JPH03247279A - Ｈｉｎｃ２制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法 - Google Patents
Ｈｉｎｃ２制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、遺伝子工学試薬として有用な制限酵素及び修
飾酵素に関し、更に詳細には１（１ｎｃ ＩＩｎ制限酵
素びＨｉｎｃ ＩＩＩ飾酵素及びその製造方法に関する
。
飾酵素に関し、更に詳細には１（１ｎｃ ＩＩｎ制限酵
素びＨｉｎｃ ＩＩＩ飾酵素及びその製造方法に関する
。
Ｈｌｎｃ ｎ制限・修飾酵素は、１９７０年にヘモフィ
ラス インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆ
ｌｕｅｎｚａｓ ）より単離され、その生化学的研究が
なされてきた。Ｈｌｎｃ ＩＩ制制限体修飾系酵素、Ｄ
ＮＡを切断する活性を有するＨｌｎａ ｎ制限酵素とＨ
ｌｎｃ ＩＩｎ制限酵素よる切断よりＤＮＡを保護する
修飾酵素により構成される。Ｈｌｎｃ ｎ制限酵素は、
典型的■型制限酵素であり、ＤＮＡ塩基配列中二回転対
称構造の６塩基からなる配列（５’ ＧＴＰｙＰｕＡＯ
３’ ）を認識し、その認識配列のｐｙとＰｕの間の位
置を、平滑末端を生成するように切断する酵素である。
ラス インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆ
ｌｕｅｎｚａｓ ）より単離され、その生化学的研究が
なされてきた。Ｈｌｎｃ ＩＩ制制限体修飾系酵素、Ｄ
ＮＡを切断する活性を有するＨｌｎａ ｎ制限酵素とＨ
ｌｎｃ ＩＩｎ制限酵素よる切断よりＤＮＡを保護する
修飾酵素により構成される。Ｈｌｎｃ ｎ制限酵素は、
典型的■型制限酵素であり、ＤＮＡ塩基配列中二回転対
称構造の６塩基からなる配列（５’ ＧＴＰｙＰｕＡＯ
３’ ）を認識し、その認識配列のｐｙとＰｕの間の位
置を、平滑末端を生成するように切断する酵素である。
一方、Ｈｌｎｃ ＩＩＩ飾酵素は、Ｈｌｎｃ ｎ制限酵
素の上記認識配列をメチル化することによりＨｌｎｃ
ＩＩｎ制限酵素よる切断を保護する機能を有する酵素で
あるが、今までにその酵素化学的性質は明らかにされて
いない。
素の上記認識配列をメチル化することによりＨｌｎｃ
ＩＩｎ制限酵素よる切断を保護する機能を有する酵素で
あるが、今までにその酵素化学的性質は明らかにされて
いない。
従来から知られているＨｌｎｃ ＩＩ制＠酵素の製造方
法としては、ランデイ（Ｌａｎｄ７ ）らの方法があり
、フンデイらは、ヘモフィラス インフルエンザＲｅ株
（以下、Ｈ１ｎｃＩＩ菌と略記する）より回収する方法
を確立している。当該方法は、ジヤーナル オプ モレ
キュツー バイオロジー（、Ｔｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）第５１巻、第３７
０頁（１９７０年）に記載されている。
法としては、ランデイ（Ｌａｎｄ７ ）らの方法があり
、フンデイらは、ヘモフィラス インフルエンザＲｅ株
（以下、Ｈ１ｎｃＩＩ菌と略記する）より回収する方法
を確立している。当該方法は、ジヤーナル オプ モレ
キュツー バイオロジー（、Ｔｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）第５１巻、第３７
０頁（１９７０年）に記載されている。
Ｈｌｎｃ Ｉｆ修飾酵素の製造方法については、いまだ
詳細な確立した方法の報告はない。
詳細な確立した方法の報告はない。
しかしながら、Ｈｌｎｃｌ［菌より得られるＭｉｎｅ
ｌｌ制限酵素、修飾酵素の含量は少なく、また操作も煩
雑であり、両酵素を大量に得ることは困難であった。一
方、これら遺伝子の単離及び当該遺伝子を種々のベクタ
ーに結合してクローニングする方法についてはいまだ明
らかにされていない。
ｌｌ制限酵素、修飾酵素の含量は少なく、また操作も煩
雑であり、両酵素を大量に得ることは困難であった。一
方、これら遺伝子の単離及び当該遺伝子を種々のベクタ
ーに結合してクローニングする方法についてはいまだ明
らかにされていない。
本発明の目的は、Ｈｌｎｃ ｌｌ制限酵素及び／又は修
飾酵素の工業的製造に適したＨｌｎｃ ＩＩ制限１１修
飾系遺伝子を含むプラスミドを導入した新規微生物、特
に大腸菌の創製及びそれを用いたＨｌｎｃ ｌｌ制限酵
素及び／又は修飾酵素の製造方法を提供することにある
。
飾酵素の工業的製造に適したＨｌｎｃ ＩＩ制限１１修
飾系遺伝子を含むプラスミドを導入した新規微生物、特
に大腸菌の創製及びそれを用いたＨｌｎｃ ｌｌ制限酵
素及び／又は修飾酵素の製造方法を提供することにある
。
（！１ｆｆｌを解決するための手段〕
本発明を概説すれば、本発明の第一の発明は遺伝子組換
え体により生産される純化されたＨｌｎｃ ｌｌ制限酵
素に関し、また本発明の第２の発明はＨｌｎｃ Ｉｆ制
限の修飾系酵素遺伝子に関する。
え体により生産される純化されたＨｌｎｃ ｌｌ制限酵
素に関し、また本発明の第２の発明はＨｌｎｃ Ｉｆ制
限の修飾系酵素遺伝子に関する。
さらに本発明の第３の発明はＨｌｎｃ ｎ制限酵素及び
／又は修飾酵素の製造方法に関する発明であって、Ｈｌ
ｎｃ ＩＩ制限・修飾系酵素遺伝子が組込まれたプラス
ミドを保有する微生物を培養し培養物よりＨｌｎｃ ｌ
ｌ制限酵素及び／又は修飾酵素を採取することを特徴と
する。
／又は修飾酵素の製造方法に関する発明であって、Ｈｌ
ｎｃ ＩＩ制限・修飾系酵素遺伝子が組込まれたプラス
ミドを保有する微生物を培養し培養物よりＨｌｎｃ ｌ
ｌ制限酵素及び／又は修飾酵素を採取することを特徴と
する。
Ｈｌｎｃ ｎ制限・修飾酵素遺伝子にはＤＮＡを切断す
る活性を有するＨｌｎａ ｌｌ制限酵素をコードする遺
伝子と、Ｈ１ｎｃＩＩ制限酵素による切断よりＤＮＡを
保護する修飾酵素をコードする遺伝子を含んでいる。
る活性を有するＨｌｎａ ｌｌ制限酵素をコードする遺
伝子と、Ｈ１ｎｃＩＩ制限酵素による切断よりＤＮＡを
保護する修飾酵素をコードする遺伝子を含んでいる。
なお、本明ｍ書において、制限・修飾系酵素遺伝子とは
、制限及び修飾の両酵素遺伝子をもつ遺伝子とその各個
別の遺伝子との両者を統合した意味の用語である。換言
すれば、制限及び／又は修飾酵素遺伝子を意味する。こ
れら遺伝子は、単独あるいは複合体の形で利用できる。
、制限及び修飾の両酵素遺伝子をもつ遺伝子とその各個
別の遺伝子との両者を統合した意味の用語である。換言
すれば、制限及び／又は修飾酵素遺伝子を意味する。こ
れら遺伝子は、単独あるいは複合体の形で利用できる。
また、上記の両遺伝子を組込んだプラスミドを用いる場
合、そのプラスミドは、両遺伝子を同一のプラスミドに
組込んだものでも、あるいは両遺伝子を各別に複数のプ
ラスミドに組込んだもののいずれであってもよい。
合、そのプラスミドは、両遺伝子を同一のプラスミドに
組込んだものでも、あるいは両遺伝子を各別に複数のプ
ラスミドに組込んだもののいずれであってもよい。
本発明者らは、Ｍｉｎｅ菌よりＨｌｎａ Ｉｆ制限・修
飾酵素遺伝子全領域を含む２．３ｋｂＤＮＡをクローニ
ングすることに成功し、更にこのＤＮＡ断片全体あるい
は一部が同一または別個のプラスミドに組み込まれたプ
ラスミドを導入した微生物、著に大腸菌を培養すること
により菌体中に著量のＨｌｎｃ ｎ制限酵素及び／ある
いは修飾酵素が高濃度で蓄積することを見出し、本発明
を完成した。
飾酵素遺伝子全領域を含む２．３ｋｂＤＮＡをクローニ
ングすることに成功し、更にこのＤＮＡ断片全体あるい
は一部が同一または別個のプラスミドに組み込まれたプ
ラスミドを導入した微生物、著に大腸菌を培養すること
により菌体中に著量のＨｌｎｃ ｎ制限酵素及び／ある
いは修飾酵素が高濃度で蓄積することを見出し、本発明
を完成した。
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明に係る新規微生物、例えば大腸菌は次に例示する
工程により得ることができる。
工程により得ることができる。
１） ＤＮＡ供与体であるＨｌｎｃ Ｉｆ生産菌から染
色体ＤＮＡを抽出し、制限酵素で部分的に切断し、ＤＮ
Ａ断片を回収する。
色体ＤＮＡを抽出し、制限酵素で部分的に切断し、ＤＮ
Ａ断片を回収する。
２）プラスミドベクターを制限酵素で開裂し、この開裂
部位に１）で得られたＤＮＡ断片を結合させる。
部位に１）で得られたＤＮＡ断片を結合させる。
３）２）で得られたＤＮＡを大腸菌宿主に導入し、形質
転換体を得、目的のＤＮＡを含有するフィプラリーを形
成し、対応する修飾酵素遺伝子を含有するクローンを単
離する。
転換体を得、目的のＤＮＡを含有するフィプラリーを形
成し、対応する修飾酵素遺伝子を含有するクローンを単
離する。
４）制限酵素遺伝子は細胞染色体内のその対応する修飾
メチフーゼ遺伝子の近傍に存在し、二つの遺伝子は、ク
ローニング実験中は一緒に結合して残っていることが推
定される。そこで、３）で得られたクローンの制限酵素
活性を解析し、制限・修飾系遺伝子が同時に組み込まれ
たクローンを選択する。
メチフーゼ遺伝子の近傍に存在し、二つの遺伝子は、ク
ローニング実験中は一緒に結合して残っていることが推
定される。そこで、３）で得られたクローンの制限酵素
活性を解析し、制限・修飾系遺伝子が同時に組み込まれ
たクローンを選択する。
■しかしながら、両遺伝子が同時に組み込まれているク
ローンが選択できない場合、修飾メチフーゼ遺伝子を含
むクローンのＤＮＡ断片を調製し、これをプローブに、
染色体ＤＮＡの制限酵素分解物とハイブリダイゼーショ
ンを行い、両遺伝子の組み込まれたＤＮＡ断片を選択す
る。なおこの際、制限酵素タンパクのアミノ酸配列の一
部が明らかであれば、修飾メチフーゼ遺伝子の上流かあ
るいは下流のどちらかに制限酵素遺伝子が存在するか明
らかになる。
ローンが選択できない場合、修飾メチフーゼ遺伝子を含
むクローンのＤＮＡ断片を調製し、これをプローブに、
染色体ＤＮＡの制限酵素分解物とハイブリダイゼーショ
ンを行い、両遺伝子の組み込まれたＤＮＡ断片を選択す
る。なおこの際、制限酵素タンパクのアミノ酸配列の一
部が明らかであれば、修飾メチフーゼ遺伝子の上流かあ
るいは下流のどちらかに制限酵素遺伝子が存在するか明
らかになる。
６）５）で得たＤＮＡ断片より、制限酵素遺伝子を含む
ＤＮＡ断片及び修飾酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製
し、それぞれ独立の複製開始点及び抗性物質耐性遺伝子
を持つプラスミドに結合させ、宿主に同時に導入し、形
質転換体を得る。
ＤＮＡ断片及び修飾酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製
し、それぞれ独立の複製開始点及び抗性物質耐性遺伝子
を持つプラスミドに結合させ、宿主に同時に導入し、形
質転換体を得る。
上記ＤＮＡ供与体であるＨ１ｎｃ菌ＤＮＡは培養液より
菌体を回収し、それより抽出する。抽出、精製、制限酵
素による切断等は、公知の方法を用いることができ、そ
の詳細は、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ ）ほか著、プロセ
デュアス イン ヌクレイツク アシツズ リサーチ（
ｐｒｏｃｅａｕｒｅｓｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）第５３５頁、ハーバ−アンド
ロー（Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ）出版（１９６
６年）及びカレントプロトコールに記載されている。
菌体を回収し、それより抽出する。抽出、精製、制限酵
素による切断等は、公知の方法を用いることができ、そ
の詳細は、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ ）ほか著、プロセ
デュアス イン ヌクレイツク アシツズ リサーチ（
ｐｒｏｃｅａｕｒｅｓｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）第５３５頁、ハーバ−アンド
ロー（Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ）出版（１９６
６年）及びカレントプロトコールに記載されている。
一方、プラスミドベクターの開裂も同様の方法で行うこ
とができる。プラスミドベクターとしては公知のものが
使用できるが、例えばＰＥＲ３２２、ｐＡ（！ＹＣ１８
４などが挙げられる。
とができる。プラスミドベクターとしては公知のものが
使用できるが、例えばＰＥＲ３２２、ｐＡ（！ＹＣ１８
４などが挙げられる。
次にＤＮＡ ！Ｊガーゼを用いてベクターＤＮＡの開裂
部位に上述のＤＮＡ断片を組み込ませるが、その手段は
公知の方法によるものであり、ベクター ＤＮＡの種類
及び制限酵素の種類に応じて適当な反応条件が選択され
る。
部位に上述のＤＮＡ断片を組み込ませるが、その手段は
公知の方法によるものであり、ベクター ＤＮＡの種類
及び制限酵素の種類に応じて適当な反応条件が選択され
る。
次いで、染色体ＤＮＡ断片を組込んだプラスミドを微生
物、特に大腸菌宿主に導入するが、その方法としては例
えばジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｌｏｌｏ
ｇｙ）第１６６巻、第５５７頁（１９８３年）に記載さ
れているハナハン（Ｈａｎａｈａｎ ）の方法がある。
物、特に大腸菌宿主に導入するが、その方法としては例
えばジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｌｏｌｏ
ｇｙ）第１６６巻、第５５７頁（１９８３年）に記載さ
れているハナハン（Ｈａｎａｈａｎ ）の方法がある。
この様にして、目的のＤＮＡ断片を宿主に導入させ、プ
ラスミドベクターの特性、例えばｐＥＲ３２２のＢａｍ
ＨＩ部位にクローニングする場合にはアンピシリン耐性
コロニーを選択することによりプラスミドライブフリー
を作成することができる。
ラスミドベクターの特性、例えばｐＥＲ３２２のＢａｍ
ＨＩ部位にクローニングする場合にはアンピシリン耐性
コロニーを選択することによりプラスミドライブフリー
を作成することができる。
こうして得られたＨ１ｎｃ菌染色体ＤＮＡのライブラリ
ーから、目的とする制限・修飾系酵素遺伝子を組込んだ
クローンの選択は以下のように公知の方法を用いて行う
。すなわち修飾酵素遺伝子に対応する制限酵素遺伝子の
認識配列中の（もしそのような配列がクローン中に存在
するとすれば）それら自身のＤＮＡメチル化するであろ
う修飾遺伝子をクローンが含有している事実を利用する
。そのようなりローンは、それ故対応する制限酵素によ
るイン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ）での消化に抵抗
するであろう。それ故、これらクローンの制限酵素消化
によりメチラーゼをコードしたクローンが選択的に残存
するであろう。
ーから、目的とする制限・修飾系酵素遺伝子を組込んだ
クローンの選択は以下のように公知の方法を用いて行う
。すなわち修飾酵素遺伝子に対応する制限酵素遺伝子の
認識配列中の（もしそのような配列がクローン中に存在
するとすれば）それら自身のＤＮＡメチル化するであろ
う修飾遺伝子をクローンが含有している事実を利用する
。そのようなりローンは、それ故対応する制限酵素によ
るイン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ）での消化に抵抗
するであろう。それ故、これらクローンの制限酵素消化
によりメチラーゼをコードしたクローンが選択的に残存
するであろう。
染色体ＤＮＡのライブラリーよりプラスミドを調製し、
Ｈｌｎｃ ｎ制限酵素で消化し、消化されたＤＮＡで大
臆菌を形質転換し、抗生物質プレートでの培養により再
び形質転換コロニーを得る。
Ｈｌｎｃ ｎ制限酵素で消化し、消化されたＤＮＡで大
臆菌を形質転換し、抗生物質プレートでの培養により再
び形質転換コロニーを得る。
これらのコロニーのいくつかを選びとり、そのＤＮＡを
修飾及び／又は制限酵素遺伝子の存在について分析する
。この様にして解析した結果、修飾酵素遺伝子を組込ん
だグラスミド（ｐＡＨＩ）を得た。これを解析した結果
、このプラスミド上の１，５ｋｂの領域に修飾酵素遺伝
子がコードされることを明らかにした。この１．５ｋｂ
の全塩基配列を解析した結果、本発明者らが明らかにし
ｆ： Ｈｌｎｃ ＩＩｎ制限酵素Ｎ末アミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列と一致する部分が認められ、このプ
ラスミドには、Ｈｌｎｃ ＩＩ修飾酵素遭伝子及び制限
酵素遺伝子の一部がコードされることが明らかとなった
。そこで、この制限酵素遺伝子の一部をプローブにし、
Ｈ１ｎｃ菌染色体ＤＮＡを制限酵素で完全に分解し、サ
ザンハイプリダイゼーション（５ｏｕｔｈｅｒｎ Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行い、両遺伝子がコードさ
れるであろう大きさのＤＮＡ断片３、Ｏｋｂを調製した
。なお、サザンハイプリダイゼーションの詳細はモレキ
ュラー クローニング ア ラボラトリ−マニュアＡ／
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）第３８２〜３８９頁、
コールド スゲリング ハーバーヲボフトリー（Ｃｏ１
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ出版（１９８２年）に記載されている。
修飾及び／又は制限酵素遺伝子の存在について分析する
。この様にして解析した結果、修飾酵素遺伝子を組込ん
だグラスミド（ｐＡＨＩ）を得た。これを解析した結果
、このプラスミド上の１，５ｋｂの領域に修飾酵素遺伝
子がコードされることを明らかにした。この１．５ｋｂ
の全塩基配列を解析した結果、本発明者らが明らかにし
ｆ： Ｈｌｎｃ ＩＩｎ制限酵素Ｎ末アミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列と一致する部分が認められ、このプ
ラスミドには、Ｈｌｎｃ ＩＩ修飾酵素遭伝子及び制限
酵素遺伝子の一部がコードされることが明らかとなった
。そこで、この制限酵素遺伝子の一部をプローブにし、
Ｈ１ｎｃ菌染色体ＤＮＡを制限酵素で完全に分解し、サ
ザンハイプリダイゼーション（５ｏｕｔｈｅｒｎ Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行い、両遺伝子がコードさ
れるであろう大きさのＤＮＡ断片３、Ｏｋｂを調製した
。なお、サザンハイプリダイゼーションの詳細はモレキ
ュラー クローニング ア ラボラトリ−マニュアＡ／
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）第３８２〜３８９頁、
コールド スゲリング ハーバーヲボフトリー（Ｃｏ１
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ出版（１９８２年）に記載されている。
このＤＮＡ断片を、ブフスミドベクターに組込み大腸菌
を形質転換した。ここで得られたグラスミドｐＡＨ２を
更に詳細に全塩基配列を解析した結果第１図に示すよう
な塩基配列が明らかになった。Ｈｌｎｅ ＩＩ修飾酵素
は第１図に示す塩基番号５１６−２０２４にコードされ
ており、またＨｌｎｃ ＩＦ制限酵素は同じ＜２０２１
−２７９７にコードされている。
を形質転換した。ここで得られたグラスミドｐＡＨ２を
更に詳細に全塩基配列を解析した結果第１図に示すよう
な塩基配列が明らかになった。Ｈｌｎｅ ＩＩ修飾酵素
は第１図に示す塩基番号５１６−２０２４にコードされ
ており、またＨｌｎｃ ＩＦ制限酵素は同じ＜２０２１
−２７９７にコードされている。
グラスミドに組み込まれたＨｌｎｃ Ｉｆ制限酵素遺伝
子を導入した大腸菌がＨｌｎｃ ＩＩ制限酵素タンパク
を生産しているか否かを調べる手段としては、次のよう
なイン ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ ）及び／又はイン ビ
トロの方法によることができる。インビボでの制限酵素
活性は、組換え体大腸菌にピルシフトファージを感染さ
せ、その感染効率を調べる。対照として組換え体プラス
ミドを保持しない宿主大腸菌を用いれば、制限＃素遺伝
子を組込んだグラスミドを保持する菌ではファージＤＮ
Ａがインビボで切断され、その感染効率は低下する。ビ
μレントファージとしては例えばラムダ ジーティ ラ
ムダ シー（λｇｔ、λＣ）を用いることができる。一
方、イン ビトロでの制限酵素活性は、試験するクロー
ンを培養しその培養物を破砕し超遠心分離を行い、残渣
を除去した上澄を用い、緩衝液（（１０ｍｈａ）リスＭ
ＣＩ （ｐＨ，７，５） −７！！ＩＭ ＭｇＣｆ富−
６ＱｍＭ ＮＩＬＣ！Ｉ！−７ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール−００１％ウシ血清アルブミン）〕中、３７°
Ｃで反応を行いアガロースゲル電気泳動により解析する
ことができる。
子を導入した大腸菌がＨｌｎｃ ＩＩ制限酵素タンパク
を生産しているか否かを調べる手段としては、次のよう
なイン ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ ）及び／又はイン ビ
トロの方法によることができる。インビボでの制限酵素
活性は、組換え体大腸菌にピルシフトファージを感染さ
せ、その感染効率を調べる。対照として組換え体プラス
ミドを保持しない宿主大腸菌を用いれば、制限＃素遺伝
子を組込んだグラスミドを保持する菌ではファージＤＮ
Ａがインビボで切断され、その感染効率は低下する。ビ
μレントファージとしては例えばラムダ ジーティ ラ
ムダ シー（λｇｔ、λＣ）を用いることができる。一
方、イン ビトロでの制限酵素活性は、試験するクロー
ンを培養しその培養物を破砕し超遠心分離を行い、残渣
を除去した上澄を用い、緩衝液（（１０ｍｈａ）リスＭ
ＣＩ （ｐＨ，７，５） −７！！ＩＭ ＭｇＣｆ富−
６ＱｍＭ ＮＩＬＣ！Ｉ！−７ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール−００１％ウシ血清アルブミン）〕中、３７°
Ｃで反応を行いアガロースゲル電気泳動により解析する
ことができる。
また、メチラーゼを生産しているか否かは、組換え体Ｄ
ＮＡがＨｌｎｃ ＩＩ制限酵素により切断されるか否か
を検定することにより解析できる。
ＮＡがＨｌｎｃ ＩＩ制限酵素により切断されるか否か
を検定することにより解析できる。
前述のプラスミドＴＩＡＨ２をもつ大腸菌は、Ｈｌｎｃ
ｎ制限酵素及び修飾酵素を発現したが、その発現量は
充分ではなく、その原因として０両遺伝子を含むベクタ
ーが発成ベクターでない、■Ｈ１ｎｃ ｎ修飾酵素遺伝
子の上流に回文構造をもち、発現が抑制されている、■
Ｈ１ｎｃ ＩＦ修飾酵素遺伝子と制限酵素遺伝子が３ｂ
ｐ重複し、Ｈｌｎｃ ＩＩ制限酵素の発現がフレームシ
フトにより行われるなどがある。そこで、高発現性の大
腸菌を得るには、ベクターを発現ベクターとし、Ｈ１ｎ
ｃＩｒ修飾酵素遺伝子の上流の回文構造は除去し、Ｈｌ
ｎｃ ＩＩ制限酵素遺伝子と修飾酵素遺伝子の間に部位
特異的変異を導入し、両遺伝子を離せばよい。また、両
遺伝子を別個のプラスミドに組み込ませてもよく、この
場合は両酵素の発現の制御が容易となる。
ｎ制限酵素及び修飾酵素を発現したが、その発現量は
充分ではなく、その原因として０両遺伝子を含むベクタ
ーが発成ベクターでない、■Ｈ１ｎｃ ｎ修飾酵素遺伝
子の上流に回文構造をもち、発現が抑制されている、■
Ｈ１ｎｃ ＩＦ修飾酵素遺伝子と制限酵素遺伝子が３ｂ
ｐ重複し、Ｈｌｎｃ ＩＩ制限酵素の発現がフレームシ
フトにより行われるなどがある。そこで、高発現性の大
腸菌を得るには、ベクターを発現ベクターとし、Ｈ１ｎ
ｃＩｒ修飾酵素遺伝子の上流の回文構造は除去し、Ｈｌ
ｎｃ ＩＩ制限酵素遺伝子と修飾酵素遺伝子の間に部位
特異的変異を導入し、両遺伝子を離せばよい。また、両
遺伝子を別個のプラスミドに組み込ませてもよく、この
場合は両酵素の発現の制御が容易となる。
本発明者らは、Ｈｌ、ｎｃ Ｉ＋修飾酵青遣云子の上流
の回文構造を削除したＨｌｎｃ ＩＩ修飾酵素遺伝子部
分を組込んだグラスミドｐＡＨ−Ｍ、Ｈｃ 、Ｍｉｎｅ
Ｔｌ制限酵素部分を組込んだプラスミドｐＡＨ−Ｒ，
Ｈｃ。
の回文構造を削除したＨｌｎｃ ＩＩ修飾酵素遺伝子部
分を組込んだグラスミドｐＡＨ−Ｍ、Ｈｃ 、Ｍｉｎｅ
Ｔｌ制限酵素部分を組込んだプラスミドｐＡＨ−Ｒ，
Ｈｃ。
及びこの場合ｐＡＨ−Ｒ，Ｈｃを制御するグラスミドと
してｐＮＴ ２０３の三つのグラスミドを保持する大腸
菌を作成し、Ｈ１ｎｃＵ制限酵素及び修飾酵素を大量発
現させた。また、ｐＡＨ−Ｍ、Ｈｃを保持する大腸菌を
作成し、Ｍｉｎｅ ＩＩ修飾酵素を大量に発現させた。
してｐＮＴ ２０３の三つのグラスミドを保持する大腸
菌を作成し、Ｈ１ｎｃＵ制限酵素及び修飾酵素を大量発
現させた。また、ｐＡＨ−Ｍ、Ｈｃを保持する大腸菌を
作成し、Ｍｉｎｅ ＩＩ修飾酵素を大量に発現させた。
以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれら実施
例に限定されるものではない。
例に限定されるものではない。
実施例 １
（１）Ｈ１ｎｃ菌染色体ＤＮＡの調製
ヘモフィラス インフルエンザ Ｒｅ ヲ、ＢＨ工培地
（プレイン−ハート−インフュージョン３７？、ヘミン
１０１ｑ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド２’
ｆ／１Ｓｐ１（７，５）２００＋を中３７°Ｃで培養し
遠心して集菌する。ｌＱｍ７の２５ ｍＭトリスＨＣＩ
（ｐＨ８，０） −５ＱｍＭグルコース−１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ液に菌体を懸濁し、リゾチームを同筒に２
ツ／廚になる様に溶かしたものをｌ、 Ｑ ｍｔ加え攪
拌し、３７℃で１５分間静置する。２８ＩＩ！ｔの １
０ ０ｍＭ Ｎａ（！ｊ’−１００ｍＭ ）
リ ス Ｈｃｆ（ｐＨ８０）溶液を加え、攪拌し、次
に４ ｒｎｌの】Ｏ％ＳＤＳ溶液を加え攪拌する。２０
ツ／Ｉｔｔのプロテイネーヌ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）
Ｋ溶液をｌ ｗｒｉｔ加えて攪拌し、３７℃で１時間
静置する。１０％ＳＤＳ −８％ザルコシ−ＩＶ （５
ａｒｃｏｓｙｌ ）溶液を１継加えて攪拌し、６０″Ｃ
で１５分間静置する。等容量のフェノ−６クロロホルム
（１： １）混液を加え、１０分分間中かに攪拌した後
、３０００ｒｐＩｌ１１で遠心し、水層とフェノール層
を分離する。
（プレイン−ハート−インフュージョン３７？、ヘミン
１０１ｑ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド２’
ｆ／１Ｓｐ１（７，５）２００＋を中３７°Ｃで培養し
遠心して集菌する。ｌＱｍ７の２５ ｍＭトリスＨＣＩ
（ｐＨ８，０） −５ＱｍＭグルコース−１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ液に菌体を懸濁し、リゾチームを同筒に２
ツ／廚になる様に溶かしたものをｌ、 Ｑ ｍｔ加え攪
拌し、３７℃で１５分間静置する。２８ＩＩ！ｔの １
０ ０ｍＭ Ｎａ（！ｊ’−１００ｍＭ ）
リ ス Ｈｃｆ（ｐＨ８０）溶液を加え、攪拌し、次
に４ ｒｎｌの】Ｏ％ＳＤＳ溶液を加え攪拌する。２０
ツ／Ｉｔｔのプロテイネーヌ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）
Ｋ溶液をｌ ｗｒｉｔ加えて攪拌し、３７℃で１時間
静置する。１０％ＳＤＳ −８％ザルコシ−ＩＶ （５
ａｒｃｏｓｙｌ ）溶液を１継加えて攪拌し、６０″Ｃ
で１５分間静置する。等容量のフェノ−６クロロホルム
（１： １）混液を加え、１０分分間中かに攪拌した後
、３０００ｒｐＩｌ１１で遠心し、水層とフェノール層
を分離する。
以下、この操作をフェノール処理という。水、讐をとり
、これに等量のイソプロピルアルコールを加え攪拌し、
０°Ｃで１０分間静置した後、１００００ ｒｐｍ遠心
分離し沈殿を回収する。これを７０％エタノールで洗浄
し、１０ＩｔのＴＩ〔（１０Ｉ！１Ｍト リスＨＣ１（
ｐＨ８，０） −１ｍＭ ＥＤＴＡ））溶液を加え、
次の工程に用いた。
、これに等量のイソプロピルアルコールを加え攪拌し、
０°Ｃで１０分間静置した後、１００００ ｒｐｍ遠心
分離し沈殿を回収する。これを７０％エタノールで洗浄
し、１０ＩｔのＴＩ〔（１０Ｉ！１Ｍト リスＨＣ１（
ｐＨ８，０） −１ｍＭ ＥＤＴＡ））溶液を加え、
次の工程に用いた。
（３Ｈ１ｎｃ菌染色体ＤＩＪＡのプラスミドライブラリ
ーの作製 上記１）で得られたＨ１ｎｃ菌染色体ＤＮＡ １５μｍ
を６０Ｈの制限酵素５ａｕ３ＡＩと最適条件〔（１０ｍ
Ｍ ）リスＨＣＩ （１：ｌＨ７，５） −７ｍＭ、
Ｊ（ｉｆｊ−１００ｍＭ ＮａＣ１） ）で３７°ｃ
ｙ々の時間反応させ、Ｏ７％シーケム ジー ティー
ジー（ＳｅａｋｅｍＧＴＧ ）アガロースゲルを用いて
電気泳動し、３−７ｋｐのＤＮＡ断片をＤＥベーパーに
吸着させ、ゲルより抜き出した。その後エタノール沈殿
によりＤＮＡ断片を回収した。
ーの作製 上記１）で得られたＨ１ｎｃ菌染色体ＤＮＡ １５μｍ
を６０Ｈの制限酵素５ａｕ３ＡＩと最適条件〔（１０ｍ
Ｍ ）リスＨＣＩ （１：ｌＨ７，５） −７ｍＭ、
Ｊ（ｉｆｊ−１００ｍＭ ＮａＣ１） ）で３７°ｃ
ｙ々の時間反応させ、Ｏ７％シーケム ジー ティー
ジー（ＳｅａｋｅｍＧＴＧ ）アガロースゲルを用いて
電気泳動し、３−７ｋｐのＤＮＡ断片をＤＥベーパーに
吸着させ、ゲルより抜き出した。その後エタノール沈殿
によりＤＮＡ断片を回収した。
プラスミドベクターとしては、ＰＢＲ３２２を用いた。
ｐＥＲ３２２の２５μ？を制限酵素ＢａｍＨｌ３００Ｕ
と緩衝液（１０ｍＭ）リスｍｃｉ （ｐＨ８，０）−７
ｍＭ Ｍｇ（！ｌｚ −１００ｍＭ ＮａＣｌ−２ｍＭ
２−メルカプトエタノール〕中、３０°Ｃで１時間反
応させ、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。この
ＤＮＡを１００ｍＭ）リスＨＣ１（ｐＨ８，０）に溶解
し、２．５Ｕのアルカリホスファターゼを加え、５５°
Ｃ−％１時間反応させ、フェノール処理、エタノール沈
殿を行いベクターＤＮＡを回収した。染色体ＤＮＡ −
５ａｕ３Ａ Ｉ断片２μ？とＢａｍＨＩで切断したｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡ−１，８μ９をＴａ ＤＮＡ リガー
ゼ７００Ｕを用い、リガーゼ緩衝液（（６６ｍＭ）リ
ス ＨＣＩ （ｐＨ７，６） ＋ ６．６
ｍＭ ＤＴＴ −０，１！ＩＩＭＡＴＰ）：］中
、１６°Ｃ１１６時間反応させ結合させた。こうして得
られたＤＮＡを、大腸菌ＭＯ１０６１（ｒｅｃＡ−）株
に形質転換し、更にアンピンリン１００μデ／ ｍｔを
含むＬ培地に移し、３７°Ｃで培養した。これよりプラ
スミドＤＮＡを調製し、プラスミドライブラリーとした
。
と緩衝液（１０ｍＭ）リスｍｃｉ （ｐＨ８，０）−７
ｍＭ Ｍｇ（！ｌｚ −１００ｍＭ ＮａＣｌ−２ｍＭ
２−メルカプトエタノール〕中、３０°Ｃで１時間反
応させ、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。この
ＤＮＡを１００ｍＭ）リスＨＣ１（ｐＨ８，０）に溶解
し、２．５Ｕのアルカリホスファターゼを加え、５５°
Ｃ−％１時間反応させ、フェノール処理、エタノール沈
殿を行いベクターＤＮＡを回収した。染色体ＤＮＡ −
５ａｕ３Ａ Ｉ断片２μ？とＢａｍＨＩで切断したｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡ−１，８μ９をＴａ ＤＮＡ リガー
ゼ７００Ｕを用い、リガーゼ緩衝液（（６６ｍＭ）リ
ス ＨＣＩ （ｐＨ７，６） ＋ ６．６
ｍＭ ＤＴＴ −０，１！ＩＩＭＡＴＰ）：］中
、１６°Ｃ１１６時間反応させ結合させた。こうして得
られたＤＮＡを、大腸菌ＭＯ１０６１（ｒｅｃＡ−）株
に形質転換し、更にアンピンリン１００μデ／ ｍｔを
含むＬ培地に移し、３７°Ｃで培養した。これよりプラ
スミドＤＮＡを調製し、プラスミドライブラリーとした
。
（３） Ｈｌｎｃ ＩＩ修飾酵素遺伝子を含有する大腸
菌の選択 上記（２のプラスミドライブラリーＤＮＡ ３０μｉを
、制限酵素Ｈ１ｎｃＩＩ ２５０Ｕと緩衝液（１０ｍ
Ｍト リ ス Ｈｃｌ （ｐＨ８，０） −７
ｍＭ ＭｇＣ１ｔ −５０ｍＭＮａＣ／ −７ｍＭ
２−メルカプトエタノール〕中、３７°Ｃで２時間反
応させた。エタノール沈殿を行いＤＮＡを回収し、得ら
れたＤＮＡを大腸菌ＭＣ！１０６１（ｒｅｃＡ−）株に
形質転換し、更にアンピシリン１００μｆ／ｍｅを含む
Ｌ培地に移し３７°Ｃで培養した。遠心して集菌した後
、プラスミドＤＮＡを調製し、上記と同様３０μデのプ
ラスミドを制限酵素Ｈ１ｎｃｎ２５０Ｕと３７°Ｃで２
時間反応させた。上記と同様に、エタノール沈殿の後Ｄ
ＮＡを回収し、これを再び大Ｍ菌ＭＯＩ Ｑ ５１ （
ｒｅｃＡ −）株に形質転換しアンピシリン１００μｆ
／ｋｌｔを含むＬ寒天培地に塗布した。３７°Ｃで生育
したコロニーを分離し、プラスミドの解析を行った。
菌の選択 上記（２のプラスミドライブラリーＤＮＡ ３０μｉを
、制限酵素Ｈ１ｎｃＩＩ ２５０Ｕと緩衝液（１０ｍ
Ｍト リ ス Ｈｃｌ （ｐＨ８，０） −７
ｍＭ ＭｇＣ１ｔ −５０ｍＭＮａＣ／ −７ｍＭ
２−メルカプトエタノール〕中、３７°Ｃで２時間反
応させた。エタノール沈殿を行いＤＮＡを回収し、得ら
れたＤＮＡを大腸菌ＭＣ！１０６１（ｒｅｃＡ−）株に
形質転換し、更にアンピシリン１００μｆ／ｍｅを含む
Ｌ培地に移し３７°Ｃで培養した。遠心して集菌した後
、プラスミドＤＮＡを調製し、上記と同様３０μデのプ
ラスミドを制限酵素Ｈ１ｎｃｎ２５０Ｕと３７°Ｃで２
時間反応させた。上記と同様に、エタノール沈殿の後Ｄ
ＮＡを回収し、これを再び大Ｍ菌ＭＯＩ Ｑ ５１ （
ｒｅｃＡ −）株に形質転換しアンピシリン１００μｆ
／ｋｌｔを含むＬ寒天培地に塗布した。３７°Ｃで生育
したコロニーを分離し、プラスミドの解析を行った。
アンピシリン耐性株を１００μｆ／ｌｎｊのアンピシリ
ンを含む２ｍｉのＬ培地で３７°Ｃ１１６時間培養した
後、集菌した。これにＱ２ｔ／の溶液Ｉ〔５０ｍＭグル
コース−１０ｍＭ）リスｍａｔ （ＰＨ８，０）−５
ｍＭ ＥＤＴＡ ）を加え懸濁し、Ｑ、 ４ ｒｎｔの
溶液■（（１２）Ｉ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳ ）を加
え０°Ｃで５分間保持した。これにＱ、 ３ ｍｔの溶
液ＩＩＩ（５Ｍ酢酸カリウムｐＨ４，８）を加え、Ｏ′
Ｃで１５分間保持した後、遠心分離し、上澄を回収した
。イソプロピルアルコ−ｆｖ０５ ｍ７を加えＯ″Ｃで
１０分間保持した後、遠心により沈殿を回収し、これを
７０％エタノールで洗浄し乾燥した。これに２０μｔ／
ｒｎｔのＲＮａｓｅ Ａを０．１ ｒｎｔ加え３７℃で
４０分間反応サセ、Ｉ Ｍ Ｍｇｃｌ−（Ｄ ０．０
３ ｍｌを加え０°Ｃで１０分間保持した。逆心分離に
より、上澄を回収しこれに０．０６ ＷＬｔの溶液■（
２０％ポリエチレングリコール＃ ６０００−２ Ｍ
ＮａＣ４）を加え攪拌し、０°Ｃで６０分間保持した
。遠心分離で沈殿を回収後、ＴＩＣ溶液に溶解した。こ
のＤＮＡ溶液にＨ１ｎｃ ｎ制限酵素を作用させ、アガ
ロース電気泳動を行いプラスミドＤＮＡがＨ４ｎｃ ３
１で切断されるかどうかを調べた。その結果約４ｋｂの
ＤＮＡを含み、ＨｉｎｃＩＩで切断されないプラスミド
が得られた。これをｐＡＨｌと命名した。
ンを含む２ｍｉのＬ培地で３７°Ｃ１１６時間培養した
後、集菌した。これにＱ２ｔ／の溶液Ｉ〔５０ｍＭグル
コース−１０ｍＭ）リスｍａｔ （ＰＨ８，０）−５
ｍＭ ＥＤＴＡ ）を加え懸濁し、Ｑ、 ４ ｒｎｔの
溶液■（（１２）Ｉ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳ ）を加
え０°Ｃで５分間保持した。これにＱ、 ３ ｍｔの溶
液ＩＩＩ（５Ｍ酢酸カリウムｐＨ４，８）を加え、Ｏ′
Ｃで１５分間保持した後、遠心分離し、上澄を回収した
。イソプロピルアルコ−ｆｖ０５ ｍ７を加えＯ″Ｃで
１０分間保持した後、遠心により沈殿を回収し、これを
７０％エタノールで洗浄し乾燥した。これに２０μｔ／
ｒｎｔのＲＮａｓｅ Ａを０．１ ｒｎｔ加え３７℃で
４０分間反応サセ、Ｉ Ｍ Ｍｇｃｌ−（Ｄ ０．０
３ ｍｌを加え０°Ｃで１０分間保持した。逆心分離に
より、上澄を回収しこれに０．０６ ＷＬｔの溶液■（
２０％ポリエチレングリコール＃ ６０００−２ Ｍ
ＮａＣ４）を加え攪拌し、０°Ｃで６０分間保持した
。遠心分離で沈殿を回収後、ＴＩＣ溶液に溶解した。こ
のＤＮＡ溶液にＨ１ｎｃ ｎ制限酵素を作用させ、アガ
ロース電気泳動を行いプラスミドＤＮＡがＨ４ｎｃ ３
１で切断されるかどうかを調べた。その結果約４ｋｂの
ＤＮＡを含み、ＨｉｎｃＩＩで切断されないプラスミド
が得られた。これをｐＡＨｌと命名した。
（４） Ｈ１ｎｃ ＩＩ修飾酵素遺伝子を含有するＤＮ
Ａ断片の調製と塩基配列の決定 ｐＡＨＩ ＤＮＡを適当量の制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＳ
ｐｈ ｒで消化して得られたＤＮＡ断片２μ２を、Ｔ＋
ＤＮＡポリメラーゼＩＵと、緩衝液（６７ｍＭ）リ
ヌ ＨＣＩ （ｐＨ８，８） −６，７ｍＭ
ＭｇＣ：ｌｘ −Ｉ ＱｍＭ ２−メルカプト
エタノ−Ａ／−０，０１％ＢＳＡ −０，３３ｍＭ （
ＬＮＴＰ ）中、３７°Ｃで５分間反応させ、５ｐｈｌ
で切断された切口を平滑末端にした。フェノール処理及
びエタノール沈殿を行いＤＮＡを回収した後、Ｓｍａ
Ｉ制限酵素で開裂させ、脱リン酸化したプラスミドベク
ターｐＵ（１！ １１９の１０μψと、ＴイＤＮＡリガ
ーゼ７００Ｕを用い結合させた。こうして得られたＤＮ
Ａを大腸菌、７Ｍ１０９株に形質転換し、アンピシリン
１００μ？／鮮を含むＬ寒天培地に塗布した。３７°Ｃ
で生育したコロニを分離し、プラスミドの解析を行った
。アンピシリン耐性株を１００μｆ／ｒｎｔのアンピシ
リンを含む２１１ｔのＬ培地で３７°Ｃ１１６時間培養
したのち、集菌しくＪで述べたと同じ方法で１ラスミド
ＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡにＨ１ｎｃ
Ｉｆ制限酵素を作用させ、アガロース電気泳動を行いプ
ラスミドＤＮＡがＨ１ｎｃ ｎで切断されるか否かを調
べた。Ｈ１ｎｃ ＩＩで切断されなかったプラスミドＤ
ＮＡに次に、制限酵素Ｓａ／ Ｉを作用させ切断される
か否かを調べた。Ｈ１ｎｃ ＩＩ修飾酵素は、５’ Ｇ
ＴＰｙＰｕＡＯ３’の認識配列のうち、５塩基目の人を
メチル化する。一方Ｓｄ Ｉ制限酵素は、５’ ＧＴＣ
ＧＡＣ３’を詔詭し切断するが、５塩基目の人がメチル
化されていると切断できない。
Ａ断片の調製と塩基配列の決定 ｐＡＨＩ ＤＮＡを適当量の制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＳ
ｐｈ ｒで消化して得られたＤＮＡ断片２μ２を、Ｔ＋
ＤＮＡポリメラーゼＩＵと、緩衝液（６７ｍＭ）リ
ヌ ＨＣＩ （ｐＨ８，８） −６，７ｍＭ
ＭｇＣ：ｌｘ −Ｉ ＱｍＭ ２−メルカプト
エタノ−Ａ／−０，０１％ＢＳＡ −０，３３ｍＭ （
ＬＮＴＰ ）中、３７°Ｃで５分間反応させ、５ｐｈｌ
で切断された切口を平滑末端にした。フェノール処理及
びエタノール沈殿を行いＤＮＡを回収した後、Ｓｍａ
Ｉ制限酵素で開裂させ、脱リン酸化したプラスミドベク
ターｐＵ（１！ １１９の１０μψと、ＴイＤＮＡリガ
ーゼ７００Ｕを用い結合させた。こうして得られたＤＮ
Ａを大腸菌、７Ｍ１０９株に形質転換し、アンピシリン
１００μ？／鮮を含むＬ寒天培地に塗布した。３７°Ｃ
で生育したコロニを分離し、プラスミドの解析を行った
。アンピシリン耐性株を１００μｆ／ｒｎｔのアンピシ
リンを含む２１１ｔのＬ培地で３７°Ｃ１１６時間培養
したのち、集菌しくＪで述べたと同じ方法で１ラスミド
ＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡにＨ１ｎｃ
Ｉｆ制限酵素を作用させ、アガロース電気泳動を行いプ
ラスミドＤＮＡがＨ１ｎｃ ｎで切断されるか否かを調
べた。Ｈ１ｎｃ ＩＩで切断されなかったプラスミドＤ
ＮＡに次に、制限酵素Ｓａ／ Ｉを作用させ切断される
か否かを調べた。Ｈ１ｎｃ ＩＩ修飾酵素は、５’ Ｇ
ＴＰｙＰｕＡＯ３’の認識配列のうち、５塩基目の人を
メチル化する。一方Ｓｄ Ｉ制限酵素は、５’ ＧＴＣ
ＧＡＣ３’を詔詭し切断するが、５塩基目の人がメチル
化されていると切断できない。
Ｈ１ｎｃ ＩＩで切断されなかったプラスミドＤＮＡは
、Ｓａ／ Ｉでも切断されなかった。そこで、ここで得
られた約４ｋｂのＥｃｏＲＶ ・Ｓｐｈ Ｉ ＤＮＡ断
片を種々の制限酵素で切断し、メツシングらのＭ１３ジ
デオキシシークエンス（ｄｉｄｅｏｘｙ ５ｅｑｕｅｎ
ｃｅ）法（メソツズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）第１０１８
、第２０！（１９８５年））に従いシーフェンス解析を
行った。すなわち、４ｋｂ ＥｃｏＲＶ ＠ Ｓｐｈ
Ｉ ＤＮＡ断片を種々の制限酵素で切断して得られた断
片を、マルチクローニングサイト中の適当な制限酵素で
開裂したＨ１３．ｍｐ１９に結合し、大腸菌ＪＭ １０
９株に形質感染させる。得られたファージプラークを’
ｌ、 Ｑ Ｗ／の２ＹＴ（バクトドリプトン１６１、酵
母エキヌ８ψ、Ｎａｐ／ ５Ｐ／ ｌ １ｐＨ７，２）
で培養し、１本鎖ＤＮＡを回収し、シーフェンス解析を
行った。このようにＥｃｏＲＶ・ｓｐｈ ｒ ＤＮＡ断
片の全塩基配列を明らかにした。
、Ｓａ／ Ｉでも切断されなかった。そこで、ここで得
られた約４ｋｂのＥｃｏＲＶ ・Ｓｐｈ Ｉ ＤＮＡ断
片を種々の制限酵素で切断し、メツシングらのＭ１３ジ
デオキシシークエンス（ｄｉｄｅｏｘｙ ５ｅｑｕｅｎ
ｃｅ）法（メソツズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）第１０１８
、第２０！（１９８５年））に従いシーフェンス解析を
行った。すなわち、４ｋｂ ＥｃｏＲＶ ＠ Ｓｐｈ
Ｉ ＤＮＡ断片を種々の制限酵素で切断して得られた断
片を、マルチクローニングサイト中の適当な制限酵素で
開裂したＨ１３．ｍｐ１９に結合し、大腸菌ＪＭ １０
９株に形質感染させる。得られたファージプラークを’
ｌ、 Ｑ Ｗ／の２ＹＴ（バクトドリプトン１６１、酵
母エキヌ８ψ、Ｎａｐ／ ５Ｐ／ ｌ １ｐＨ７，２）
で培養し、１本鎖ＤＮＡを回収し、シーフェンス解析を
行った。このようにＥｃｏＲＶ・ｓｐｈ ｒ ＤＮＡ断
片の全塩基配列を明らかにした。
（５Ｈ１ｎｃｌＩ制限酵素タンパクのＮ末アミノ酸配列
の決定 次に１ｉｎｅ ＩＩ制限酵素遺伝子を検索するために、
マツダイラ／Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ ）の方法〔ザ ジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈ
ｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第２６２巻、第１００３５頁（１
９８７年）〕でＨ１ｎｃＩＩ制限酵素タンパクのＮ末ア
ミノ酸配列を決定した。発明者らは、既にＨｌｈｃ菌よ
り精製されたＨ１ｎｃ ＩＩ制限酵素タンパクをＳＤＳ
電気泳動に供したｉ 、ＰＶＤＥメンブフンに移し、ブ
ロモフェノールブルーにより染色し、７％酢酸アンモニ
ウムメタノールで脱色した。Ｈ１ｎｃ ＩＩタンパクの
部分を切りとり、アミノ酸シークエンサーに供しエドマ
ン分解により、アミノ酸配列を決定した（第１表）。
の決定 次に１ｉｎｅ ＩＩ制限酵素遺伝子を検索するために、
マツダイラ／Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ ）の方法〔ザ ジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈ
ｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第２６２巻、第１００３５頁（１
９８７年）〕でＨ１ｎｃＩＩ制限酵素タンパクのＮ末ア
ミノ酸配列を決定した。発明者らは、既にＨｌｈｃ菌よ
り精製されたＨ１ｎｃ ＩＩ制限酵素タンパクをＳＤＳ
電気泳動に供したｉ 、ＰＶＤＥメンブフンに移し、ブ
ロモフェノールブルーにより染色し、７％酢酸アンモニ
ウムメタノールで脱色した。Ｈ１ｎｃ ＩＩタンパクの
部分を切りとり、アミノ酸シークエンサーに供しエドマ
ン分解により、アミノ酸配列を決定した（第１表）。
第 １ 表
Ａｓｎ−３ｅｒ−工ｆｅ−Ｌｅｔｌ−工ｆｅ−Ｇ／ｙ−
ＧＩ！ｎ−Ｌｙｓ−’Ｖａ／−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−
Ｇ／ｙ−Ｈｌｓ−ＡＩ！ａ− その結果、４）で得られたＥｃｏＲＶ・Ｓｐｈ Ｉ断片
には、Ｈｌｈｃ ＩＩ修飾酵素遺伝子及びその下流にＨ
１ｎｃ ＩＩ制御限酵素遺伝子の一部が含まれることが
明らかとなった。
ＧＩ！ｎ−Ｌｙｓ−’Ｖａ／−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−
Ｇ／ｙ−Ｈｌｓ−ＡＩ！ａ− その結果、４）で得られたＥｃｏＲＶ・Ｓｐｈ Ｉ断片
には、Ｈｌｈｃ ＩＩ修飾酵素遺伝子及びその下流にＨ
１ｎｃ ＩＩ制御限酵素遺伝子の一部が含まれることが
明らかとなった。
（■Ｈｏｎｅ ＩＩ制限・修飾酵素遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片の調製 そこで、（滲で得られたＥｃｏＲＶ・Ｓｐｈ Ｉ断片よ
りＨｌｎｃ ［制限酵素遺伝子の一部を含む５ａｕ３Ａ
Ｉ断片を、適当量の！９ａｕ３Ａ Ｉで消化して調製
しこれをグローブとして、（１）で得られたＨ１ｎｃ菌
染色体ＤＮＡを種々の制限酵素で完全分解し、サザンハ
イプリダイゼーションを行った。その結果、Ｈｌｎｏ
ｎ修飾酵素遺伝子に加えて、制限酵素遺伝子も含有され
ると予想される大きさのＤＮＡ断片が、Ｈｌｎｄｎ［断
片の中に認められた。それ故この）（ｉｎｄ ｍ断片を
調製し、ＨｌｎｃＬ ［１制限酵素で開裂したｐＢＲ３
２２ベクターに結合した。こうして得られたプラスミド
ＤＮＡを大腸菌ＨＢ １０１株に形質転換した。（３）
で述べたと同じ方法でプラスミドＤＮＡを調製し、Ｈ１
ｎｃＩＩ制限酵素を作用させアガロース電気泳動を行い
、プラスミドＤＮＡがＨｌｎ（！ ｎで切断されるか否
かを調べた。Ｈｌｎｃ ＩＩで切断されなかったプラス
ミドＤＮＡを持つ組換え体大腸菌の制限酵素活性をファ
ージ感染に対する耐性の獲得の有無で試験した。すなわ
ち、組換え体をアンピシリン１００μｆ／ａｔマルトー
ス０．４％を含む２Ｉｌ！ｔのＬ培地で３７°Ｃ１１６
時間培養し、これに適当に希釈したピルレントラムダフ
ァージを加え、３７℃、２０分間保持し吸着させた後、
５０°Ｃに保温しておいた０、 ７％寒天、マルトース
０．４％を含むＬ軟寒天培地を加え、アンピシリン１０
０μｆＰ／ｍｌを含むＬ寒天培地に流し、寒天を固化さ
せた。対照としてプラスミドを保持しない大腸菌ＨＢＩ
ＯＩ株を、０４％マルトースを含むＬ培地で培養したも
のを用い、同様にピルシフトヲムダファージを感染させ
たものを用いた。試験菌、対照菌ともに３７°Ｃで一晩
保持した後、プレート上のプラーク数を測定した。この
様にして調べた結果、制限・修飾酵素遺伝子をコードす
るＤＮＡ断片、２，８ｋｂＨ１ｎｄＩ［［断片を持つ組
換え体プラスミドｐＡＨ２が得られた。本プラスミドを
保有する組換え体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ Ｈ１３１０１／ ｐＡＨ２と命名した。
ＮＡ断片の調製 そこで、（滲で得られたＥｃｏＲＶ・Ｓｐｈ Ｉ断片よ
りＨｌｎｃ ［制限酵素遺伝子の一部を含む５ａｕ３Ａ
Ｉ断片を、適当量の！９ａｕ３Ａ Ｉで消化して調製
しこれをグローブとして、（１）で得られたＨ１ｎｃ菌
染色体ＤＮＡを種々の制限酵素で完全分解し、サザンハ
イプリダイゼーションを行った。その結果、Ｈｌｎｏ
ｎ修飾酵素遺伝子に加えて、制限酵素遺伝子も含有され
ると予想される大きさのＤＮＡ断片が、Ｈｌｎｄｎ［断
片の中に認められた。それ故この）（ｉｎｄ ｍ断片を
調製し、ＨｌｎｃＬ ［１制限酵素で開裂したｐＢＲ３
２２ベクターに結合した。こうして得られたプラスミド
ＤＮＡを大腸菌ＨＢ １０１株に形質転換した。（３）
で述べたと同じ方法でプラスミドＤＮＡを調製し、Ｈ１
ｎｃＩＩ制限酵素を作用させアガロース電気泳動を行い
、プラスミドＤＮＡがＨｌｎ（！ ｎで切断されるか否
かを調べた。Ｈｌｎｃ ＩＩで切断されなかったプラス
ミドＤＮＡを持つ組換え体大腸菌の制限酵素活性をファ
ージ感染に対する耐性の獲得の有無で試験した。すなわ
ち、組換え体をアンピシリン１００μｆ／ａｔマルトー
ス０．４％を含む２Ｉｌ！ｔのＬ培地で３７°Ｃ１１６
時間培養し、これに適当に希釈したピルレントラムダフ
ァージを加え、３７℃、２０分間保持し吸着させた後、
５０°Ｃに保温しておいた０、 ７％寒天、マルトース
０．４％を含むＬ軟寒天培地を加え、アンピシリン１０
０μｆＰ／ｍｌを含むＬ寒天培地に流し、寒天を固化さ
せた。対照としてプラスミドを保持しない大腸菌ＨＢＩ
ＯＩ株を、０４％マルトースを含むＬ培地で培養したも
のを用い、同様にピルシフトヲムダファージを感染させ
たものを用いた。試験菌、対照菌ともに３７°Ｃで一晩
保持した後、プレート上のプラーク数を測定した。この
様にして調べた結果、制限・修飾酵素遺伝子をコードす
るＤＮＡ断片、２，８ｋｂＨ１ｎｄＩ［［断片を持つ組
換え体プラスミドｐＡＨ２が得られた。本プラスミドを
保有する組換え体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ Ｈ１３１０１／ ｐＡＨ２と命名した。
（７） Ｈｌｎｃ ＩＩ制限酵素遺伝子の塩基配列（６
）で得られたＨｌｎｄＩ［ＤＮＡ断片を、（４で述べた
のと同様に、種々の制限酵素で切断し、Ｍ１３ジデオキ
シシークエンス法に従いシーフェンス解析を行った。こ
の様にして第１図に示すようなＨｌｎｃ ＩＩ制限・修
飾酵素遺伝子をコードする２、８ｋｂ Ｈ１ｎ４ｎ［Ｄ
ＮＡ断片の全塩基配列を明らかにした。即ち第１図はＨ
ｌｎｃ Ｉ［制限・修飾酵素遺伝子のＤＮＡ配列及びア
ミノ酸配列を示す図である。
）で得られたＨｌｎｄＩ［ＤＮＡ断片を、（４で述べた
のと同様に、種々の制限酵素で切断し、Ｍ１３ジデオキ
シシークエンス法に従いシーフェンス解析を行った。こ
の様にして第１図に示すようなＨｌｎｃ ＩＩ制限・修
飾酵素遺伝子をコードする２、８ｋｂ Ｈ１ｎ４ｎ［Ｄ
ＮＡ断片の全塩基配列を明らかにした。即ち第１図はＨ
ｌｎｃ Ｉ［制限・修飾酵素遺伝子のＤＮＡ配列及びア
ミノ酸配列を示す図である。
（８） Ｈｌｎｃ ｎ制限・修飾酵素タンパクを生産す
る大腸菌の創製とその生産 Ｈｌｎｃ Ｉｆ制限酵素タンパク並びに修飾酵素タンパ
クの両者を同時に生産する大腸菌を以下に示す方法で創
製した。この大腸菌には修飾酵素遺伝子と制限酵素遺伝
子をそれぞれ独立に挿入された二つのプラスミドと、制
限酵素遺伝子の発現を調節するプラスミドを保持させた
。
る大腸菌の創製とその生産 Ｈｌｎｃ Ｉｆ制限酵素タンパク並びに修飾酵素タンパ
クの両者を同時に生産する大腸菌を以下に示す方法で創
製した。この大腸菌には修飾酵素遺伝子と制限酵素遺伝
子をそれぞれ独立に挿入された二つのプラスミドと、制
限酵素遺伝子の発現を調節するプラスミドを保持させた
。
８−１．修飾酵素遺伝子を含有するプラスミドの作製
修飾酵素遺伝子の上流には発現を調節していると思われ
る回文構造が存在するため、これを除去するために以下
の操作を行った。（４）で得られたＥｃｏＲＶ ５ｓｐ
ｈ Ｉ断片を制限酵素Ａｔ＆Ｉで切断し、ＨｌｎＯｎ修
飾酵素遺伝子を含む１．８ｋｂのＡｆ＆Ｉ断片を調製し
、ＳｍＩＬ工制限酵素で開裂した］）Ｕｏ １９ベクタ
ーに結合した。このプラスミド１５μ？をベクター上の
マルチクローニング部位に存在するＢａｍＨＩ 、 Ｓ
ｐｈ Ｉ両制限酵素部位で開裂した。開裂したＤＮＡに
エキソヌクレアーゼｍ１８０Ｕを加え、６０ｐｌの緩衝
液（５０ｍＭトリ）Ｈｏｔ （ｐＨ８，０） −１
００ｍＭＮａＣ／ −１０ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール〕中、３７°Ｃで反応を行う。反応液１０μｌを適
当時間ごとに分取し、６０μｌのマングビーンヌクレア
ーゼ緩衝液（６０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）
−１００ｍＭＮ！ＬＣ／ −２ｍＭ酢酸亜鉛−２０％
グリセロール〕に加、する。６５°Ｃ，５分間加熱しエ
キソヌクレア−セｌ［を失活させた後、マングビーンヌ
クレアーゼ５０Ｕを加え、３７°Ｃで３０分間反応を行
う。こうして得られたＢａｍＨＩ部位から削られた種々
の長さを持つＤＮＡ断片をＴ、 ＤＮＡ リガーゼを
用いて再度環状化させ、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
した。アンピシリン１００μ汁１を含むＬ寒天培地に塗
布し、３７°Ｃで生育したコロニーを分離し、プラスミ
ドの調製及び解析を行った。その結果、回文構造の除去
されたグラスミドが得られ、これをｐＵ（！ −Ｍ、
Ｈｃ １３と命名した。次に、このグラスミドｐＵｏ
−Ｍ、Ｈｃｌ ３をＰｖｕ ＩＩ制限酵素で切断し、１
，９ｋｂのＰｖｕ Ｉｆ断片を調製した。ＫｃｏＲＶ制
限酵素で開裂し脱リン酸化したｐＡｃＹｏ １８４ベク
ターにこの断片を結合し、得られたプラスミドをｐｋＨ
−Ｍ、、 Ｈａ と命名した。
る回文構造が存在するため、これを除去するために以下
の操作を行った。（４）で得られたＥｃｏＲＶ ５ｓｐ
ｈ Ｉ断片を制限酵素Ａｔ＆Ｉで切断し、ＨｌｎＯｎ修
飾酵素遺伝子を含む１．８ｋｂのＡｆ＆Ｉ断片を調製し
、ＳｍＩＬ工制限酵素で開裂した］）Ｕｏ １９ベクタ
ーに結合した。このプラスミド１５μ？をベクター上の
マルチクローニング部位に存在するＢａｍＨＩ 、 Ｓ
ｐｈ Ｉ両制限酵素部位で開裂した。開裂したＤＮＡに
エキソヌクレアーゼｍ１８０Ｕを加え、６０ｐｌの緩衝
液（５０ｍＭトリ）Ｈｏｔ （ｐＨ８，０） −１
００ｍＭＮａＣ／ −１０ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール〕中、３７°Ｃで反応を行う。反応液１０μｌを適
当時間ごとに分取し、６０μｌのマングビーンヌクレア
ーゼ緩衝液（６０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）
−１００ｍＭＮ！ＬＣ／ −２ｍＭ酢酸亜鉛−２０％
グリセロール〕に加、する。６５°Ｃ，５分間加熱しエ
キソヌクレア−セｌ［を失活させた後、マングビーンヌ
クレアーゼ５０Ｕを加え、３７°Ｃで３０分間反応を行
う。こうして得られたＢａｍＨＩ部位から削られた種々
の長さを持つＤＮＡ断片をＴ、 ＤＮＡ リガーゼを
用いて再度環状化させ、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
した。アンピシリン１００μ汁１を含むＬ寒天培地に塗
布し、３７°Ｃで生育したコロニーを分離し、プラスミ
ドの調製及び解析を行った。その結果、回文構造の除去
されたグラスミドが得られ、これをｐＵ（！ −Ｍ、
Ｈｃ １３と命名した。次に、このグラスミドｐＵｏ
−Ｍ、Ｈｃｌ ３をＰｖｕ ＩＩ制限酵素で切断し、１
，９ｋｂのＰｖｕ Ｉｆ断片を調製した。ＫｃｏＲＶ制
限酵素で開裂し脱リン酸化したｐＡｃＹｏ １８４ベク
ターにこの断片を結合し、得られたプラスミドをｐｋＨ
−Ｍ、、 Ｈａ と命名した。
８−２制限酵素遺伝子を含有するプラスミドの作製とそ
の発現調節 （６）で調製したｐＡＨ２プラスミドを適当量のＢｓｐ
ＨＩ制限酵素で消化して得られたＨｌｎｃ Ｕ制限酵素
遺伝子を含むＤＮＡ断片を（４で述べたと同様にＴ、Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした後、Ｈｌｎｄ
ｍ制限酵素により消化し、Ｂ８１）ＨＩ （ｂｌｕ
ｎｔ ｅｎｄｅｄ ） ＠ Ｈｌｎｄ ＩＩＩ断片Ｑ、
９ ｋｂを調製した。
の発現調節 （６）で調製したｐＡＨ２プラスミドを適当量のＢｓｐ
ＨＩ制限酵素で消化して得られたＨｌｎｃ Ｕ制限酵素
遺伝子を含むＤＮＡ断片を（４で述べたと同様にＴ、Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした後、Ｈｌｎｄ
ｍ制限酵素により消化し、Ｂ８１）ＨＩ （ｂｌｕ
ｎｔ ｅｎｄｅｄ ） ＠ Ｈｌｎｄ ＩＩＩ断片Ｑ、
９ ｋｂを調製した。
次に、ｐＰＬ −１＆ｍｂｄａプラスミドをＥｃｏＲＩ
、 Ｈｐａ １両制限酵素で消化し、ＰＬプロモータ
ーを含むＥａｏＲＩ ＊ Ｈｐａ Ｉ断片０，５ｋｂを
調製した。ＥｃｏＲＬＨｌｎｄ １１両制限酵素で開裂
したＴＩＢＲ３２２ベクターにこの二つの断片を結合し
、得られたグラスミドをｐＡＨ−Ｒ，Ｈａ と命名した
。このグラスミドｐＡＨ−Ｒ，Ｈａの発現を調整するた
めに、ラムダファージのＣｌ５ｓｙタンパク及びＮタン
パクを用いる系とした。したがって、両タンパクをコー
ドする遺伝子を持つ１）ＮＴ ２０３プフスミドを同時
に形質転換した。
、 Ｈｐａ １両制限酵素で消化し、ＰＬプロモータ
ーを含むＥａｏＲＩ ＊ Ｈｐａ Ｉ断片０，５ｋｂを
調製した。ＥｃｏＲＬＨｌｎｄ １１両制限酵素で開裂
したＴＩＢＲ３２２ベクターにこの二つの断片を結合し
、得られたグラスミドをｐＡＨ−Ｒ，Ｈａ と命名した
。このグラスミドｐＡＨ−Ｒ，Ｈａの発現を調整するた
めに、ラムダファージのＣｌ５ｓｙタンパク及びＮタン
パクを用いる系とした。したがって、両タンパクをコー
ドする遺伝子を持つ１）ＮＴ ２０３プフスミドを同時
に形質転換した。
３−３． Ｗｉｎｅ Ｉｆ制限・修飾酵素タンパクの生
産８−２．で得られた二つのプラスミドｐＡＨ−Ｍ。
産８−２．で得られた二つのプラスミドｐＡＨ−Ｍ。
Ｈｃ 、 ｐＡＨ−Ｒ，Ｈａ及びｐＮＴ ２０３ブヲス
ミドを大腸菌ＲＲ１株に形質転換し、アンピシリン１０
０μｆ ／ｙｎｌ 、テトラサイクリン１５μＰ／ｍｔ
、クロヲムフエニコール３０μｆ／ｗ＋ｔを含むＬ寒天
培地に塗布し、３０°Ｃで生育したコロニーを分離し、
プラスミドを調製し解析した。次に、これら３種のプラ
スミドを大腸菌ＲＲ１株に導入した。これら三つのグラ
スミドを導入した大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＲＲ１／ ｐＡＨ−Ｈｌｎｃと表示され工業技
術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１１２３３
号（ＦＥＢＭ Ｐ−１１２３３）として寄託されている
。
ミドを大腸菌ＲＲ１株に形質転換し、アンピシリン１０
０μｆ ／ｙｎｌ 、テトラサイクリン１５μＰ／ｍｔ
、クロヲムフエニコール３０μｆ／ｗ＋ｔを含むＬ寒天
培地に塗布し、３０°Ｃで生育したコロニーを分離し、
プラスミドを調製し解析した。次に、これら３種のプラ
スミドを大腸菌ＲＲ１株に導入した。これら三つのグラ
スミドを導入した大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＲＲ１／ ｐＡＨ−Ｈｌｎｃと表示され工業技
術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１１２３３
号（ＦＥＢＭ Ｐ−１１２３３）として寄託されている
。
本菌株によるＨｌｎｃ ＩＩ制限・修飾酵素の生産方法
を以下に示す。前記大腸菌をアンピシリン１００μ？／
耐テトラサイクリン、１５μｔ／ｗｔｔクロラムフェニ
コール、３０μ汁１を含０２ ｔｕｔ （７）Ｌ培地に
接種し、３０°Ｃで１６時間前培養した。
を以下に示す。前記大腸菌をアンピシリン１００μ？／
耐テトラサイクリン、１５μｔ／ｗｔｔクロラムフェニ
コール、３０μ汁１を含０２ ｔｕｔ （７）Ｌ培地に
接種し、３０°Ｃで１６時間前培養した。
これをアンピシリン１００μｆ ／ ｍ／ 、テトラサ
イクリン１５μｆ ／ ａｔ 、クロラムフェニコール
３０Ｂｆ／／ｍｔ、 工ＰＴＧ （イソプロピル−１−
千オーβ−Ｄ−ガラクトビヲノシド）２ｍＭ全含む１０
０ｘｔのＬ培地に移し、３０°Ｃで約３時間培養した後
、４２°Ｃで１５分間培養し、更に３７°Ｃで３時間培
養した。集菌後、１．２屑ｔの１０ｍＭ２−メルカプト
エタノール−０，１５％トリトンｘ−１００を含む２０
１１１１Ｍ！Ｊン酸カリウム緩衝液（ｐａ７．５）に懸
濁し、超音波処理で菌を破砕し、１５０００ｒｐｍで３
０分間遠心し、上澄を回収する。上澄の活性を測定した
ところ、Ｈ１ｎｃＩＩ制限酵素が１５００００、修飾酵
素が５０００Ｕ生産されていた。
イクリン１５μｆ ／ ａｔ 、クロラムフェニコール
３０Ｂｆ／／ｍｔ、 工ＰＴＧ （イソプロピル−１−
千オーβ−Ｄ−ガラクトビヲノシド）２ｍＭ全含む１０
０ｘｔのＬ培地に移し、３０°Ｃで約３時間培養した後
、４２°Ｃで１５分間培養し、更に３７°Ｃで３時間培
養した。集菌後、１．２屑ｔの１０ｍＭ２−メルカプト
エタノール−０，１５％トリトンｘ−１００を含む２０
１１１１Ｍ！Ｊン酸カリウム緩衝液（ｐａ７．５）に懸
濁し、超音波処理で菌を破砕し、１５０００ｒｐｍで３
０分間遠心し、上澄を回収する。上澄の活性を測定した
ところ、Ｈ１ｎｃＩＩ制限酵素が１５００００、修飾酵
素が５０００Ｕ生産されていた。
マタ、両酵素は、ホスホセルロース、ＤΣＡｌ−セルロ
ース、ヘパリンセファロース、セファデックスＧ−１０
０等のクロマトグラフィーで分離でき、それぞれ単一な
酵素として精製可能である。
ース、ヘパリンセファロース、セファデックスＧ−１０
０等のクロマトグラフィーで分離でき、それぞれ単一な
酵素として精製可能である。
実施例 ２
Ｈｌｎｃ ＩＩ修飾酵素遺伝子が組み込まれたグラスミ
ドを導入した大腸菌によるＨｌｎｃ ｎ修飾酵素の生産 Ｈｌｎｃ ＩＦ修飾酵素遺伝子を組込んだプラスミドＰ
ＡＨ−Ｍ、 Ｈｃは、〔実施例１）（８）に示した様に
して作製した。このプラスミドｐＡＨ−Ｍ、 Ｈａのみ
を導入した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＲＲ１／ ｐＡ）Ｊ −Ｍ、 Ｈｃ）によるＨｌｎｃ
ＩＩ修飾酵素の生産方法を以下に示す。前記大腸菌を
クロラムフエニズ１■ Ｃ（つ３） ＭｅｔＳｅｒＰｈｅ１１ｅＬｙｓＰｒｏｌｌｅＴｙｒＧ
１ｎＡｓｐＨｅＡｓｎＳｅｒｌｌｅ２０６３ Ｔ
丁ＡＡＴＣＧＧＧＣＡＡＡＡＡＧ丁ＧＡＡＡＣＧ丁ＣＣ
Ｔ＾＾ＡＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＴＧＴＣＡＧＧＴ１５
ＬｅｕｌｌｅＧ１ｙＧ１ｎＬｙｓＶａｌＬｙｓＡｒｚ
ＰｒｏＬｙｓＳｅｒＧ１ｙＴｈｒＬｅｕＳｅｒＧ１ｙ２
１１１ＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＴＴＴＧ
ＡＡ＾＾ＡＴＴＡＧ丁ＡＴ＾丁ＡＡＧＴＴＴＴＴＧ＾＾
＾３１ ＨｉｓＡ］ａ＾１ａＧ１ｙＧ１ｕＰｒｏ
ＰｈｅＧ１ｕＬｙｓＬｅｕＶａ１丁ｙｒＬｙｓＰｈｅＬ
ｅｕＬｙｓ２１５９ ＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡ
ＧＡＴＴＴＡＡＣＡＴ丁ＴＡＡＧＣ＾＾ＴＡＴＧ＾＾Ｔ
ＡＴＣＴＴＡＡ丁ＧＡ丁４７ Ｇ１ｕＡｓｎＬｅ
ｕＳｅｒＡｓｐＬｅｕＴｈｒＰｈｅＬｙｓＧ１ｎ丁ｙｒ
Ｇ１ｕ丁ｙｒＬｅｕＡｓｎＡｓｐ２２０７ ＴＴ
ＡＴＴＴＡＴＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＧＣＧＡＴＡ＾丁Ｔ
ＧＧＡＣＡ丁ＧＡＡＧＣＴＡＧＡＴ＾丁Ａ＾＾５３
１６ｕｐｈ６ＭｅｔＬｙｓＡｓｎＰｒｏ＾１ａｌｌｅ
ｌｌｅＧ１ｙＨｉｓＧｌｕＡ１ａＡｒ（ＴｙｒＬｙｓ２
２５５ ＴＴＡＴＴ丁＾ＡＴＴＣＴＣＣＡＡＣ＾
丁ＴＧＣ丁ＴＴＴＴＴＴＧＴＴ＾＾ＧＴ＾ＧＡＧＧＴ＾
＾ＡＧＣＴ７９ＬｅｕＰｈｅＡｓｎＳｅｒＰｒｏＴｈｒ
ＬｅｕＬｅｕＰｈｅＬｅｕＬｅｕＳｅｒ＾ｒＨＧｌｙＬ
ｙｓ＾１ａ２３０３ ＧＣ＾＾Ｃ丁ＧＡＡ＾＾Ｔ
ＴＧＧＡＧＣＡ丁ＡＧ＾＾＾＾ＴＴＴＡＴＴ丁ＧＡＧＧ
ＡＧＡＡＡＣＡ＾＾＾Ｔ９５ ＾］ａＴｈｒＧ１ｕ
ＡｓｎＴｒｐｓｅｒ１１ｅＧ１ｕＡｓｎＬｅｕＰｈｅＧ
ｌｕＧ１ｕＬｙｓＧ１ｎＡｓｎ１１ ＡｓｐＴｈｒＡｌ ａＡｓｐ ＩＩ ｅＬｅｕ Ｌｅｕ
Ｖａｌ ＬｙｓＡｓ ｐＧｌ ｎ ＰｈｅＴｙｒＧｌ
ｕ ＬｅｕＬｅ ｕ４３ １１ｅＳｅｒＡ１ａＴｙｒＬｙｓＬｅｕ＾１ａＧ１ｎＴ
ｈｒＣｙｓＡ１ａＬｙｓＭｅｔ１１ｅＡｓｐＡｓｎ４９
５ ５９ ＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧＡＴＡＴＴＡ
Ａ ＴＴＡ ＴＴＴＡＧＡ Ａ ＧＴＡＧＡＣＴＣＧ
ＧＡ ＡＬｙｓＧｌ ｕ ＰｈｅＡｓ ｐＬｅｕ Ｐｈ
ｅＡｓｐ １１ｅＡｓ ｎＴｙｒＬｅｕＧｌ ｕ Ｖａ
ｌ Ａ ｓｐＳ ｅ ｒＧｌ ｕ９１ ＰｈｅＬｙｓＳｅ ｒＧｌ ｕ ＰｒｏＳｅｒＧｌｕ
ＬｅｕＴｙ ｒＩ １ ｅＡｓ ｎＴｒｐ Ａ ｌａ
Ａｌａ Ａｌ ａｇｅ ｔ２６３９ ＣＡＡＡＴＴ
ＣＡＧＴＴＴＣＡＴＧＴＡＡＧＡＧＡＴＴＴＡＧＡＴＣ
ＡＧＧＧＧＴＴＴＡＡＴＧＧＡＡＣＴ２０７ Ｇ１ｎ
１１ｅＧ１ｎＰｈｅ）ＩｉｓＶａｌＡｒｇＡｓｐＬｅｕ
ＡｓｐＧ１ｎＧ１ｙＰｈｅＡｓｎＧｌｙＴｈｒ６８７ ２３ Ａ ＧＡＧＡＡ ＧＡ ＡＴＧＧＧＣＡ ＡＡ Ａ Ｔ
ＣＴＴＡＴＣＴＡＡ Ａ Ａ ＣＡＴＴＴＴＧＴＴＡＣ
ＴＣＡ ＡＧＣＡＡｒｇＧ１ｕＧ１ｕＴｒｐＡｌａＬｙ
ｓＳｅｒＴｙｒＬｅｕＬｙｓＨｉｓＰｈｅＶａｌＴｈｒ
ＧｌｎＡｌａ７３５ ３９ ＧＡＧＣＡＡ Ａ ＧＡＧＣＣＡＴＡ ＴＣＴＡＴＧＡ
ＴＡＧＡＴＡ ＡＧＴＴＴＧＴＴＡ ＡＧＣＣＡ Ｔ
ＴＴＡ ＡＧＧｌｕＧｌｎ ＡｒｇＡｌａ ＩＩ ｅＳ
ｅｒＭｅｔ １１ｅＡｓ ｐＬｙｓＰｈｅ Ｖａ ｌ
Ｌｙｓ Ｐ ｒｏＰｈｅＬｙｓ７８３ ５５ ＾ＡＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣ
ＡＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＴＬｙｓＴｙｒＩ
ｌｅＬｅｕｕ本
ドを導入した大腸菌によるＨｌｎｃ ｎ修飾酵素の生産 Ｈｌｎｃ ＩＦ修飾酵素遺伝子を組込んだプラスミドＰ
ＡＨ−Ｍ、 Ｈｃは、〔実施例１）（８）に示した様に
して作製した。このプラスミドｐＡＨ−Ｍ、 Ｈａのみ
を導入した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＲＲ１／ ｐＡ）Ｊ −Ｍ、 Ｈｃ）によるＨｌｎｃ
ＩＩ修飾酵素の生産方法を以下に示す。前記大腸菌を
クロラムフエニズ１■ Ｃ（つ３） ＭｅｔＳｅｒＰｈｅ１１ｅＬｙｓＰｒｏｌｌｅＴｙｒＧ
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ＡＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＴＬｙｓＴｙｒＩ
ｌｅＬｅｕｕ本
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、組換え体により生産される純化されたＨｉｎｃII制
限酵素。 ２、ＨｉｎｃII制限・修飾系酵素遺伝子。 ３、ＨｉｎｃII制限・修飾系酵素遺伝子が組み込まれた
プラスミドを保有する微生物を培養し、培養物よりＨｉ
ｎｃII制限酵素及び／又は修飾酵素を採取することを特
徴とするＨｉｎｃII制限酵素及び／又は修飾酵素の製造
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2042892A JPH03247279A (ja) | 1990-02-23 | 1990-02-23 | Ｈｉｎｃ２制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2042892A JPH03247279A (ja) | 1990-02-23 | 1990-02-23 | Ｈｉｎｃ２制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03247279A true JPH03247279A (ja) | 1991-11-05 |
Family
ID=12648685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2042892A Pending JPH03247279A (ja) | 1990-02-23 | 1990-02-23 | Ｈｉｎｃ２制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03247279A (ja) |
-
1990
- 1990-02-23 JP JP2042892A patent/JPH03247279A/ja active Pending
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