JPH03266990A - 新規なｎａｄｈオキシダーゼによる脱水素方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なＮＡＤＨオキシダーゼの用途に関し、さ
らに詳しくは、アルカリ側においても高い活性を保持す
る新規ＮＡＤＨオキシダーゼと種々の脱水素酵素との共
役反応を利用して有用物質を生産する方法に関する。

酸化型ニコチンアミドデニンジヌクレオチド（以下、Ｎ
ＡＤ“という）は、種々の脱水素酵素の補酵素であり、
脱水素酵素の作用により、基質からハイドライドイオン
を受は取り、即ち基質を酸化し、ＮＡＤ＋自身は還元さ
れ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以
下、ＮＡＤＨという）となる。生成するＮＡＤＨは、Ｎ
ＡＤＨオキシダーゼの作用により、水もしくは分子状酵
素を水素受容体として酸化を受け、ＮＡＤ＋が再生され
る。

上記した如く、脱水素酵素反応において、脱水素酵素と
ＮＡＤＨオキシダーゼを共存させることにより、ＮＡＤ
＋再生系が成立し、微量のＮＡＤ”を添加することによ
って工業的に有用な光学活性化合物や反応中間体の脱水
素反応を円滑に行なうことが可能となる。

ＮＡＤ＋を補酵素とする脱水素酵素反応は、般に可逆反
応であり、中性付近では、反応平衡はＮＡＤＨ−＋ＮＡ
Ｄ＋の方に大きく片寄っている。

従ってこのような場合には、脱水素酵素とＮＡＤＨオキ
シダーゼとを共役させてＮＡＤ＋再生を行い、基質を円
滑に脱水素反応させることは困難である。一方、アルカ
リ側では、脱水素酵素反応の反応平衡はＮＡＤ＋→ＮＡ
ＤＨの方向に移るから、この部分には、脱水素酵素をＮ
ＡＤＨオキシダーゼと共役させてＮＡＤ＋の再生を行な
うことが可能となり、その結果基質の脱水素反応が容易
に進行する。

このように、ＮＡＤ′″を補酵素とし脱水素酵素とＮＡ
ＤＨオキシダーゼを共存させて基質の脱水素酵素反応を
行う場合、アルカリ側においても高活性を保持する作用
ｐＨ域の広いＮＡＤＨオキシダーゼの開発か重要な課題
となっている。

また、従来より分子状酵素を電子受容体としてＮＡＤＨ
を酸化するＮＡＤＨオキシダーゼとしては、ラクトバチ
ルス・ブランクラム（Ｌ　ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のもの［アグリカルチュラ
ル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ（Ａ　ｇｒｉ
ｃａｌＬｕｒａｌ　　ａｎｄ　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２５巻、第８７６ページ、
１９６１年］、ストレプトコッカス拳７アエカリス（Ｓ
　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｆａｅｃａｌｉｓ）由
来のもの［ジャーナル・オブφバイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、２３７巻、第２６４７
ページ、■９６２年］、アコレプラズマ・ライドラライ
（Ａ　ｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ　　ｌａｉｄｌａｗｉｉ
）由来のもの［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイ
オケミストリー（Ｅ　ｕｒｏｐｅａｎ　　Ｊ　ｏｕｒｎ
ａｌ　　ｏｆ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１２
０巻、第３２９ページ、１９８１年］、バチルス・メガ
テリウム（１３ａｃｉｌ　ｌｕｓｍｅｇａｔｅｒ　ｉｕ
ｍ）由来のもの［ジャーナル・オブ書バイオケミストリ
ー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）　、９８巻、第１４３３ページ、１９８５年
］ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌ　ｅｕｃｏ
ｎ。

５ｔｏｃ　　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のもの
［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ　ｏｕｒ
ｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂ　ｉ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、９７巻、第１２７９ページ、
１９８５年１等が報告されている。

しかしながら、これらの技術で知られているＮＡＤＨオ
キシダーゼは、微生物の培養がむずがしく大量調製が困
難であったり（アコレプラズマ・ライドラライ等）、酵
素が菌体内画分に存在するため採取がむずかしく、菌体
内含量の向上が困難であり（バチルス・メカチリウム等
）、或いは熱安定性か弱く長期にわたる活性の保持を期
待しえない（ロイコノストック・メセンテロイデス等）
等の欠点を有しており、いずれも工業的生産及び利用に
適していない。

本発明者らは、工業的製造及び利用に適したＮＡＤＨオ
キシターゼ源微生物について広く検索した結果、アルカ
リ性領域に至適生育ｐＨを有する酵素の存在下でも不在
下でも生存しうる成る種の嫌気性細菌か、温度安定性に
優れたＮ　Ａ　Ｄ　Ｈオキシダーゼを生産することを見
い出し、該微生物を培地で培養し、ＮＡＤＨオキシダー
ゼを工業的に製造する方法を提案した（特願昭６３−２
５７３７４号明細書参照、以下、上記微生物を「好アル
カリ性通性嫌気性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌」と言
うことかある）。

本発明者らは、更に効率的にＮＡＤＨオキシターゼを製
造する方法を鋭意検討した結果、好アルカリ性通性嫌気
性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌の染色体より、ＮＡＤ
Ｈオキシダーゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域
を抽出し、それをＣｏ１Ｅｌ系プラスミドの自立増殖能
を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域を有するプラスミドベク
タに連結し、該プラスミドで形質転換した微生物、例え
ばエシェリヒア・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　
ｃｏｌｉ）Ｋ−１２系微生物を生育培地で培養すると、
効率的にＮＡＤＨオキシダーゼが製造できることを見出
し、先に提案した（特願平１−２１１１６７７号及び特
願平１−４５４４５号出願明細書参照）。

本発明者らは、さらに脱水素酵素と共役して、種々の光
学活性化合物や反応中間体の脱水素反応に応用可能な、
工業的に有用性の高いＮＡＤＨオキシダーゼを広く検索
した結果、今回、本発明者らが先に提案した前記のＮＡ
ＤＨオキシダーゼは、アルカリ側においても高い酵素活
性を有し、脱水素酵素との共役反応により、ピルビン酸
をはじめとした各種の有用物質の効率的生産及び各種の
生化学反応試薬としてきわめて有用であることを見出し
、本発明を完成するに至った。

課題を解決するだめの手段 本発明によれは、ＮＡＤ＋を補酵素とする脱水素酵素を
ＮＡＤＨオキシターゼの共存下に基質を脱水素する方法
において、アルカリ性領域に至適生育ｐ　Ｈを有する通
性嫌気性のＮＡＤＨオキシターセ生産菌の培養物又はそ
のＮＡＤＨオキシダーゼ含有処理物をＮＡＤＨオキシダ
ーゼとして用いることを特徴とする方法が提供される。

上記本発明の方法において使用されるＮＡＤＨオキシタ
ーゼ生産菌としては、好アルカリ性通性嫌気性のＮ　Ａ
　Ｄ　Ｈオキシダーゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮ
Ａ領域を少くとも保有するプラスミドで形質転換した微
生物、例えばエシェリヒア・コＩＪ　Ｋ　−１２系微生
物が挙げられる。

以下、本発明の方法において用いるプラスミドの構成及
υその調製方法、該プラスミドで形質転換された微生物
、その微生物によるＮＡＤＨオキシターセの製造、並び
に該Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈオキシダーゼと共役する脱水素酵素
による脱水素反応についてさらに詳細に説明する。

本発明方法において用いうるプラスミドは、必須のＤＮ
Ａ領域として、ＮＡＤＨを分子状酸素を用いて酸化して
ＮＡＤを再生する機能をもつ酵素、すなわちＮＡＤＨオ
キシダーゼをコードする［ＭＡ　Ｄ　Ｈオキシダーゼの
生合成を司る遺伝子又はＮＡＤＨオキシダーセ構造遺伝
子を含むＤＮＡ領域」（以下、これを「Ｎ領域」と称す
ることかあ・る）を少くとも保有し、エシェリヒア・コ
リ内で自立増殖能を有し、且つＮＡＤＨオキシダーゼ構
造遺伝子の発現能を有する限り、他のいかなる遺伝子を
保有していてもよい。

プラスミドが保有することができる自律増殖能を司る遺
伝子領域及び構造遺伝子の発現を制御し得る遺伝子領域
の具体例としてはそれぞれ、例えば、ｒｃｏｌ　　Ｅｌ
系プラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ領
域」　（以下、これを「Ｓ領域」と称することがある）
及びｒ　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈオキシダーゼ構造遺伝子を発現
制御しうるプロモータ−及びオペレーターを含む調節遺
伝子ＤＮＡ領域」（以下、これを「Ｐ領域」と称するこ
とがある）を掲げことができる。プラスミドは更に、他
の遺伝情報を担うＤＮＡ領域、例えば、抗生物質耐性マ
ーカーであるアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域
を保有することもできる。

先ず、Ｎ領域のＤＮＡの供給源となる微生物としては、
好アルカリ性通性嫌気性細菌に属し、ＮＡＤＨオキシダ
ーゼ生産能を有する菌株またこれらの変異株を用いるこ
とができる。これらの性質を有する菌株の好適具体例と
しては、例えば、アグリカルチュラル・アンド・バイオ
ロジカル・ケミ　ス　ト　リ　−（Ａ　ｇｒｉｃａｌｔ
ｕｒａｌ　　　ａｎｄ　　　Ｂ　　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、第５１巻、第２２７１〜
２２７５ページ（１９８７）に記載されているＥｐＯ１
株があげられる。本菌株は工業技術院微生物工業技術研
究所に微生物受託番号　微工研条寄第２７４４号（ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−２７４４）として寄託されている。

Ｎ領域のＤＮＡは、上記した微生物の染色体を適当な制
限酵素、例えばＡｌｕ　　Ｉ、　Ｈｉｎｄ　　ｍ、Ｅｃ
ｏＲＩ、ＢａｍＨＩ等で切り出すことにより調製するこ
とができる。特に好適に用いられるＮ領域ＤＮＡとして
は、前記の好アルカリ性通性嫌気性のＮ　Ａ　Ｄ　Ｈオ
キシダーゼ生産菌ＥＰＯＩ株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２７
４４）の染色体を、制限酵素Ａ１ｕＩ及び／又はＨｉｎ
ｄ　　ＩＩＦで切り出すことにより得られる長さか約１
−６ｋｂのＤＮＡ断片、該染色体を制限酵素ＢｃｏＲＩ
及びＢａｍＨＩで切り出すことにより得られる長さか３
．６ｋｂのＤＮＡの断片等が挙げられる。

上記した１、６ｋｂのＤＮＡ断片及び３．６ｋｂのＤＮ
Ａ断片を各種の制限酵素で切断した時の切断断片の長さ
全容々表１及び表２に示す。また、これらのＤＮＡ断片
の制限酵素切断地図を各々第１図及び第２図に示す。な
お、本明細書中において示すプラスミド及びＤＮＡ断片
の長さは、アカロースケル電気泳動法により測定した値
である。

制限酵素 Ｃ１ａ　　　Ｉ Ｄｒａ　　　Ｉ Ｈｉｎｃ　　ｍ 制限酵素 ｌａ　　Ｉ ｌａ　　Ｉ Ｈｉｎｃ　　ｎ ａｃ　　Ｉ 戎−土 切断断片の長さ ０．４ｋｂ、１．２ｋｂ ０．３ｋｂ、１．３ｋｂ ０．７ｋｂ、０．９ｋｂ 表２ 切断断片の長さ ２、ｌｋｂ、１．４ｋｂ ２．３ｋｂ、１．３ｋｂ ２．６ｋｂ、１．ｏｋｂ ２．９ｋｂ、０．７ｋｂ 次に、Ｓ領域としては、コピー数かｌ細胞染色体当り２
０〜３０個であるＣｏ１Ｅｌ系プラスミドの自律増殖を
司る遺伝子を含むＤＮＡ領域か包含され、その代表例と
しては、プラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造製）を制限酵
素ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ　　ｍ、ＢａｍＨＩ等で開裂し
て得られるＤＮＡ断片を挙げることができる。

さらに、Ｐ領域としては、例えば、］・リプトファンオ
ペロン及びラクトースオペロンに由来スる、ｔｒｐプロ
モーターの”−３５領域°′と１ａｃＵ　Ｖ　−５プロ
モーターの’−１０領域′″とを融合すること［ｄｅＢ
ｏｅｒ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、、Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０．２１　（１９８３）；Ｒｕ５ｓ
ｅ１、　Ｄ、　Ｒ，＆　　Ｂｅｎｎｅｔｔ、　Ｇ、　Ｎ
、　Ｇｅｎｅ　　２０゜２３１　（１９８２）参照］に
より構築された調節遺伝子（ＤＮＡ　（以下、これをＰ
　ｔａｃと略す）か好適に用いられる。Ｐ　ｔａｃはラ
クトースリプレッザーによる抑制を受けるが、エシェリ
ヒア・コリＪＭ１０９のごとき１ａｃＩｏ宿主中では、
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下
、これをＩ　ＰＴＧと略す）の添加により抑制を解除す
ることかできる。Ｐ　ｔａｃとしてはプラスミドｐＤＲ
５４０（ファルマシア製）由来のＰ　ｔａｃ含をＤＮＡ
断片又は単離したＰ　ｔａｃ断片（ファルマシア１ ２ 製）を利用することができる他、両末端に任意の制限酵
素切断認識部位を含有するように通常用いられるＤＮＡ
合成装置（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ社製　Ｓ　ｙｓｔｅｍｌ　
　Ｐｌｕｓ）により合成したＤＮＡも使用することがで
きる。

本発明において用いられるプラスミドの具体例としては
、Ｎ領域、Ｐ領域及びＳ領域の３つの領域から実質的に
なるプラスミドｐＮＯＸＩ及びＮ領域及びＳ領域の２つ
の領域から実質的になるプラスミドｐＮＯＸ２を挙げる
ことができる。これ等のプラスミドｐＮＯＸｌ及びｐＮ
ＯＸ２は、例えば以下に示す方法で調製することができ
る。

Ｎ領域の供給源としては、前述した好アルカリ性通性嫌
気性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌ＥＰｏｔ株（ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−２７４４）の培養物を用いることができる
。

ＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌の培養はそれ自体既知の方
法で行なうことができ、その際に使用し得る培地の栄養
源である窒素源としては、例えば、アンモニウム、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等
の無機窒素化合物を単独でもしくは混合して用いるこ２
ができる。また、無機金属塩としては、例えば、リン酸
−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム
、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄等を用
いることができる。以上のような無機栄養源の他に、コ
ーンステイープリカー、酵母エキス、ペプトン等の天然
栄養源を加えてもよい。さらに、炭素源として例えば、
グルコース、キシロース、マンノース、フルクトース、
アルドース、シュークロース、セロビオース、キシラン
等を培地に添加することができる。

前述したＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌ＥＰＯＩ株を上記
の如き組成の培地で培養する場合、培養温度は通常約２
０〜約５０°Ｃ１好ましくは約３５〜約４５°Ｃの範囲
内が適当である。また、培養中の培地のｐＨは約７．５
以上のアルカリ性領域であれば厳密に限定されるもので
はないが、一般には８〜ｌ００５、好ましくは８．５〜
ｌ０００の範囲内が有利である。培地のｐＨは、水酸化
ナトリラム、水酸化カリウム、アンモニア炭酸ナトリウ
ム等のアルカリを適宜培地に添加することにより至適範
囲内となるよう調製するのが好都合である。

培養時間は通常３〜２４時間、好ましくは５〜２０時間
程度とすることができる。培養は通気撹拌、振盪等の好
気的条件下で行なうことかでき、或いは無酸素嫌気的条
件下で行ってもよい。

嫌気的条件下で培養を行なう場合には、還元銅カラムで
酸素を除去した窒素ガス、ヘリウムカス、アルゴンガス
又はそれ等の混合物等の酸素不合ガス雰囲気や、培地の
酸化還元電位を低下させて嫌気性菌の生育を容易にする
チタニウム（Ｉ［Ｉ）クエン酸、ジチオナイト等の還元
剤の添加等、通性嫌気性菌の培養に際し通常用いられる
手法［例えば山里、宇田用、児玉、森地編、「微生物の
分離法」Ｒ＆Ｄプランニング（１９８６年刊）２４６〜
２７４頁、等参照１の中から、本菌の生育至適とするア
ルカリ性領域において効力を有し、かつ本菌の生育に悪
影響を及ぼさない条件を適当に選択し、それを適用する
ことかできる。

さらに、菌体取得にいたるまでの培養はその全段階を嫌
気条件下又は好気条件下の一条件下で行なう必要はなく
、培養途中で嫌気条件がら好気条件に、あるいは好気条
件から嫌気条件に変更することにより、両者の条件を組
み合わせて培養するのもまた好ましい方法である。

かくして培養される菌体を集め、超音波処理、ホモジェ
ナイズ等の通常用いられる手段により菌体を破砕した後
、それ自体既知の通常用いられる方法によって染色体Ｄ
ＮＡを抽出することができる。

上記の如く抽出される染色体ＤＮＡは、適当な制限酵素
、例えばＡｌｕ　　Ｉで切断し、更に制限酵素Ｈｉｎｄ
　　ｍで切断するか、又は制限酵素Ｈｉｎｄ■で直接切
断することにより、長さが約１．６ｋｂのＮ領域を得る
ことができる。また、適当な制限酵素、例えは制限酵素
ＥｃｏＲＩで切断し、さらに制限酵素ＢａｎＨＩで切断
することにより、長さが約３．６ｋｂのＮ領域を得るこ
とができる。

プラスミドｐＮＯＸ１を創生ずる場合、上記の５ ６ 制限酵素Ａｌｕ　　Ｉ及び／又はＨｉｎｄ　　ｍで切断
される、長さが約１．６ｋｂのＤＮＡ断片（Ｎ領域）を
プラスミド又はλファージ等のクローニングベクターに
クローニングする。例えば、このＤＮＡ断片を発現クロ
ーニングベクターｐ　Ｐ　Ｌ　−１ａｂｄａ（ファルマ
シア社製）のＨｐａ　　　Ｉ部位に導入することかでき
る。この場合、ＨｐａＩ部位には制限酵素Ａｌｕ　　Ｉ
で切断した断片しかそのままの形では導入できないので
、制限酵素Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩで切断した場合は、リン
カ−を付けるか又は切断部位を平滑末端にした後、上記
のＨｐａ　　Ｉ部位に導入することができる。

上記ＤＮＡ断片を導入したプラスミドを適当な宿主大腸
菌、例えばエシェリヒア・コリＮ４８３０株に形質転換
したのち、４２°０１３分間の熱誘導により発現させ、
目的蛋白の発現をＮＡＤＨオキシダーゼ特異抗体を使用
する免疫スクリーニング等の方法により確認することに
よって、容易に目的のクローンを得ることができる。ま
た、上記のＤＮＡ断片は、他の発現ベクターに連結する
こともできる。

また、Ｓ領域の供給源としては、前記したＣｏ１Ｅｌプ
ラスミドとして代表的なプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒
造製）を使用するのが最も好ましい。

さらに、Ｐ領域としては、前記したＰ　ｔａｃを用いる
のが好適である。Ｐ　ｔａｃは両末端に任意の制限酵素
認識部位を有するようにＤＮＡ合成を行なうのが好まし
い。その際プラスミドｐＢＲ３２２への組み込みを考慮
し、５′側にＥｃｏＲＩ切断部位、３′側にＨｉｎｄ　
　ｍ切断部位を有するのが望ましい。

上記の如くして調製されるＰ　ｔａｃ断片を、制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌ＋で処理したプラスミドｐ
ＢＲ３２２（Ｓ領域）と−緒にし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を作用させて、プラスミドｐＢＲ３２２に上記Ｐ　ｔａ
ｃ断片が組み込まれたプラスミドを作成することかでき
る。次いで、このプラスミドをＨｉｎｄ　　ｍで開裂さ
せ、Ｈｉｎｄ　　ｍで切り出されたＮＤＡオキシダーゼ
構造遺伝子を含むＮＤＡ断片（Ｎ領域）と−緒にし、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを作用させ結合させ、適当な宿主を形
質転換し、そのＮＡＤＨオキシターゼの発現の有無から
目的のプラスミドを得ることができる。かくして調製さ
れる目的のプラスミドを、本発明者らはプラスミドｐＮ
ＯＸｌと命名する。

プラスミドｐＮＯＸ１の制限酵素の感受性（認識部位の
数）及び該制限酵素による切断断片の長さ（ｋ　ｂ）を
下記表３に示す。さらに、このプラスミドの制限酵素切
断地図を第３図に示す。

青□Ｊ 制限酵素 ＥｃｏＲＩ ｌａＩ ＢａｍＨＩ Ｐｓｔ　　Ｉ Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ 切断断片の長さ ５．９ｋｂ ５．９ｋｂ ５．９に、ｂ ５．９ｋｂ ４．３ｋｂ、１．６ｋｂ また、プラスミドｐＮＯＸ２を創生ずる場合は、前記し
た長さが約３．６ｋｂのＤＮＡ断片（Ｎ領域）を、制限
酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したプラスミドｐ
ＢＲ３２２（Ｓ領域）と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
作用させてＮ領域及びＳ領域を結合させて作成すること
が出来る。次いでこのプラスミド溶液を用いて適当な宿
主を形質転換し、そのＮＡＤＨオキシダーゼを発現させ
ることにより目的のシラスミドを得ることかできる。か
くして調製される目的のプラスミドを、本発明者らはｐ
ＮＯＸ２と命名する。

プラスミドｐＮＯＸ２の制限酵素の感受性（認識部位の
数）及び該制限酵素による切断断片の長さ（ｋｂ）を下
記表４に示す。さらにこのプラスミドの制限酵素切断地
図を第４図に示す。

９ ０ 酉−Ａ 制限酵素　　　認識部位の数　　　切断断片の長さＥｃ
ｏＲＩ　　　　　　　ｌ　　　　　　　　７．６ｋｂＣ
１ａＩ　　　　　　　　１　　　　　　　７．６ｋｂＢ
ａｍＨＩ　　　　　　　ｌ　　　　　　　’７．６ｋｂ
ＳａｃＩ１７．６ｋｂ Ｐｓｔ　　Ｉ　　　　　　　ｌ　　　　　　　　７．６
ｋｂ次に、本発明に従うプラスミドによる宿主微生物の
形質転換及び該微生物を用いたＮＡＤＨオキシダーゼの
製造法について述べる。

本発明に従うプラスミドによる形質転換に利用できる宿
主菌としては、大腸菌（エシェリヒア・コリ）か好まし
く、それらの中でも特にエシェリヒア・コリに一１２系
菌株が好ましい。

また、これら宿主菌に対する本発明に従うプラスミドの
導入はそれ自体既知の方法、例えば、Ｍ。

Ｍａｎｄｅｌ、　Ａ、　Ｈｉｇａ；　Ｊ　、　Ｍｏ１．
　Ｂｉｏｌ、　５３．１５９　（１９７０）等の文献に
記載の方法で行うことができる。

このようにして形質転換された宿主菌はそれ自体既知の
方法で培養することにより、ＮＡＤＨオキシダーゼを菌
体内に充分に生産蓄積させることができる。

かくして培養される菌体は、ＮＡＤＨオキシダーゼをそ
の菌体内に含有しているので、取得菌体を例えば超音波
処理、酵素処理、ホモジナイズ等の通常用いられる手段
にて破砕し、得られる無細胞抽出液を、塩析、イオン交
換クロマトグラフィ、ゲル濾過等のそれ自体既知の分離
、精製方法［例えば日本生化学会編　生化学実験講座第
１巻「タンパク質の化学工分離精製」東京化学同人刊１
〜３３４頁；堀尾武−１山下仁平編［蛋白質・酵素の基
礎実験法」南江堂刊１〜３７９頁等参照］に付すことに
よりＮＡＤＨオキシダーゼを採取することができる。

なお、上記形質転換された菌の培養は、宿主菌の種類に
よって異なるが、一般には、通常用いられる合成又は天
然培地を用いて行なうことができる。しかして炭素源と
しては、グルコース、グリセロール、フラクｈ−ス、シ
ュクロース、！１等の種々の炭水化物か使用できる、ま
た。窒素源としては、トリプトン、酵母エキス、コーン
・スチブ・リカー、カゼイン加水分解物等の天然有機窒
素源が使用できる。天然有機窒素源の多くは窒素源と共
に炭素源にもなり得る。また、Ｐ領域としてＰ　ｔａｃ
断片を保有するプラストミドで形質転換された宿主菌を
培養する場合は、培地にＩＰＴＧを通常０．１ｍＭ以上
、好ましくは０．５ｍＭ−５ｍＭ程度の濃度で、培養開
始後対数増殖期間中期に添加して、ＮＡＤＨオキシダー
ゼの誘導発現を行うのか好ましい。

培養は、振盪培養あるいは通気撹拌深部培養などの好気
的条件下に行うことかできる。培養温度は一般に２０〜
５０°Ｃであり、培地中の培地のｐＨは中性または微ア
ルカリ性付近、例えはｐＨ８〜９．５の範囲内に維持す
ることか望ましい。

培養期間は通常ｌＯ〜４０時間程度である。

以上に述べた如くして製造されるＮＡＤＨオキシダーゼ
の酵素学的及び理科学的性質を示せば以下のとおりであ
る。

（１）　　作用：本酵素は以下の反応式で示される如＜
ＮＡＤＨを酸化してＮＡＤと過酸化水素を生成する。

ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋０２−　　ＮＡＤ”＋Ｈ２Ｏ２（２）
　至適ｐＨ：酢酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液を
用いて測定したところ、本酵素はｐＨ８〜９付近に至適
ｐＨを有する（第５図参照）。

（３）　至適温度及び熱安定性ニリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）を用いて測定したところ、本酵素は約３７°Ｃに
至適温度を有していた（第６図参照）。

（４）　温度安定性：本酵素を上記（３）にて用いたと
同じ緩衝液に懸濁し３７°Ｃにて保存し活性の温度安定
性を調べたところ、１００時間経過後も０時間における
と略々間等の活性を有していた。一方、既に知られてい
るロイコノストック・メセンテロシデス（Ｌ　ｏｕｃｏ
ｎｏｓｔｏｃ　　Ｍ　ｅｓｅｒｔｅｒｏｉｄ３ ４ ｅｓ）は、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ
　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）第９７巻、１２８５頁（１９８５）の第７Ｂ図に記
載されているごとく、３０°Ｃでは６０分後も活性を保
つものの４０°Ｃでは約６０％、５０℃では０％に活性
が低下し、安定性が劣ることがわかる。

（５）　−価陽イオンの要求：無細胞菌体抽出液を５０
ｍＭトリス緩衝液にて透析して得た酵素液のＮＡＤＨオ
キシダーゼ活性を１００とした場合、該酵素液に２０ｍ
Ｍ濃度となるようにに＋、Ｎａ”、ＮＨ，＋を添加した
ときの活性はそれぞれ、３１０．１８０．３１０であっ
た。

（６）　　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈオキシダーゼは無細胞抽出液
を１００，０００Ｘｇで１時間超遠心処理した上清画分
に存在する。

なお、本酵素の定性的分析は、ＮＡＤＨの３４０ｎｍ吸
光の減少もしくはＮＡＤＨ共存時の酸素の吸収を酸素電
極又はマノメーターにより観測することにより行なった
。また、本酵素の活性測定は次のように行うことができ
る：すなわち、５０ｍＭ緩衝液１．９ｍ１２．酵素液０
．０５ｍ（２からなる反応液を指定する温度にて予め保
持した後、５ｍＭ　　ＮＡＤＨｏ、０５ｍ１２を加え反
応を開始し、３４０ｎｍにおける吸光の減少を測定する
。酵素活性は１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを酸化する
酵素量を１単位とした。

前記ＥｐＯＩ株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１００９６）又は形
質転換菌の培養物又は前記の如くして得られるそのＮＡ
ＤＨオキシターゼ含有処理物は、種々のＮＡＤ＋を補酵
素とする脱水素酵素と共役さセることにより、対応する
基質の脱水素反応に利用することができ、それにより種
々の含有物質の生産及び生化学反応への応用が可能であ
る。

本発明のＮＡＤＨオキシダーゼと共役させうる脱水素酵
素としては、例えば、以下のものを挙げることができる
。

（１）　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，ｌ。

■、３８、ＥＣ１，１，１，３９） 反応：Ｌ−リンゴ酸＋ＮＡＤ＋　　モー→ピルビン酸＋
ＣＯ２＋ＮＡＤＨ＋Ｈ” （２）　アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，ｌ。

１．１） 反応：アルコール十ＮＡＤ＋　−３ アルデヒド＋ＮＡＤＨ十Ｈ４ （３）　グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣｌ。

１．１．６） 反応：グリセロール＋ＮＡＤ＋　□ ジヒドロキシアセトン十ＮＡＤＨ＋Ｈ＋（４）　乳酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１゜２７） 反応：Ｌ−乳酸十ＮＡＤ＋　　≠ ピルビン酸十ＮＡＤＨ＋）（” （５）　３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１
，１，１，３０） 反応＝Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸十ＮＡＤ＋□　アセト酢
酸十ＮＡＤＨ＋Ｈ＋ （６）　インクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣｌ。

１．１．４１） 反応：イソクエン酸十ＮＡＤ”　　；二→２−オキソグ
ルタル酸＋ＣＯ２＋ ＮＡＤＨ十Ｈ” （７）　ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＥＣｌ。

１．１．４８） 反応：Ｄ−ガラクトフラノース＋ＮＡＤ”７’−Ｄ−ガ
ラクトノ−γ−ラクトン ＋ＮＡＤＨ十Ｈ” （８）　テストロン１７β−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１
，１，１，６３） 反応：テストロン＋ＮＡＤ＋　□ ４−アンドロステン−３，１７−シオン十ＮＡＤＨ＋Ｈ
＋ （９）　ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，
２，１，Ｉ） 反応：ホルムアデヒド＋還元型グルタチオン＋ＮＡＤ”
　７−−　Ｓ−ホルミルグルタチオン十ＮＡＤＨ＋Ｈ” （１０）　　ギ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅｃ　　１．２．
１．２）反応：ギ酸十ＮＡＤ“→Ｃｏ２＋ＮＡＤＨ十〇
“（１１）アラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，４゜１
．１） ７ ８ 反応：Ｌ−アラニン＋Ｈ２０＋ＮＡＤ”□　ヒルピン酸
十ＮＨ４”＋ＮＡＤＨ 十Ｈ” （１２）　　グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１゜
４．１．２） 反応：Ｌ−グルタミン酸＋Ｈ２０＋ＮＡＤ”□　２−オ
キソグルタル 十ＮＡＤＨ＋Ｈ” 以上の例示は、本発明に従うＮＡＤＨオキシダーゼと共
役して有用物質の生産に用いうる脱水素酵素について、
具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、
これによって本発明の範囲は何ら限定されるものではな
い。

上記した脱水素酵素とＮＡＤＨオキシダーゼの共存下で
の基質の脱水素反応は、例えば次のとおり進行する。先
ず、反応の第一ステップとして、基質酸化物とＮＡＤＨ
が生成する。次に反応の第ニステップとして、生成した
ＮＡＤＨが酸素の存在下で、ＮＡＤＨオキシダーゼの作
用により、ＮＡＤ＋と過酸化水素に変換される。第１ス
テンプと第２ステツプが繰り返される事で微量のＮＡＤ
＋かりザイクルされ、目的の基質酸化物が蓄積する。

上記反応は通常緩衝液中で行なわれ、用いろる緩衝液は
、特に厳密に限定されるものではないが、脱水素酵素反
応の反応平衡は、アルカリ側において、ＮＡＤ＋→ＮＡ
ＤＨの方向に移り、アルカリ側に至適ｐ　Ｈを有する本
発明のＮＡＤＨオキシダゼと共役させることにより基質
の脱水素反応が容易に進行するから、アルカリ領域の緩
衝液、好ましくはｐＨ８〜９．５の緩衝液が望ましい。

アルカリ領域の緩衝液としては、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸
緩衝液を挙げることができる。反応に使用する本発明の
ＮＡＤＨオキシダごゼ及び脱水素酵素の量はそれぞれ、
通常０．０５〜１０単位、好ましくは０．１〜５単位の
範囲内とすることかできる。

反応温度は通常２０〜４０°Ｃの範囲内であり、また反
応時間は１〜６時間程度とすることができる。

補酵素は通常１〜２００μＭ１好ましくは５〜１００μ
Ｍの範囲内で用いることができる。

前記した本発明に従うＮＡＤＨオキシダーゼと共役しう
る脱水素酵素として、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを用い
て、Ｌ−リンゴ酸からピルビン酸を製造する方法につい
てさらに詳しく述べる。

リンゴ酸デルヒドロゲナーゼを、本発明に従うＮＡＤＨ
オキシダーゼと共役させて、Ｌ−リン酸からピルビン酸
を製造する場合、反応は次のように進行する。

ＨＯＯＣ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨＣＨ３−Ｃ−Ｃ０Ｏ
Ｈα ＯＨ０ この場合、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの反応平衡は、中
性付近ではＮＡＤＨ減少方向に片寄っているので、ＮＡ
ＤＨオキシダーゼとの共役反応により、ピルビン酸を生
産させることは困難である。

ところが、アルカリ側では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
の反応平衡はＮＡＤＨ増加方向（ＮＡＤ”→ＮＡＤＨ）
に移るので、本発明に従うＮＡＤＨオキシダーゼとの共
役反応が進行してピルビン酸の生産が可能となる。

反応に用いる緩衝液としてはトリス、炭酸緩衝液等が使
用できるが、トリス緩衝液が好ましい。

トリス緩衝液は１〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜ｌｏ
ｏｍＭの濃度が反応に適している。ｐＨは６〜１０の範
囲内が好ましく、７〜９の範囲内がより好ましい。ＮＡ
ＤＨオキシダーゼの活性向上の為、反応系にに＋、Ｎａ
＋、ＮＨ，＋等−価陽イオン０．１〜５０ｍＭを添加す
ることが可能であり、その添加量は１〜］、ＯｍＭの範
囲内が好ましい。

基質であるリンゴ酸もしくはリンゴ酸塩類は通常ｌＯ〜
１０００ｍＭの濃度で反応系に添加する１ ２ ことかでき、５０〜４００ｍＭの範囲内がより好ましい
。ＮＡＤＨオキシダーゼ及び脱水素酵素はそれぞれ通常
０．０５〜ｌＯ単位、好ましくは０．５〜５単位の範囲
内で用いることができる。

ＮＡＤ“の添加量は通常１〜２００μＭ１好ましくは５
〜１００μＭの範囲内である。反応温度は通常２０〜４
０°Ｃの範囲内であり、反応時間は１〜６時間時間上す
ることができる。蓄積するピルビン酸は晶析等のそれ自
体既知の方法により回収が可能である。

次に、実施例により本発明に従うプラスミドの調製、Ｎ
ＡＤＨオキシダーゼの製造及び該ＮＡＤＨオキシダーゼ
を用いたピルビン酸の製造についてさらに具体的に説明
する。しかしながら、下記の実施例は本発明について具
体的な認識を得る助としてのみ挙げたものであり、これ
によって本発明の範囲は何ら限定されるものではない。

すの形質転換 Ａ）　好アルカリ外通性嫌気性ＮＡＤＨオキシダーゼ生
産菌染色体ＤＮＡの調製 Ｋ　２　ＨＰ　Ｏａ　ｌ　ｇ　％硝酸アンモニウム２ｇ
、ＭｇＳ　Ｏ４・７　Ｈｘ　Ｏ２００ｒｎ　ｇ　ｓ　Ｍ
　ｎ　Ｓ　Ｏ（・７　Ｈ２０５ｍｇ、Ｆｅ５０．７Ｈ２
０５ｍｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２０７００ｍｇ１酵母工キ
ス３ｇ、ポリペプトン３００　ｍ　ｇ　％主２９２１０
ｇ及びレザスリン１ｍｇを蒸留水９００ｍ１２に溶解し
、９０ｍＱずつ１００ｍ＋２容血清ビンに分注した。煮
沸脱気し、還元銅カラムを通過して調製した無酸素窒素
ガスを通気後ブチル栓をかぶせ、アルミキャップにて封
じ１２０°０１５分殺菌を行なった。この培地に１２０
°ｃ、１５分滅菌済みの１０％炭酸ナトリウム水溶液（
ｐＨ１０，６）をｌｏｍ（２添加し、培地のｐＨを１０
とした。さらに、還元剤としてサイエンス（３ｃｉｅｎ
ｃｅ）第１９４巻１１６５〜１１６６頁記載のＡ、　１
．　Ｂ、　Ｚｅｈｎｄｅｒ　　＆Ｋ　、　Ｗｕｈｒｍａ
ｎｎらの方法に準じて調製したチタニウム（ＩＩＩ）ク
エン酸溶液を最終濃度０．１３ｍＭとなるように添加し
た。本培地に好アルカリ性通性嫌気性細菌Ｅｐ０１株（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２７４４）を接種し、４０°Ｃｌ２
Ｏ時間静置培養を行なったものを種培養液とした。

キシランＩＯｇをグルコース１０ｇに変えた他は同組成
の培地４５０ｍ０．を５００ｍ＜＋容血清ヒンに分注し
、同様の操作を行ない１２０°０，１５分殺菌後、ｌＯ
％炭酸ナトリウム水溶液５０ｍ（２゜チタニウム（１）
クエン酸溶液を最終濃度０．１３ｍＭとなるように添加
した。前記種培養液１０ｍＱを接種し、４０°Ｃ１２４
時間靜装培養した。

培養終了後培養液１００ｍ４，１０，０００Ｘｇ。

２０分遠心し、得られた菌体を５０ｍＭ１Ｊス緩衝液（
ｐＨ８，０）−］　ＯｍＭＸＥＤＴＡ　・２Ｎａ溶液５
０ｍ（２に懸濁した。次にリゾチウムを最終濃度が２ｍ
　ｇ　／　ｍ　（ｌになるように添加し、５分間静置後
、１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を５ｍｆ２添加し
、６５°Ｃで３０分間保温した。

この容菌液に、５ＭＮａＣｌ溶液１５ｍ１２を添加し、
０°Ｃで１時間冷却し、全量を遠心分離（１２，０００
ｘｇ、６０分間、４°Ｃ）し、上清両分を分取し、２倍
量のエタノールを加え、混合後、遠心分離（５，０００
Ｘ　ｇ、　　ｌ　０分間、４°Ｃ）した。得られた沈殿
物を１０　ｍ　Ｍ　トＩＪス緩衝液（ｐＨ７−５）−１
ｍＭ　　ＥＤＴＡ　・２Ｎａ溶液で溶解させ、フェノー
ル処理（除タンパク処理）およびＲＮＡ分解酵素による
処理を行ないＤＮＡを得た。

Ｂ）　　ＮＡＤＨオキシダーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ
断片（Ｎ領域）の調製 前記Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡ５０μｇを制限酵素
Ａｌｕ　　Ｉ　　１００ｕｎｉｔｓを用い３０°Ｃ１１
時間反応させて切断し、染色体ＤＮＡのＡｌｕＩ分解物
溶液を調製した。Ａｌｕ　　１分解物溶液をアガロース
ケル電気泳動により分離し、１〜４ｋｂの長さのＤＮＡ
断片を含むゲルを切り出し、常法（Ｂ、　Ｖｏｇｅｌｓ
ｔｅｉｎ　　＆　　Ｄ、　ＧｉＬ　　Ｌｅｓｐｉｅ、　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　ｖｏ１７６、ｐｐ６１５−６１９　（１９７９）
］　に従いＮａＩにより溶解し１、ガラスパウダーにＤ
ＮＡ断片を吸着させる方法により精製した。

５ ３に のＡｌｕ１分解物溶液に、シラスミドｐｐ・Ｌｌａｍｂ
ｄａ　（ファルマシア社製）１μｇを制限酵素Ｈｐａｌ
を用い３０°０．　１時間反応させることにより開裂し
て得た開裂物溶液を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７，６）、１０ｍＭジチオスライトール、Ｉ　ｍ　Ｍ
　　Ａ　Ｔ　Ｐ　、　　ｌ　Ｏｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　ＣＩ
□及びＴ４リガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加しく各成
分の濃度は最終濃度である）、１６°Ｃで１５時間反応
させて結合させた。

この溶液を用い、常法［Ｍ　、　Ｍａｎｄｅ　ｌ　、　
Ａ　。

Ｈｉｇａ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　ｖｏ１５
３、ｐ１５９（１９７０）参照１に従ってエシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　Ｎ　
４８３０株を形質転換し、Ｌ培地（トリプトン１０ｇ、
酵母エキス５ｇ。

ＮａＣ１５ｇ、グルコース１ｇ及び蒸留水］（２゜ｐＨ
７，２）にアンピシリンを５０　ｐ（１／ｍ＋２濃度に
添加し、１．５％寒天で固化させた培地（以下、ＬＡ培
地と称する）に塗抹し、３０°Ｃで２０時間培養し、コ
ロニーを形成させた。培地上にニトロセルロースメンプ
ランを［き、４２°Ｃで３時間熱誘導をかけた。メンブ
ランフィルタ−上のコロニーを溶菌させ、牛血清アルブ
ミンでメンプランの非特異的結合をブロックした後、精
製したＮ　Ａ　Ｄ　Ｈオキシダーゼでウサギを免疫して
調製した抗ＮＡＤＨオキシダーゼ抗体を一次抗体として
イムノスクリーニングを行った。メンプランを更にｈｏ
ｒｓｅ　−ｒａｄｉｓｈパーオキシダーゼを結合させた
ａｎｔｉ　−ｒａｂｂｉｔ　　Ｉ　ｇＧで処理したのち
、過酸化水素−３，３−ジアミノベンデイン系又は過酸
化水素−４−クロロ−１−ナフトール系で発色さゼて、
目的のコロニーを選択した。形質転換株は５ＸＩＯ−’
の割合で取得できた。

得られた５株をＬ　Ａ液体培地で３０°Ｃ１２０時間培
養し、次いで４２°Ｃ，３時間の熱誘導を行った後、遠
心（１２，００Ｏｒｐｍ、２０分間）集菌した。該菌体
１ｇを２０ｍ１２のトリノ緩衝液（ｐＨ７，８）に懸濁
後、超音波破砕、遠心により残渣を除いた、無細胞抽出
液について酸素電極（Ｙ　ｅｌｌｏｗ　　Ｓ　ｐｒｉｎ
ｇｓ　　Ｔ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）を用いてＮ　Ａ
　Ｄ　Ｈ酸化時の酸素吸収の最も大きな菌株を選択した
。この株より、アルカリ−５ＤＳ法［Ｔ。

Ｍａｎｉａｒｉｓ、　Ｅ　、　Ｆ　、　Ｆ　ｒｉｔｓｃ
ｂ、　　Ｊ　、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　（］　９
８２）　Ｉ）　ｒ）　９０−９１参照］によりシラスミ
ドを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、分子量をア
カロースケル電気泳動により調へたところ、ｐ　Ｐ　Ｌ
　−ｌａｍｂｄａに約２．０ｋｂのＤＮＡ断片が挿入さ
れていることがわかった。

ｐ　Ｐ　Ｌ　−ｌａｍｂｄａ挿入に用いたＨ　ｐａ　Ｉ
認識部位は平滑末端同士の連結反応（Ｉｉｇａｔｉｏｎ
）により使用できないため。他の制限酵素切断認識部位
を検索した結果、挿入ＤＮＡ断片はＨｉｎｄｌｌ［によ
る切断で約１．６ｋｂの断片として切出せることが判明
し、抽出したプラスミドのＨｉｎｄｌｌＩによる切断分
解物をアカロースゲル電気泳動により分離し、ゲルから
前述のＮａｌ−カラスパウダー法により１．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片を調製した。

Ｃ）　　Ｐｔａｃの合成 下記に示すような塩基配列を有するプロモーターＰｔａ
ＣをＤＮＡ合成装置（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ社製Ｓ　ｙｓｔ
ｅｍｌＰｌｕｓ）を用いて合成した。

ＡＡＴＴＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧ
ＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴ
ＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＹＧＧＡＡ
ＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣ
ＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴ
ＴＧＴＴＡＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＣＡ ＴＧＴＴＣＧＡ Ｄ）　プラスミドｐＮＯＸ１の造成及び該プラスミドに
よるエシェリヒア・コリの形質転換プラスミドｐＢＲ３
２２１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ及び）ＴｉｎｄＴＩＴ
（各１　ｕｎｉｔ）を用い３０°Ｃ１１時間反応させ切
断して得た分解物溶液に、前記Ｂ）項で調製したｌ　、
６　ｋｂのＤＮＡ断片１μｇと前記Ｃ）項で調製したＰ
ｔａｃＤＮＡ断片１．０μｇを混合し、最終濃度で各々
５０ｍＭ、１　０ｍＭ、　　１　ｍＭ、　　］　ｍＭ、
　　ｌ　ＯｍＭ、　　Ｉ　ｕｎｉｔとなるようにトリス
緩衝液（（７，６）、ジチオスライトール、Ａ　Ｔ　Ｐ
　、　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２、Ｔ４リガーゼを添加し、］６
°Ｃで１５時間反応させ結合した。この溶液を用いてエ
シェリヒア・コ！Ｊ　（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃ９ ０ ｈｉ　　ｃｏｌｉ）　Ｋ　−］　２系菌株ＪＭ１０９株
を常法に従って形質転換さ旦、ＬＡ培地に塗抹し、３７
℃で２４時間培養した。生育してきた株につき、アルカ
リ−３ＤＳ法によりプラスミドを抽出し、制限酵素Ｅ　
ｃｏＲＩ　（５ｕｎｉｔｓ）及びＣ１ａ　Ｉ　（５ｕｎ
ｉｔ５）を用いてプラスミドを切断し、アカロースゲル
電気泳動により分子量を測定したところ、ＮＡＤＨオキ
シダーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｉ６ｋｂ）がＨ
ｉｎｄＩ［切断部位に異なった配置で結合したプラスミ
ドが各々１つずつ存在した。

このうちＥｃｏＲＩ、Ｃ１ａ　Ｉによって生ずる断片の
中に、約１．２　ｋ　ｂの長さのものを生ずる方のプラ
スミドをｐＮＯＸｌと命名した。また、このプラスミド
ｐＮＯＸＩで形質転換されたエシェリヒア・コリに一１
２系菌株ＩＭＩ　０９株をＮＹＯｌと命名した。このＮ
ＹＯｌ株は、茨城基つくば宙乗１丁目１番３号の工業技
術院微生物工業研究所に、受託番号：微工研条寄第２７
４５号（ＦＥＲ，Ｍ　　ＢＰ−２４７５）として寄託さ
れている。

プラスミドによるエシェリヒア・コ リの形質転換 Ａ）　　ＮＡＤＨオキシダーゼの生合成を司る遺伝子を
含むＤＮＡ断片（Ｎ領域）の調製 実施例１のＡ）項で調製した染色体ＤＮＡ５０ｐｇを制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ各々１００ｕｎｉｔｓ
を用い、３０°Ｃで１時間反応させて切断し、染色体Ｄ
ＮＡ（７）ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ分解物溶液を調製
した。上記の分解物溶液をアガロースゲル電気泳動によ
り分離し、１〜４ｋｂの長さのＤＮＡ断片を含むゲルを
切り出し、常法［Ｂ、　Ｖｏｇｅｌｓｔｉｎ　　＆　　
Ｄ、　ＧｉＬ　　Ｌｅｓｐｉｅ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　ｖｏｌ　　７６、ｐ
６１５−６］９（１９７９）］　に従いＮａＩにより溶
解し、ガラスパウダーにＤＮＡ断片を吸着させる方法に
より精製した。

Ｂ）　％プラスミドｐＮＯＸ２の造成及び該プラスミド
によるエシェリヒア・コリの形質転換 プラスミドｐＢＲ３２２１μｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩ
及びＢａｍＨＩ（各１　ｕｎｉｔ）を用いる３０℃で１
時間反応させ切断して得た分解物溶液に、前記Ａ）項で
調製した３、６ｋｂのＤＮＡ断片（Ｎ領域）１μｇを混
合し、最終濃度で各々５０ｍＭ、Ｉ　ＯｍＭ、］　ｍＭ
Ｓ　１　ｍＭ、Ｉ　ＯｍＭ、］ｕｎｉｔとなるようにト
リス緩衝液（ｐＨ７，６）、ジチオスライトール、ＡＴ
Ｐ、ＭｇＣ１２、Ｔ４リガーゼを添加し、１６°Ｃで１
５時間反応させ結合した。

この溶液を用い、常法［Ｍ　、　Ｍａｎｄｅｌ、　Ａ　
。

Ｈｉｇａ、　Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｎ、　ｖｏｌ
　５３、ｐ１５９（１９７０）参照］に従ってエシェリ
ヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　
ＨＢ　Ｉ　Ｏ１株を形質添加し、Ｌ培地（トリプトン１
０ｇ１酵母エキス５ｇ。

ＮａＣ１５ｇ、グルコースＩｇ及び蒸留水１ａ、ｐＨ７
，２）にアンピシリンを５０μｇ／ｍＩ２濃度に添加し
、１．５％寒天で固化させた培地に塗抹し、３０°Ｃで
２０時間培養し、コロニーを形成させた。培地上にニト
ロセルロースメンプランを置き、４２°Ｃで３時間熱誘
導をかけた。メンブランフィルタ−上のコロニーを溶菌
さゼ、牛血清アルブミンでメンプランの非特異的結合を
ブロックした後、精製したＮＡＤＨオキシダーセでウサ
ギを免疫して調製した抗ＮＡＤＨオキシダーゼ抗体を一
次抗体としてイムノスクリーニングを行った。更に、上
記メンプランを、ｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈパーオキシ
ダーゼを結合させたａｎｔｉ　−ｒａｂｂｉｔ　　Ｉ　
ｇＧで処理したのち、過酸化水素−３，３−ジアミノベ
ンデイン系または過酸化水素−４−クロロｌ−ナフトー
ル系で発色させて、目的のコロニを選択した。形質転換
株は５ＸｌＯ−５の割合で取得できた。

得られた５株をＬ培地で３０°Ｃｌ２Ｏ時間培養し、遠
心分離（１２，００Ｏｒｐｍ、２０分間）により集菌し
た。該菌体１ｇを２ｍ＋２のトリス緩衝液（ｐＨ７，８
）に懸濁後、超音波破砕、遠心分離により残渣を除いた
無細菌抽出液について、酸素電極（Ｙｅｌｌｏｗ　　Ｓ
ｐｒｉｎｇｓ　　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）を用いて
Ｎ　Ｄ　Ａ　Ｈ酸化時の酸素吸収の最も大きな菌株を選
択した。この株より、アルカリ−３ＤＳ法［Ｔ　、　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ　、　Ｆ　、　Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ
、　Ｊ　。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１
ｏｎｉｎｆ”　　（１９８２）ｐ９０〜９１参照）によ
りプラスミドを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲ１及びＢａｍ
ＨＩで切断し、分子量をアガロースゲル電気泳動により
調べたところ、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ
Ｉ切断部位に３．６ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されている
ことがわかった。このシラスミドをｐＮＯＸ２と命名し
た。また、このプラスミドｐＮＯＸ２で形質転換された
エシェリヒア・コリに一１２系菌株ＨＢｌｏｔ株をＮＹ
Ｏ２と命名した。このＮＹＯ２株は、茨城系つくば車乗
１丁目１番３号の工業技術院微生物工業技術研究所に、
受託番号：微工研条寄第２７４６号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−２７４６）として寄託されている。

実施例　３　：　ＮＡＤＨオキシダーゼの製造Ｍ９Ｓ培
地（５，８ｇ％Ｎａ２ＨＰＯい３ｇＫＨ２ＰＯ４，５ｇ
　　ＮａＣ＋、Ｉｇ　　ＮＨ４Ｃｌ。

ＩＱ蒸留水、０．５％グリセロール、０．５％カザミノ
酸及び４μｇ１ｍ１２チアミン塩酸）ｌｏｏｍＱを５０
０ｍ１２容三角フラスコに分注し、］２００Ｃで１５分
間滅菌処理した。この培地にアンピシリンを４０μｇ　
／　ｍ　Ｑ濃度に加え、実施例１で得たＮＹＯ１株及び
その親株である１Ｍ１０９株、実施例２で得たＮＹＯ２
株及びその親株であるＨＢＩＯＩ株を、それぞれ別途植
菌し、３０°Ｃで約１６時間培養を行った。これを１：
１００の希釈率で新鮮な培地１００ｍｆｆに植菌し、３
０℃で培養を続けた。ＮＹＯ１株の場合は、６５０ｎｍ
の吸光度がおよそ１．０に達したところで、ＩＰＴＧの
終濃度２ｍＭになるように添加して、ラクトースリプレ
ッサーによるＰ　ｔａｃの抑制を解除し、培養を継続し
た。約４時間後、遠心（１２，００Ｏｒｐｍ、２Ｑ分）
集菌し、集菌体を１ｍ（２のトリス緩衝液に懸濁し、超
音波破砕を行った。遠心（１２，ＯＯＯｒｐｍ、２０分
）により残液を除き、膜系に存在するエシェリヒア・コ
リのＮＡＤＨデヒドゲナーゼの影響を最小限にするため
１００．０００Ｘｇ、１時間の超遠心分離を行ない、そ
の上清を酵素液とした。

ＮＡＤＨオキシダーゼの活性測定は、次のようにして行
なった。すなわち、５０ｍｏ、リン酸カリウム緩衝液１
．９ｍ１２．上記の酵素液０．０５ｍ１２からなる反応
液を指定する温度にて予め保持した後、５ｍＭ　　ＮＡ
ＤＨｏ、０５ｍ４を加え反応を開始し、３４０ｎｍにお
ける吸光の減少を測定した。酵素活性は１分間にｌｐｍ
ｏｌのＮＡＤＨを酸化する酵素量を１単位とした。

上記で得た酵素液につき、３７°Ｃにて活性を測定した
結果を下記表５に示す。対照として、ＮＡＤＨオキシダ
ーゼ遺伝子の供給源である好アルカリ性通性嫌気性細菌
Ｅｐ０１株ＦＥＲＭ　　ＢＰ２７４４を実施例１のＡ）
項に記載の方法で培養し、同様に調製した酵素液の活性
も併せて示す。

表５ 表５に示すように、本発明のプラスミドで形質転換した
菌株（ＮＹＯＩ及びＮＹＯ２）を用いれば、遺伝子の供
給源である親株（ＥｐＯＩ）と比較して、各々４倍及び
２０倍以上のＮ　Ａ　Ｄ　Ｈオキシダーゼ比活性が上が
ると同時に、本発明のプラスミドはエシェリヒア・コリ
に一１２系菌株の中で効率よ＜ＮＡＤＨオキシダーゼを
発現できることが明らかとなった。

（１００，０００Ｘｇ、１時間の超遠心分離上清液）を
用いて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（エシェリヒア・コ
リより、Ｔｏｋｕｓｈｉｇｅ　　ｅｔ　ａｌ、　　Ｊ　
。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　７３．１６９−１８０．１９７３
の方法に従って精製）と共役反応を行ない、Ｌ−リンゴ
酸を基質としてピルビン酸を製造した。

反応液［２００ｍＭ　　Ｌ−リンゴ酸、１ｍＭ塩化マン
ガン、５０μＭ　　ＮＡＤ”、２．５単位／ｍ（ｌ　リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼ、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
８，５）含有］に、上記のＮＡＤＨオキシダーゼ酵素液
を、酵素液由来の蛋白濃度が２ｍｇ／ｍｆｆ反応液とな
るように添加し、３７°Ｃで４時間反応させた。反応後
、ピルビン酸及びコハク酸生成量を高速液体クロマトグ
ラフィーにて定量した。その結果を表６に示した。

なお、対照として、ＮＡＤＨオキシダーセ活性を有する
プレヒハクテリウム・フラバム（Ｂ　ｒｅｖｉｂ７ｅｒ
ｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）　ＭＪ　２３３　　（ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−１４９７）、ロイコノオスドック・メセン
テロイデス（Ｌ　ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　　ｍｅｓｅｎ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ　　Ａ　Ｔｃｃ８０４２）及びＮＡＤ
Ｈオキシダーゼ遺伝子の供給源であるＥｐＯｌ　（ＦＥ
ＲＭ　　Ｐ−１００９６）株菌体を、それぞれ生育培地
にて培養後向様に調製した酵素液によるピルビン酸及び
コハク酸の生成量も同様に測定した。但し、ブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ２３３の場合、１００゜０００
　×ｇ　Ｎ　　］時間の超遠心分離を行なった沈殿部分
にＮＡＤＨオキシダーゼ活性を有していたため、この沈
殿画分を酵素液とした。

第２図 表６に示すように、本発明のＮＹＯＩ及びＮＹＯ２株由
来のＮ　Ａ　Ｄ　Ｈオキシダーゼを用いれば、フマル酸
副生もなく、高収率で効率的に、Ｌ　−ＩＪンゴ酸から
ピルビン酸を生産できることか判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明により得られるＮＡＤＨオキシダーゼ
構造遺伝子を含む長さが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片の制
限酵素切断地図であり、第２図は、本発明により得られ
るプラスミドｐＮＯＸ　ｌの制限酵素切断地図であり、
第３図は、本発明により得られるＮＡＤＨオキシダーゼ
構造遺伝子を含む長さ約３．６ｋｂ１７）ＤＮＡ断片の
制限酵素切断地図であり、 第４図は、本発明により得られるプラスミドｐＮＯＸ２
の制限酵素切断地図であり、 第５図は本発明により得られるＮＡＤＨオキシダーゼの
至適ｐＨを示すグラフであり、第６図は本発明により得
られるＮＡＤＨオキシダーゼの至適温度を示ずグラフで
ある。 ２ 第３図 第４図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ＮＡＤ＾＋を補酵素とする脱水素酸素とＮＡＤＨオ
   キシダーゼの共存下に基質を脱水素する方法において、
   アルカリ性領域に至適生育ｐＨを有する通性嫌気性のＮ
   ＡＤＨオキシダーゼ生産菌の培養物又はそのＮＡＤＨオ
   キシダーゼ含有処理物をＮＡＤＨオキシダーゼとして用
   いることを特徴とする方法。