動相:80%メタノール水溶液
流速:2.0 mL/min
で保持時間30分、34分に得られる画分を取得し、
・保持時間30分より得られる画分の溶媒留去するステップを含み、ステリフェリンAを76.9%以上含有し、若しくは、
・保持時間34分より得られる画分の溶媒留去するステップを含み、ステリフェリンBを73.9%以上含有する、
又は
(b) ODS逆相系高速液体クロマトグラフィーで、以下の条件:
固定相:COSMOSILR 5C18 AR II
固定相サイズ:内径10 mm x 長さ250 mm
移動相:85%メタノール水溶液
流速:2.0 mL/min
・保持時間40〜42分より得られる画分の溶媒留去するステップを含み、新規なステリフェリン化合物(コード番号S09226.15-4)を76.3%以上含有する抽出物として取得できる。
(1) 材料
ステリフェリン化合物を含む抽出物の抽出及び精製には、海綿動物(学名:Stelleta globostellata、採集場所:加計呂麻島産(S12111画分に対して)及び馬毛島産(S09226画分に対して))を使用した。実験に使用したOP9細胞及びTF-1細胞はATCCから、MB-1細胞は公益財団法人実験動物中央研究所(神奈川県川崎市)から入手した。
海洋生物サンプルを100%メタノールで2回抽出し、抽出液を濃縮後、クロロホルムと水の2相分配により脂溶性画分(S12111-E)と水溶性画分(S12111-A)に分画した。得られた脂溶性画分は、溶媒留去後、DMSO(和光純薬工業株式会社、大阪)で1 mg/mL、水溶性画分は80%DMSOで5 μg/mLの濃度に調製した。
96ウェルプレートの各ウェルに、3μg/mLのマイトマイシン C(Sigma-Aldrich Co. LLC.、米国)で3時間 (37℃、5%CO2)処理したOP9細胞を9.0×103個播種し、37℃、5% CO2下でインキュベートした。その際の培養液として、20%非働化FBS (MP Biomedicals,LLC.、米国)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P/S, Gibco、Thermo Fisher Scientific Inc.、米国)を含むαMEM (Gibco)を使用した。翌日、OP9細胞が播種されている各ウェルにMB-1細胞を2.5×103個播種した。その際のOP9細胞とMB-1細胞の共培養では、培養液として、10% 非働化FBS (Biowest SAS、仏国)、1%P/S、1% non-essential amino acids (NEAA, Invitrogen、Thermo Fisher Scientific Inc.)及び10 μM β-メルカプトエタノール (Gibco)を含むαMEMを使用した。48時間後、DMSOに溶かした海綿動物試料を2μL添加し、5倍希釈で4段階の濃度(10 μg/mL、2 μg/mL、0.4 μg/mL及び0.08 μg/mL)に調製した。 48時間37℃、5%CO2下でインキュベートした後に、4%パラホルムアルデヒド(和光純薬工業株式会社)で固定、Hoechst33342(同仁化学研究所、熊本)で核染色し、顕微鏡(IX71型、オリンパス株式会社、東京)で観察した。このとき、in vitroにおけるLSC特異的な効果の獲得と副作用の危険性の排除のため、評価基準として(1)CA形成阻害活性を有すること、及び(2)OP9細胞に強い毒性が見られないことの2点を設け、顕微鏡観察にて判断した。
単離化合物の構造決定を行うにあたり、各種NMRスペクトルはAVANCE400 (Bruker、独国)、AVANCE600 (Bruker)、MSスペクトルはHRESIMS Exactive plus (Thermo Fisher Scientific)により測定を行った。NMR測定では、重クロロホルム中に試料を溶かして測定した。MSの測定は、100%メタノールで5 μg/mLの濃度に調製した単離化合物の溶液を使用し、ポジティブモードで測定した(イオン化方法:電子スプレイイオン化法、ニードル電圧:3.84kV、キャピラリー温度:320℃)。
海綿中に含まれるステリフェリン化合物の純度は、TOF-MSを使用して、ステリフェリン化合物に特有なピークを測定試料全体のピークの積分値に対する割合を求めることにより算出した。
(1) 海綿動物からの脂溶性画分の取得
加計呂麻島産海綿Stelleta globostellata (192 g wet wt.)を粉砕し、メタノール(800 mL×3回)で抽出し、濃縮した抽出液をジクロロメタンと水で2相分配した。水層はさらにノルマルブタノール(n-ブタノール)との間で2相分配し、n-ブタノール層はジクロロメタン層と合一した。得られた水層は画分1-2とし、合一した有機層は濃縮後、溶媒分画によりノルマルヘキサン(n-ヘキサン)、ジクロロメタン及び60%メタノールのそれぞれに可溶性の画分へと分け、各々画分2-1、2-2、2-3とした(図3)。
S12111画分からの画分1-2、2-1、2-2、2-3について、前記「スクリーニング」と同様の方法で行った活性評価試験の結果を表1及び図4に示す。
画分1-2、2-1、2-2、2-3についてスクリーニングと同様の方法で行った活性評価試験の結果を表2に示す。
画分2-1(n-ヘキサン層)をオープンシリカゲルカラムクロマトグラフィー (内径2 cm×長さ15 cm)によりさらに分画した。n-ヘキサン、n-ヘキサン:酢酸エチル 9:1、8:2、7:3、6:4、クロロホルム:メタノール:水 7:3:0.5の6種類の溶媒それぞれ150 mL順にカラムに流し、25 mLずつ回収して32のフラクションに分けた。このうち20〜22のフラクションをまとめ、溶媒留去したものを画分8-6とした(図5)。
S12111画分から精製して得られた画分10-1〜6の活性評価試験結果を表3に示す。
S09226画分からの画分2-2(クロロホルム層)をODSフラッシュカラムクロマトグラフィーによりさらに分画した。50、70%メタノール、70、85%アセトニトリル、100%メタノール、クロロホルム:メタノール:水 6:4:1の6種類の溶媒それぞれ500 mLの順にカラムに流し、各溶媒可溶性の画分に分け、溶媒を留去した。このうち100%メタノール可溶性のものを画分8-5とした(図6)。
S12111画分から精製した画分10-3及び画分10-5について、1H-13CNMR及び高分解能MSを測定した。高分解能MSスペクトルは、画分10-3については、C32H48O4(理論値;m/z 496.3553 (Na付加で519.3445)、実測値;m/z 519.3445 [M+Na]+)、画分10-5については、C32H48O4(理論値;m/z 496.3553 (Na付加で519.3445)、実測値m/z;519.3446 [M+Na]+)を示した。また、これらのNMRスペクトル解析により、それぞれステリフェリンA及びステリフェリンBが同定された(図8、図9)。
マウス間葉系細胞でCA形成で支持細胞として働くOP9細胞、及びMB-1細胞との共培養によって形成されるCA形成に対するステリフェリン化合物の影響を検討した。
アポトーシスの検出には、NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells(Biotium、米国)又はミトコンドリア膜電位差を検出する蛍光試薬JC-1(Cayman Chemical、米国)を使用した。
NucView 488による評価は、各ウェルに対して0.05%トリプシン-EDTAを加え、4分間インキュベートし、培養液を加えた後、それぞれ分取した後に遠心分離(1,200 rpm、4分間)し、細胞を採取した。採取した細胞懸濁液をそれぞれ1 mLあたり1.0×106個の密度になるように調整し、それぞれ200 μLずつを分取した。分取した細胞にNucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live CellsのNucView 488 substrate stock solutionを5 μL加え、遮光して常温で20分間インキュベートした。300 μLの培養液を加え、セルソーター(SH-800型、ソニー株式会社、東京)によって解析し、各ウェルにおける緑色蛍光陽性の細胞の割合を算出した。
次に、MB-1細胞単独培養時のイマチニブ単体によるアポトーシス惹起作用の評価を行った。
アポトーシスの検出には、NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells(Biotium、米国)を使用し、上記MB-1細胞とOP9細胞の共培養系でのアポトーシスの検出方法と同様の方法で行った。
マウス間葉系細胞でCA形成で支持細胞として働くOP9細胞、及びMB-1細胞との共培養によって形成されるCAに対するステリフェリン化合物の影響をアポトーシス検出試薬JC-1を使用して検討した。
ステリフェリンA非添加条件と比較して、ステリフェリンA添加条件ではイマチニブの添加によってミトコンドリアの膜電位差が消失していることを表すJC-1 reagentの低蛍光強度側のピークの増加が認められた。すなわち、ステリフェリンAとイマチニブとの共存下、アポトーシスが惹起されていることが確認された(図12A、図12B)。また、ステリフェリンA共存下、イマチニブの用量を変化させると、イマチニブの用量に依存したアポトーシスの惹起が認められた(図12C)。これらの結果は、Nuc View 488を使用した結果と一致した。
マウス間葉系細胞でCA形成で支持細胞として働くOP9細胞、及びMB-1細胞間の立体的な位置関係に対するステリフェリン化合物の影響を、それぞれ蛍光タンパク質を導入したOP9細胞とMB-1細胞を用いて検討した。
ステリフェリンA非添加条件ではMB-1細胞がOP9細胞の層の下側へと潜り込んでいる様子が観察されたが、ステリフェリンA添加条件ではMB-1細胞がOP9細胞の層の上側へと露出していることが認められた(図13)。
以上の結果より、海綿動物より単離精製された画分から、白血病幹細胞様細胞であるMB-1細胞とOP9細胞との共培養系で認められるCA形成に対して抑制活性を有するステリフェリン化合物を同定した。上記のように、ステリフェリン化合物は、本実験で行った濃度において、MB-1細胞に対して直接的なアポトーシス惹起作用は示さない。したがって、本結果で認めたステリフェリン化合物の作用は、支持細胞との共培養下での特有な作用である。そして、ステリフェリンA非添加条件ではMB-1細胞がOP9細胞の層の下側へと潜り込んでいるが、ステリフェリンA添加条件ではMB-1細胞がOP9細胞の層の上側へと露出している。即ち、本結果で認めた作用は、ステリフェリン化合物が白血病幹細胞ニッチ形成に対して抑制的に作用することを示すものあり、ステリフェリン化合物が白血病幹細胞による悪性腫瘍の再発防止に有用であることを示すものである。
上記ステリフェリンAのMB-1細胞のニッチ形成抑制作用がMB-1細胞に特有な作用に基づくものではないことを検証する目的で、MB-1細胞と同様に白血病幹細胞様の特性を有するTF-1細胞とOP9細胞との共培養系におけるTF-1細胞のニッチ形成に対するS12111の脂溶性画分及びステリフェリンAの作用を評価した。
上記のOP9細胞とMB-1細胞及びOP9細胞とTF-1細胞の共培養系でのステリフェリン化合物のニッチ形成阻害作用が共培養系に特有な作用であるところから、共培養系でステリフェリン化合物の作用させた後のOP9細胞とMB-1細胞のそれぞれを分離してステリフェリン化合物を作用させた場合における各細胞の役割を検討した。
第1日にOP9細胞を上記と同様の方法で培地に播種し、インキュベートした。第2日にMB-1細胞を播種し、OP9細胞と共培養した。第4日にステリフェリンAを0.4 μg/mLとなるように添加しインキュベートした後、第6日に培地をステリフェリンAを含まない新鮮培地に交換し、第8日にCAの再形成の有無を検討し、評価した(図15A)。
第1日にOP9細胞を上記と同様の方法で培地に播種し、インキュベートした。第2日にMB-1細胞を播種し、OP9細胞と共培養した。第4日にステリフェリンAを0.4μg/mLとなるように添加しインキュベートした後、第6日に遊離MB-1細胞を採取し、第5日からインキュベートした新鮮OP9細胞に加え共培養し、ステリフェリンA非共存下で共培養し、第8日にCAの再形成の有無を検討した。
第1日にOP9細胞を上記と同様の方法で培地に播種し、インキュベートした。第2日にステリフェリンAを0.4 μg/mLとなるように添加しインキュベートした。第4日にステリフェリンAと非接触の新鮮MB-1細胞を播種し、共培養後、第6日にCAの形成の有無を検討した。また、対照群としてステリフェリンAを添加せずに、OP9細胞とMB-1細胞を上記のスケジュールで共培養させた系でCA形成を検討し比較した。
Claims (11)
- 前記ステリフェリン化合物が、ステリフェリンA、ステリフェリンB、又はそれらのジアステレオマー若しくはエナンチオマーから選択されることを特徴とする、請求項3に記載の腫瘍細胞のニッチ形成阻害剤。
- 前記式(IV)の化合物又はその薬学的な許容可能な塩が、抗腫瘍作用を示さない量で用いられるものである、請求項5又は6に記載の腫瘍細胞のニッチ形成阻害剤。
- 前記腫瘍細胞が、がん幹細胞、白血病幹細胞又は慢性骨髄性白血病細胞であることを特徴とする、請求項3〜7のいずれか1項に記載のニッチ形成阻害剤。
- 請求項3〜8のいずれか1項に記載のニッチ形成阻害剤とイマチニブとを組み合わせることを特徴とする抗腫瘍用医薬組成物。
- 請求項9に記載の医薬組成物が、悪性腫瘍の再発防止用であることを特徴とする、悪性腫瘍に対する再発予防剤。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016004523 | 2016-01-13 | ||
JP2016004523 | 2016-01-13 | ||
PCT/JP2017/000856 WO2017122736A1 (ja) | 2016-01-13 | 2017-01-12 | 白血病幹細胞のニッチ形成抑制活性を有する海洋生物由来の抽出物、化合物及び医薬組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017122736A1 JPWO2017122736A1 (ja) | 2018-11-22 |
JP6931889B2 true JP6931889B2 (ja) | 2021-09-08 |
Family
ID=59311873
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017561166A Active JP6931889B2 (ja) | 2016-01-13 | 2017-01-12 | 白血病幹細胞のニッチ形成抑制活性を有する海洋生物由来の抽出物、化合物及び医薬組成物 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10933044B2 (ja) |
EP (1) | EP3403661B1 (ja) |
JP (1) | JP6931889B2 (ja) |
CN (1) | CN108463230B (ja) |
WO (1) | WO2017122736A1 (ja) |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101113134A (zh) * | 2007-06-26 | 2008-01-30 | 中国人民解放军第二军医大学 | 细薄星芒海绵中的一种三萜类抗肿瘤化合物及其制备方法 |
US20120121535A1 (en) | 2009-03-05 | 2012-05-17 | Riken | Agent for preventing recurrence of leukemia |
JP2013505968A (ja) | 2009-10-01 | 2013-02-21 | シーエスエル、リミテッド | フィラデルフィア染色体陽性白血病の治療方法 |
US9334306B2 (en) | 2011-07-09 | 2016-05-10 | The Regents Of The University Of California | Leukemia stem cell targeting ligands and methods of use |
ES2733042T3 (es) | 2011-11-07 | 2019-11-27 | Univ California | Selección como diana de un nicho de células madre de cáncer quiescentes |
CN103288790A (zh) * | 2013-06-28 | 2013-09-11 | 天津医科大学 | 一种具有抗类风湿性关节炎作用的三萜类化合物的制备方法和应用 |
-
2017
- 2017-01-12 US US16/069,647 patent/US10933044B2/en active Active
- 2017-01-12 WO PCT/JP2017/000856 patent/WO2017122736A1/ja active Application Filing
- 2017-01-12 JP JP2017561166A patent/JP6931889B2/ja active Active
- 2017-01-12 EP EP17738490.6A patent/EP3403661B1/en active Active
- 2017-01-12 CN CN201780006491.2A patent/CN108463230B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2017122736A1 (ja) | 2017-07-20 |
CN108463230A (zh) | 2018-08-28 |
JPWO2017122736A1 (ja) | 2018-11-22 |
CN108463230B (zh) | 2022-01-04 |
EP3403661B1 (en) | 2021-07-28 |
US10933044B2 (en) | 2021-03-02 |
EP3403661A4 (en) | 2019-09-11 |
EP3403661A1 (en) | 2018-11-21 |
US20190022045A1 (en) | 2019-01-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Li et al. | Piperlongumine analogue L50377 induces pyroptosis via ROS mediated NF-κB suppression in non-small-cell lung cancer | |
Pandey et al. | Design, synthesis and evaluation of novel PEGylated curcumin analogs as potent Nrf2 activators in human bronchial epithelial cells | |
Rui et al. | The dual induction of apoptosis and autophagy by SZC014, a synthetic oleanolic acid derivative, in gastric cancer cells via NF-κB pathway | |
Ke et al. | Foeniculum vulgare seed extract induces apoptosis in lung cancer cells partly through the down-regulation of Bcl-2 | |
JP2024001049A (ja) | Mcm複合体の形成を阻害する方法および抗ガン化合物についてスクリーニングする方法 | |
Wu et al. | Anticancer and anti-angiogenic activities of extract from Actinidia eriantha Benth root | |
Gracheva et al. | Synthesis and cytostatic properties of polyfunctionalized furanoallocolchicinoids | |
Li et al. | Derivatives of deoxypodophyllotoxin induce apoptosis through bcl-2/bax proteins expression | |
JP5161239B2 (ja) | フタリド化合物のダイマーの抗腫瘍作用 | |
Güzelcan et al. | Synthesis of new derivatives of boehmeriasin A and their biological evaluation in liver cancer | |
JP5356029B2 (ja) | フタリド誘導体の使用 | |
Ferreira-Silva et al. | Casearin D inhibits ERK phosphorylation and induces downregulation of cyclin D1 in HepG2 cells | |
JP6931889B2 (ja) | 白血病幹細胞のニッチ形成抑制活性を有する海洋生物由来の抽出物、化合物及び医薬組成物 | |
Thuy et al. | In vivo anticancer activity of maesopsin 4-O-β-glucoside isolated from leaves of Artocarpus tonkinensis a. Chev. Ex Gagnep | |
Wu et al. | Effects and mechanism of inhibition of naringin in combination with atorvastatin on prostate cancer cells in vitro and in vivo | |
JP7462569B2 (ja) | Cyp26酵素を阻害するための化合物および方法 | |
CN108653297B (zh) | 以细胞核内组织蛋白酶l为靶点的灵芝酮二醇在制药中的应用 | |
Goswami et al. | Antiproliferative potential of a novel parthenin analog P16 as evident by apoptosis accompanied by down-regulation of PI3K/AKT and ERK pathways in human acute lymphoblastic leukemia MOLT-4 cells | |
Zhang et al. | Podophyllotoxin–pterostilbene fused conjugates as potential multifunctional antineoplastic agents against human uveal melanoma cells | |
US8546366B2 (en) | Method for inhibition of tumor cell growth using (22R)-5α-lanosta-8,24-dien-3β,15α,21-triol | |
Huang et al. | 1-Hydroxy-3-[(E)-4-(piperazine-diium) but-2-enyloxy]-9, 10-anthraquinone ditrifluoroactate induced autophagic cell death in human PC3 cells | |
KR20220124040A (ko) | 해삼 생식선 추출물 또는 이로부터 유래된 화합물의 항암 용도 | |
US20230293564A1 (en) | Method and compounds for inhibiting the MCM complex and their application in cancer treatment | |
Wu et al. | Development of novel quinoline-NO donor hybrids inducing human breast cancer cells apoptosis via inhibition of topoisomerase I | |
RU2394569C2 (ru) | Применение производных фталида |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20180710 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190830 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200623 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200824 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200825 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201215 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210212 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210331 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210720 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210804 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6931889 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |