JPH03201989A - リポプロテインリパーゼの遺伝情報を有するｄｎａ - Google Patents
リポプロテインリパーゼの遺伝情報を有するｄｎａInfo
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- JPH03201989A JPH03201989A JP1344663A JP34466389A JPH03201989A JP H03201989 A JPH03201989 A JP H03201989A JP 1344663 A JP1344663 A JP 1344663A JP 34466389 A JP34466389 A JP 34466389A JP H03201989 A JPH03201989 A JP H03201989A
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、微生物由来のリポプロティンリパーゼをコー
ドする遺伝子のＤＮＡ配列に関する。
ドする遺伝子のＤＮＡ配列に関する。
リボプロティンリパーゼ（以下、ＬＰＬと略す）は生体
中のカイロ累クロン、その他の低比重リポタンパク質の
トリグリセライドを加水分解する特殊なトリアジルグリ
セロ−プロティンアシルハイドロラーゼ（Ｅ Ｃ３，１
，１，３４）である。当＝亥酵素は、その効率的な加水
分解に、例えばプロテアーゼ等の助力を必要とするいわ
ゆるリパーゼ（トリアジルグリセロールアシルハイドロ
ラーゼ、ＥＣ０３，１，１，３）と区別されている。
中のカイロ累クロン、その他の低比重リポタンパク質の
トリグリセライドを加水分解する特殊なトリアジルグリ
セロ−プロティンアシルハイドロラーゼ（Ｅ Ｃ３，１
，１，３４）である。当＝亥酵素は、その効率的な加水
分解に、例えばプロテアーゼ等の助力を必要とするいわ
ゆるリパーゼ（トリアジルグリセロールアシルハイドロ
ラーゼ、ＥＣ０３，１，１，３）と区別されている。
従来、ＬＰＬはシュードモナス属やクロモバクテリウム
属等の微生物や人、マウス、牛等の哺乳類に存在するこ
とが知られており、特に微生物由来のＬＰＬが工業的に
製造されている（特公昭６３−３５９４号公報）。
属等の微生物や人、マウス、牛等の哺乳類に存在するこ
とが知られており、特に微生物由来のＬＰＬが工業的に
製造されている（特公昭６３−３５９４号公報）。
ＬＰＬは特に臨床検査分野において、血清又はその他の
試料中のトリグリセライドの定量に広く利用されている
。しかしながら、ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配
列については人（ｓ（ｉｅｎｃｅ２３５ １６３８〜１
６４１（１９８７）） 、マウス（Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
試料中のトリグリセライドの定量に広く利用されている
。しかしながら、ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配
列については人（ｓ（ｉｅｎｃｅ２３５ １６３８〜１
６４１（１９８７）） 、マウス（Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｎ＋、 ２６２ ８４６３〜８４６６ （１９８
７））、牛（Ｐｒｏｃ。
７））、牛（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ
、 ８４ ４３６９ 〜４３７３（１９８７））等
哺乳類のものについては知られているが、微生物由来の
ものに関しては全く知られていなかった。
、 ８４ ４３６９ 〜４３７３（１９８７））等
哺乳類のものについては知られているが、微生物由来の
ものに関しては全く知られていなかった。
なお、シュードモナスフラジが生産する、いわゆるリパ
ーゼについては、すでにＤＮＡ配列が知られているが（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏ
ｍａ＋ｕｎ。
ーゼについては、すでにＤＮＡ配列が知られているが（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏ
ｍａ＋ｕｎ。
１４Ｌ １８５〜１９０ （１９８６）、特開昭６４−
７４９９２号公報）これらは上記したように明らかに本
発明とは異なる酵素である。
７４９９２号公報）これらは上記したように明らかに本
発明とは異なる酵素である。
本発明の課題は、遺伝子工学的手法によりＬＰｌ、を効
率良く生産したり、ＬＰＬの構造を明らかにするための
、微生物由来のＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列
を提供することにある。
率良く生産したり、ＬＰＬの構造を明らかにするための
、微生物由来のＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列
を提供することにある。
本発明者らは、上記の課題を解決するため、微生物由来
のＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列について検討
した。そして、ＬＰＬ生産菌の有するＬＰＬ遺伝子をク
ローニングし、該遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ると
ともに該遺伝子のＤＮＡ配列を決定することに成功し、
さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
のＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列について検討
した。そして、ＬＰＬ生産菌の有するＬＰＬ遺伝子をク
ローニングし、該遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ると
ともに該遺伝子のＤＮＡ配列を決定することに成功し、
さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は微生物由来のＬＰＬをコードする遺
伝子のＤＮＡ配列に関するものである。
伝子のＤＮＡ配列に関するものである。
本発明のＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列は一義
的には決まらず、多種存在する可能性があり得る。この
ことは、よく知られているように、多くのアミノ酸にお
いて、それをコードする遺伝子のＤＮＡ配列が複数存在
することからも当然のことである。本発明者等により明
らかにされたＬＰＬのアミノ酸配列をコードする遺伝子
の場合も、そのＤＮＡ配列は天然の遺伝子の塩基配列以
外にも多数の可能性があり、本発明のＤＮＡ配列は、天
然のＤＮＡ配列のみに限定されるものではなく、本発明
により明らかにされたＬＰＬのアミノ酸配列をコードす
る他のＤＮＡ配列も含むものである。
的には決まらず、多種存在する可能性があり得る。この
ことは、よく知られているように、多くのアミノ酸にお
いて、それをコードする遺伝子のＤＮＡ配列が複数存在
することからも当然のことである。本発明者等により明
らかにされたＬＰＬのアミノ酸配列をコードする遺伝子
の場合も、そのＤＮＡ配列は天然の遺伝子の塩基配列以
外にも多数の可能性があり、本発明のＤＮＡ配列は、天
然のＤＮＡ配列のみに限定されるものではなく、本発明
により明らかにされたＬＰＬのアミノ酸配列をコードす
る他のＤＮＡ配列も含むものである。
さらに遺伝子組換技術によれば、基本となるＤＮＡ特定
の部位に、該ＤＮＡがコードするものの基本的な特性を
変化させることなく、あるいはその特性を改善するよう
に、人為的に変異を起こすことができる０本発明により
提供される天然の塩基配列を有するＤＮＡあるいは天然
のものとは異なる塩基配列を有するＤＮＡに関しても同
様に人為的に挿入、欠失、置換を行うことにより天然の
遺伝子を同等あるいは改善された特性とすることが可能
であり、本発明はそのような変異遺伝子をも当然に含む
ものである。
の部位に、該ＤＮＡがコードするものの基本的な特性を
変化させることなく、あるいはその特性を改善するよう
に、人為的に変異を起こすことができる０本発明により
提供される天然の塩基配列を有するＤＮＡあるいは天然
のものとは異なる塩基配列を有するＤＮＡに関しても同
様に人為的に挿入、欠失、置換を行うことにより天然の
遺伝子を同等あるいは改善された特性とすることが可能
であり、本発明はそのような変異遺伝子をも当然に含む
ものである。
本発明においてＬＰＬをコードする遺伝子は、シュード
モナス属に属する微生物由来のものであることが好まし
い。
モナス属に属する微生物由来のものであることが好まし
い。
また、本発明におけるＤＮＡ配列は下記のアミノ酸配列
をコードするものであることが好適である。
をコードするものであることが好適である。
以下、本発明を実施するための各ステップについて詳細
に説明する。
に説明する。
（ａ）ＬＰＬをコードする遺伝子を有するＤＮＡＰＨＧ
ＶＰＴＳＡＣＧＥＧＡＹＫＶＮＧＶＳＹＹＳＷＳＧＳＳ
ＰＬＴＮＦＬＤＰＳＤＡＦＬＧＡＳＳＬＴＦＫＮＱＨＡ
ＮＲＬＫＮＡＳＬ さらに、本発明におけるＤＮＡ配列は下記のＤＮＡ配列
を有するものであることが好適である。
ＶＰＴＳＡＣＧＥＧＡＹＫＶＮＧＶＳＹＹＳＷＳＧＳＳ
ＰＬＴＮＦＬＤＰＳＤＡＦＬＧＡＳＳＬＴＦＫＮＱＨＡ
ＮＲＬＫＮＡＳＬ さらに、本発明におけるＤＮＡ配列は下記のＤＮＡ配列
を有するものであることが好適である。
ＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣ
ＴＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＧＣＣＴＣＧＣＣＴＣ
ＴＣＴＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＴＣＣＡＧ
ＧＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＡＴ
ＧＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＡＴＴＣＣＣＡ
ＧＣＧＣＣＴＴＧＣＧＣＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＣＣＣＡ
ＧＧＴＣＴＡＣＧＴＣＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣＡＧ
ＴＴＧＧＡＣＡＣＣＴＣＧＧＡＡＧＴＣＣＧＣＧＧＣＧ
ＡＧＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡ
ＡＡＴＣＧＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣ
八ＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣ
ＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＧＡＣＣＡＴＣＣＧＣＴＡＣＧＴ
ＣＧＣＣＧＣＣＧＴＡＣＧＴＣＣＣＧＡＣＣＴＧＡＴＣ
ＧＣＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＴＣＧＧＣ［：ＣＣ
Ｃ断片及び組み換えベクターの調製 本発明に用いられる組み換えベクターは、例えばエシェ
リヒア属に属する微生物の培養された細胞内での複製能
を有するベクターＤＮＡに、ＬＰＬ生産能を有する微生
物から調製されたＬＰＬをコードする遺伝子を有するＤ
ＮＡ断片を組み込んでなるものである。
ＴＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＧＣＣＴＣＧＣＣＴＣ
ＴＣＴＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＴＣＣＡＧ
ＧＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＡＴ
ＧＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＡＴＴＣＣＣＡ
ＧＣＧＣＣＴＴＧＣＧＣＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＣＣＣＡ
ＧＧＴＣＴＡＣＧＴＣＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣＡＧ
ＴＴＧＧＡＣＡＣＣＴＣＧＧＡＡＧＴＣＣＧＣＧＧＣＧ
ＡＧＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡ
ＡＡＴＣＧＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣ
八ＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣ
ＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＧＡＣＣＡＴＣＣＧＣＴＡＣＧＴ
ＣＧＣＣＧＣＣＧＴＡＣＧＴＣＣＣＧＡＣＣＴＧＡＴＣ
ＧＣＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＴＣＧＧＣ［：ＣＣ
Ｃ断片及び組み換えベクターの調製 本発明に用いられる組み換えベクターは、例えばエシェ
リヒア属に属する微生物の培養された細胞内での複製能
を有するベクターＤＮＡに、ＬＰＬ生産能を有する微生
物から調製されたＬＰＬをコードする遺伝子を有するＤ
ＮＡ断片を組み込んでなるものである。
かかるものの好適な例としては、以下の如くして調製さ
れたものが例示される。すなわち、シュードモナスＰＳ
−２１（微工研菌寄第７０２６号）を栄養培地で培養し
、培養物を得る。この培養物を、例えば５． ＯＯＯｒ
ｐｍ以上、好ましくは８．０００〜１０．０００ｒｐ−
で５分以上、好ましくは１０−１５分間遠心分離してシ
ュードモナスＰＳ−２１の菌体を得る。
れたものが例示される。すなわち、シュードモナスＰＳ
−２１（微工研菌寄第７０２６号）を栄養培地で培養し
、培養物を得る。この培養物を、例えば５． ＯＯＯｒ
ｐｍ以上、好ましくは８．０００〜１０．０００ｒｐ−
で５分以上、好ましくは１０−１５分間遠心分離してシ
ュードモナスＰＳ−２１の菌体を得る。
この菌体より、例えばＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ｒｏｄｒｉｑｕｅｓ、 Ｒ，
Ｌ、 ｅｔ ａｌ、 ＡｄｄｉｓｏｎＷｅｓｌｅｙ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ＋ １９８３）記
載の方法、あるいはＫｏｉｚｕｓｉ Ｊ、 らの方法
（Ｂｉｏｔｅｃｈ、 Ｂｉｏｅｎｇ。
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ｒｏｄｒｉｑｕｅｓ、 Ｒ，
Ｌ、 ｅｔ ａｌ、 ＡｄｄｉｓｏｎＷｅｓｌｅｙ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ＋ １９８３）記
載の方法、あるいはＫｏｉｚｕｓｉ Ｊ、 らの方法
（Ｂｉｏｔｅｃｈ、 Ｂｉｏｅｎｇ。
、 ２７ ７２１３７２８．１９８５）等により染色体
ＤＮＡを得ることができる。
ＤＮＡを得ることができる。
この染色体ＤＮＡにＢａ１Ｉ旧、 ＥｃｏＲＩ、 ５ａ
ｕ３ＡＩ、 （東洋結髪）等の制限酵素を用いて、部分
分解又は完全分解することにより、種々の大きさの染色
体ＤＮＡ断片混合物を得る。
ｕ３ＡＩ、 （東洋結髪）等の制限酵素を用いて、部分
分解又は完全分解することにより、種々の大きさの染色
体ＤＮＡ断片混合物を得る。
このようにして得られたＤＮＡ断片混合物から、例えば
ショ糖密度勾配遠心分離等により低分子量のＤＮＡ断片
を除き、さらにエタノール沈澱法等の濃縮手段により濃
縮し、ＬＰＬをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片
混合物を得る。
ショ糖密度勾配遠心分離等により低分子量のＤＮＡ断片
を除き、さらにエタノール沈澱法等の濃縮手段により濃
縮し、ＬＰＬをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片
混合物を得る。
一方、本発明に用いるベクターＤＮＡとしては、如何な
るものでもよく、例えばプラス旦ドベクターＤＮＡ、バ
タテリオファージベクターＤＮＡ等が挙げられるが、好
適な例としてはプラスミドベクターｐＢＲ３２２，ｐＵ
ｃ１９（東洋結髪）、バクテリオファージベクターＥＭ
ＢＬ３．λＺＡＰ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）等が挙
げられる。
るものでもよく、例えばプラス旦ドベクターＤＮＡ、バ
タテリオファージベクターＤＮＡ等が挙げられるが、好
適な例としてはプラスミドベクターｐＢＲ３２２，ｐＵ
ｃ１９（東洋結髪）、バクテリオファージベクターＥＭ
ＢＬ３．λＺＡＰ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）等が挙
げられる。
次に、上記ベクターＤＮＡに上記のようにして得たＬＰ
Ｌをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物を連
結する。連結には、例え１大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ、
−ＤＮＡリガーゼ（東洋結髪）等、好ましくはＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼを４〜３７°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃ
で酵素１〜１００ユニツ）１時間以上、好ましくは４〜
１６時間作用させて組み換えＤＮＡを得る。
Ｌをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物を連
結する。連結には、例え１大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ、
−ＤＮＡリガーゼ（東洋結髪）等、好ましくはＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼを４〜３７°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃ
で酵素１〜１００ユニツ）１時間以上、好ましくは４〜
１６時間作用させて組み換えＤＮＡを得る。
この組み換えＤＮＡを用いて、例えばＥ、ｃｏｌｉに１
２、好ましくは８．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ８８１０１株、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｐ２３９２株、Ｅ
、ｃｏｌｉ ＸＬＩ−ｂｌｕｅ株（ＳＴＲＡＴＡＧｆ！
Ｎ［り等を形質転換あるいは形質導入して、それぞれの
菌体を得る。この形質転換及び形質導入は、例えばＭｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｍａｎｉａｔｉｅ
ｓ Ｔ。
２、好ましくは８．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ８８１０１株、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｐ２３９２株、Ｅ
、ｃｏｌｉ ＸＬＩ−ｂｌｕｅ株（ＳＴＲＡＴＡＧｆ！
Ｎ［り等を形質転換あるいは形質導入して、それぞれの
菌体を得る。この形質転換及び形質導入は、例えばＭｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｍａｎｉａｔｉｅ
ｓ Ｔ。
ｅｔ ａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
１９Ｂ２）記載の方法により行うことができる。
１９Ｂ２）記載の方法により行うことができる。
（ｂ）ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を有した
組み換えプラスミドの調製 上記菌株よりのＬＰＬをコードする遺伝子を含有する組
み換えＤＮＡの検索は、公知のハイブリダイゼーション
による方法、抗ＬＰＬ抗体を用いる方法、ハロー形成等
によるＬＰＬ活性を検出する方法等いずれの方法でも行
うことができる。
組み換えプラスミドの調製 上記菌株よりのＬＰＬをコードする遺伝子を含有する組
み換えＤＮＡの検索は、公知のハイブリダイゼーション
による方法、抗ＬＰＬ抗体を用いる方法、ハロー形成等
によるＬＰＬ活性を検出する方法等いずれの方法でも行
うことができる。
さらに上記組み換えＤＮＡ中のＬＰＬをコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ断片を常法に従い小断片化して上記
プラスミドベクターＤＮＡと連結し、ＬＰＬをコードす
る遺伝子のＤＮＡ配列を有した組み換えプラスミドを得
ることができる。
子を含有するＤＮＡ断片を常法に従い小断片化して上記
プラスミドベクターＤＮＡと連結し、ＬＰＬをコードす
る遺伝子のＤＮＡ配列を有した組み換えプラスミドを得
ることができる。
（Ｃ）ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列の決定
上記ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を有した組
み換えプラスミドよりＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮ
Ａ配列を決定するには、公知の方法、例えばＳａｎｇｅ
ｒ等によるｄｉｄｅｏｘｙ法（Ｐｒｏｃ。
み換えプラスミドよりＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮ
Ａ配列を決定するには、公知の方法、例えばＳａｎｇｅ
ｒ等によるｄｉｄｅｏｘｙ法（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、＾、、
７４．５４６３〜５４６７゜１９７７）を用いて決定す
ることができる。
７４．５４６３〜５４６７゜１９７７）を用いて決定す
ることができる。
［実施例〕
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
（１）シュードモナスＰＳ−２１の染色体ＤＮＡの調製
シュードモナスＰＳ−２１（微工研菌寄第７０２６号）
をＬＢ培地（ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５
％、塩化ナトリウム１．０％、ｐＨ７，４）１００−に
接種し、３０°Ｃで８時間振盪培養して培養物を得た。
をＬＢ培地（ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５
％、塩化ナトリウム１．０％、ｐＨ７，４）１００−に
接種し、３０°Ｃで８時間振盪培養して培養物を得た。
この培養物を１２．００Ｏｒｐｍ 、１０分間遠心分離
して湿菌体約１ｇを得た後、該菌体からＲｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ｒｏｄｒ
ｉｑｕｅｚ Ｒ，Ｌ。
して湿菌体約１ｇを得た後、該菌体からＲｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ｒｏｄｒ
ｉｑｕｅｚ Ｒ，Ｌ。
ｅｔ ａｌ、 Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ＋１９８３）記載の方
法により染色体Ｄ Ｎ Ａｉ／Ｊ１．８■を調製した。
ｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ＋１９８３）記載の方
法により染色体Ｄ Ｎ Ａｉ／Ｊ１．８■を調製した。
次に、この染色体ＤＮＡ １００μｇを制限酵素Ｍｂｏ
ｌｌ （宝酒造社製）で常法に従い部分分解し、５〜
２０％ショ糖密度勾配遠心分離を行って７〜１２ａＫｂ
画分のＤＮＡ断片約ｌＯμｇを調製した。
ｌｌ （宝酒造社製）で常法に従い部分分解し、５〜
２０％ショ糖密度勾配遠心分離を行って７〜１２ａＫｂ
画分のＤＮＡ断片約ｌＯμｇを調製した。
（２）ＬＰＬをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片
及び該ＤＮＡ断片を有する組み換えベクターの調製 バクテリオファージベクターＥＭＢＬ３ （Ｂａｓ＋旧
切断済、５ＴＲＡＴＡＧＩＩ！ＮＥ製）ｌμｇと上記（
１）で得られたＤＮＡ断片０．５μｇをＴ、−ＤＮＡリ
ガーゼ（東洋結髪）■ユニットで１６°Ｃ１１２時間反
応させＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはλＤＮＡイ
ンビトロパッケージングキットＧｉｇａｐａｃｋ Ｇｏ
ｌｄ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いてパッケージ
ソゲした。パッケージングにより得られた組み換えファ
ージはＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉ
ａｔｉｅｓ Ｔ、 ｅｔ ａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ ＩＩａｒｂｏｒ＋１９８２）記載の方法でＥ、ｃ
ｏｌｉ Ｐ２３９２ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）に形
質導入した。使用ＤＮＡＩμｇ当り、約ｌＸｌ０’個の
ファージプラークが得られた。
及び該ＤＮＡ断片を有する組み換えベクターの調製 バクテリオファージベクターＥＭＢＬ３ （Ｂａｓ＋旧
切断済、５ＴＲＡＴＡＧＩＩ！ＮＥ製）ｌμｇと上記（
１）で得られたＤＮＡ断片０．５μｇをＴ、−ＤＮＡリ
ガーゼ（東洋結髪）■ユニットで１６°Ｃ１１２時間反
応させＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはλＤＮＡイ
ンビトロパッケージングキットＧｉｇａｐａｃｋ Ｇｏ
ｌｄ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いてパッケージ
ソゲした。パッケージングにより得られた組み換えファ
ージはＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉ
ａｔｉｅｓ Ｔ、 ｅｔ ａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ ＩＩａｒｂｏｒ＋１９８２）記載の方法でＥ、ｃ
ｏｌｉ Ｐ２３９２ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）に形
質導入した。使用ＤＮＡＩμｇ当り、約ｌＸｌ０’個の
ファージプラークが得られた。
（３）ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を有した
組み換えプラスミドの調製 ＬＰＬをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片を有す
る組み換えファージの検索はプラーク・ハイブリダイゼ
ーションにより行った。すなわち、シュードモナスＰＳ
−２１生産のＬＰＬのアミノ酸配列より２１ｍａｒのミ
ックスプローブを作威し、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナ
ーゼとｒ ３２ ｐＡＴＰを用いてアイソトープラベ
ルしてＤＮＡプローブとした。常法に従いプラーク・ハ
イブリダイゼーションを行ったところ、上記ファージプ
ラーク１０００個当り、２〜３個の陽性シグナルが得ら
れた。
組み換えプラスミドの調製 ＬＰＬをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片を有す
る組み換えファージの検索はプラーク・ハイブリダイゼ
ーションにより行った。すなわち、シュードモナスＰＳ
−２１生産のＬＰＬのアミノ酸配列より２１ｍａｒのミ
ックスプローブを作威し、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナ
ーゼとｒ ３２ ｐＡＴＰを用いてアイソトープラベ
ルしてＤＮＡプローブとした。常法に従いプラーク・ハ
イブリダイゼーションを行ったところ、上記ファージプ
ラーク１０００個当り、２〜３個の陽性シグナルが得ら
れた。
陽性シグナルを示す組み換えファージ１種を純化し、常
法に従ってファージＤＮＡを調製したところ、約１５Ｋ
ｂｐのＤＮＡが挿入されていた（第１図参照）。
法に従ってファージＤＮＡを調製したところ、約１５Ｋ
ｂｐのＤＮＡが挿入されていた（第１図参照）。
次いで、この１５Ｋｂｐの挿入ＤＮＡを種々の制限酵素
で切断してｐＵｃ１９にサブクローニングし、ＬＰＬを
コードする遺伝子のＤＮＡ配列を含有する組み換えプラ
スミド５ｕｂｃｌｏｎｅ Ａを得た。
で切断してｐＵｃ１９にサブクローニングし、ＬＰＬを
コードする遺伝子のＤＮＡ配列を含有する組み換えプラ
スミド５ｕｂｃｌｏｎｅ Ａを得た。
５ｕｂｃｌｏｎｅ Ａの挿入ＤＮＡ約４．３Ｋｂは種々
の制限酵素により特徴付けられた（第１図参照）。
の制限酵素により特徴付けられた（第１図参照）。
（４）ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列の決定
上記（３）の５ｕｂｃｌｏｎｅ Ａをさらに種々の制限
酵素で切断して小断片化し、５ｅｑｕｅｎａｓｅ ”Ｄ
ＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ （東洋結髪）を用
いて塩基配列の決定を行った。その結果、第２図に示す
ようなオープンリーディングフレームの存在が認められ
た。オープンリープインクフレーム塩基配列及びアミノ
酸配列を第２図に示した。なお、このオープンリーディ
ングフレーム中には、シュードモナスＰＳ−２１の生産
するＬＰＬのＮ末端アミノ酸配列と相同配列が存在しく
第２図下部）、ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列
であることが確認された。
酵素で切断して小断片化し、５ｅｑｕｅｎａｓｅ ”Ｄ
ＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ （東洋結髪）を用
いて塩基配列の決定を行った。その結果、第２図に示す
ようなオープンリーディングフレームの存在が認められ
た。オープンリープインクフレーム塩基配列及びアミノ
酸配列を第２図に示した。なお、このオープンリーディ
ングフレーム中には、シュードモナスＰＳ−２１の生産
するＬＰＬのＮ末端アミノ酸配列と相同配列が存在しく
第２図下部）、ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列
であることが確認された。
本発明はＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を提供
するものであり、このＤＮＡ配列により、ＬＰＬの効率
的生産やＬＰＬの構造解析等が可能になると期待される
。
するものであり、このＤＮＡ配列により、ＬＰＬの効率
的生産やＬＰＬの構造解析等が可能になると期待される
。
第１図はプラーク・ハイブリダイゼーションで陽性シグ
ナルを示す組み換えファージの挿入ＤＮＡの制限酵素地
図及び５ｕｂｃｌｏｎｅ Ａ挿入ＤＮＡの制限酵素地図
を示す。 第２図（ａ）、０））はシュードモナスＰＳ−２１由来
ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するＤ
ＮＡ配列を示す。なお、下部はシュードモナスＰＳ−２
１の生産するＬＰＬのＮ末端アミノ酸配列と相同配列部
位を示す。 第２図 （ａ） 第２図 （ｂ） ＡＴＧＡＡＧ＾＾ＧＡＡＧ ＫＫＫＳ ＾ ＾ ＾ ＾ｃｃｃｃ丁ＣＴＧＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＴ
ＡＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＡＴＡＣＣＣＣＡＴＣＧＴ
ＧＣＴＧＧＣＣＣＡＣ５Ｐ Ｌ Ｉ Ｑ Ａ
Ｓ Ｔ Ｙ Ｔ Ｑ Ｔ Ｘ Ｙ
Ｐ Ｉ Ｖ Ｌ Ａ ｌ１Ｇ ＧＣＡ ＴＧ
ＣＴＣＧＧＣＴＴＣＧ ＡＣＡ Ａ ＣＡ ＴＣＣＴ
ＣＧＧ Ｇ Ｇ ＴＣＧ ＡＣＴ Ａ ＣＴＩ；Ｇ Ｔ
ＴＣＧＧＣＡＴＴＣＣＣＡ ＧＣＧＣＣＧＭＬＧＦＤ
ＮＩＬＧＶＤＹＷＦＧＩＰＳ＾ＴＴＧＣＧＣＣＧＴＧＡ
ＣＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＴＣＴＬＲＲＤＧＡＱＶＹ ＾Ａ ＶＴＥＶＳ（ＩＬＤＴｓＥ Ｇ丁ＣＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＣ
ＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＶＲＧ ε ＱＬＬＱＱＶ
ＥＥＩＶＡし ＾＾ＧＧ丁ＣＡＡＣＣＴＧＡ にＶＮＬＩ ＴＣＣＧＣＴＡＣＧＴＣＧＣＣＧＣＣＧＴ＾ＰＴＩＲＹ
ＶＡＡＶ ＣＧＴＣＣＣＧＡＣＣ丁ＧＡＴＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＡ
ＣＣＲＰ Ｄ Ｌ Ｉ Ａ
’ Ｓ Ａ Ｔ Ｓ Ｖ Ｇ Ａ Ｐ
ＩＩ Ｋ Ｇ Ｓ Ｄ ＴＧＣＣＧＡＣ
Ｔ丁ＣＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＣＧＧＧＴＴ
ＣＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＧＣＡＡＴＣＣＴＣＴＣＣＧＧ
ＧＣＴＧ＾ＤＦＬＲＱＩＰＰＧＳＡＧＥＡＩＬＳＧＬし ■ ＡＣＧＣＡＧＡＡＴ ＧＴＱＮ ＴＣＡＣＴＧＧＧＣＴＣＧＣＴＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＡ
ＡＣＡＧＣＧＳＬＧＳＬ［！５ＬＮＳＥ ＾Ｃ ＧＡＡＲＦＮＡ に Ｖ ＣＣＧＣＡ
ＡＣ：ＡＡＧＧＴＣＡＡＣＧＧＣＧＴＧＡＧ
ＣＰＩＩＧＶＰＴＳＡＣＧＥＧＡＹＫＶＮＧＶＳＴＡＴ
Ｔ ＡＣＣ＾＾
ＣＴＴＣＣＴＣＧＡＴＣＣＧＡＧＣＧＡＣＧＣＣＴＴＣ
ＹＹＳＷＳＧＳＳＰＬＴＮＦＬＤＰＳＤＡＦ＾ し ＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣ＾＾ＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＧＴＣ
ＧＧＣＡＣＣに ＮＧＴＡＮＤＧＬＶＧＴ
ナルを示す組み換えファージの挿入ＤＮＡの制限酵素地
図及び５ｕｂｃｌｏｎｅ Ａ挿入ＤＮＡの制限酵素地図
を示す。 第２図（ａ）、０））はシュードモナスＰＳ−２１由来
ＬＰＬをコードする遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するＤ
ＮＡ配列を示す。なお、下部はシュードモナスＰＳ−２
１の生産するＬＰＬのＮ末端アミノ酸配列と相同配列部
位を示す。 第２図 （ａ） 第２図 （ｂ） ＡＴＧＡＡＧ＾＾ＧＡＡＧ ＫＫＫＳ ＾ ＾ ＾ ＾ｃｃｃｃ丁ＣＴＧＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＴ
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ＧＧＣＡＣＣに ＮＧＴＡＮＤＧＬＶＧＴ
Claims (4)
- （１）微生物由来のリポプロテインリパーゼをコードす
る遺伝子のＤＮＡ配列。 - （２）微生物がシュードモナス属に属する微生物である
請求項１記載のＤＮＡ配列。 - （３）下記のアミノ酸配列をコードする請求項１又は２
記載のＤＮＡ配列。 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 - （４）下記のＤＮＡ配列を有する請求項１又は２記載の
ＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1344663A JPH0779703B2 (ja) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | リポプロテインリパーゼの遺伝情報を有するｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1344663A JPH0779703B2 (ja) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | リポプロテインリパーゼの遺伝情報を有するｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03201989A true JPH03201989A (ja) | 1991-09-03 |
| JPH0779703B2 JPH0779703B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=18371020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1344663A Expired - Fee Related JPH0779703B2 (ja) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | リポプロテインリパーゼの遺伝情報を有するｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0779703B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997035974A1 (fr) * | 1996-03-26 | 1997-10-02 | Institut Pasteur | Sequences en amont du gene sm22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS633594A (ja) * | 1986-06-23 | 1988-01-08 | Hitachi Ltd | 磁気記録再生装置 |
-
1989
- 1989-12-28 JP JP1344663A patent/JPH0779703B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS633594A (ja) * | 1986-06-23 | 1988-01-08 | Hitachi Ltd | 磁気記録再生装置 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997035974A1 (fr) * | 1996-03-26 | 1997-10-02 | Institut Pasteur | Sequences en amont du gene sm22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires |
| FR2746815A1 (fr) * | 1996-03-26 | 1997-10-03 | Pasteur Institut | Sequences en amont du gene sm 22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0779703B2 (ja) | 1995-08-30 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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