JPH03264536A - アンギオテンシン変換酵素阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、下記構造を有するペプチドを有効成分とする
アンギオテンシン変換酵素阻害剤に関する。

Ｐｒｏ−Ａｌａ　−Ｇｉｎ　−Ｌｙｓ ［従来の技術］ アンギオテンシン変換酵素は、主として肺や血管内皮細
胞、腎近位尿細管に存在し、アンギオテンンンＩ（Ａｓ
ｐ　−Ａｒｇ　−Ｖａｌ　−Ｔｙｒ−１ｉｅ　−Ｈｉｓ
　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ）に作用し
て、アンギオテンソンＩのＣ末端よりジペプチド（Ｈｉ
ｓ９−Ｌｅｕ”）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有
するアンギオテンシン■を生成させる酵素である。また
、この酵素は生体内降圧物質であるプラジキニンを破壊
し不活化する作用も併有し、昇圧系に強力に関与してい
る。

従来より、アンギオテンシン変換酵素の活性を阻害すれ
ば、降圧に働き、臨床的には高血圧症の予防、治療に有
効であると考えられている。

最近ではプロリン誘導体であるカプトプリルが合成され
、降圧活性が確認されて以来、種々のアンギオテンンン
変換酵素阻害物質の合成研究が盛んであり、又天然物か
らの取得も試みられているところである。

天然物由来のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は食品あ
るいは食品原料から得られるので低毒性で安全性の高い
降圧剤となることが期待されるからである。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、天然物中に見出されるアンギオテンシン
変換酵素阻害物質は極めてまれで、僅かにブラジル産や
日本産蛇毒より得られたテプロタイド（ノナペプチド５
Ｑ２０８８１）等や、ストレプトミセス属に属する放線
菌の代謝産物ＴＳ８３　（特開昭５８−１７７９２０号
公報）が知られているに過ぎない。また、天然物を酵素
処理して得られたアンギオテンンン変換酵素阻害物質と
しては、牛乳カゼインをトリプトンンにより分解して得
たペプチド類が知られているに過ぎず（特開１＠５８−
１０９４２５号、同５９−４４．３２３号、同５９−４
４３２４号、同６１−３６２２６号、同６１−３６２２
７号）新規な阻害物質の開発が望まれているところであ
る。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる課題を解決すべく天然物質で副作
用の少ないアンギオテンンン変換酵素阻害物質を鋭意探
索した結果、カッオブンの熱水抽出物中にアンギオテン
ンン変換酵素阻害活性を有する物質の存在をつきとめ、
該物質がＰｒｏ　−Ａｈａ　−Ｇｌｎ　−Ｌｙｓを骨格
とするペプチドであることを知見し、更に該物質は動物
の組織中に含有されるクレアチンカイネース由来である
ことを見出し本発明を完成した。

本発明のＰｒｏ　−Ａｌａ　−Ｇｌｎ　−Ｌｙｓを骨格
とするペプチドはカツオブシやクレアチンカイネース分
解物などの天然物から単離精製することにより、あるい
はペプチド合成の常套手段を適用して合成することによ
って製造することができる。

」二足でいうＰｒｏはプロリン、Ａｌａはアラニン、Ｇ
ｌｎはグルタミン、Ｌｙｓはリジンを意味し、かかるア
ミノ酸はいずれもし一体である。

カツオブン等の天然物から本発明のペプチドを取得する
には、熱水による抽出が行われる。

具体的にはカツオブンを水に混合し、強力な撹拌下で沸
騰させる。得られる煮汁を冷却後、遠心分離等の公知の
操作で濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを適用し
た後、あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤に対す
る吸着親和性の差、種々の溶剤に封する溶解性あるいは
溶解度の差、２種の混ざり合わない液相間における分配
の差、分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液からの
析出性あるいは析出速度の差などを利用する手段を適用
して目的物を単離するのが好ましい。これらの方法は必
要に応じて単独に用いられ、あるいは任意の順序に組合
せ、また反覆して適用される。

本発明のペプチドはペプチド合成に通常用いられる方法
、即ち液相法または固相法でペプチド結合の任意の位置
で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応
性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメント
に相当する反応性アミノ基を有する原料とをカルボジイ
ミド法、活性エステル法等を用いて縮合させ、生成する
縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去させる
ことによっても製造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は
、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては
、例えばベンジルオキシアルボニル、ｔ−ブチルオキシ
カルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボ
ニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル等が挙
げられる。カルボキシル基の保護基としては例えばアル
キルエステル、ベンジルエステル等を形威し得る基が挙
げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基
はクロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキ
シベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。

縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にある
いはＮ〜保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性
エステルを用いて実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合
はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。

更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される
。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等
が挙げられる。

本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口投
与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口
投与が好ましい。本発明のペプチドの投与量は、化合物
の種類、投与方法、患者の症状・年令等により異なるが
、通常１回０．００１−１０００ｍｇ、好ましくは０．
０１−１０ｍｇを１日当たり１〜３回である。本発明の
ペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の
形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野におい
て常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が
用いられる。具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マン
ニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン
、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ
酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセ
ルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロー
ス、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシブロビルセル
ロー一 ス、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニル
ピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、
ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベン
トナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エ
ステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸
グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラヂン
、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動
パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオ
ン界面活性剤、プロピレングリコール、水等が挙げられ
る。

剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロ
ップ剤、懸濁剤、単剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼
付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は
常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用
崎、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であっ
てもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティン
グしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを
水ζこ溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩
水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝
剤や保存剤を添加してもよい。

これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％以上、
好ましくは０．５〜７０％の割合で含有することができ
る。これらの製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含
有していてもよい。

［作　　用］ 本発明のペプチドは、優れたアンギオテンノン変換酵素
阻害作用を有し、血圧降下作用、プラジキニン不活化抑
制作用を示し、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血
圧などの高血圧症の予防、治療剤、これらの疾患の診断
剤や各種の病態において用いられる血圧降下剤、狭心病
発作の閾値上昇、心筋梗塞の減少、うっ血性心不全にお
ける病態の改善剤として有用である。

［実施例］ 次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

〔ペプチドの抽出〕

カツオブシ５２に水４．５ｍｌを加え、ホモジナイズし
、フラスコに入れて、沸騰水浴中に１０分間放置した。

冷却後遠心分離し、上澄液をＳｅｐ　−ｐａｋカートリ
ッジ（Ｃ１８）に注入し、溶出した両分を濃縮し、高速
液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ、ＣＮカラム）により
精製し、阻害層性両分を得た。

氷晶を気相プロテインシーケンザー（アプライド　バイ
オシステムズ社製　４７０　Ａ型）を用いる自動エドマ
ン分解法を適用してアミノ酸配列を分析し、下記の構造
を得た。

１１−　Ａｓｐ　−Ｍｅｔ　−１１ｅ　−Ｐｒｏ　−Ａ
ｌａ　−Ｇｌｎ　−Ｌｙｓ　−ＯＨプロティンデーター
バンクによるホモジナイズの結果、本ペプチドは筋肉ク
レアチンカイネースのＣ末端に一致した。

〔ペプチドの合成〕

市販のＢｏｃ　（ブトキシカルボニル）−Ｌｙｓ（クロ
ロベンジルオキシカルボニルで保護）　−０−Ｒｅｓｉ
ｎ　〔ベンジル樹脂（置換率０．３２ｍｅｑ／９）　）
　０．９４ｙをバイオザーチ社のペプチド合成装置ＳＡ
Ｍ２の反応槽に分取し、以下のように合成を行った。

４５％トリフルオロ酢酸、２．５％アニソール及び２％
の１．２−エタンジヂオールを含む塩化メチレン中、２
５分間の反応により、Ｂｏａ基を除去したのち、塩化メ
チレン？こよる洗浄、１０％ジイソプロピルエチルアミ
ンを含む塩化メヂレンによる中和、及び塩化メチレンに
よる洗浄を行った。

これと５ｍｌの０　、４　Ｍ　Ｂｏａ　−Ｇｌｎ　（グ
ルタミン）　−ｏＢｚ（ベンジルエステル）のジメヂル
ホルムアミド溶液、５ｍｌの０．６Ｍジイソプロピルカ
ルボジイミドの塩化メヂレン溶液とを混合した後、反応
槽に加え、室温にて２時間撹拌反応させた。

得られた樹脂をジメヂルホルムアミド、塩化メチレン、
１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メヂレン
、塩化メチレン更に塩化メチレン及びジメヂルホルムア
ミドとの混合液で洗浄し、Ｂｏａ　−Ｇｌｎ　−Ｌｙｓ
−樹脂を得た。

引き続き同様のＢｏａ基の除去、Ｂｏｃとアミノ酸のカ
ップリングを繰り返しＡｓｐ（ｏＢｚｌ）　−Ｍｅｔ　
−１１ｅ　−Ｐｒｏ　−Ａｌａ　−ＧｌｎＬｙｓ（ＣＩ
−ｚ）−樹脂を得た。

該樹脂を２０ｍ１の１０％アニソールを含むフッ化水素
中で０℃、１時間撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離させ
た。フッ化水素を減圧留去し、残渣を３０％酢酸で抽出
し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラ
ム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　　５　Ｃ／　１８　）による逆
相クロマトグラフィーｌこより精製し、Ｈ−Ａｓｐ−Ｍ
ｅｔ−口ｅ　−Ｐｒｏ　−Ａｌａ　−Ｇｌｎ　−Ｌｙｓ
−ＯＨ（収量＋６０ｍｙ）を得た。

氷晶を前記と同一のプロテインシーケンザーにより分析
０ した結果、上記の組成であることが判明した。

又、目的とするペプチドのアミノ酸種に応じて反応薬剤
を変更した以外は上記の合成例に準じて第１表に示す各
種のペプチドを合成した。

実施例１〜７ （アンギオテンンン変換酵素阻害活性の測定）アンギオ
テンシン変換酵素阻害活性の測定は、ＣｈｅｕｎｇとＣ
ｕｓｈｍａｎの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａ
ｒａｍａｃｏｌｏｇｙ　２０１６３７（１９７１）’］
に準じて以下の方法で行った。

酵素基質；Ｂｚ（ベンノル）　−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅ
ｕ（８６畔を水８ｍｌとリン酸緩衝液８ｍｌに溶解した
溶液） 酵　素、うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製）
（Ｉｙを５０ｍモルのリン酸緩衝液１０ｍ１中で粉砕し
た後、遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を１００μｇ、酵素溶液を１２μＱ及び
本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を２５
０μＱとした後、３７℃で３０分間反応を行った。

反応はｌＮ−ＨＣｌ　　２５０μＱを用いて終了させた
。

反応終了肢に酢酸エチル１．５ｍｌを入れＶ　ｏｒｔｅ
ｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。

酢酸エチル層から１．Ｏｍｌをとり出して、酢酸エチル
を留去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し
、抽出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（ＯＤ　
２２＋１）を測定した。

阻害率は阻害剤なしで反応したときのＯＤ２．ａを１０
０％とし、反応時間０分のときの○Ｄ２２８を０％とし
て求め阻害率５０％の時の阻害剤（本発明のペプチド）
の濃度■Ｃ３ｏ（μＭ）で活性を表示した。

結果を第１表に示す。

又、参考例として本発明以外の阻害剤についても測定を
行ったので、第１表に合わせて示す。

】１ ２ 第１表 手続補正書 平成３年２月８日 １、事件の表示 平成２年特許願第６１７８８号 ２、発明の名称 アンギオテンシン変換酵素阻害剤 （注）　Ａｓｐ １ｅ １ａ Ｌｙｓ； アスパラギン酸、 イソロイシン、 アラニン、 リジン Ｎｅｔ・メチオニン Ｐｒｏ・プロリン Ｇｌｎ　　グルタミン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記のペプチド Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ を有効成分とするアンギオテンシン変換酵素阻害剤