CN108463230A - 具有白血病干细胞的微环境形成抑制活性的来自海洋生物的提取物、化合物和医药组合物 - Google Patents

具有白血病干细胞的微环境形成抑制活性的来自海洋生物的提取物、化合物和医药组合物 Download PDF

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Abstract

以人白血病干细胞样细胞的鹅卵石样区域(cobblestone area，CA)形成阻碍活性作为指标，从海绵动物(Porifera)的脂溶性组分提取具有该活性的组分，进一步从该组分中分离提纯具有该活性的化合物，通过确定其结构来鉴定包含新型化合物的stelliferin化合物。进一步发现，上述分离提纯的stelliferin化合物显著抑制对现有抗肿瘤剂具有耐性的来自人慢性骨髓性白血病(CML)的白血病干细胞样细胞的微环境形成，增强抗肿瘤剂对该细胞的效果。本发明提供一种对白血病干细胞的微环境形成具有阻碍或抑制活性的医药组合物、通过与其它抗肿瘤用药并用的恶性肿瘤的复发防止剂等。

Description

具有白血病干细胞的微环境形成抑制活性的来自海洋生物的 提取物、化合物和医药组合物
技术领域
本发明涉及一种来自海洋生物、特别是海绵动物(Polifera)的包含对于白血病干细胞的微环境(niche)形成具有抑制活性的化合物的提取物、从该提取物分离提纯的化合物、其衍生物、含有这些的医药组合物、与其它抗肿瘤剂组合使用的恶性肿瘤的复发防止剂以及用于白血病干细胞的分离和/或甄选的方法。
背景技术
包括多种抗白血病药的抗肿瘤剂已被开发并在临床使用。这些抗肿瘤剂抑制恶性肿瘤细胞的活动和增殖，具有缓解症状等效果。另一方面，多数恶性肿瘤中，具有自我复制能力和多能性的癌干细胞存活，通过其活化而具有高复发率。又称为“血液癌症”的白血病也同样，白血病也存在白血病干细胞，多数情况下，其停留在抗肿瘤剂难以奏效的休止期，癌干细胞和白血病干细胞在微环境(Niche)环境中存活，这些细胞对药剂具有耐性，活化时成为复发的原因(参照图1)。
如果白血病干细胞的微环境的环境及其形成机理、耐药性的机理、微环境形成的阻碍方法等得以明确，就能够提供将微环境形成作为目标而将其抑制或消灭的药剂。并且，被认为如果并用使抑制或消灭微环境形成的药剂和特异性使恶性肿瘤细胞自身坏死或诱导其凋亡的药剂，则在现有治疗方法下为难治性的白血病等恶性肿瘤也能够根治，从而作为癌症、白血病干细胞的新的特异性攻击剂探讨新型药剂(专利文献1～3)。
然而，至今未能开发出对于包括白血病干细胞的癌干细胞用于抑制肿瘤细胞的微环境形成的有效药剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开公报WO2010/101257
专利文献2：国际公开公报WO2013/009690
专利文献3：国际公开公报WO2013/070807
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明提供一种包含对癌干细胞、特别是对白血病干细胞的微环境形成具有阻碍或抑制活性的化合物的提取物、从该提取物分离提纯的化合物和含有这些的医药组合物、通过与其它抗肿瘤用药并用的恶性肿瘤的复发防止剂、白血病干细胞的分离和/或甄选方法。
用于解决技术问题的技术方案
本发明的发明以人白血病干细胞样细胞的鹅卵石样区域(cobblestone area，CA)形成阻碍活性作为指标，人从海绵动物(Porifera)的脂溶性组分提取、分离具有该活性的组分，进一步从该组分中分离提纯具有该活性的化合物，通过确定其结构来鉴定了包括新型化合物的stelliferin化合物。进一步发现，上述分离提纯的stelliferin化合物抑制对现有抗肿瘤剂具有耐性的来自人慢性骨髓性白血病(CML)的白血病干细胞样细胞的微环境形成，增强抗肿瘤剂对该细胞的效果，从而完成了本发明。
本发明提供一种利用脂溶性溶剂从海绵动物(Polifera)提取的提取物，其中，每单位干燥重量至少含有2％(w/w)以上的下述式(I)所示的stelliferin化合物，该提取物对于肿瘤细胞的微环境形成具有抑制作用。
其中，
R1为萜烯基，
R2选自H或乙酰基，
R3和R4分别独立，选自H、－OH、甲基、羧基或羟基甲基。
本发明的上述提取物有时可以通过包括以下步骤而制造：
(I)对于利用水溶性醇系溶剂从海绵动物得到的提取物，使用非水溶性有机溶剂提取脂溶性组分的步骤；
(II)对于上述步骤(I)中的脂溶性组分，添加高浓度的水溶性醇系溶剂/水溶液和非水溶性脂肪族烃系溶剂，进行液－液提取，回收非水溶性脂肪族烃系溶剂层(组分2-1)的步骤；
(III)将上述步骤(II)中的高浓度的水溶性醇系溶剂/水溶液层浓缩或蒸馏去除溶剂后，利用中浓度的水溶性醇系溶剂/水溶液和氯系烃溶剂进行液－液提取，回收氯系烃溶剂组分(组分2-2)的步骤；和
(IV)将上述组分2-1和上述组分2-2浓缩或蒸馏去除溶剂的步骤。
上述提取物有时是通过包括以下步骤而制造的提取物：
(I’)对于利用水溶性醇系溶剂从海绵动物得到的提取物，使用水和非水溶性有机溶剂将脂溶性组分进行液－液提取的步骤；
(II’)对于上述步骤(I’)中的脂溶性组分，添加90％水溶性醇系溶剂/水溶液和非水溶性脂肪族烃系溶剂，进行液－液提取，回收非水溶性脂肪族烃系溶剂层(组分2-1)的步骤；
(III’)向上述步骤(II’)中的90％水溶性醇系溶剂/水溶液层添加水进行稀释，用由此得到的60％水溶性醇系溶剂/水溶液和氯系烃溶剂进行液－液提取，回收氯系烃溶剂组分(组分2-2)的步骤；和(IV’)将上述组分2-1和上述组分2-2浓缩或蒸馏去除溶剂的步骤。
在制造本发明的提取物的方法中，有时上述步骤(I)～(IV)包括以下的(i)～(v)。有时通过包括(i)～(v)来制造。
(i)对于利用水溶性醇系溶剂从海绵动物得到的提取物，利用水和氯系烃溶剂进行液－液提取，回收氯系烃溶剂组分的步骤；
(ii)对于在上述(i)的步骤得到的水溶性组分，利用非水溶性醇系溶剂进行液－液提取的步骤；
(iii)将上述步骤(i)的氯系烃溶剂层和上述步骤(ii)的非水溶性醇系溶剂层混合，并浓缩或蒸馏去除溶剂后，添加高浓度的水溶性醇系溶剂水溶液和非水溶性脂肪族烃系溶剂，进行液－液提取，回收非水溶性脂肪族烃系溶剂层的步骤；
(iv)对于上述步骤(iii)中的高浓度的水溶性醇系溶剂/水溶液层添加水进行稀释，用由此得到的中浓度的水溶性醇系溶剂/水溶液和氯系烃溶剂进行液－液提取，回收氯系烃溶剂组分的步骤；和
(v)将上述步骤(iii)的非水溶性脂肪族烃系溶剂层和上述步骤(iv)的氯系烃溶剂层的各自的组分浓缩或蒸馏去除溶剂的步骤。
在制造本发明的提取物的方法中，有时上述步骤(I)～(IV)或(I’)～(IV’)包括以下的(i’)～(v’)。有时通过(i’)～(v’)来制造。
(i’)对于利用水溶性醇系溶剂从海绵动物得到的提取物，利用水和氯系烃溶剂进行液－液提取，回收氯系烃溶剂组分的步骤；
(ii’)对于在上述(i)的步骤得到的水溶性组分，利用非水溶性醇系溶剂进行液－液提取的步骤；
(iii’)将上述步骤(i’)的氯系烃溶剂层和上述步骤(ii’)的非水溶性醇系溶剂层混合，并浓缩或蒸馏去除溶剂后，添加90％水溶性醇系溶剂水溶液和非水溶性脂肪族烃系溶剂，进行液－液提取，回收非水溶性脂肪族烃系溶剂层的步骤；
(iv’)向上述步骤(iii’)中的90％水溶性醇系溶剂/水溶液层中添加水进行稀释，用由此得到的60％水溶性醇系溶剂/水溶液和氯系烃溶剂进行液－液提取，回收氯系烃溶剂组分的步骤；和
(v’)将上述步骤(iii’)的非水溶性脂肪族烃系溶剂层和上述步骤(iv’)的氯系烃溶剂层的各自的组分浓缩或蒸馏去除溶剂。
本发明的上述提取物，关于它的制造方法，有时除了包括上述步骤(I)～(IV)、(I’)～(IV’)、(i)～(v)或(i’)～(v’)的步骤之外，还包括以下的步骤(vi)～(viii)而成为含有70％以上的stelliferin化合物的上述提取物。
(vi)将在上述步骤(IV)、(IV’)、(v)或(v’)中记载的利用非脂溶性脂肪族烃系溶剂提取的脂溶性组分利用硅胶柱层析，按照通过非极性溶剂、非极性溶剂与极性溶剂的混合溶剂，进一步通过极性溶剂与水的混合溶剂的顺序依次进行洗脱，获取对于肿瘤细胞的微环境形成具有抑制作用的组分的步骤；
(vii)之后，在上述步骤(vi)的之前或之后，任意地，利用ODS系反相高效液相色谱，通过使用甲醇与水的混合溶剂的梯度层析进行提纯，获得对于肿瘤细胞的微环境形成具有抑制作用的组分的步骤；和
(viii)将在上述步骤(vi)或(vii)中得到的对于肿瘤细胞的微环境形成具有抑制作用的组分进一步利用高效液相层析进行划分的步骤。
上述(viii)的步骤中利用高效液相层析进行划分的条件有时可以为下述条件。
(a)使用ODS反相高效液相色谱，在以下条件下：
固定相：COSMOSILR5C18 AR II
固定相大小：内径10mm x长度250mm
流动相：80％甲醇水溶液
流速：2.0mL/min
获取在保持时间30分钟、34分钟得到的组分，
·通过包括对于在保持时间第30分钟得到的组分进行蒸馏去除溶剂的步骤，从而获得含有70％以上的stelliferin化合物的提取物，
·通过包括对于在保持时间第34分钟得到的组分进行蒸馏去除溶剂的步骤，从而获得含有70％以上的stelliferin化合物的提取物，
或者，
(b)使用ODS反相高效液相色谱，在以下条件：
固定相：COSMOSILR 5C18 AR II
固定相大小：内径10mm x长度250mm
流动相：85％甲醇水溶液
流速：2.0mL/min
·通过包括对于在保持时间40～42分钟得到的组分进行蒸馏去除溶剂的步骤，由此获取。
在上述提取物的发明中，上述stelliferin化合物有时选自stelliferin A、stelliferin B或者它们的非对映体或对映体。
本发明的上述提取物中，上述肿瘤细胞有时为癌干细胞、白血病干细胞或慢性骨髓性白血病细胞。
另外，本发明提供下述式(II)所示的化合物或者其药学上可接受的盐。
R1选自下述式(III)或(IV)或萜烯基，
R2选自H、－COCH3、－COCH2CH3、－CO(CH2)2CH3、－COCH(CH3)2、－COC(CH3)3。
本发明的上述化合物中，有时上述式(I)～(IV)的化合物以下述式(V)～(VII)表示。
进一步，本发明提供一种含有上述提取物或上述化合物的肿瘤细胞微环境形成抑制剂。
本发明有时是用于预防和/或治疗肿瘤细胞的微环境形成的方法,其包括将上述提取物或上述化合物的有效用量向需要它的患者给药的步骤。
另外，本发明提供上述提取物或上述化合物，其在用于预防和/或治疗肿瘤细胞的微环境形成的方法中使用。
另外，本发明提供上述提取物或上述化合物在制造用于预防和/或治疗肿瘤细胞的微环境形成的药剂中的使用。
进一步，本发明提供肿瘤细胞的微环境形成抑制剂，其含有上述提取物或者上述化合物或其药学上可接受的盐。
另外，本发明提供用于预防和/或治疗肿瘤细胞的微环境形成的方法，其包括将上述提取物或者上述化合物或其药学上可接受的盐的有效用量向需要它的患者给药的步骤。
另外，本发明提供上述提取物或者上述化合物或其药学上可接受的盐在用于预防和/或治疗肿瘤细胞的微环境形成方法中的使用。
另外，本发明提供上述提取物或者上述化合物或其药学上可接受的盐在制造用于预防和/或治疗肿瘤细胞的微环境形成的药剂中的使用。
在本发明的上述微环境形成抑制剂或具有上述微环境形成阻碍作用的上述提取物或上述化合物的方法和使用中，上述肿瘤细胞有时为癌干细胞、白血病干细胞或慢性骨髓性白血病细胞。
进一步，本发明提供将上述提取物或上述化合物与1种或2种以上抗肿瘤剂组合的抗肿瘤用医药组合物。
另外，本发明提供用于预防和/或治疗肿瘤的方法，其中，对于有需要的患者，将有效用量的上述提取物或上述化合物与1种或2种以上抗肿瘤剂组合。
另外，本发明提供上述提取物或上述化合物，其与1种或2种以上抗肿瘤剂组合而在用于预防和/或治疗肿瘤的方法中使用。
另外，本发明提供上述提取物或上述化合物在通过与1种或2种以上抗肿瘤剂组合而制造用于预防和/或治疗肿瘤的医药中的使用。
作为抗肿瘤用医药组合物，有时上述抗肿瘤剂为选自替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、伊马替尼(imatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、舒尼替尼(sunitinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)、他米巴罗汀(tamibarotene)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、帕尼单抗(panitumumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、硼替佐米(bortezomib)、拉帕替尼(lapatinib)、利妥昔单抗(rituximab)、异环磷酰胺(ifosfamide)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、尼莫司汀(nimustine)、白消安(busulfan)、美法仑(melphalan)、依诺他滨(enocitabine)、卡培他滨(capecitabine)、卡莫氟(carmofur)、吉西他滨(gemcitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、替加氟(tegafur)、替加氟·尿嘧啶(tegafur-uracil)、奈拉滨(nelarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟达拉滨(fludarabine)、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他丁(pentostatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、伊立替康(irinotecan)、依托泊苷(etoposide)、索布佐生(sobuzoxane)、多西紫杉醇(docetaxel)、拓扑替康(nogitecan)、紫杉醇(paclitaxel)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春花碱(vinblastine)、放线菌素D(actinomycinD)、阿柔比星(aclarubicin)、伊达比星(idarubicine)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、博来霉素(bleomycine)、培洛霉素(peplomycin)、丝裂霉素C(mytomycin C)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、奈达铂(nedaplatin)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、乙炔雌二醇(ethinylestradiol)、氯地孕酮、戈舍瑞林(goserelin)、他莫昔芬(tamoxifen)、比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、泼尼松龙(prednisolone)、亮丙瑞林(leuprorelin)、来曲唑(letrozole)、干扰素α(interferonα)、干扰素β(interferonβ)、干扰素γ(interferonγ)、白介素2(interleukin 2)、乌苯美司(ubenimex)、干燥BCG和香菇多糖(lentinan)中的至少一种。
本发明的上述医药组合物有时是用于防止恶性肿瘤的复发的针对恶性肿瘤的复发预防剂。
另外，本发明有时是针对恶性肿瘤的复发预防方法，其包括将上述医药组合物以有效用量向有需要的患者给药的步骤。
另外，本发明的上述医药组合物有时是用于在针对恶性肿瘤的复发预防方法中使用的医药组合物。
另外，本发明有时是用于在针对恶性肿瘤的复发预防方法中使用的医药组合物。
另外，本发明有时是为了制造针对恶性肿瘤用于预防复发的医药而使用的医药组合物。
另外，本发明提供用于分离和/或甄选癌干细胞或白血病干细胞的方法，其使用上述提取物或上述化合物。
另外，在本发明中，有时将上述“提取物”表述为“组合物”。发明效果
本发明提供：来自海洋生物、特别是来自海绵的、包含针对包括白血病干细胞的癌干细胞的微环境形成具有抑制活性的化合物的提取物；由该提取物分离提纯的活性化合物；含有它们作为有效成分的微环境形成抑制剂；与其它抗肿瘤剂组合使用的用于防止恶性肿瘤复发的药剂；以及分离和/或甄选癌干细胞或白血病干细胞的方法。
附图说明
图1A是说明白血病干细胞(LSC)的耐药性与白血病复发的关系的图。
图1B是将来自人慢性骨髓性白血病(CML)的细胞株MB-1与来自小鼠骨髓性间质细胞株OP9共培养而产生的鹅卵石样区域(CA：微环境环境模型)的显微镜照片图。
图2A是表示筛选方法的操作概要的图。
图2B是表示在筛选方法中评价鹅卵石样区域(CA)的形成与否的指标的图。
图3是表示从采集自加计吕麻岛的海绵动物(学名：Stelleta globostellata，代码编号S12111)划分出的、对于MB-1细胞的微环境形成具有抑制作用的脂溶性组分2-1和组分2-2的分离提纯方案的图。
图4是表示S12111组分(脂溶性组分)的CA形成阻碍作用的图。
图5是表示从脂溶性组分2-1进一步分离提纯，获得具有MB-1细胞的微环境形成抑制作用的组分10-3和组分10-5的分离提纯方案的图。
图6是表示从采集自马毛岛的海绵动物(学名：Stelleta globostellata，代码编号：S09226)分离提纯具有MB-1细胞的微环境形成抑制作用的组分9-2的分离提纯方案的图。
图7A是表示将从S09226组分划分出的组分9-2利用液相层析划分出组分15-1～15-10时的色谱的图。
图7B是表示将组分9-2利用液相层析划分出组分15-1～15-10时的各组分的获取量的图。
图8是表示从S12111组分分离提纯的组分10-3的化合物的NMR测定结果和结构式的鉴定的图。
图9是表示从S12111组分分离提纯的组分10-5的化合物的NMR测定结果和结构式的鉴定的图。
图10A是表示从S09226组分分离提纯的组分15-4的化合物的质谱的图。
图10B是表示从S09226组分分离提纯的组分15-4的化合物的NMR测定结果和结构式的鉴定的图。
图11A是关于将stelliferin A与各种浓度的伊马替尼添加至慢性骨髓性白血病细胞MB-1与OP9细胞的共培养体系的情况下针对MB-1细胞的细胞凋亡诱导作用，利用核染色荧光试剂NucView 488进行评价的FACS的图表图。
图11B是关于将stelliferin A与各种浓度的伊马替尼添加至慢性骨髓性白血病细胞MB-1与OP9细胞的共培养体系的情况下的细胞凋亡诱导作用，利用核染色荧光试剂NucView 488进行染色并通过FACS评价，并将所得到的结果进行总结的图。
图11C是利用核染色荧光试剂NucView 488评价MB-1细胞单独培养体系的伊马替尼用量依赖性细胞凋亡诱导作用的图。
图12A是关于将stelliferin A与伊马替尼添加至慢性骨髓性白血病细胞MB-1与OP9细胞的共培养体系的情况下针对MB-1细胞的细胞凋亡诱导作用，利用检测线粒体膜电位差的荧光试剂JC-1进行染色而评价的FACS的图表图。
图12B是关于将stelliferin A与伊马替尼添加至慢性骨髓性白血病细胞MB-1与OP9细胞的共培养体系的情况下针对MB-1细胞的细胞凋亡诱导作用，利用JC-1试剂进行染色并通过FACS解析，并将所得到的结果进行总结的图。
图12C是关于将stelliferin A与各种浓度的伊马替尼添加至慢性骨髓性白血病细胞MB-1与OP9细胞的共培养体系的情况下针对MB-1细胞的细胞凋亡诱导作用，利用JC-1试剂进行染色而评价的FACS的图表图。
图12D是关于将stelliferin A与各种浓度的伊马替尼添加至慢性骨髓性白血病细胞MB-1与OP9细胞的共培养体系的情况下针对MB-1细胞的细胞凋亡诱导作用，将利用JC-1试剂进行染色而评价的FACS的结果进行总结的图。
图13是表示对于OP9细胞和MB-1细胞各自导入荧光蛋白(分别为mCherry、GFP)基因并通过共焦点显微镜观察细胞彼此的立体位置关系的图。
图14A是在具有白血病干细胞样特性的TF-1细胞与OP9细胞的共培养体系中评价S12111组分对于微环境形成的抑制作用的显微镜照片的图。
图14B是在TF-1细胞与OP9细胞的共培养体系中评价stelliferin A对于微环境形成的抑制作用的显微镜照片的图。
图15A是表示在stelliferin A共存下将MB-1细胞与OP9细胞共培养后去除stelliferin A的情况下，评价的stelliferin A的CA形成阻碍活性的结果的图。
图15B是表示在stelliferin A共存下将MB-1细胞与OP9细胞共培养，回收其中的游离MB-1后，与新鲜OP9细胞在stelliferin A非共存下进行培养的情况下，评价对stelliferin A的CA形成阻碍所造成的影响的结果的图。
图15C是表示在stelliferin A共存下培养OP9细胞后，将该OP9细胞与MB-1细胞在stelliferin A非共存下的共培养的体系中的stelliferin A的CA形成阻碍作用的图。
具体实施方式
本发明的实施方式之一是一种利用脂溶性溶剂从海绵动物(Polifera)提取的提取物，该提取物整体的每单位干燥重量中至少含有2％(w/w)以上的stelliferin化合物，该提取物对于肿瘤细胞的微环境形成具有抑制作用。
在本说明书中，stelliferin化合物是指下述式(VIII)所示的化合物。
其中，
R1为萜烯基，
R2为H或C1～4的酰基，优选选自H或乙酰基，
R3和R4分别独立，选自H、－OH、优选为甲基的C1～6烷基、优选为羟基甲基的羟基烷基或羧基或其酯衍生物。
作为上述萜烯基的例子，可以例举下述式(1)～(45)的取代基。
具有上述式(1)～(45)的萜烯基的stelliferin化合物中，stelliferin A～F的结构式和获取方法等记载在Tsuda M.等、《天然有机化合物讨论会讲演要旨集》33,441-447(1991年9月7日)中；stelliferin J～N的结构式和获取方法等记载在Tanaka N.等、《Tetrahedron》,Vol.67,6689-6696(2011)中；stellettin(ステレッティン)A～I的结构式和获取方法等记载在McCormick,《J.L.J.Nat.Prod.》59:1047-1050(1996)和Tang S.-A等、《Chinese J.Nat.Med.》3:213-218(2005)中；globostellatic acid(グロボステラト酸)A～D的结构式和获取方法等记载在Ryu G.等、《J.Nat.Prod.》59:512-514(1996)中；globostellatic acid、globostellatic acid A、D、F～M、stelliferin核糖核苷的13E-异构体、stelliferin？核糖核苷和3-O-脱乙酰-13Z-stelliferin核糖核苷的结构式和获取方法等记载在Fouad M等、《J.Nat.Prod.》,69:211-218(2006)中；globostellatic acid X甲酯类(globostellatic acid X methyl esters)的结构式和获取方法等记载在Aoki S.等、《Bioorg Med Chem.》15:4818-28(2007)中。
另外，在本说明书中，有时上述“提取物”表述为“组合物”。
含有stelliferin化合物的提取物或者含有stelliferin化合物并阻碍癌细胞的微环境形成的提取物或组合物能够通过如下方式获得：将从海绵(Polifera)通过使用液－液提取法等分离提纯法分离提纯的组分进行划分，在针对培养细胞系的鹅卵石样区域形成的阻碍活性的筛选系中，以该组分对鹅卵石样区域形成是否具有阻碍活性作为指标而获得。
作为上述分离提纯法，能够使用例如选自液－液提取法、高效液相层析(HPLC)、开放柱层析和亲和层析等的层析法、Sephadex柱等分子筛等的方法中的两相分配法。
如下述实施例所记载，海绵动物的醇提取物的脂溶性组分中，接着可以组合进一步的分离提纯方法，获得活性更强的组分或经分离提纯后的活性化合物。在本发明中，从将这些海绵动物划分而得的组分中的3个组分中，分离出包含新型化合物的3种stelliferin化合物，对其结构进行了鉴定并确定。该化合物包含stelliferin A、stelliferin B和作为新型stelliferin化合物的stelliferin化合物3(代码编号S09226.15-4)。
另一方面，从海绵动物获得的这3种stelliferin化合物以外，在海绵动物的脂溶性组分中，例如，组分15-2(代码编号S09226.15-2)、15-3(代码编号S09226.15-3)、15-6(代码编号S09226.15-6)、15-8(代码编号S09226.15-8)、15-9(代码编号S09226.15-9)和15-10(代码编号S09226.15-10)也被包含在本发明的提取物中，另外，这些组分所包含的化合物作为对于肿瘤细胞具有微环境形成抑制作用的未知的stelliferin化合物，被包括在本发明的化合物中。
更具体地说，本发明的提取物为利用脂溶性溶剂从海绵动物(Stelletaglobostellata)提取的提取物，该提取物的每单位干燥重量中至少含有2％(w/w)以上的stelliferin化合物，能够获取对于肿瘤细胞的微环境形成具有抑制作用的组合物。在本说明书中，将stelliferin化合物至少可以含有3％(w/w)以上、至少含有5％(w/w)以上、至少可以含有10％(w/w)以上、至少可以含有15％(w/w)以上、至少可以含有20％(w/w)以上、至少可以含有25％(w/w)以上、至少可以含有30％(w/w)以上、至少可以含有35％(w/w)以上、至少可以含有40％(w/w)以上、至少可以含有45％(w/w)以上、至少可以含有50％(w/w)以上、至少可以含有55％(w/w)以上、至少可以含有60％(w/w)以上、至少可以含有65％(w/w)以上、至少可以含有70％(w/w)以上、至少可以含有75％(w/w)以上、至少可以含有80％(w/w)以上、至少可以含有85％(w/w)以上、至少可以含有90％(w/w)以上、至少可以含有95％(w/w)以上。
在本发明的上述提取物中，
上述脂溶性组分能够通过包括以下步骤而制造：
(I)对于利用水溶性醇系溶剂从海绵动物得到的提取物，使用非水溶性有机溶剂提取脂溶性组分的步骤；
(II)对于上述步骤(I)中的脂溶性组分，添加高浓度的水溶性醇系溶剂/水溶液和非水溶性脂肪族烃系溶剂，进行液－液提取，回收非水溶性脂肪族烃系溶剂层(组分2-1)的步骤；
(III)向上述步骤(II)中的高浓度的水溶性醇系溶剂/水溶液层添加水进行稀释，用由此得到的中浓度的水溶性醇系溶剂/水溶液和氯系烃溶剂进行液－液提取，回收氯系烃溶剂组分(组分2-2)的步骤；和
(IV)将上述组分2-1和上述组分2-2浓缩或蒸馏去除溶剂的步骤。
另外，在本发明的上述提取物中，
上述脂溶性组分能够通过包括以下步骤而制造：
(I)对于利用水溶性醇系溶剂从海绵动物得到的提取物，使用非水溶性有机溶剂提取脂溶性组分的步骤；
(II)对于上述步骤(I)中的脂溶性组分，添加高浓度的水溶性醇系溶剂/水溶液和非水溶性脂肪族烃系溶剂，进行液－液提取，回收非水溶性脂肪族烃系溶剂层(组分2-1)的步骤；
(III)向上述步骤(II)中的高浓度的水溶性醇系溶剂/水溶液层添加水进行稀释，用由此得到的中浓度的水溶性醇系溶剂/水溶液和氯系烃溶剂进行液－液提取，回收氯系烃溶剂组分(组分2-2)的步骤；和
(IV)将上述组分2-1和上述组分2-2浓缩或蒸馏去除溶剂的步骤。
通过以下能够得到含有76.3％以上的stelliferin化合物的提取物：
(V)进一步，将上述步骤(IV)中记载的组分2-1和组分2-2利用硅胶柱层析，按照通过非极性溶剂、非极性溶剂与极性溶剂的混合溶剂，进一步通过极性溶剂与水的混合溶剂的顺序依次进行洗脱，获取对于肿瘤细胞的微环境形成具有抑制作用的组分的步骤；
(VI)进而，在上述步骤(V)的之前或之后，任意地，利用ODS系反相高效液相色谱，通过使用甲醇与水的混合溶剂的梯度层析进行提纯，获得对肿瘤细胞的微环境形成具有抑制作用的组分的步骤；和(VII)将在上述步骤(V)或(VI)中得到的对于肿瘤细胞的微环境形成具有抑制作用的组分进一步利用高效液相层析进行划分，进行分离提纯。
作为上述使用高效液相层析进行划分来获得本发明的提取物或化合物的条件，例如可以例举下述条件。
(i)使用ODS反相高效液相色谱，在以下条件下：
固定相：COSMOSILR5C18AR II
固定相大小：内径10mm x长度250mm
流动相：80％甲醇水溶液
流速：2.0mL/min
获取在保持时间30分钟、34分钟得到的组分，
·通过包括对于在保持时间第30分钟得到的组分进行蒸馏去除溶剂的步骤，从而获得含有76.9％以上的stelliferin化合物的提取物，或
·通过包括对于在保持时间第34分钟得到的组分进行蒸馏去除溶剂的步骤，从而获得含有73.9％以上的stelliferin化合物的提取物，
或者，
(ii)使用ODS反相高效液相色谱，在以下条件：
固定相：COSMOSILR 5C18AR II
固定相大小：内径10mm x长度250mm
流动相：85％甲醇水溶液
流速：2.0mL/min
·对于在保持时间40～42分钟得到的组分进行蒸馏去除溶剂，从而获取含有76.9％的stelliferin化合物的提取物。
关于上述(I)～(VI)的步骤，更具体而言，上述提取物能够通过包括以下步骤而制造，但不限定于此：
(i)对于利用甲醇从海绵动物得到的提取物，利用水和包含二氯甲烷或氯仿的氯系烃溶剂进行液－液提取，回收氯系烃溶剂组分的步骤；
(ii)对于在上述(i)的步骤中得到的水溶性组分，利用正丁醇进行液－液提取的步骤；
(iii)将上述步骤(i)的氯系烃溶剂层和上述步骤(ii)的正丁醇层混合后进行浓缩或蒸馏去除溶剂后，添加高浓度的甲醇水溶液和正己烷，进行液－液提取，回收正己烷层的步骤；
(iv)对于上述步骤(iii)中的高浓度的甲醇层添加水进行稀释，用由此得到的中浓度的甲醇和氯系烃溶剂进行液－液提取，回收氯系烃溶剂组分的步骤；和
(v)将上述步骤(iii)的正己烷和上述步骤(iv)的氯系烃溶剂层的各自的组分浓缩或蒸馏去除溶剂的步骤。
在本说明书中，“高浓度”是指75％以上，优选为80％以上，最优选为90％以上。
在本说明书中，“中浓度”是指30％以上且低于75％，优选为40％以上且低于70％，最优选为60％。
下面作为通过本方法获取的提取物的例子，记载组分10-2～15-10的获取方法，但不限定于这些获取方法。
在本发明的上述提取物的制造方法中，除了包括上述步骤(i)～(v)以外，还包括下述步骤(vi)～(viii)，由此能够获取含有76.3％以上的新型stelliferin化合物(代码编号S09226.15-4)的提取物：
(vi)将上述步骤(v)所记载的利用非水溶性溶剂提取的脂溶性组分，利用硅胶柱层析，以按照非极性溶剂、非极性溶剂与极性溶剂的混合溶剂、以及极性溶剂与水的混合溶剂的顺序，使得从非极性溶剂变化至极性溶剂的方式依次进行洗脱，在洗脱过程中分取一定量的组分，评价该组分对于肿瘤细胞的微环境形成的抑制作用，从而获取具有该活性的组分的步骤；
(vii)进一步，在上述步骤(vi)的之前或之后，任选地，使用ODS系反相高效液相色谱，通过在利用甲醇与水的混合溶剂的梯度层析中依次增加甲醇的含量进行洗脱，分取规定量的组分，获取对于肿瘤细胞的微环境形成显示抑制作用的组分，由此将包含在上述脂溶性组分中的含有活性化合物的组分进行提纯的步骤；和
(viii)进一步，对于从上述步骤(vi)或(vii)中得到的对于肿瘤细胞的微环境形成具有抑制作用的组分，使用ODS反相高效液相色谱进行划分的步骤。
作为利用上述步骤(viii)的ODS反相高效液相色谱的分离提纯法的条件的例子，可以例举以下。
(a)使用ODS反相高效液相色谱，在以下条件下：
固定相：COSMOSILR 5C18AR II
固定相大小：内径10mm x长度250mm
流动相：80％甲醇水溶液
流速：2.0mL/min
获取在保持时间第30分钟、第34分钟得到的组分，
·包括对于在保持时间第30分钟得到的组分进行蒸馏去除溶剂的步骤，能够得到含有76.9％以上的stelliferin A的提取物，或
·包括对于在保持时间第34分钟得到的组分进行蒸馏去除溶剂的步骤，能够得到含有73.9％以上的stelliferin B的提取物，
或者
(b)使用ODS反相高效液相色谱，在以下条件：
固定相：COSMOSILR 5C18AR II
固定相大小：内径10mm x长度250mm
流动相：85％甲醇水溶液
流速：2.0mL/min
·包括对于在保持时间第40～42分钟得到的组分进行蒸馏去除溶剂的步骤，能够得到含有76.3％以上的新型stelliferin化合物(代码编号S09226.15-4)的提取物。
进一步，在ODS反相高效液相色谱中，在相同洗提条件下，作为除上述stelliferin化合物(代码编号S09226.15-4)以外的组分，能够分取以代码编号S09226.15-2～代码编号S09226.15-10表示的具有肿瘤细胞微环境形成阻碍作用的组分。
另外，作为本发明的提取物所包含的、具有肿瘤细胞微环境形成阻碍作用的化合物的例子，能够以下述式(IX)表示。
R1选自下述式(X)或(XI)或者上述萜烯基，
R2选自H、－COCH3、－COCH2CH3、－CO(CH2)2CH3、－COCH(CH3)2、－COC(CH3)3。
在本说明书中“萜烯”又被称为“类异戊二烯”，特别是在来自天然物质的情况下被称为“萜类化合物”，是指具有作为5碳化合物的异戊二烯单元的化合物或其衍生物，主要是指来自天然物质的化合物，但不限定于天然物质。
“萜稀基”是指从萜稀或萜类化合物脱离1个或2个氢原子等而成的取代基及其衍生物。萜稀包括单萜烯、倍半萜烯、二萜烯、二倍半萜、三萜烯、四萜烯(类胡萝卜素)、多萜烯等，但不限定于这些。
更具体而言，本发明的脂溶性组分所含的上述化合物有时以下述式(XII)～(XIV)表示。
进而，将这些从海绵动物分离的stelliferin A、B或者包括stelliferin·S09226.15-4的stelliferin·S09226.15-2～stelliferin·S09226.15-10组分所包含的stelliferin化合物进行衍生化，由此能够进一步提高微环境形成阻碍活性或者改善吸收、分布、代谢、排泄等体内动态，从而改善生物利用度。作为衍生化的例子，可以例举：对于stelliferin结构所具有的羟基，通过本领域技术人员惯用的缩合反应进行酯化；或对于天然的stelliferin化合物所具有的乙酰酯基，通过本领域技术人员惯用的水解进行脱乙酰化；以及对于经脱乙酰化后的化合物的羟基，通过本领域技术人员惯用的缩合反应进行再酯化等。作为上述酯化或再酯化，可以例举乙酰化、正丙基酯化、异丙基酯化、叔丁基酯化等的衍生化，但不限定于这些。
在本说明书中，“前体药物”是指向生物体内给药后在生物体内经代谢而生成本发明的化合物作为活性代谢产物的化合物或其盐。
作为前体药物的stelliferin衍生物的例子，可以例举下述式XV～XVII所示化合物或它们的盐。
R5和R6分别独立，选自H、乙酰基、正丙基酯基、异丙基酯基和叔丁基酯基，但不限定于这些。
R7和R8分别独立，选自H、乙酰基、正丙基酯基、异丙基酯基和叔丁基酯基，但不限定于这些。
R9和R10分别独立，选自H、乙酰基、正丙基酯基、异丙基酯基和叔丁基酯基，但不限定于这些。
在本说明书中，“脂溶性溶剂”是指非水溶性、非极性、无极性、疏水性、亲油性或油溶性的溶剂，例如指二氯甲烷、氯仿、正己烷、正丁醇、乙酸乙酯、苯和甲苯等溶剂，但不限定于此。
在本说明书中，“脂溶性组分”是指多种化合物的混合物或掺和物或者利用上述脂溶性溶剂从天然物质中提取的组合物，例如是指包含如下溶质的组合物，该溶质为：从海绵天然物质的破碎物中采用利用液－液提取法的分离方法而分配至脂溶性溶剂中，并在分取脂溶性溶剂后通过蒸馏去除溶剂或浓缩而获取的溶质。
在本说明书中，“液－液提取法”或“液－液分配法”是指利用目的物质对于本领域技术人员已知的两种液体的溶解性的差异的分离提纯法，但只要能够分离、提纯目的物质，则不限定于两种液体，能够使用例如液相－固相、气相－固相、气相－液相等的两相分配法。
在本说明书中，“氯系烃溶剂”是指在本技术领域中作为溶剂使用的低分子量的氯化烃，例如氯仿、二氯甲烷(methylene chloride)、三氯乙烷和四氯乙烯等，但不限定于这些。
在本说明书中，“水溶性有机溶剂”是指甲基醇(甲醇)、乙基醇(乙醇)等极性有机溶剂。有时将“水溶性有机溶剂”和“水”包括在内记载为“极性溶剂”。
在本说明书中，“水溶性醇系溶剂”是指甲基醇(甲醇)、乙基醇(乙醇)等极性醇系溶剂。有时将“水溶性醇系溶剂”和“水”包括在内记载为“极性醇系溶剂”。
在本说明书中，“非水溶性醇系溶剂”是指在常温显示非水溶性的醇系溶剂，指正丁醇、2-丁醇、异丁醇、异戊醇(异戊基醇)等，但不限定于这些。
在本说明书中，“非水溶性脂肪族烃系溶剂”是指非极性的脂肪族烃，例如指正己烷等，但不限定于此。
另外，使用“氯系烃溶剂”或“非水溶性脂肪族烃系溶剂”进行液－液提取的情况下，替代这些溶剂或者与这些溶剂一同还能够使用选自苯、甲苯、二甲苯和苯乙烯等芳香烃系溶剂；氯苯和邻二氯苯等氯化芳香烃系溶剂；乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸戊酯(乙酸戊基酯)和乙酸异戊酯(乙酸异戊基酯)等酯系溶剂；以及乙醚、1,4-二噁烷和四氢呋喃等醚系溶剂中的非水溶性溶剂。
在本说明书中，“非水溶性溶剂”是指在约23℃的室温环境下与等量的水混合时分离成两层的溶剂，将不分离成两层而与水混合的有机溶剂表述为“水溶性溶剂”。
在本说明书中，“醇提取物”是指从多种化合物的混合物或掺和物或者天然物质等中，通过使用但不限于使用甲醇或乙醇等水溶性醇系溶剂来提取的提取物。
“微环境”一般是指“生态位”。特别是在本说明书中，“微环境”特指在生物体内的微小环境中，处于癌细胞的休眠期的具有干细胞样的特性的恶性肿瘤细胞的“所在地”。在慢性骨髓性白血病中，慢性骨髓性白血病细胞在鹅卵石样区域以细胞集团的形式形成微环境。该微环境肿瘤细胞对于抗肿瘤剂显示耐药性，微环境肿瘤细胞的活化导致的再增殖被认为是使用抗肿瘤剂缓解癌症后复发的原因(专利文献1～3)。
在本说明书中，“肿瘤”是指细胞或组织在生物体中自发地过度增殖，包括产生于上皮细胞(消化道的粘膜或肝细胞等细胞的表皮部分)的“癌”、产生于非上皮细胞(骨、软骨、肌肉等连接脏器的组织细胞)的“肉瘤”、产生于造血器官(血液、淋巴液、骨髓)的“白血病”、“恶性淋巴瘤”、“多发性骨髓瘤”。
在本说明书中，“癌干细胞(Cancer stem cells：CSCs)”是指癌细胞中具有干细胞性质的细胞。具有自我复制能力和多能性，被认为以癌干细胞为起源产生癌症。已经在各种癌症中发现了癌干细胞。作为癌干细胞的例子，更具体地可以例举上颌癌干细胞、(上、中、下)咽癌干细胞、喉癌干细胞、舌癌干细胞、甲状腺癌干细胞、乳腺癌干细胞、肺癌干细胞(非小细胞肺癌干细胞、小细胞肺癌干细胞)、食道癌干细胞、胃癌干细胞、十二指肠癌干细胞、大肠癌干细胞(结肠癌干细胞、直肠癌干细胞)、肝癌干细胞(肝细胞癌干细胞、胆管细胞癌干细胞)、胆囊癌干细胞、胆管癌干细胞、胰腺癌干细胞、肛门癌干细胞、肾癌干细胞、尿道癌干细胞、膀胱癌干细胞、前列腺癌干细胞、阴茎癌干细胞、精巢(睾丸)癌干细胞、子宫癌干细胞(宫颈癌干细胞、子宫体癌干细胞)、卵巢癌干细胞、外阴癌干细胞、阴道癌干细胞、基底细胞癌干细胞、鳞状细胞癌干细胞、白血病干细胞、恶性淋巴瘤干细胞以及多发性骨髓瘤干细胞。
在本说明书中，“白血病干细胞(LSC)”是指显现CD34、CD44和CD45的细胞，在生物体内，在细胞分裂的休眠期形成微环境，活化时具有增殖白血球细胞的能力，被认为是在急性白血病的临床缓解期造成白血病复发的原因(专利文献1～3)，上述CD34是作为造血干细胞的性状的表面标记物，上述CD44作为癌干细胞的标记物且被认为是与细胞黏着性相关的透明质酸受体，上述CD45是淋巴细胞膜的主要构成成分之一。
“鹅卵石样区域(cobblestone area：CA)”又称为“鹅卵石状结构形成区域”，是指上述白血病干细胞等的癌细胞以集团黏着在由间充质细胞等构成的支撑组织而形成的细胞集团。
在本说明书中，“微环境形成抑制剂”是指对癌细胞的鹅卵石样区域的形成具有阻碍、抑制、缩小或消灭活性的化合物或其盐或者含有它们的化合物。作为微环境形成阻碍作用的机理的例子之一，可以想到通过阻碍形成微环境的癌细胞对于支撑组织的黏着而导致。目前在临床所使用的抗肿瘤剂中，还没有报道具有该微环境形成阻碍作用的物质。
在本说明书中，“抗肿瘤剂”和“抗肿瘤用医药组合物”以相同含义使用。“抗肿瘤剂”或“抗肿瘤用医药组合物”是指用于使患有恶性肿瘤的患者的症状缓解或延缓症状的发展或者改善患者的生命预期的药剂。“抗肿瘤剂”和“抗肿瘤用医药组合物”包括在日本厚生劳动省的药效分类中分类为“肿瘤用药”的药剂及其候选物质。在上述药效分类表中，“肿瘤用药”是分类为“碱化剂”、“代谢拮抗剂”、“抗肿瘤性抗生物质制剂”、“抗肿瘤性植物成分制剂”和“其它肿瘤用药”。作为抗肿瘤剂，已经在临床中作为“分子靶向药物”，使用替伊莫单抗、伊马替尼、厄洛替尼、吉非替尼、吉妥珠单抗奥唑米星、舒尼替尼、西妥昔单抗、索拉非尼、达沙替尼、他米巴罗汀、曲妥珠单抗、维甲酸、帕尼单抗、贝伐单抗、硼替佐米、拉帕替尼和利妥昔单抗等；作为“烷基化剂”使用异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安和美法仑等；作为“代谢拮抗剂”使用依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、吉西他滨、阿糖胞苷、替加氟、替加氟·尿嘧啶、奈拉滨、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁和甲氨蝶呤等；作为“植物生物碱”使用伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西紫杉醇、拓扑替康、紫杉醇、长春瑞滨、长春新碱、长春地辛和长春花碱等；作为“抗肿瘤性抗生物质”使用放线菌素D、阿柔比星、伊达比星、表柔比星、柔红霉素、阿霉素、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C和米托蒽醌等；作为“铂制剂”使用奥沙利铂、卡铂、顺铂和奈达铂等；作为“激素剂”使用阿那曲唑、依西美坦、乙炔雌二醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、亮丙瑞林和来曲唑等；以及作为“生物反应调节物”使用干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素2、乌苯美司、干燥BCG和香菇多糖等。本说明书所记载的“抗肿瘤剂”不限定于这些已应用于临床的药剂。
具体而言，作为本发明的“抗肿瘤剂”或“抗肿瘤用医药组合物”所针对的“恶性肿瘤”，作为头颈部的恶性肿瘤可以例举“上颌癌”、“(上、中、下)咽癌”、“喉癌”、“舌癌”、“甲状腺癌”等；作为胸部的恶性肿瘤可以例举“乳腺癌”、“肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌)”等；作为消化器官的恶性肿瘤可以例举“食道癌”、“胃癌”、“十二指肠癌”、“大肠癌(结肠癌、直肠癌)”、“肝癌(肝细胞癌、胆管细胞癌)”、“胆嚢癌”、“胆管癌”、“胰腺癌”、“肛门癌”等；作为泌尿器官的恶性肿瘤可以例举“肾癌”、“尿道癌”、“膀胱癌”、“前列腺癌”、“阴茎癌”、“精巣(睾丸)癌”；作为生殖器的恶性肿瘤可以例举“子宫癌(子宫颈癌、子宫体癌)”、“卵巣癌”、“外阴癌”、“阴道癌”；作为皮肤的恶性肿瘤可以例举“基底细胞癌”、“鳞状细胞癌”；作为造血器官(血液、淋巴液、骨髓)的恶性肿瘤可以例举“白血病”、“恶性淋巴瘤”、“多发性骨髓瘤”，但不限定于这些。
上述白血病干细胞(LSC)在微环境环境中细胞周期停止。因此，LSC对于效果的发挥依赖于细胞周期的现有抗肿瘤剂表现耐性，在白血病慢性期LSC活化时，白血病复发。于是，为了预防白血病复发，尝试以LSC为目标而诱导细胞凋亡的策略(专利文献1)。
本发明的阻碍癌细胞微环境形成的提取物或从该提取物分离提纯的化合物、这些化合物的衍生物或对于这些化合物或衍生物通过全合成法合成的化合物，具有以下作用：阻碍以OP9细胞等间充质细胞作为支撑组织黏着的人慢性骨髓性白血病细胞(CML)的鹅卵石样区域的形成的作用，在体外的共培养体系中，使浮游CML细胞增加的效果。黏着在支撑组织的CML对抗肿瘤剂表示耐性，但浮游CML细胞因抗肿瘤剂而诱导坏死或细胞凋亡。因此，通过将本发明的微环境形成阻碍药与抗肿瘤剂组合使用，消灭或减少在癌患者利用抗肿瘤剂治疗的缓解期中的形成白血病干细胞等的微环境的癌细胞，从而能够改善癌的复发。
对于上述癌细胞的微环境形成具有阻碍作用的提取物或化合物或其盐，能够通过添加药学上可接受的医药品添加剂，制造成经口剂、注射剂等非经口剂等的肿瘤细胞微环境形成抑制剂。
作为药学上可接受的盐，例如可以例举金属盐、铵盐、与有机碱的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性或酸性氨基酸的盐等，但不限定于这些。
作为金属盐的恰当的例子，可以例举钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐、钡盐等碱土金属盐；铝盐等。
作为与有机碱的盐的恰当的例子，可以例举与三甲胺、三乙胺、吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等的盐。
作为与碱性氨基酸的盐的恰当的例子，可以例举与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等的盐，作为与酸性氨基酸的盐的恰当的例子，可以例举与天冬氨酸、谷氨酸等的盐。
能够将上述stelliferin化合物或其衍生物或其药学上可接受的盐或溶剂合物中的至少一种，例如利用生理盐水等溶剂稀释成规定的浓度和用量，添加pH调节剂等药学上可接受的添加剂，制成医药制剂从而向患者给药。
上述医药制剂是含有具有上述微环境形成阻碍活性的化合物或其盐或溶剂合物作为有效成分的医药组合物，在本说明书中表述为微环境形成抑制剂，优选为用于恶性肿瘤的预防、治疗的医药组合物，通过与其它抗肿瘤剂组合从而能够作为用于预防恶性肿瘤复发的医药组合物使用。
用于制备上述医药制剂的药学上可接受的医药品添加剂，能够添加本领域技术人员公知的稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、缓冲剂、悬浊剂、乳化剂、表面活性剂等添加物来制备。这些医药品添加剂的种类及其用法、用量记载于医药品添加物事典2007(日本医药品添加剂协会编，药事日报社，2007年7月)等，能够依照这些记载进行制备、使用。
更具体而言，作为稳定剂能够使用酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸等有机酸；作为抗氧化剂能够使用例如抗坏血酸、二丁基羟基甲苯或没食子酸丙酯等；作为pH调节剂能够使用稀盐酸或氢氧化钠水溶液等；作为缓冲剂能够使用柠檬酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸或抗坏血酸或其盐类、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸或精氨酸或其盐类、氧化镁、氧化锌、氢氧化镁、磷酸或硼酸或其盐类；作为悬浊剂或乳化剂能够使用卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯、多甘油脂肪酸酯、聚氧化乙烯固化蓖麻油、聚山梨酸酯或聚氧化乙烯·聚氧化丙烯共聚物等；作为表面活性剂能够使用例如聚山梨酸酯80、十二烷基硫酸钠或聚氧化乙烯固化蓖麻油等，但不限定于这些。
上述制剂所含的有效成分化合物的量没有特别限定，可在广范围内适当选择，但通常在全体组合物中含有0.5～95重量％，优选含有1～30重量％。
本发明所涉及的医药组合物的给药量依照症状的程度、年龄、性别、体重、给药方式·盐的种类、对于药剂的感受性差异、疾病的具体种类等而不同，通常在成人的情况下，每日经口给药约1mg～约1000mg(优选为约10mg～约500mg)，在外用剂的情况下为约1mg～约1000mg(优选为约10mg～约500mg)，在注射剂的情况下，将体重每1Kg约1μg～约3000μg(优选为约3μg～约3000μg)在1天以1次给药的方式或分2～6次给药的方式使用。
本发明的提取物或化合物可以进一步与其它1～3种具有抗肿瘤作用的活性成分并用。作为该“其它活性成分”例如可以选自替伊莫单抗、伊马替尼、厄洛替尼、吉非替尼、吉妥珠单抗奥唑米星、舒尼替尼、西妥昔单抗、索拉非尼、达沙替尼、他米巴罗汀、曲妥珠单抗、维甲酸、帕尼单抗、贝伐单抗、硼替佐米、拉帕替尼、利妥昔单抗、异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、美法仑、依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、吉西他滨、阿糖胞苷、替加氟、替加氟·尿嘧啶、奈拉滨、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、甲氨蝶呤、伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西紫杉醇、拓扑替康、紫杉醇、长春瑞滨、长春新碱、长春地辛、长春花碱、放线菌素D、阿柔比星、伊达比星、表柔比星、柔红霉素、阿霉素、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、奥沙利铂、卡铂、顺铂、奈达铂、阿那曲唑、依西美坦、乙炔雌二醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、亮丙瑞林、来曲唑、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素2、乌苯美司、干燥BCG和香菇多糖中。
上述“其它活性成分”和本发明的提取物或化合物或其盐可以依照公知方法混合而在同一医药组合物(例如片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液剂、注射剂、栓剂、缓释剂等)中制剂化来并用，也可以分别进行制剂化，对于同一患者同时或错开时间给药。
在将上述本发明的提取物或化合物与其它活性成分组合使用的情况下，能够依照患者的症状、年龄、性别、体重和既往病史等，将各个成分的量适当增减来组合使用。
另外，本发明的上述提取物和/或化合物能够用在用于从混有白血病干细胞的组织或细胞培养体系中分离和/或甄选白血病干细胞的方法中。
本发明的用于从混有白血病干细胞的组织或细胞培养体系分离和/或甄选白血病干细胞的方法能够通过包括如下步骤来实施：向混有白血病干细胞的组织或培养细胞中添加含有上述提取物和/或上述化合物的培养液，进行孵育，采集浮游细胞的步骤。
关于确认所采集的浮游细胞是否为白血病干细胞，能够通过调查白血病干细胞特有的细胞标记物的组合、其它白血病干细胞特有的特性来确认。
本说明书中所言及的全部文献通过引用其整体而纳入本说明书中。在此记载的实施例仅为本发明的实施方式的例示，不应解释为对本发明的范围的限定。
实施例1
1.材料和实验方法
(1)材料
包含stelliferin化合物的提取物的提取和提纯使用了海绵动物(学名：Stelletaglobostellata，采集地点：加计吕麻岛产(对于S12111组分)和马毛岛产(对于S09226组分))。实验所使用的OP9细胞和TF-1细胞从ATCC获得，MB-1细胞从公益财团法人实验动物中央研究所(神奈川县川崎市)获得。
用于从上述提取物中将stelliferin化合物提取、用于将该stelliferin化合物分离、提纯的柱色谱和用于HPLC的洗脱液的甲醇、二氯甲烷、氯仿、丙酮、正己烷、正丁醇和二甲基亚砜(DMSO)使用了市售的特级品以上的级别。另外，在以下记载中，“60％甲醇”、“85％甲醇”和“90％甲醇”等记载表示甲醇和水的混合液中甲醇含量分别为60％、85％和90％的情况。另外，同样地，“85％乙腈”的记载表示水溶液中的乙腈含量为85％。
(2)作为筛选样品的脂溶性组分和水溶性组分的制备方法
将海洋生物样品使用100％甲醇提取2次，浓缩提取液后，通过氯仿与水的两相分配划分为脂溶性组分(S12111-E)与水溶性组分(S12111-A)。所得到的脂溶性组分在进行蒸馏去除溶剂后，用DMSO(和光纯药工业株式会社，大阪)制备成1mg/mL的浓度，水溶性组分用80％DMSO制备成5μg/mL的浓度。
(3)筛选方法
在96孔板的各孔中，接种使用3μg/mL的丝裂霉素C(Sigma-Aldrich Co.LLC.,美国)处理3小时(37℃，5％CO2)的OP9细胞9.0×103个，在37℃、5％CO2下进行孵育。作为此时的培养液，使用含有20％灭活FBS(MP Biomedicals,LLC.,美国)和1％青霉素-链霉素(P/S,Gibco，Thermo Fisher Scientific Inc.,美国)的αMEM(Gibco)。次日，在接种有OP9细胞的各孔中接种MB-1细胞2.5×103个。此时的OP9细胞与MB-1细胞的共培养中，作为培养液，使用含有10％灭活FBS(Biowest SAS，法国)，1％P/S，1％非必须氨基酸(NEAA,Invitrogen，Thermo Fisher Scientific Inc.)和10μMβ-巯基乙醇(Gibco)的αMEM。48小时后，添加溶解于DMSO的海绵动物试样2μL，通过5倍稀释制备4阶段的浓度(10μg/mL、2μg/mL、0.4μg/mL和0.08μg/mL)。在37℃、5％CO2下孵育48小时后，使用4％多聚甲醛(和光纯药工业株式会社)进行固定，使用Hoechst33342(同仁化学研究所，熊本)进行核染色，利用显微镜(IX71型，奥林巴斯株式会社，东京)进行观察。此时，为了获得在体外的LSC特异性效果以及排除副作用的危险性，作为评价基准设定2点：(1)具有CA形成阻碍活性；和(2)对OP9细胞未见强毒性，通过显微镜观察进行判断。
各被实验体的微环境形成阻碍作用的评价方法如图2A和图2B记载。更详细而言如下述的各部分记载。
(4)所分离化合物的结构确定方法
进行所分离化合物的结构确定时，各种NMR谱利用AVANCE400(Bruker，德国)、AVANCE600(Bruker)，MS谱利用HRESIMS Exactive plus(Thermo Fisher Scientific)进行测定。NMR测定中，在氘代氯仿中溶解试样进行测定。MS的测定使用利用100％甲醇制备成5μg/mL的浓度的分离化合物的溶液，以正模式测定(离子化方法：电喷射离子化法，针电压：3.84kV，毛细管温度：320℃)。
(5)分离提纯的提取物组分中的stelliferin化合物的纯度测定
海绵中所含stelliferin化合物的纯度使用TOF-MS，通过求得stelliferin化合物特有的峰相对于测定试样整体的峰的积分值的比例来计算。
另外，对于stelliferin A、stelliferin B和stelliferin化合物S09226.15-4的分离提纯后的组分的纯度，基于1H-NMR谱的各化合物的峰的积分值计算。
2.实验结果
(1)从海绵动物获取脂溶性组分
将加计吕麻岛产海绵Stelleta globostellata(192g wet wt.)破碎，使用甲醇(800mL×3次)进行提取，将浓缩的提取液使用二氯甲烷和水进行两相分配。水层进一步与正丁醇(n-丁醇)之间进行两相分配，将正丁醇层与二氯甲烷层合在一起。将所得到的水层设为组分1-2，将合在一起的有机层浓缩后，通过溶剂分离分为对于正己烷(n-己烷)、二氯甲烷和60％甲醇分别具有可溶性的组分，分别设为组分2-1、2-2、2-3(图3)。
另外，将马毛岛产海绵同生物种(998g wet wt.)，使用甲醇(1000mL×3次)进行提取，将浓缩的提取液使用氯仿和水进行两相分配。水层进一步与正丁醇之间进行两相分配，将所得到的正丁醇层与氯仿层合在一起。将所得到的水层设为组分1-2，将合在一起的有机层浓缩后，通过溶剂分离分为对于正己烷、氯仿和60％甲醇分别具有可溶性的组分，将蒸馏去除溶剂后的组分设为组分2-1、2-2、2-3(图3)。
(2)脂溶性组分的微环境形成阻碍活性(S12111组分)
对于来自S12111组分的组分1-2、2-1、2-2、2-3，将通过与上述“筛选”相同的方法进行活性评价试验的结果示于表1和图4。
[表1]
来自S12111组分的脂溶性组分2-1和组分2-2确认到强的CA形成阻碍活性，组分1-2和组分2-3几乎未显示活性。
另外，关于这些脂溶性组分中，收量多且示出下述记载的微环境形成抑制作用的来自S09226组分的组分2-2中的stelliferin化合物含量，使用TOF-MS，以来自stelliferin化合物的峰相对于试样整体的峰的积分值的的比例求得，每单位干燥重量中约为2.26％(w/w)。
(3)脂溶性组分的微环境形成阻碍活性(S09226组分)
对于组分1-2、2-1、2-2、2-3，将通过与筛选相同的方法进行活性评价试验的结果示于表2。
[表2]
来自S09226组分的脂溶性组分2-1和2-2确认到强的CA形成阻碍活性。组分1-2和2-3与S12111组分同样，仅显示弱的活性。
(4)脂溶性组分中含有活性成分的组分的提纯和分离(S12111组分)
将组分2-1(正己烷层)利用开放式硅胶柱层析(内径2cm×长度15cm)进一步进行划分。将正己烷、正己烷﹕乙酸乙酯为9﹕1、8﹕2、7﹕3、6﹕4、氯仿﹕甲醇﹕水为7﹕3﹕0.5的6种溶剂依次分别向色谱柱中灌入150mL，每25mL进行一次回收，分为32个流分。将这些中20～22的流分合在一起，将蒸馏去除溶剂后的设为组分8-6(图5)。
接下来将组分8-6(17.4mg)利用反相HPLC进行进一步的提纯。色谱柱使用了COSMOSILR 5C18ARII(内径10mm×长度25cm)，将85％甲醇以流速2mL/min流通10分钟后，历时30分钟，有梯度地变成100％甲醇。将出现在保持时间第38～42分钟处的2条峰回收，蒸馏去除溶剂，设为组分9-4(图5)。得到保持时间第30分钟处的stelliferin化合物(下述中鉴定为stelliferin A，组分10-3)的提取物2.1mg，第34分钟处的别的stelliferin化合物(下述中鉴定为stelliferin B，组分10-5)的提取物1.8mg。
将组分9-4(6.3mg)进一步利用反相HPLC进行提纯。流动相为80％甲醇，其它条件与上述相同。得到保持时间第30分钟处的、下述鉴定为stelliferin A的stelliferin化合物(组分10-3)2.1mg，第34分钟处的、下述鉴定为stelliferin B的stelliferin化合物(组分10-5)1.8mg(图5)。
(5)从脂溶性组分中提纯和分离的组分的微环境形成阻碍活性
将从S12111组分提纯得到的组分10-1～6的活性评价试验结果示于表3。
[表3]
从S12111组分提纯的组分10-3～6显示强的CA形成阻碍活性。
(6)脂溶性组分中含有活性成分的组分的提纯和分离(S09226组分)
将来自S09226组分的组分2-2(氯仿层)利用ODS快速柱层析进一步进行划分。将50、70％甲醇、70、85％乙腈、100％甲醇、氯仿﹕甲醇﹕水为6﹕4﹕1的6种溶剂依次分别向色谱柱中灌入500mL，分为各溶剂可溶性的组分，蒸馏去除溶剂。将这些中100％甲醇可溶性的组分设为组分8-5(图6)。
接下来，将组分8-5(1293.6mg)利用开放式硅胶柱层析进一步进行划分。将氯仿、氯仿﹕甲醇为19﹕1、9﹕1、氯仿﹕甲醇﹕水为8﹕2﹕0.1、7﹕3﹕0.5、6﹕4﹕1的6种溶剂依次分别向色谱柱中灌入200mL，约每25mL进行一次回收，分为48个流分。将这些中4～8的流分合在一起，将蒸馏去除溶剂后的组分设为组分9-2(图6)。
将组分9-2(278.0mg)利用反相HPLC进行了进一步的提纯。流动相使用85％甲醇，其它条件与分离stelliferin A和B(组分10-3、10-5)时相同。回收出现在保持时间第40～42分钟的峰，蒸馏去除溶剂，得到组分15-2～15-10(图7A，图7B)，其中组分15-4中包含化合物3(代码编号；S09226.15-4)，组分15-5中包含化合物4(代码编号；S09226.15-5)，组分15-7中包含化合物5(代码编号；S09226.15-7)。
将该组分10-3中的stelliferin A、组分10-5中的stelliferin B、组分15-4中的新型化合物S09226.15-4的含量使用1H-NMR求得，则在各组分的每单位干燥重量中，stelliferin A为约76.9％(w/w)以上，stelliferin B为约73.9％(w/w)以上，新型stelliferin化合物S09226.15-4为约76.3％(w/w)以上。
将从S09226组分得到的组分15-1～10的活性评价试验结果示于表4。
[表4]
S09226.15-1～8 CA形成阻碍活性
从S09226组分得到的组分15-2～15-10显示强CA形成阻碍活性。
(7)从脂溶性组分分离的活性成分的结构确定
对于从S12111组分提纯的组分10-3和组分10-5，使用1H-13CNMR和高解析度MS进行测定。高解析度MS谱中，对于组分10-3表示为C32H48O4(理论值；m/z 496.3553(附加Na后为519.3445)，实测值；m/z 519.3445[M+Na]+)，对于组分10-5表示为C32H48O4(理论值；m/z496.3553(附加Na后为519.3445)，实测值m/z；519.3446[M+Na]+)。另外，通过解析这些NMR谱，分别鉴定为stelliferin A和stelliferin B(图8，图9)。
另外，对于从S09226组分分离、提纯得到的、与stelliferin A和stelliferin B的HPLC的保持时间不同且显示强CA形成阻碍活性的组分15-4的NMR和高解析度MS进行测定。高解析度MS谱中确认到C32H48O4Na(理论值；m/z 519.3445，实测值；m/z 519.3443)的峰。进一步，从NMR谱鉴定了组分15-4所含化合物是新型stelliferin化合物(图10A、图10B)。
进一步，对于确认到强CA形成阻碍活性的、从上述组分15-5和15-7分取的化合物4和化合物5也分别测定了1H-NMR谱。其结果，将组分15-5的主成分鉴定为stelliferin A，将组分15-7的主成分鉴定为stelliferin B。
实施例2
(8)具有微环境形成阻碍活性的stelliferin化合物与抗肿瘤剂的并用带来的恶性肿瘤细胞的细胞凋亡诱导作用的评价
探讨stelliferin化合物对于通过共培养OP9细胞和MB-1细胞而形成的CA形成所造成的影响，其中OP9细胞在小鼠间充质细胞的CA形成时作为支撑细胞发挥作用。
在12孔板中以每1孔为1.6×105个的密度接种实施了MMC处理的OP9细胞。培养1天后，以每1孔为8.0×104个的密度接种MB-1细胞。培养2天后，以0.4μg/mL的浓度添加stelliferin A。培养1天后，以0.2μM和1.0μM的浓度添加伊马替尼。培养1天后，进行下述细胞凋亡检测。
细胞凋亡的检测使用NucView 488胱天蛋白酶-3活细胞检测试剂盒(Biotium，美国)或检测线粒体膜电位差的荧光试剂JC-1(Cayman Chemical，美国)。
关于利用NucView 488的评价，可以对于各孔添加0.05％胰蛋白酶-EDTA，孵育4分钟，添加培养液后，分别分取后进行离心分离(1,200rpm，4分钟)，采集细胞。将所采集的细胞悬浊液分别调整至每1mL中为1.0×106个的密度，各自分取200μL。向分取的细胞中添加NucView 488胱天蛋白酶-3活细胞检测试剂盒的NucView 488底物储液5μL，避光后在常温孵育20分钟。添加300μL的培养液，使用细胞分选仪(SH-800型，索尼株式会社，东京)进行解析，计算各孔中的绿色荧光阳性的细胞比例。
与不添加stelliferin A的条件相比较，在添加stelliferin A的条件中，无论在伊马替尼为0.2μM、1.0μM的哪一个添加条件下，表示胱天蛋白酶3活性的NucView的高荧光强度侧的峰都确认到依赖于stelliferin A和伊马替尼各自的浓度的增加(图11A)。
将这些结果总结在表5和图11B中。从这些结果可知，依赖于stelliferin A和伊马替尼各自的浓度，诱导了细胞凋亡的MB-1细胞的比例在统计学上显著地(Student的t检验法，p<0.05)增加。
[表5]
MB-1细胞的细胞凋亡诱导率(％)
(9)由伊马替尼单体导致的细胞凋亡诱导作用的评价
接下来，进行MB-1细胞单独培养时由伊马替尼单独导致的细胞凋亡诱导作用的评价。
将利用细胞分选仪从与OP9细胞的共培养体系中提纯的MB-1细胞以每1孔为2.0×105个的密度接种在12孔板中，以0.2μM和1.0μM的浓度添加伊马替尼。培养1天后，进行下述细胞凋亡检测。
细胞凋亡的检测使用NucView 488胱天蛋白酶-3活细胞检测试剂盒(Biotium，美国)，通过与上述MB-1细胞与OP9细胞的共培养体系中的细胞凋亡检测方法相同的方法进行。
与不添加stelliferin A时的共培养MB-1细胞相比，单独培养的MB-1细胞显示对伊马替尼的高感受性(图11C)。从这些结果可以确认，MB-1细胞在与OP9细胞的共培养下，获得了药剂抵抗性。
(10)使用JC-1试剂对于具有微环境形成阻碍活性的stelliferin化合物与抗肿瘤剂的并用带来的恶性肿瘤细胞的细胞凋亡诱导作用进行的评价
关于stelliferin化合物对于通过共培养OP9细胞和MB-1细胞而形成的CA造成的影响，使用细胞凋亡检测试剂JC-1进行探讨，其中OP9细胞在小鼠间充质细胞的CA形成时作为支撑细胞发挥作用。
在24孔板中以每1个孔为8.0×104个的密度接种实施了MMC处理的OP9细胞。培养1天后，接种MB-1细胞，每1个孔的密度为4.0×104个。培养2天后，以0.4μg/mL的浓度添加stelliferin A。培养1天后，以1.0μM的浓度添加伊马替尼。培养1天后，进行下述细胞凋亡检测。
细胞凋亡的检测使用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1 MitochondrialMembrane Potential Assay Kit)。对于各孔添加50μL的JC-1线粒体膜电位检测试剂盒的JC-1试剂，孵育20分钟。之后，对于各孔添加0.05％胰蛋白酶-EDTA，孵育4分钟，添加培养液后，分别分取后进行离心分离(1,200rpm，4分钟)，采集细胞。将所采集的细胞分别悬浮于300μL的培养液中，利用细胞分选仪(SH-800型，索尼株式会社，东京)解析，计算各孔中红色荧光阴性的细胞的比例。
结果
与不添加stelliferin A的条件相比，添加stelliferin A的条件下，确认到了通过添加伊马替尼，表示线粒体膜电位差消失的JC-1试剂的低荧光强度侧的峰增加。即，确认到在stelliferin A与伊马替尼的共存下，诱导了细胞凋亡(图12A、图12B)。另外，在stelliferin A共存下，使伊马替尼的用量变化时，确认到依赖于伊马替尼用量的细胞凋亡诱导(图12C)。这些结果与使用Nuc View 488的结果一致。
(11)stelliferin化合物对于细胞间立体位置关系的影响的评价
关于stelliferin化合物对于在小鼠间充质细胞中作为CA形成中的支撑细胞发挥作用的OP9细胞和MB-1细胞间的立体位置关系的影响，使用分别导入有荧光蛋白质的OP9细胞和MB-1细胞进行探讨。
以4.0×105个的密度在玻璃底的35mm培养皿中接种实施了MMC处理且导入有荧光蛋白质mCherry的OP9细胞。培养1天后，以2.0×105个的密度接种导入有荧光蛋白质GFP的MB-1细胞。培养2天后，以0.4μg/mL的浓度添加stelliferin A。培养2天后，使用共焦点显微镜(IX81型，奥林巴斯)拍摄细胞间的立体位置关系，进行探讨。
结果
在不添加stelliferin A的条件下，观察到MB-1细胞潜入OP9细胞层的下侧的样子，在添加stelliferin A的条件下，确认到MB-1细胞露出至OP9细胞层的上侧(图13)。
小结
由以上结果可知，从自海绵动物中分离提纯的组分中，鉴定了对于在作为白血病干细胞样细胞的MB-1细胞和OP9细胞的共培养体系中确认到的CA形成具有抑制活性的stelliferin化合物。如上所述，stelliferin化合物在本实验所进行的浓度下，对于MB-1细胞不显示直接的细胞凋亡诱导作用。因此，本结果中确认到的stelliferin化合物的作用是在与支撑细胞的共培养下所特有的作用。而且，在不添加stelliferin A的条件下，MB-1细胞潜入OP9细胞层的下侧，但在添加了stelliferin A的条件下，MB-1细胞露出至OP9细胞层的上侧。即，本结果中确认到的作用，表示stelliferin化合物对于白血病干细胞微环境形成发挥抑制性作用，并表示stelliferin化合物对防止由白血病干细胞导致的恶性肿瘤复发是有用的。
(12)S12111组分的TF-1细胞和OP9细胞的共培养体系中的微环境形成抑制作用的评价
为了证明上述stelliferin A的MB-1细胞的微环境形成抑制作用并不是基于对MB-1细胞特有的作用的结果，在与MB-1细胞同样具有白血病干细胞样特性的TF-1细胞和OP9细胞的共培养体系中，评价S12111的脂溶性组分和stelliferin A对TF-1细胞的微环境形成的作用。
关于实验方法，除了作为MB-1细胞的替代使用了TF-1细胞(来自人骨髓红白血病细胞的细胞株)以外，基本上与上述MB-1细胞的评价同样进行。在stelliferin A的评价中，更详细而言，关于stelliferin A的TF-1细胞和OP9细胞的共培养体系中的微环境形成抑制作用的评价，在24孔板的各孔中接种实施利用MMC的处理后的OP9细胞8.0×104个。培养1天后，接种TF-1细胞4.0×104个。作为此时的培养液，使用包含10％灭活FBS(Biowest SAS，法国)、1％P/S的IMDM(Gibco)。培养1天后，更换培养基，继续培养1天后，以0.4μg/mL的浓度添加stelliferin A。培养2天后，通过显微镜观测有无CA形成。
对于TF-1细胞，也与对于MB-1细胞的stelliferin A的效果同样，S12111的脂溶性组分(S12111-E)和stelliferin A抑制了微环境形成(图14A和图14B)。由此证明了stelliferin化合物所表示出的针对白血病干细胞样细胞的微环境形成，并非对MB-1细胞特有的作用，而是对于白血病干细胞样细胞所共通的作用(在图14中，左图：对照组，右图：S12111-E组分)。
实施例3
(13)stelliferin化合物的OP9细胞和MB-1细胞的共培养体系的微环境形成阻碍作用中，对于OP9细胞和MB-1细胞各自的角色的探讨
鉴于上述在OP9细胞与MB-1细胞以及在OP9细胞与TF-1细胞的共培养体系中的stelliferin化合物的微环境形成阻碍作用是对共培养体系特有的作用，对于将在共培养体系中使stelliferin化合物作用后的OP9细胞和MB-1细胞各自分离开，之后使stelliferin化合物作用时的各细胞所担当的角色进行探讨。
1)关于向OP9细胞与MB-1细胞的共培养体系中添加stelliferin化合物后更换培养基的情况下的CA再形成的探讨
在第1天通过与上述相同的方法在培养基中接种OP9细胞并进行孵育。在第2天接种MB-1细胞，与OP9细胞进行共培养。在第4天添加stelliferin A，使浓度为0.4μg/mL，进行孵育后，在第6天将培养基更换为不含stelliferin A的新鲜培养基，在第8天调查CA的再形成与否，进行评价(图15A)。
其结果，即使在使stelliferin化合物作用于OP9细胞与MB-1细胞的共培养体系后去除stelliferin化合物，也未确认到CA再形成(图15A)。因此，本结果显示stelliferin A的效果在OP9细胞与MB-1细胞的共培养体系中持续作用。
2)在使stelliferin化合物作用于OP9细胞与MB-1细胞的共培养体系后采集游离细胞并将其与新鲜的OP9细胞共培养的情况下的CA再形成的探讨
在第1天将OP9细胞通过与上述同样的方法接种在培养基中，进行孵育。在第2天接种MB-1细胞，与OP9细胞进行共培养。在第4天添加stelliferin A，使浓度为0.4μg/mL，进行孵育后，在第6天采集游离MB-1细胞，将其添加至从第5天开始孵育的新鲜OP9细胞中进行共培养，在stelliferin A非共存下进行共培养，在第8天调查CA的再形成与否。
其结果，将新鲜OP9细胞与经stelliferin A作用的MB-1细胞进行共培养时，确认到CA的形成(图15B)。本结果显示，上述stelliferin化合物的目标不是MB-1细胞。
3)在使stelliferin化合物作用于OP9细胞的单独培养体系后，与未接触stelliferin化合物的MB-1细胞共培养的情况下CA形成的探讨
在第1天通过与上述相同的方法在培养基中接种OP9细胞，进行孵育。在第2天添加stelliferin A，使浓度为0.4μg/mL，进行孵育。在第4天接种没有与stelliferin A接触的新鲜MB-1细胞，进行共培养后，在第6天探讨CA的形成与否。另外，作为对照组，对于不添加stelliferin A地将OP9细胞与MB-1细胞按照上述日程进行共培养的体系中探讨CA形成并进行比较。
其结果，和将没有与stelliferin A接触的OP细胞和MB-1细胞共培养的情况相比，在将与stelliferin A接触的OP9细胞和没有与stelliferin A接触的MB-1细胞共培养的情况下，CA的形成数减少了(图15C)。本结果表示，就stelliferin化合物的CA形成阻碍作用而言，相比于作用于MB-1细胞，更多是作用于OP9细胞。
由以上结果表示，stelliferin化合物在白血病干细胞样的MB-1细胞和具有作为支撑细胞的功能的OP9细胞的共培养体系中，具有CA形成阻碍作用，就其作用而言，相比于作用于MB-1细胞，更多是作用于作为支撑细胞的OP9细胞。
本说明书所记载的实验与白血病干细胞相关联，但本说明书所记载的提取物、组合物、化合物、肿瘤细胞的微环境形成抑制剂、医药组合物、复发预防剂以及白血病干细胞的分离和/或甄选方法不限于白血病干细胞，能够用于任意癌干细胞。
因此，上述结果表示，通过将含有包括stelliferin A的stelliferin化合物的医药组合物与对癌细胞发挥细胞毒性的抗肿瘤药或抗癌剂等组合，并将它们的有效量向缓解期的癌患者给药，能够抑制或阻碍包括白血病干细胞的癌干细胞的微环境形成，能够抑制包括白血病的复发的癌的复发。
而且，本结果表示，stelliferin化合物提供一种与现有的抗肿瘤剂作用不同的、新的针对恶性肿瘤的复发、特别是针对白血病的复发的治疗策略。

Claims (11)

1.一种利用脂溶性溶剂从海绵动物(Polifera)提取的提取物，其特征在于：
每单位干燥重量至少含有2％(w/w)以上的下述式(I)所示的stelliferin化合物，该提取物对于肿瘤细胞的微环境形成具有抑制作用，
其中，
R1为萜烯基，
R2选自H或乙酰基，
R3和R4分别独立，选自H、－OH、甲基、羧基或羟基甲基。
2.如权利要求1所述的提取物，其特征在于：
所述stelliferin化合物选自stelliferin A、stelliferin B或者它们的非对映体或对映体。
3.一种化合物或者其药学上可接受的盐，该化合物的特征在于：
其由下述式(1I)表示，
其中，
R1为下述式的萜烯基，
R2选自H或乙酰基，
R3和R4分别独立，选自H、－OH、甲基、羧基或羟基甲基。
4.如权利要求3所述的化合物，其特征在于：
所述式(II)的化合物由下述式(III)～(V)表示，
5.一种肿瘤细胞的微环境形成抑制剂，其特征在于：
含有权利要求1或2所述的提取物。
6.一种肿瘤细胞的微环境形成抑制剂，其特征在于：
含有权利要求3或4的化合物或其药学上可接受的盐。
7.如权利要求5或6所述的微环境形成抑制剂，其特征在于：
所述肿瘤细胞为癌干细胞、白血病干细胞或慢性骨髓性白血病细胞。
8.一种抗肿瘤用医药组合物，其特征在于：
组合了权利要求1或2的所述提取物或者权利要求3或4的化合物与1种或2种以上抗肿瘤剂。
9.如权利要求8所述的抗肿瘤用医药组合物，其特征在于：
所述抗肿瘤剂选自替伊莫单抗、伊马替尼、厄洛替尼、吉非替尼、吉妥珠单抗奥唑米星、舒尼替尼、西妥昔单抗、索拉非尼、达沙替尼、他米巴罗汀、曲妥珠单抗、维甲酸、帕尼单抗、贝伐单抗、硼替佐米、拉帕替尼、利妥昔单抗、异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、美法仑、依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、吉西他滨、阿糖胞苷、替加氟、替加氟·尿嘧啶、奈拉滨、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、甲氨蝶呤、伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西紫杉醇、拓扑替康、紫杉醇、长春瑞滨、长春新碱、长春地辛、长春花碱、放线菌素D、阿柔比星、伊达比星、表柔比星、柔红霉素、阿霉素、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、奥沙利铂、卡铂、顺铂、奈达铂、阿那曲唑、依西美坦、乙炔雌二醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、亮丙瑞林、来曲唑、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素2、乌苯美司、干燥BCG和香菇多糖。
10.一种对恶性肿瘤的复发预防剂，其特征在于：
将权利要求8或9所述的医药组合物用于防止恶性肿瘤的复发。
11.一种用于分离和/或甄选癌干细胞或白血病干细胞的方法，其特征在于：
使用权利要求1或2的提取物或者权利要求3或4所述的化合物。
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